KR20080005563A - 불임과 연관된 산화성 스트레스의 치료를 위한ｎ-아세틸시스테인 아미드(ｎａｃ 아미드) - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시험관내에서 배양되고 수정되며 유지되는 정자, 난세포 및 배아의 세포 손상 및 궁극적인 소멸에 기여하는 산화성 스트레스 및 자유 라디칼 형성을 감소시키거나 방지하는, N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드)를 함유하는 시험관내 배양물 및/또는 수정 배지에 관한 것이다. 시험관내 배양 및 수정용의 상기 NAC 아미드 함유 배지 조성물은 난세포 배양, 조기 배아의 배양 및 발달, 정자의 제조 또는 배양, 및 난세포 또는 정자의 전처리에 사용하기에 적합하다. NAC 아미드 함유 조성물은 배반포 단계까지 생존하는 배아의 성장을 지지한다.
수정 배지, N-아세틸시스테인 아미드, 난세포, 정자, 배아

Description

불임과 연관된 산화성 스트레스의 치료를 위한 Ｎ-아세틸시스테인 아미드(ＮＡＣ 아미드){N-Acetylcysteine amide(NAC amide) for treatment of oxidative stress associated with infertility}
본 발명은 일반적으로 난세포의 질, 수정 및 배아의 생존력을 저하시키는 산화성 스트레스를 감소시켜 정자, 난세포 및 배아의 생체내 및 시험관내 생존 및 기능 개선을 촉진시키기 위한 산화 방지제의 용도에 관한 것이다.
근본적으로, 수정은 정자 세포가 온혈 동물 종(인간을 포함함)의 암컷에 착상되어 난세포와 결합하고 융합함에 의해 발생한다. 이어서 당해 수정된 난세포는 분열하여 배아를 형성한다. 지난 수십년동안, 과학자 및 임상학자는 보조 생식 기술을 사용으로 이들 과정에 개입하여 몇몇 개체에서의 불량한 수정을 치료하거나 다른 장소 또는 시점에 사용하기 위해 정자, 난세포 또는 배아를 보관하였다.
보조 생식의 경우에 사용되는 과정들은, 정자 샘플을 세척하여 정액장 또는조직 파편과 같은 비정자 성분으로부터 정자가 풍부한 분획물을 분리해내고; 추가로 사정액내의 죽은 정자 또는 백혈구로부터 건강한 운동성(유영) 정자를 분리하고; 훗날에 사용하거나 다른 장소에 있는 암컷에 배달하기 위해 정자(저장)를 동결시키거나 냉장보관하고; 진단 시험에서 배양을 위해 또는 시험관내 수정(IVF) 또는 세포질내 정자 주사(ICSI)와 같은 치료학적 시술에 사용하기 위해 정자를 증대시키거나 희석시키고; 시험관내 수정에 사용하기 위해 암컷으로부터 난세포를 배양하거나 동결시키고; 암컷에 이식하기 전에 배아를 배양하거나 동결시켜 임신시키는 것을 포함한다.
당해 방법의 각 단계에서, 시험관내 시술은 정자, 난세포 및 배아의 정상적인 생존 및 기능을 감소시킨다. 많은 연구를 통하여 당해 과정들이 개선되었지만 전반적으로 성공은 제한적이다. 예를 들어, IVF 시도에서 20% 미만이 출산에 성공하였다. 추가로, 정자 세포는 통상적으로 동결 과정에서 절반 미만이 생존하여 공여자로부터의 동결된 정자를 사용한 임신율은 평균 10 내지 20%이다. 난세포 및 배아는 또한 배양 또는 동결 후 기능이 상당히 파괴되는 것으로 나타난다. 구체적으로, 인간 난세포는 동결 과정으로부터 매우 낮은 수준으로 생존한다. 따라서, 수십년동안 연구되었지만, 보조 생식 기술 분야, 특히, 생식자 및 배아 조작, 배양 및 보관에 있어서 많은 개선의 여지가 있다.
정자 수거에 사용되는 일반적인 과정중 하나는 정자 세포를 세척하는 것이다. 보조 생식 기술에 사용하기 전에 정자 세포를 세척하는 것은 여러가지 이유로 중요하다. 정액장은 정자 세포 뿐만 아니라 샘플내의 정자 세포에 독성일 수 있는 당 및 단백질을 함유한다. 또한, 동결된 정자 샘플은 몇몇 종, 특히, 조류 및 인간의 암컷에 정자를 주입하기 전에 정자 세포로부터 세척될 필요가 있는 냉동보존 매질을 함유한다. 모든 종에 대해서 냉동보존 매질은 지질 막 과산화(LPO)를 유발하고 해동 후 정자를 퇴화시킨다. 일반적으로, 세척은 정액 또는 해동된 정자의 샘플을 희석 세척 매질을 통해 원심분리함을 포함하여 정자가 풍부한 펠렛을 수거할 수 있다. 매우 일반적인 과정이지만, 원심분리 자체는 정자 막 과산화 및 막 파괴를 유발할 수 있다.
정자 세척 과정 후 또는 이를 대신하여, 샘플로부터 운동성 정자의 분리를 위해 특정 과정이 수행될 수 있다. 정자 샘플은 살아있는 운동성 정자에 손상을 입힐 수 있는 효소를 방출하는 죽었거나 죽어가는 정자를 함유한다. 추가로, 당해 샘플은 또한 건강한 정자에 독성인 백혈구, 적혈구 및 세균을 함유한다. 정자 분리는 진단 또는 치료학적 과정에 사용하기 위해 살아있고 건강하며 운동성인 정자를 분리해 내는 것을 포함한다. 일반적으로, 운동성 정자가 죽은 정자 및 조직 파편으로부터 유영해 나오도록 하거나(정자 유영 증가) 밀도 구배를 통해 정자를 원심분리하거나 정자를 죽은 정자 및 조직 파편과 결합된 칼럼에 통과시킴에 의해 정자는 분리된다. 이들 각각의 기술은 그들 고유의 단점을 갖는다. 유영 증가는 단지 정자의 수가 낮게 회수되고 이는 장기간의 배양 기간을 필요로 한다. 현재 원심분리 농도 구배 시약은 일반적으로 정자에 독성이어서 정자 샘플로부터 농도 구배 용액을 제거하기 위해 추가의 세척 단계가 필요하다. 칼럼 방법은 운동성 정자에 대한 선택성이 불량하고 온전한 사정액으로부터 양호한 정자 수를 회수하지는 못한다.
일단, 정자가 세척되거나 분리되면, 이어서 이들은 다양한 용도로 배양 배지 또는 보존 배지로 증대(또는 희석)된다. 현존하는 정자 배양 기술은 운동성 정자를 손실시키고 또한 배양 시간동안 정자 DNA를 손상시킨다. 정자가 대부분의 종의 암컷에서 수일동안 생존하지만 배양시의 정자 생존 기간은 전형적으로 생체내에서 관찰되는 것의 절반이다. 불량한 질의 정자는 심지어 배양시의 보다 단축된 기간동안 생존할 수 있다. 당해 많은 손상은 막의 지질이 과산화되고 DNA 또는 염색질이 파괴되기 때문이다. 정자는 정자 분석 및 진단 시험; 보조 생식 기술, 예를 들어, IVF, 생식자 난관내 이식, 암컷으로의 정자 주입, ICSI; 및 냉동보존 전 보관에 사용하기 위해 배지에서 증대된다. 증대되거나 희석된 정자에 각각을 사용하기 위해서는 기본 배지와는 어느정도 상이한 제형이 요구되지만, 모든 경우에, 정자 생존은 암컷 생식관의 외부에서는 최적이 아니다.
또한, 난세포 및 배아는 생체내 조건에서와 비교하여 배양에서 흔히 비정상적으로 발달한다(예를 들어, 염색체 수, 세포골격 형성). 추가로, 현재 배양 방법은 고투여량의 동물성 단백질, 예를 들어, 혈청을 사용하고 있고 이는 태아를 과도하게 크게하고 출산을 위한 주산기 합병증을 초래할 수 있다.
세포 주입 층과 함께 정자, 난세포 및 배아를 동시 배양하여 보조 생식 기술에서 몇몇 난제를 극복할 수 있다. 그러나, 동시 배양은 질 및 확실성이 가변적이어서 주입 세포로부터 병원체가, 생존 동물 또는 인간에게 다시 전달될 생식자 또는 배아에 도입될 위험을 부가한다.
정자, 난세포 및 배아의 보관은 상업적 동물 육종 프로그램, 인간 수정 및 정자 공여 프로그램 및 몇몇 질환 상태를 취급하는데 있어서 다각적으로 중요하다. 예를 들어, 정자 샘플은, 궁극적으로 정자 생성을 방해할 수 있는 암 또는 기타 질환으로 진단된 수컷을 위해 동결될 수 있다. 정자의 동결 및 보관은 위기에 처한 종을 보존하기 위한 분야에서 중요하다. 많은 이들 종은 현존의 방법하에 잘 동결되지 않는 정액을 갖는다. 표준 동물 축산에서, 동결된 비거세 정자를 사용한 인공 정자 주입(AI)은 85%의 젖소에 사용된다. 대부분의 상업용 칠면조는 자연적으로 짝짓기하기에는 너무 무거워져서 거의 모든 칠면조 농장에서는 AI가 요구된다. 미국에서는 매주 약, 6백만마리의 칠면조에게 정자를 주입한다. 그러나, 수거된 칠면조 정자에 대한 현재의 보관 방법은 농장간에 정액을 전달하는데 요구되는 수시간동안에도 정자의 생존을 지속시킬 수 없고 장기 동결에 대해서는 훨씬 못하다. 이것은 생산을 개선시키기 위해 유전자 물질을 보관하거나 운반하는 능력을 제한한다. 인간 공여자 AI는 또한 중증 남성 불임을 갖는 커플에 사용되지만 공여자 정액을 사용한 임신율은 자연적 생식에서 발생하는 것의 4분의 1에 불과하다. 추가로, 수술에 의한 정액 주입이 요구될 수 있다.
모든 종 기원의 정자를 동결시키기 위한 현재 기술은 막을 손상시킴에 따라 샘플중의 정자 세포의 약 절반이 죽게된다. 이러한 많은 손상은 정자 막의 지질 과산화를 유발하는 반응성 산소 종에 의해 발생한다. 이들 다각적이며 심각한 문제에도 불구하고, 당업계의 기술 및 프로토콜은 지난 15년간 거의 변화하지 않았다. 다양한 요구에 따라 동결된 정자의 사용이 증가하고 있다는 관점에서, 정자를 배양하거나, 동결시키거나 보관하기 위한 새로운 방법 및 조건이 인간 수정 전문가 뿐만 아니라 동물 생산자에게 잇점을 제공할 것이다.
난세포 및 배아의 동결은 또한 위험에 처한 종의 유전자 물질을 보존하거나, 가치있는 가축의 자손 번식을 증가시키거나 불임 커플에게 전달하기 전 배아를 보 유하기 위해 중요하다. 난세포 및 배아를 동결시키는 현재 방법은 최적이 아니며 축소된 개발 잠재력은 여전하다. 사실, 인간 난세포는 거의 성공적으로 동결되지 않아 다수의 배아들을 여성의 자궁에 이식시킬 필요가 있고 이는 위험한 다중 임신 수를 증가시킨다. 추가로, 유전자 치료 후 수득된 것들과 같이 모든 종 기원의 IVF 배아 또는 유전자 변형된 배아는 현재의 동결 매질을 사용해서는 동결후 생존율이 매우 불량하다. 이것은 클로닝된 배아 및 배아 줄기 세포(ESC) 기원의 배아를 포함한다.
시험관내 수정 및 배아 전달은 난세포와 정자의 시험관내 수정 및 이어서 발달된 배아를 암컷 몸체에 이식하는 것을 포함한다. 1978년 영국에서 에드워드등에 의해 시험관내 수정에 따른 인간의 출산이 최초로 보고된 이후, 발달 기술이 최근에 진전함에 따라 당해 과정은 전세계적으로 급속하게 사용되었다. 예를 들어, 일본에서는 시험관내 수정이 현재 불임증에 필수적인 치료법이다. 최근에 시험관내 수정 기술 및 과정이 진전되었음에도 불구하고, 실제적으로 임신을 유도한 경우는 몇몇 건수에 불과하다. 이러한 원인은 불임 남성 환자에서 수정능력이 낮기 때문일 수 있지만 이식된 난세포의 이식율이 낮은게 주요 원인인 것으로 보인다[문헌참조: Mori, Munehide et al., Nippon sankahujin kagakukai zashi, 45:397, (1993); Cohen, J. et al., VIIIth World Congress on in vitro Fertilization and Alternate Assisted Reproduction Kyoto, Sep., 12-15 (1993), World Collaborative Report (1991)].
기술적 요소외에, 배양 동안에 감소된 배아의 질이 이식율을 저하시키는 원 인일 수도 있다[문헌참조: Inoue, Masahito, Rinsho fujinka sanka, 48:148, (1994)]. 포유동물의 난세포는 파충류 및 조류의 알에서 알부민에 상응하는 물질을 갖고 있지 않기 때문에, 난세포에서 보존된 영양물의 양은 천연적으로 낮다. 따라서, 시험관내 수정의 조기 단계의 배아에서는, 배양 배지의 영양물이 투명대(zona pellucida)를 통해서 흡수되어야만 한다. 화학적 한정 배지, 예를 들어, 햄스 F-10 배지, MEM(최소 필수 배지), 듈베코 MEM등이 시험관내 수정 기술에 통상적으로 사용되어 왔지만, 이들은 본래 시험관내 수정을 위해 개발된 것이 아니었다. 그러나, 이들 배지 또는 변형된 대응배지가 조직 배양에서 통상적으로 사용되고 있는 바, 이들은 당연히 시험관내 배양된 조기 배아의 영양물 요구에는 최적이 아니다.
인간 난관 유체(HTF) 배지는 인간 시험관내 수정을 위해 적합한 영양물 함유 배지로서 개발되었다. HTF 배지는 인간 난관 유체의 전해질 조성과 유사한 조성을 포함한다[문헌참조: Quinn, P.J. et al., Fertility and Sterility, 44:493 (1982)]. 이러한 배지는 시판되고 있고 전형적으로 이전에 사용된 햄스 F-10 배지를 대체하고 있다. 그러나, HTF 배지는 주요 성분으로서 전해질 및 에너지원으로서 글루코스만을 함유하고 있기 때문에 당해 배지는 영양물 조성에서 아미노산을 함유하는 햄스 F-10 배지보다 개선된 것이 없다. 사실, HTF 배지의 사용에도 불구하고 배아 이식율은 증진되지 않았고 배아의 질은 여전히 개선되지 않았다.
당해 단점을 보완하기 위해, 열처리에 의해 불활성화된 여성 혈청을 배지에 첨가하여 배양된 배아를 유지시키는 방법이 사용되었다. 당해 혈청은 동물 세포 배양에 필수 요소인 영양물로서 단백질, 탄수화물, 지질, 비타민 및 무기물외에 성장 인자등을 함유한다. 그러나, 당해 혈청이 시험관내 수정-배아 전달 과정에서 항상 요구되지는 않음이 보고되었다[문헌참조: Menezo, Y. et al., Fertility and Sterility, 42:750(1984)]. 실질적으로, 배아의 성장은 여성 혈청 첨가에 의해 억제될 수 있다[문헌참조: Mehita et al., Biology of Reproduction, 43:600 (1990)]. 추가로, 혈청 자체를 수거하기가 어렵고 바이러스등에 의해 오염될 위험이 있기 때문에 여성 혈청은 시험관내 수정된 난세포 배지에 대한 첨가제로 사용하기에 적합하지 않다.
자유 라디칼은 배아에 대해 상당한 성장 억제 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 이것은, 생체내의 경우와 비교하여 시험관내에서 세포가 산소와 보다 많이 직접적으로 접촉함으로 인해 발생되는 산화성 스트레스에 의해 배양된 배아의 성장이 억제된다는 이론에 근거한 것이다[문헌참조: Whitten, W., Advanced in the Biosciences, 6:129 (1971); Quinn, P.J. et al., Journal of Experimental Zoology, 206:73 (1978)]. 따라서, 산화성 스트레스의 예방은 배아의 성장을 증진시킬 수 있다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 에데트산(EDTA)등과 같은 특정 성분들은 산화성 스트레스의 효과를 극복하기 위한 시도에서 배양 배지에 첨가되었다[문헌참조: Abramczuk, J. et al., Developmental Biology, 61:378 (1977); Nonozaki, T. et al., Journal of Assisted Reproduction and Genetics, v9:274 (1992)].
추가로, 또한, 유효 성분이 아직 밝혀지지 않은 난관의 상피 세포를 사용하 는 동시 배양이 배아의 성장을 위해 효과적이고[문헌참조: Xu, K.P. et al., Journal of Reproduction and Fertility, 94:33 (1992)] 인슐린형 성장 인자와 같은 성장 인자가 배아의 성장을 직접 자극한다는 것[문헌참조: Matui, Motozumi et al., Honyudoubutu ranshi gakkaishi, 11:132 (19949)]이 보고되었다. 그러나, 또한 당해 동시 배양이 기껏해야 배지의 탈독화를 위해 효과적일 뿐이고 배아가 적당한 영양물을 수득한다는 이용가능한 증거가 없다는 것이 보고되었다[문헌참조: Bavister, B.D., Human Reproduction, 7:1339 (1992)]. 임의의 경우에, 시험관내 수정을 위한 대부분의 통상적인 배지 및, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, EDTA 등의 첨가를 포함하는, 기존의 배지에 첨가제를 첨가하는 방법은 단지 부분적으로 시험관내 성장의 중단을 차단한다. 추가로, 보고된 유형의 배지는 취급하기가 매우 불편한데, 그 이유는 배아의 실제 배양동안에, 배아의 증식 단계를 허용하는 최적의 배지가 적합하게 선택되고 단계마다 교환되어야만 하기 때문이다.
따라서, 시험관내 수정 분야는 배양된 난세포, 정자 및 배아가 바이러스 오염이 부재이고 당해 세포가 시험관내 배양 조건하에서 가능한한 오랫동안 생존 및 기능을 유지하기 위한 영양물 및 성분들을 함유하는 배양 배지 및 환경을 요구하고 있다. 당해 배지는 배양동안의 세포내 및 주변의 산화성 스트레스 및 자유 라디칼 형성을 차단하거나 감소시킴에 의해 정자 및 난세포, 및 발달 중인 배아에 대한 손상을 막아야만 한다. 당해 배지는 또한 시험관내 수정-배아 전달 과정동안에 성장하는 조기 배아에 대해서 뿐만 아니라 정자 및 난세포의 처리 및/또는 전처리에 적합해야만 한다. 이상적으로, 당해 배지는 안전하고 모든 조기 배아의 성장 단계를 유지시킬 수 있다.
당업계에서는 것은 배양 및 배양 배지 및 수정 생성물을 안전하게 보완하여 난세포 및 정자의 생존력을 보호하는 신규 화합물 및 방법이 요구된다. 또한 시험관내 수정용 배양 배지에 사용되어 수정 전후 모두에 난세포 및 정자의 생존 및 성숙화 및 수득한 배아의 적당하고 건강한 발달을 위해 적당한 조건을 제공하는 화합물 및 방법이 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 난세포 성숙화 및 수정동안에 배양 및 배양 배지, 및 시험관내 수정에 따른 배아 배양 및 이어서 조기 단계 이식전 배아 발달을 위한 배양 및 배양 배지를 위한 보충물로서 산화방지제인 N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 유도체의 용도를 제공한다. NAC 아미드는 생체내 및 시험관내에서 생식 세포(정자 및 난세포)의 생존력 및 기능, 및 배아 및 수정란 형성을 개선시키기 위한 방법 및 조성물에 사용하기 위해 제공된다.
본 발명은 정자, 난세포 또는 배아에 비독성이고 시험관내 취급 및 조작동안에 이들의 기능 및 생존을 추가로 개선시키는 NAC 아미드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는 조성물, 제제 또는 제형을 제공한다. NAC 아미드 함유 조성물은 인간 및 동물에서 다양한 보조 생식 기술에 사용하기 위해서 뿐만 아니라 자연적으로 착상시키고자 하는 커플에 사용하기 위해 정자 및 난세포 기능을 개선시킨다. 본 발명은 추가로 기타 관련 잇점을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 NAC 아미드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 유도체 또는 염 또는 에스테르를 배양 배지에 보충하거나 여기에 포함시킴에 의해 시험관내 수정 기술 동안에 정자와 난세포의 수정율을 증가시키는 방법을 제공한다. NAC 아미드가 보충된 배지는 또한 포유동물 배아의 수정율을 증가시키기 위해 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 알 및/또는 정자 성숙화, 정자와 난세포 사이의 수정 및 배아와 수정란의 발달을 위한 배양 배지 중의 성분으로서 사용하기 위한 NAC 아미드를 제공한다. 이식 배양 배지에 NAC 아미드의 존재는 배아 이식 전에 배양동안에 발생할 수 있는 자유 라디칼 및 산화 손상을 감소시켜 배아의 형성, 생존 및 발달을 증가시킬 수 있다.
이전의 측면과 관련된 또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 배반포 단계 및 이후의 배아 발달의 생존력 및 성공을 증가시키기 위한 과립세포-마크로파아지-콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 다른 성분 또는 인자와 연계되어 사용되는 NAC 아미드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 형질 전환 동물 배아 및 알의 생성 및 유지에 관여하는 방법 및 조성물에 사용하기 위한 NAC 아미드를 제공한다. 이러한 측면에 따라, 형질 전환 동물의 알 및 배아에 공급되는 NAC 아미드는 생체내 뿐만 아니라 시험관내 배양동안에 형질 전환 유기체의 완전한 발달율을 개선시킬 것이다.
이의 또 다른 측면에서, 본 발명은 시험관내 및 생체내에서 세포 성장 및 클로닝을 지지하는 것 뿐만 아니라, 줄기 세포 또는 기타 생식 세포의 인간을 포함하는 동물로의 이식을 육성시키고 지지해주는 NAC 아미드를 포함하는 방법 및 조성물 을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 자궁으로의 배아 이식 후에 암컷이 섭취하여 이식 후 산화성 스트레스의 조건을 차단하거나 감소시키는 위해 산화방지제를 제공하기 위해 NAC 아미드를 포함하는 생리학적으로 또는 제약학적으로 허용되는 조성물 또는 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수컷이 섭취하여 정자 생성, 발달 및 전체 수정능에 대한 자유 라디칼 또는 산화성 스트레스의 부작용을 감소시키기 위해 건강한 정자 발달을 허용하는 산화방지제를 제공하기 위한, NAC 아미드를 포함하는 생리학적으로 또는 제약학적으로 허용되는 조성물 또는 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간을 포함하는 동물에서 불임과 연관된 산화성 스트레스를 예방, 감소, 대응 또는 완화시키기 위해, NAC 아미드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 유도체 또는 염 또는 에스테르를 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미성숙 신생아의 생존 및 발달에 악영향을 주는 과량의 헴 옥시게나제 및 빌리루빈으로부터 비롯되는 산화성 스트레스를 예방, 감소, 대응 또는 완화시키기 위해, NAC 아미드, 또는 생리학적으로 허용되는 이의 유도체 또는 염 또는 에스테르를 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 동물에서 수정 잠재력을 증가시키기 위한 비-살정성 윤활제를 제공한다. 윤활제는 NAC 아미드 또는 생리학적으로 허용되는 이 의 유도체 또는 염 또는 에스테르 및 비-살정성 윤활성 화합물을 포함한다. 윤활성 화합물은 글리세린, 메틸셀룰로스, 프로필렌 글리콜, 식물성 오일, 또는 석유 젤리 또는 글리세린과 석유 젤리의 배합물 또는 폴리에틸렌 옥사이드, 나트륨 카복시폴리메틸렌 및 메틸파라벤의 배합물을 포함할 수 있다. 윤활제는 질외 또는 인공 정액 주입 전에 질내에 투여하거나 위치시킴에 의해 생체내에 사용될 수 있거나 수용 부분에 사정하기 전에 윤활제를 수컷 성기에 도포하는 것과 같은 정액 수거동안에 사용될 수 있다. 윤활제는 또한 생식 과정전에 의학 장치를 윤활시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 추가의 측면, 특징 및 잇점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 하기의 예시로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 시험관내 수정을 위한 배양 배지 조성물중의 보충물로서 유효한 산화방지제인 글루타치온 N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 또는 제약학적으로 허용되는 유도체 또는 염 또는 에스테르의 사용을 포함한다. 당해 NAC 아미드 보충된 배지는 특히, 난세포, 정자, 수정된 난세포인 조기 배아의 배양 또는 수정 전에 난세포 또는 정자의 전처리에 적용된다. NAC 아미드, 예를 들어, 수용성 NAC 아미드를 포함하는 조성물이 또한 본 발명에 따른 배지에 첨가하기 전에 제형화되고 농축될 수 있다. 농축된 제형은 배지에 첨가 즉시 희석되거나 배지에 첨가전에 희석된다. NAC 아미드, 또는 NAC 아미드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는 제제는 조기 배아의 성장 자극 및 질적 안정화에 효과적이고 시험관내 조기 배아의 배양 및 성공적인 발달을 위해 적합하다.
글루타치온 N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드), 아미드 형태의 N-아세틸시스테인(NAC)은 신규한 저분자량의 티올 산화방지제이고 Cu2 + 킬레이터이다. NAC 아미드는 자유 라디칼의 스캐빈저로서 역할하여 세포 손상에 대해 보호 효과를 제공한다. 포유동물 적혈구(RBC)에서, NAC 아미드는 3급 부틸하이드록시퍼옥사이드(BuOOH)-유도된 세포내 산화를 억제하고 RBC에서 BuOOH-유도된 티올 고갈 및 헤모글로빈 산화를 지연시키는 것으로 나타났다. 외부에서 적용된 NAC 아미드에 의한 티올 고갈된 RBC의 회복은 NAC를 사용하여 관찰되는 것보다 훨씬 높았다. NAC와 는 다르게, NAC 아미드는 헤모글로빈이 산화되는 것을 차단하였다(문헌참조: L. Grinberg et al., Free Radic Biol Med., 2005 Jan 1, 38(1):136-45). 무세포 시스템에서, NAC 아미드는 산화된 글루타치온(GSSG)와 반응하여 감소된 글루타치온(GSH)를 생성시키는 것으로 나타났다. NAC 아미드는 세포막을 용이하게 침투하고 세포의 산화환원 기구에 도입되어 세포내 GSH를 재충전시켜 세포가 산화되지 않도록 한다, 이러한 중성 카복실 그룹 때문에, NAC 아미드는 증진된 친지질성 및 세포 침투성을 보유한다(문헌참조: 디. 아틀라스 등의 미국 특허 제5,874,468호). NAC 아미드는 또한 세포막 및 혈뇌 장벽을 통과하는데 있어서 NAC 및 GSH보다 우수하다.
NAC 아미드는 단백질 및 DNA의 합성, 수송, 효소 활성, 대사 및 자유 라디칼 매개된 손상으로부터 세포의 보호를 포함하는, 많은 중요한 생물학적 현상에서 직간접적으로 기능할 수 있다. NAC 아미드는 세포내에 적당한 산화 상태를 유지시키는데 관여하는 효능있는 세포 산화방지제이다. NAC 아미드는 대부분의 세포에 의해 합성되고 산화된 생분자를 이의 활성 환원 형태로 재순환시킬 수 있다. 산화방지제로서 NAC 아미드는, GSH보다는 더 효과적이지 않지만, 효과적으로 작용할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 생식자, 특히, 난세포에서 난세포 배양 배지에 NAC 아미드를 보충함에 의해 GSH의 세포내 농도를 증가시키는 방법이 제공된다(실시예 1). NAC 아미드가 배양 배지에 첨가되는 조성물, 제제 또는 제형에 존재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. NAC 아미드, 및 생리학적으로 허용되는 이의 유도체, 염 또는 에스테르는 본 발명에 따라 사용하기에 적합하다. NAC 아미드는 또한 수용성이다. NAC 아미드가 글루타치온에서의 세포내 농도를 증가시킬 수 있다는 것은 본 발명의 잇점이고 이는 세포내 글루타치온에서의 농도 증가가 산화성 스트레스를 감소시킴에 따라서 수정 과정 및 조기 배아 발달을 증진시킬 수 있기 때문이다. 본 발명에 따른, NAC 아미드 보충은 난세포의 질을 감소시키고 수정을 감소시키며 시험관내 시스템에서 배아 생존력을 감소시키는 산화성 스트레스를 감소시키는 작용을 한다.
용어 "배아"는 배반포 단계 까지의 수정 후, 인간 및 비-인간 포유동물을 포함한 유기체의 조기 성장 단계를 언급한다. 배아는 분화되지 않는 전능성 세포를 갖고 있음을 특징으로 한다. 반대로, 개체의 체세포는 전능성이 아닌 신체의 분화된 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시험관내 수정을 위해, 특히 난세포(난) 또는 조기 배아(수정된 난세포)의 배양 또는 난세포 또는 정자의 전처리에 적용되는, NAC 아미드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는 배양 배지 조성물을 포함한다. 특히, 배양 배지 조성물은 조기 배아의 성장의 자극 및 질적 안정화를 위해 효과적이고 시험관내 조기 배아의 배양을 위해 적합하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 정자 기능을 개선시키기 위한 방법을 포함하고, 여기서, 정자는 난세포를 수정시키는 능력이 증가된다. 이러한 기능은 광범위한 측정 가능한 세포 기능에 의해 분석될 수 있다. 당해 분석 가능한 기능은 정자 운동성, 정자 생존력, 정자의 막 통합성, 시험관내 수정, 정자 염색질 안정성, 배양에서 생존 시간, 자궁 점막의 침투성, 및 자궁 침투 분석 및 반투명대 분석을 포함한다. 정자가 대조군(즉, PCAGH를 포함하지 않고 수행되는 분석)과 비교하여, PCAGH에 의해 상당히 양호하게(p < 0.05) 작용하는 경우에, 이는 조성물 또는 방법에 적용된 후 개선된 능력을 갖는다. 정자 기능을 평가하는데 사용될 수 있는 대표적인 다양한 분석은 제이.이. 엘링톤 등의 미국 특허 제 6,539,309 호에 기재되어 있고 이는 본원의 실시예 1에서 제시된다.
NAC 아미드가 윤활제에 제형화되어 수정전, 수정동안에 또는 수정 후 산화성 스트레스 및 자유 라디칼 형성을 감소시키는 그러한 양태에서, 윤활제의 기제는 비-살정성 윤활 화합물이다. 당해 윤활제는 석유 젤리, 야채 오일, 글리세린, 폴리카보필, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 규소 오일, 카보머(예를 들어, 카보머 934), 알기네이트, 메틸파라벤, 야자나무 오일, 코코아 버터, 알로에 베라, 기타 식물성 오일, 알기네이트 프로필렌 글리콜, 유니베이스(unibase)(Warner-Chilcott), 광유; 폴리에틸렌 옥사이드, 나트륨 카복시폴리메틸렌 및 메틸파라벤의 배합물 등을 포함한다. 예를 들어, 50% 석유 젤리/50% 글리세린의 기제 윤활제가 적합하다. pH 안정화제 및 산화방지제와 같은 추가의 성분이 첨가될 수 있다. 수산화나트륨은 바람직하게 pH를 7.4로 하기 위해 첨가된다. 기타 pH 안정화제는 EDTA 또는 양쪽성 완충제(예를 들어, TES, PIPES, MOPS, HEPES)를 포함한다. 기타 산화방지제 또는 자유 라디칼 스캐빈저, 예를 들어, 비타민 E가 첨가될 수 있다. 특정 양태에서, 규소 오일 또는 폴리비닐 알콜이 첨가된다.
윤활제는 바람직하게 비자극성이고 용이하게 적용된다. 겔, 발포체, 크림, 젤리, 좌제 형태일 수 있다[문헌참조: 카즈미로스키의 미국 특허 제4,384,003호]. 윤활제는 예를 들어, 질외 또는 인공 정액 주입동안에 사용하기 위해 윤활제 튜브 및 질내 적용 도포기를 포함하는 키트에 내장될 수 있다. 또한 다양한 수단에 의해 정자 공여체로부터 정자를 수거하는 동안에 사용될 수 있다. 추가로, 윤활제는 다양한 보조 생식 기술 및 진단 과정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 윤활제는 퇴행성 정자 수거를 위해 방광으로 삽입되는 카테터를 피복하기 위해 사용될 수 있다. 윤활제는 배아 전달, 인공 정자 주입, 또는 내시경 검사, 조영 방사선 촬영 또는 생검을 수행하기 전에 카테터, 피펫 또는 손을 윤활시키는데 사용될 수 있다. 윤활제는 정자 수거, 질외, 보조 생식 기술 등을 위한 임의의 동물 중에 사용될 수 있다. 동물은 인간, 소, 말, 고양이, 양, 조류, 개 및 다양한 신종 또는 희귀종(예를 들어, 코끼리, 사자, 코뿔소)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 기능이 개선된 정자를 수득하기 위해 정자를 증대(예를 들어, 정자의 희석 또는 현탁)시키는 방법이 제공된다. 정자의 기능 개선은 난세포에 수정되는 정자의 개선된 잠재력을 언급한다. 이러한 잠재력은 실시예 2에 기재된 바와 같이, 운동성, 생존력, 생존 시간, 막 안정화, 지질 과산화 손상 수준, 염색질 안정성, 점막 침투성, 난세포 수정 또는 이어서 배아 발달 등에 의해 평가될 수 있다. 유사하게, 난세포의 개선된 기능은 정자에 의한 난세포의 수정 후 정상적인 발달에 대한 개선된 잠재력을 언급한다. 배아의 개선된 기능은 정상 발달 및 자손 생성을 위해 개선된 잠재력을 언급한다. 난세포와 배아에 대한 당해 잠재력은 염색체 수, 세포수, 세포골격 형성 및 대사 활성을 평가함에 의해 분석된다. 개선된 기능은 또한 적절한 대조군과 비교하여 다양한 분석에 의해 평가되는 바와 같이, 배양 배지 또는 윤활제에 NAC 아미드가 존재하는 결과로서, 정자, 난세포 또는 배아의 증진된 수행능, 생존력 및 생존을 언급할 수 있다.
증대된 정자는 분리 또는 세척 후 정자 펠렛을 재현탁시키고 정액 샘플을 희석시키거나 정자의 배양액을 희석시키는 등에 사용된다. 이러한 방식으로 정자는 배지, 또는 배양, 정액 주입, 본원에 기재된 바와 같이 수정 잠재력의 분석, 시험관내 수정, 동결, 자궁내 정액 주입, 자궁 캡 정액 주입등을 포함하는, 다양한 과정을 위해 적합한, 배지 또는 NAC 아미드 함유 배지에 위치하게 된다. 정자는 배지에 첨가될 수 있거나 배지가 정자에 첨가될 수 있다.
기타 양태에서, 본 발명은 약 실온(예를 들어 20℃) 내지 약 체온(예를 들어, 37℃ 또는 39℃)의 온도 범위에서 배양 또는 보유 동안에 이들의 생존을 증가시키는 증대된 정자의 배양을 위한 방법을 포함한다. 이것은 독성 스크린 시험에서 정자의 배양 및 성별 자손 생성을 위해, 유동 세포측정기에 의한 X 및 Y 염색체 함유 분획물로 분류하기 위한 정자의 보유를 포함한다. 추가로, 정자 증대 배지는 직접적인 정액 주입, 냉동 보존 및 난세포내 주입용 전달 피펫에 의한 픽업을 위해 정자 운동성을 느리게하는 보다 점성의 배지를 요하는 세포질내 정자 주사(ICSI)용의 정자를 제조하는데 사용된다. 샘플 매질은 양쪽성 완충제, 예를 들어, TES, HEPES, PIPES; 기타 완충제, 예를 들어, 중탄산나트륨; TALP; 또는 HTF를 함유할 수 있는 균염 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 성분은 거대분자, 예를 들어, 알부민, 오비덕틴, 젤라틴, 하이알루론산, 우유, 난백, 호르몬, 추가의 자유 라디칼 스캐빈저(예를 들어, 멜라닌, 비타민 E 유도체, 티오레독신), 효소(예를 들어, SOD, 카탈라제), 성장 인자(예를 들어, EGF, IGF, PAF, VIP), 중합체 분자(예를 들어, 헤파린, 덱스트란, 폴리라이신, PVP 또는 PVA)를 포함할 수 있다. 추가로, 당해 매질은 카페인, 여포 유체, 칼슘, 옥시토신, 칼리크리넨, 프로스타글란딘, 흉선 추출물, 펜톡시필린, 2-데옥시아데노신, 이노시톨, 플라바노이드, 혈소판 활성화 인자, 하이포타우린, 콘드로이틴 설페이트 및 머캅토에탄올과 같은 정자 운동성 자극제를 포함할 수 있다. 카페인(예를 들어, 5mM) 및 펜톡시필린(예를 들어, 1mM)이 적합한 자극제이다. 항생제 및 항진균제가 또한 함유될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 시험관내 배양 시스템에서 난세포, 배아 또는 배아 줄기 세포(ESC)의 생존 및 성숙화를 증가시키는 방법을 포함한다. 난세포, 배아 또는 ESC는 다양한 진단 및 독성학적 분석, 시험관내 수정 또는 자손 번식에 사용하기 위해 배양된다. 이들 방법은 난세포, 배아 또는 ESC를 함유하는 샘플을, NAC 아미드 또는 생리학적으로 허용되는 이의 유도체 또는 염 또는 에스테르를 함유하는 배양 배지와 접촉시킴을 포함한다.
본 발명의 방법 및 조성물에 따라 NAC 아미드가 또 다른 성분 또는 인자, 예를 들어, 배반포 단계 및 이후까지의 배아 발달의 생존력 및 성공을 증가시키기 위한 과립세포-마크로파아지-콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 연계하여 투여되거나 공급되거나 사용된다.
또 다른 양태에서, NAC 아미드는 비-인간 형질 전환 동물, 예를 들어, 돼지, 양, 염소 및 설치류를 비제한적인 예로서 포함하는, 형질 전환 동물 배아 및 알의 생성 및 유지에 관여하는 방법 및 조성물에 사용된다. 형질 전환 동물의 알 및 배아는 보통, 천연적으로 낮은 수준으로 생성된 GSH를 포함하고 완전한 발달을 위한 성공 비율이 낮다. 따라서, 본 양태에 따라, 형질 전환 동물의 알 및 배아에 공급된 NAC 아미드는 생체내 뿐만 아니라 시험관내 배양 동안에 형질 전환 유기체의 완전한 발달 비율을 개선시켜 완전하게 형질 전환된 동물에서 성공 비율을 증가시킬 것이다. 본 발명은 또한 예를 들어, 인간 및 동물 아미노산, 이종성 단백질, 예를 들어, 응고 인자, 성장 인자, 항암 인자 등을 생성하는 능력을 갖는 형질 전환 동물을 생성시킬 수 있다. 본 발명에 따라 생성된 형질 전환 동물은 또한 인간 이식체용으로 항원 부재 기관의 공급원으로서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 줄기 세포 또는 기타 생식 세포의 인간을 포함하는 동물로의 이식을 육성하고 지지하는 것 뿐만 아니라 시험관내 및 생체내 세포 성장 및 클로닝을 지지하는 NAC 아미드를 포함하는 방법 및 조성물을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 미성숙 신생아의 생존 및 발달에 악영향을 미치는 과량의 헴 옥시게나제 및 빌리루빈으로부터 비롯되는 산화성 스트레스를 차단, 감소, 대응 또는 완화시키는 과정에 사용되는 NAC 아미드, 또는 생리학적으로 허용되는 이의 유도체 또는 염 또는 에스테르를 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 포함한다. NAC 아미드의 신생아로의 투여는 이의 산화방지제 방어를 개선하고 보충하며 감염 및 염증에 대한 감수성의 증가를 차단함에 의해 미성숙 유아 및 신생아에서 기관지 폐 이형성증을 추가로 개선시도록 추가로 작용할 수 있다. 당해 신생아 및 미성숙 유아에게 제공된 NAC 아미드는 또한 아폽토시스 및 이의 쇠약 및 비극적 효과를 차단할 수 있다.
본 발명에 따른 치료목적을 위해, NAC 아미드는 당업자에 의해 이해되는 치료 또는 처치 방법에 적합한 다양한 경로로 투여될 수 있다. NAC 아미드에 대한 투여 경로 및 방식에 대한 비제한적인 예는 피하, 정맥내, 근육내 및 하흉곽내를 포함하는 비경구 주사 경로를 포함한다. 기타 투여 방식은 경구, 흡입, 국소, 비강내, 지주막하강내, 피내, 점안내, 질내, 직장내, 경피적, 장내, 주사 캐뉼라, 연속 주입, 시간 조절 방출 및 설하 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 한 양태에서, NAC 아미드의 투여는 내시경 수술에 의해 매개될 수 있다. 뇌에 영향을 미치는 다양한 신경학적 질환 또는 장애의 치료를 위해, NAC 아미드는 뇌심실을 따라 존재하는 조직으로 도입될 수 있다. 거의 모든 뇌 영역의 뇌실 시스템은 질환 또는 장애에 의해 영향받은 뇌의 상이한 영역으로 용이하게 접근할 수 있도록 한다. 예를 들어, 치료를 위해서는 캐뉼라 및 삼투압 펌프와 같은 장치가 이식되어 제약학적으로 허용되는 조성물의 성분으로서 NAC 아미드와 같은 치료학적 화합물이 투여될 수 있다. NAC 아미드의 직접적인 주사가 또한 포함된다. 예를 들어, 많은 뇌 영역의 뇌실의 인접 부분은 분비되거나 도입된 신경학적 물질이 NAC 아미드에 의한 치료 부위내 및 주변으로 확산되는 것을 도와준다.
수용자에게 투여, 예를 들어, 주입 투여를 위해, 수용성 NAC 아미드를 함유하도록 제형화된 조성물 또는 제제는 전형적으로 멸균 용액 또는 현탁액에 존재한다. 또한, NAC 아미드는 방부제, 안정화제, 및 용액 또는 현탁액이 수용자의 체액(즉, 혈액)과 등장성이 되도록 하는 물질을 함유할 수 있는, 제약학적으로 및 생리학적으로 허용되는 수성 또는 유성 비히클에 재현탁될 수 있다. 사용하기에 적합한 부형제의 비제한적인 예는 물, 인산 완충 식염수(pH 7.4), 0.15M 수성 염화 나트륨 용액, 덱스트로스, 글리세롤, 희석된 에탄올 등 및 이의 혼합물을 포함한다. 예시적인 안정화제는 단독으로 또는 혼합물로 사용될 수 있는 폴리에틸렌 글리콜, 단백질, 사카라이드, 아미노산, 무기간 및 유기산이다.
국소 투여를 위한 NAC 아미드를 포함하는 제제는 로션, 연고, 겔, 크림, 좌제, 적가제, 액제, 분무제 및 산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. NAC 아미드는 액체, 겔 크림 및 패드 또는 스폰지에 흡수된 젤리 형태로 점성막에 투여될 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 액제, 산제 또는 유성 기제, 증점제등이 필요하거나 요망될 수 있다. 경구 투여를 위해 NAC 아미드를 포함하는 조성물은 산제 또는 과립, 현탁제 또는 수성 또는 비액성 매질내 용제, 사쉐제, 캅셀제 또는 정제를 포함한다. 증점제, 희석제, 향제, 분산제, 유화제 또는 결합제가 요망될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 용제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
사용되는 투여 경로 뿐만 아니라 NAC 아미드의 투여량은 개체에 따라 결정되고 당업자에게 공지된 유사한 유형의 적용 또는 지시에 사용되는 양에 상응한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여횟수는 치료될 증상의 중증도 및 반응에 의존하지만 정상적으로 1일 1회 이상의 투여일 것이고 치료 기간은 수일 내지 수개월동안 지속되거나 치유가될때까지 또는 질환 상태가 완화될때까지 지속될 것이다. 당업자는 용이하게 최적 투여량, 투여 방법 및 반복 비율을 결정할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여가능한 투여 형태에 대한 약제학적 제제는 투여당 적어도 25 내지 250mg에 상당하는 양 또는 투여당 적어도 50 내지 350mg에 상당하는 양 또는 투여당 적어도 50 내지 150mg에 상당하는 양 또는 투여당 적어도 25 내지 250mg에 상당하는 양 또는 투여당 적어도 50mg에 상당하는 양으로 NAC 아미드, 또는 제약학적으로 허용되는 이의 염, 에스테르 또는 유도체를 포함할 수 있다. NAC 아미드는 인간 및 비-인간 포유동물에 투여될 수 있다. 따라서 인간 및 수의학적 약물에 적용된다.
NAC 아미드의 적합한 에스테르의 예는 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 하이드록시에틸 에스테르, t-부틸 에스테르, 콜레스테릴 에스테르, 이소프로필 에스테르 및 글리세릴 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 아킬 및 아릴 에스테르를 포함한다.
일반적으로, 정자를 증대시키거나 정자, 난세포, 배아 또는 ESC를 배양하기 위해 적합한 배지는 균염 용액, 예를 들어, M199, 합성 난관 유체, PBS, BO, 시험-난황, 티로데, HBSS, Ham's F10, HTF, Menezo's B2, Menezo's B3, Ham's F12, DMEM, TALP, 어얼스 완충염, CZB, KSOM, BWW 배지 및 emCare 매질(PETS, Canton, Tex)이다. 한 양태에서, M199 배지는 난세포를 배양하기 위해 사용된다. 특정 양태에서, TALP 또는 HTF는 정자 배양 배지를 위해 사용되고 CZB는 배아 배양 배지용으로 사용된다.
난세포 또는 배아용 배양 배지내 NAC 아미드 농도의 적정 범위는 적절할 경우 001 내지 15% 또는 0.001 내지 10%, 또는 0.001 내지 5%, 또는 0.01 내지 5% 또는 0.05 내지 1%, 또는 0.05 내지 0.5%, 또는 0.1 내지 5% 또는 0.1 내지 1%이다. 임의로, 아미노산(예를 들어, 글루탐산)과 같은 기타 첨가제가 존재할 수 있다. 일반적으로, 첨가제는 거대분자, 완충제, 항생제, 및 가능하게는 수정이 성취되어야만 하는 경우 정자 자극제를 제한없이 포함한다. 호르몬 또는 기타 단백질이 또한 첨가될 수 있다. 당해 호르몬 및 단백질은 황체 형성 호르몬, 에스트로겐, 프로게스테론, 여포 자극 호르몬, 인간 만성 생식선자극 호르몬, 성장 인자, 여포 유체 및 오비덕틴, 알부민 및 아미노산을 포함한다. 일반적으로, 배지는 또한 혈청 약 1% 내지 20%를 함유한다. 바람직하게, 혈청은 난세포 또는 배아 공급원과 같은 동일 동물 공급원으로부터 비롯된다. 정자, 난세포 또는 배아는 전형적으로 당해 배지내에서 5% CO2 및 37℃의 습한 대기에서 배양한다. 배양물은 체세포, 일반적으로 방사선 조사된 세포, 배양된 세포 또는 배양중 제한된 생존 기간을 갖는 세포(예를 들어, 흉선 세포)를 포함하는 영양세포 층을 추가로 포함한다.
기타 양태에서, 본 발명은 기능성 정자의 손실을 감소시키거나 난세포에 대한 세포 손상을 감소시키거나 냉장, 동결 또는 융화된 상태로의 저장으로부터 비롯된 배아 또는 ESC(배아 줄기 세포)에 대한 세포 손상을 감소시키는 방법을 포함한다. 당해 방법은 PCAGH를 정자, 난세포, 배아 또는 ESC를 함유하는 샘플과 손실 또는 손상을 감소시키는 유효량으로 배합하고, 이 샘플을 냉장, 냉동 또는 융화된 상태로 보관함을 포함한다.
NAC 아미드는 정자, 난세포, 배아 및 ESC에 대한 냉동보존 매질내 첨가제일 수 있다. 냉동보존 매질은 전형적으로 적가 방식으로 세포에 서서히 첨가된다. 당해 냉동보존 매질은 침투성 및 비침투성 화합물을 포함한다. 일반적으로 보통, DMSO, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 등이 사용된다. 기타 침투성 제제는 프로판디올, 디메틸포름아미드 및 아세트아미드를 포함한다. 비침투성 제제는 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 동결 억제 어류 또는 식물 단백질, 카복시메틸셀룰로스, 혈청 알부민, 하이드록시에틸 전분, 피콜, 덱스트란, 젤라틴, 알부민, 난황, 우유 생성물, 지질 비히클 또는 레시틴을 포함한다. 첨가될 수 있는 보조제 화합물은 당 알콜, 단순당(예를 들어, 슈크로스, 라피노스, 트레할로스, 갈락토스 및 락토스), 글리코사미노글리캔(예를 들어, 헤파린, 크론드로이틴 설페이트), 부틸화된 하이드록시 톨루엔, 세제, 자유 라디칼 스캐빈저, 추가의 산화방지제(예를 들어, 비타민 E, 타우린), 아미노산(예를 들어, 글라이신, 글루탐산) 및 플라보노이드 및 탁솔(바람직하게 0.5 내지 5㎛)을 포함한다. 정자 동결을 위해 글리세롤이 바람직하고 난세포, 배아 또는 ESC의 동결을 위해서는 에틸렌 글리세롤 또는 DMSO가 바람직하다. 전형적으로, 글리세롤은 3 내지 15%로 첨가되고; 기타 적합한 농도는 공지된 방법 및 분석을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 기타 제제는 전형적으로 약 0.1 내지 5%의 농도 범위로 첨가된다. 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 태아 소 혈청, 난황, 탈지유, 젤라틴, 카제인 또는 오비덕틴과 같은 단백질이 또한 첨가될 수 있다.
세포를 냉동보존 배지에 현탁시킨 후(예를 들어, 보관을 위해), 용기를 밀봉하고 이어서 냉장시키거나 동결시킨다. 간략하게, 냉장을 위해서, 샘플을, 물로 충전된 용기로 냉장고에 1시간동안 또는 온도가 4℃에 도달할때까지 위치시킨다. 이어서 샘플을 냉장 팩과 함께 스티로폼 용기에 위치시키고 정자의 경우 익일에 정액 주입을 위해 운송될 수 있다. 샘플이 동결되어야만 하는 경우, 냉각 샘플을 냉동바이엘에 분취하고 1 내지 2시간동안 액체 질소의 증기상에 위치시키고 이어서 장기 보관을 위해 액체 질소의 액체 상으로 찔러 넣거나 프로그램 가능한 컴퓨터화된 동결기내에서 동결시킨다. 동결된 샘플을 37℃ 수욕조에서 가온시켜 해동시키고 직접 정액 주입하거나 정액 주입 전에 세척한다. 기타 냉장 및 동결 프로토콜이 사용될 수 있다. 유리화는 당, 피콜등을 사용하여 난세포 또는 배아를 탈수시킴을 포함한다. 이어서 난세포 또는 배아는 동결보호제에 첨가되고 액체 질소에 신속하게 이동시킨다.
본 발명의 방법 및 조성물에 따라, 정자, 난세포 또는 배아를 상기된 바와 같이 제조하고 보관할 수 있다. 냉장은 일반적으로 단기 보관을 위해 적합한 수단인 반면 동결 또는 유리화는 일반적으로 장기 또는 단기 보관을 위해 적합한 수단이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 동물의 수정능력을 증가시킨다. 이들 방법은 일반적으로 인간, 소, 개, 말, 돼지, 양, 조류, 설치류 및 기타의 것을 포함하는 많은 종에 적용될 수 있다. 수정이 요망되는 경우 유용하지만 본 발명은 수정 기능부전인 동물 및 인간에서 착상 가능성을 증가시키기 위한 특정 용도를 갖는다. 당해 기능부전은 낮은 수의 정자, 감소된 정자의 운동성 및 비정상적인 정자 형태를 포함한다. 이들 기능부전 뿐만 아니라 본 발명의 방법 및 조성물은 인공 정액 주입 과정에서 유용하다. 종종, 상업적 육종에서, 수컷 및 암컷은 지정학적으로 멀리 있어서 정액 주입을 위해 정자를 운송해야 한다. 정자 샘플을 수득하고 정액을 주입하는 사이의 연장된 시간 공백 때문에, 냉장되거나 냉동된 상태로 운송할 필요가 있다. 더욱이, 특히, 가치있고 희귀 동물에 대해서는 장기 보관이 요망될 수 있다. 인간에 대해서는, 지정학적 거리 또는 시간을 고려한 정자의 보관이 필요할 수 있다. 방사선 처리가 치료의 일부인 질환을 앓거나 정관절제술 전의 남성의 경우 향후 사용하기 위해 정자를 보관할 필요가 있다. 동결 보관 후, 생식 세포는 흔히 최종 사용 동안에 배양한다. 배양 중인 생식 세포의 생존 및 건강은 NAC 아미드를 배양물 및/또는 냉동보존 배지에 첨가하여 개선될 수 있다.
본 발명에 따른 윤활제는 정자 수거, 질외 및 인공 정액 주입을 포함한 모든 상황에 대해 유용하다. 현재, 정자 수거는 임의의 윤활제 없이 수행되는데 이는 시판되는 윤활제 및 타액의 살정성 성질때문이다[문헌참조: Goldenberg et al., Fertility and Sterility 26:872-723, 1975, Scoeman & Tyler, J. Reprod. Fert. 2:275-281, 1985, Miller et al., Fert. and Steril. 61:1171-1173, 1994]. 정자 기능을 개선시키고 잠재적인 수정능을 증가시키기 위해 NAC 아미드 함유 비-살정성 윤활제를 사용하는 것이 공여자의 위안을 위해 요망될 수 있다. 이와 같이, 윤활제는 콘돔 또는 기타 수거 장치, 예를 들어, 카테터 또는 바이엘에 적용될 수 있다. 또한 불임 커플에는 흔히 윤활제가 필요하다. 그러나, 윤활제는 살정성이기때문에 이들의 사용은 추천되지 않는다. 이들 경우에, 적용기의 부재 또는 존재하에 질내에 윤활제를 적용하는 것이 요망될 수 있고 이로울수 있는데 이는 정자 기능이 증가될 것이기 때문이다. 유사하게, 윤활제는 인공 정액 주입 전에 질내에 적용되어 착상 기회를 개선시킬 수 있다.
배양, 수정 및 성숙화 매질에 NAC 아미드의 보충은 난세포, 정자 및 배아의 생명력, 생존력, 정상적인 활동 및 기능이 이들이 시험관내 수정 및 배아 발달 전, 동안 및 후에 배양되는 시간동안 및 암컷에 전달하기 전에 지속될 수 있도록 해주는 환경을 제공한다. NAC 아미드가 기타 산화방지제, 예를 들어, GSH 및 NAC 보다 우수하다는 것은 본원의 실시예 1에 의해 지지된다. 배아용 성숙화 배지중의 보충물로서 NAC 아미드의 사용을 포함하는 본 발명은 대조군인 비보충된 배지와 비교하여 배아가 계속 발달할 수 있도록 해주고 배반포 단계까지 개선된 기능을 갖도록 해준다(실시예 1).
하기의 실시예는 본 발명을 추가로 기재하지만 어떠한 방식으로든지 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 돼지 난세포 성숙화, 수정 및 배아 배양동안에 배양 및 배양 배지에 NAC 아미드, 글루타치온(GSH) 및 N-아세틸시스테인(NAC)을 보충하여 나타나는 GSH의 세포내 농도 뿐만 아니라 수정 및 배아 발달의 다양한 판정에 대한 효과를 평가한다.
실험 디자인: 3개의 시험을 수행하였고, 각 시험은 처리 그룹당 30마리의 돼지 난세포(4개의 각각의 처리 그룹당 총 90마리의 난세포)를 사용한다. 난세포는 제조원(Trans Ova Genetics, Sioux City, IA)로부터 구입하였다. 처리군은 1) 대조군(비보충 산화방지제); 2) GSH 보충(1.0mM); 3) NAC 보충(1.0mM) 및 4) NAC 아미드 보충(1.0mM)이다.
화학물질: 달리 특정되지 않는 경우, 모든 화학물질은 제조원[Sigma Chemical Company(St. Louis, MO)]로부터 구입하였는데, 이들은 배아 등급의 품질이다. NAC 아미드는 골드슈타인 글렌 박사가 제공하였다. NAC 아미드는 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 아틀라스등의 미국 특허 제6,420,429호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
시험관내 성숙화: 난세포는 39℃ 및 5% CO2 대기에서 무기 오일(Specialty Media, Phillipsburg, NJ)하의 얼스 염, 0.01U/ml LH 및 FSH, 10ng/ml EGF, 항생제 및 10% 태아 소 혈청을 갖는 조직 배양 배지 199에서 2 내지 24시간동안 성숙화시키고, 이어서 호르몬 없이 20 내지 24시간동안 추가로 성숙화시켰다.
난세포의 시험관내 수정(IVF): 난구 세포는 0.1% 하이알루로니다제와 진탕시켜 제거하고 세척하며 무기 오일 오버레이를 갖는 트리스-수정 배지(113.1mM NaCl, 3mM KCl, 7.5mM CaCl2ㆍ2H2O, 20mM Tris, 11mM D(+)-글루코스, 5mM 나트륨 피루베이트, 1mg/ml BSA, 2mM 카페인)중에 위치시키고 동결 해동된 정자를 난세포당 2000개 정자의 농도로 첨가하였다. 생식자를 약 6시간동안 5% CO2 대기에서 39℃에서 배양하였다.
시험관내 수정 파라미터 평가: IVF 12시간 후, 실온에서 48시간동안 에탄올중의 25%(v:v) 아세트산을 사용하여 난세포를 현미경 슬라이드에 고정시킴에 의해 수정화를 분석하였다. 난세포는 45%(v:v)의 아세트산중의 1% 오르세인으로 염색시키고 400X 배율에서 상 대비 현미경을 사용하여 조사하였다.
시험관내 배양: 추정 수정란을 세척하고 39℃, 5% CO2 대기에서 48시간동안 광유 오버레이를 갖는 NCSU-23 배양 배지(108.73mM NaCl, 4.78mM KCl, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4ㆍ7H2O, 5.5mM 글루코스, 1mM 글루타민, 7mM 타우린, 5mM 하이포타우린, 25.07mM NaHCO3, 1.7mM CaCl2ㆍH2O, 75㎍/ml의 페니실린 G, 50㎍/ml의 스트렙토마이신, 4mg/ml의 BSA, pH 7.4)중에서 배양하였다. 48시간 후에, 제1 세포 분열이 일어난 배아를 IVF 후 144시간의 배반포 형성때까지 상기된 바와 동일한 방식으로 신선한 NCSU 23 배양 배지에 위치시킨다.
글루타치온 분석: 난세포를 PBS로 세척하고 동결시키고 인산중의 무딘 유리 막대를 사용하여 파열시킨다. 당해 분석은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였고(문헌참조: B.D. Whitaker and J.W.Knight, 2004, Theriogenology, 62:311-322) GSH의 양은 GSH 농도에 대한 흡광도의 변화 비율에 대한 표준 곡선을 사용하여 결정하였다.
표 1은 pmol로서 표현되는 난세포당 세포내 GSH 농도를 요약하고 있다. NAC 아미드의 보충은 대조군과 비교하여 GSH의 세포내 농도를 2.2배 증가시켰다. 조사된 보충물중에, NAC 아미드는 GSH 자체의 보충과 비교하여 세포내 GSH를 40% 초과로 증가시켰고 NAC 보충물과 비교하여 GSH의 세포내 농도를 15% 초과로 증가시켰다.
처리 GSH 농도/난세포(pmol)
대조군 3.19
GSH 4.18
NAC 6.00
NAC 아미드 7.03
NAC 아미드 및 NAC는 대조군 보다 상당히 고량이다(P < .05). NAC 아미드는 GSH 보다 상당히 고량이다(P <.05).
수정 파라미터는 IVF가 완료된 후 12시간째에 각각의 처리 그룹으로부터의 추정 수정란의 핵 염색 샘플(n=4)에 의해 주관적으로 조사하였다(도해 1, *은 전핵(pronucleus)을 나타낸다). 예비 분석에서, 본원에 기재된 연구의 의도는 2-세포 및 배반포 단계까지 계속 발달한 수정란의 수를 평가하는 것이었기 때문에 단지 소수의 수정란을 염색시켰다. 당해 분석은 단순히 임의의 명백한 비정상증이 나타나는지를 관찰하기 위한 것이었다. 배지로의 GSH, NAC 또는 NAC 아미드의 보충은 예비적으로 핵 염색시킨 소수의 수정란을 기준으로 수정 반응에 어떠한 명백한 변화를 나타내지 못했다.
글루타치온이 난세포-정자 복합체를 촉진시켜 IVF 후 수컷 전핵을 발달시킨다는 문헌 보고와 함께 난세포내 글루타치온 농도의 증가가 다정수정의 빈도를 감소시킨다는 이전의 관찰 내용을 토대로[문헌참조:B.D. Whitaker and J.W.Knight, 2004, Theriogenology, 62:311-322], NAC 아미드가 이들 과정에 이로운 역할을 수행할 수 있음이 고무적이다.
잔류 수정란은 이들 각각의 배지에서 배반포 발달 단계(148시간)를 거치도록 배양하고 이들의 발달 및 생존력의 진행을 기록하였다(표 2). 배양 배지의 NAC 아미드 보충물은 수정란의 발달을 2-세포 단계까지 증진시켰고, 추가로 후속적인 최종 %의 배아가 배반포 단계(시험관내 분석의 종점)까지 계속 발달된 2-세포 단계에 도달하도록 도와주었다.
처리 2-세포 발달 단계에 도달하는 배아 % 배반포 발달 단계에 도달하는 % 배아(2-세포 단계에서 관찰되는 것들중)
대조군 19 40
GSH 25 40
NAC 30 55
AD4 45 85
NAC 아미드는 2-세포(P<.05) 및 배반포(P<.10) 단계로 발달하는 배아의 %를 상당히 증가시켰다.
실시예 1의 연구 결과는 배양 배지의 NAC 아미드로의 보충이 글루타치온의 세포내 농도를 상당히 증가시켰음을 보여준다. 이러한 사실은 세포내 글루타치온 농도의 증가가 산화성 스트레스를 감소시킬 것이고 이에 따라서 수정 과정 및 조기 배아 발달이 증진될 것임을 시사하는 많은 증거가 있기때문에 생물학적으로 중요한 발견이다. 본 실시예에 제공된 발견은 NAC 아미드가 보충된 배지는 2-세포 배아가 되도록 갈라지는 수정란의 %를 증가시켰음을 입증한다. 가장 중요하게, NAC 아미드가 보충된 배지에서 배양된 배아의 85%가 계속 종점까지 발달하여 배반포 발달 단계에 도달하게 된다. 이것은 배반포 단계로 발달되는 대조군(비보충된) 배아에서의 퍼센트 보다 2배 초과되었다.
조사된 3개의 산화방지제(GSH, NAC 및 NAC 아미드)중에, NAC 아미드가 2개의 천연적으로 존재하는 생성물보다 일관되게 더욱 효과적이 었다. 이들 결과는 GSH 자체(기타 γ-글루타밀 사이클 화합물에 대해)가 약간 효과적(비보충된 대조군 배지와 비교하여)이라는 기타 연구 결과와 유사하다[문헌참조: B.D.Whitaker and J. W. Knight, 2004, Theriogenology, 62:311-322]. NAC 보충이 측정된 모든 파라미터를 증진시키지만 이는 NAC 아미드 보다는 그 정도가 약하다.
지금까지 이들 결과는, 난세포에서 글루타치온의 세포내 농도를 증가시켜 NAC 아미드가 시험관내 시스템에서 난세포 질, 수정 및 배아 생존력을 감소시키는 산화성 스트레스를 감소시킴을 강하게 시사한다.
실시예 2
본 실시예는 정자 기능/수정 잠재력을 평가하는데 사용되는 다양한 분석 및 방법을 기재한다. 추가의 기재는 제이.이.엘링턴 등의 미국 특허 제6,593,309호에서 찾을 수 있다. 정자 운동성은 정자 기능 및 이에 따른 수정 잠재력을 평가하는데 사용될 수 있는 한가지 기능이다. 정자 운동성은 운동성 정자의 총 %, 점진적으로 운동성인 정자(앞으로 유영)의 총 % 또는 점진적으로 운동성인 정자의 속도로서 표현된다. 이들 측정은 다양한 분석에 의해 수행될 수 있지만 2개의 방식중 하나로 분석되는 것이 간편하다. 주관적 가시적 측정은 정자가 혈구측정기내 또는 현미경 슬라이드상에 위치하는 경우 상 대비 현미경을 사용하여 수행되거나, 컴퓨터 보조 정액 분석기를 사용한다. 상 대비 현미경하에, 운동성 및 전체 정자를 계수하고 빠른, 중간 또는 느린으로서 속도를 평가한다. 컴퓨터 보조 정액 분석기(Hamilton Thorn, Beverly, Mass.)를 사용하여 샘플내 각각의 정자 세포들의 운동성 특징을 객관적으로 측정한다. 분석기는 각각의 정자 세포를 추적하고 정자의 운동성 및 속도를 측정한다. 데이타는 운동성 %로서 표현되며, 측정치는 패스 속도 및 트랙 속도를 얻기 위한 것이다.
정자 생존력은 여러 상이한 방법중 하나로 측정한다. 예를 들어, 이들 방법중 2개는 막 배제 염색으로 염색하고 ATP 수준을 측정하는 것이다. 간략하게, 정자 샘플을 생존성 염료, 예를 들어, Hoechst 33258 또는 에오신-니그로신 염료로 항온처리한다. 세포를 혈구세포측정기내에 위치시키고 현미경으로 조사하였다. 막이 붕괴되어 죽은 정자를 당해 염료로 염색한다. 염색되지 않은 세포 수를 계수된 총 세포 수로 나누어 생존 세포 %를 구한다. 정자 샘플내 ATP 수준은 정자를 용해시키고 용해물을, ATP 존재시 형광을 나타내는 루시페라제 효소와 함께 항온처리하여 측정한다. 형광은 형광측정기(정자 생존력 시험: Firezyme, Nova Scotia, Canada)로 측정한다. 샘플내 형광의 양을 표준 곡선에서의 형광 양과 비교하여 샘플내 존재하는 생존 정자 수를 측정한다.
정자의 막 통합성은 전형적으로 비-등장성 환경에 노출되는 경우 물 또는 염을 펌핑하는 정자의 능력을 측정하는 저장액(hypo-osmotiz) 팽창 검사에 의해 분석한다. 간략하게, 저장성 팽윤 시험에서, 정자는 저장성(150mOsm) 용액인 75mM 프럭토스 및 25mM 나트륨 시트레이트의 용액에 현탁시킨다. 온전하고 건강한 막을 갖는 정자는 염을 세포 밖으로 펌핑하여 세포가 보다 작아짐에 따라 막이 오그라지게 된다. 정자 꼬리는 이러한 촘촘해진 막 내부로 휘감긴다. 따라서, 구부러진 꼬리를 갖는 정자는 정상적인 막을 갖는 생존하는 건강한 정자로서 계수된다. 존재하는 정자의 총수와 비교하는 경우, 기능성 정자의 %를 설정할 수 있다.
막 통합성 정도는 바람직하게, 취급동안에 방출되는 자유 라디칼에 의해 생성된 정자 막 손상을 평가하는 지질 과산화(LPO)를 측정하여 결정한다. 지질 막 과산화는 정자를 37℃의 수욕조에서 1시간동안 황화철 및 아스코르브산으로 항온처리하여 분석한다. 빙냉 트리클로로아세트산으로 단백질을 침전시킨다. 상등액을 원심분리로 수거하고 티오바르비투르산 및 NaOH와 비등시켜 반응시켰다. 수득한 말론디알데하이드(MDA) 형성은 MDA 표준물과 비교하여 534nm에서 흡광도를 측정하여 정량한다[문헌참조: M. Bell et al., J. Andrology 14:472-478, 1993]. LPO는 nM MDA/108 정자로서 표현된다. PCAGH의 안정화 효과는 LPO 생성을 감소시킨다. 본 발명에 따라, 정자가 위치하는 배지 또는 환경내에 사용되는 경우, NAC 아미드는 취급동안에 정자가 접하게 되는 산화성 스트레스(과산화)를 감소시키거나 완화시킬 수 있다.
염색질 DNA의 안정성은 정자 염색질 민감성 분석(SCSA)를 사용하여 분석한다. 당해 분석은 488nm 광으로 여기시킨 후 아크리딘 오렌지 염색에 의한 일본쇄 및 이본쇄 DNA의 이염소체(metachromatic) 염색을 기초로한다. 녹색 형광은 이본쇄 DNA를 나타내고 적색 형광은 일본쇄 DNA를 나타낸다. 샘플내 DNA 변성 정도는 "α"로서 나타내고 수학식 α= 적색/(적색 + 녹색)에 의해 계산한다. 모든 경우에, 정자는 TNE 완충액(0.01M 트리스 아미노메탄-HCl, 0.015M NaCl 및 1mM EDTA)과 혼합하고 급속 동결시킨다. 이어서 정자 샘플은 0.01% 트리톤-X, 0.08N HCl 및 0.15M NaCl에 적용하여 비정상적인 염색질을 갖는 정자내 DNA를 부분적으로 변성시킨다. 정자를 6g/ml의 아크리딘 오렌지로 염색하고 유동 세포측정기에 통류시켜 "α"를 결정한다.
시험관내 수정율은 시험관내 난세포 수정율 %를 측정하여 결정한다. 성숙한 난세포를 22시간동안 M199 배지 + 7.5% 태아 소 혈청 및 50㎍/ml의 황체 형성 호르몬중에서 시험관내 배양한다. 4시간동안 배양 한 후, 10IU 헤파린을 첨가하여 정자를 화학적으로 기능성이 되게하고 24시간동안 난세포와 함께 배양한다. 배양 말기에, 난세포를 아세토-오르세인 염료 또는 이의 등가물로 염색시켜 수정된 난세포 %를 측정한다. 또한, 수정된 난세포는 2일동안 배양물에 방치할 수 있고 이 시간동안에 분열이 일어나고 갈라지는 배아의 수(즉, 2개 이상의 세포)를 계수한다.
정자 배양물에서 생존 시간(운동성이 상실되는 시간)은 정자 기능을 설정하는 또 다른 간편한 방법이다. 이러한 파라미터는 주어진 수컷의 실제 수정능과 잘 관련된다. 간략하게, 분취량의 정자를, Tyrode's 배지와 같은 배양 배지(pH 7.4)에 위치시키고 습한 대기에서 37℃, 5%CO2에서 배양한다. 정해진 간격으로, 예를 들어, 8시간 마다 배양물내 운동성 정자의 %는 역위 현미경 또는 컴퓨터 보조 정자 분석기를 사용하는 가시적 분석에 의해 결정한다. 마지막 시점에서, 5% 미만의 세포가 진행 운동성을 갖는 경우, 정자 샘플은 더 이상 생존하지 않는 것으로 간주된다.
정자 기능의 또 다른 파라미터는 자궁 점막 침투 능력이다. 이러한 침투 시험은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 간략하게, 시험관내, 자궁 점막, 전형적으로 소 자궁 점막을 함유하는 시판용 키트(Tru-Trax, Fertility Technologies, Natick, Mass)를 제조한다. 정자를 트랙의 한 말단에 위치시키고 정자가 주어진 시간 후에 점막으로 침투하는 거리를 측정한다. 또한, 점막의 정자 침투는 암컷의 생체내에서 측정할 수 있다. 질외 주입후 다양한 시점에서, 자궁 점막의 샘플을 제거하고 샘플내 존재하는 정자의 수를 현미경으로 조사한다. 질외 주입 후 시험에서, 보다 빠른 속도를 갖는 정자가 대조군 윤활제로의 노출 후 환자 기원의 점막 샘플 보다 PCAGH 윤활제에 노출 후 점막 샘플에서 더 많이 관찰되는 경우 정자 기능이 개선된 것이다.
정자 기능 잠재력의 또 다른 분석은 정자 침투 및 반투명대 분석을 포함한다. 정자 침투 분석에서, 정자가 난세포로 침투하는 능력을 측정한다. 간략하게, 시판되는 투명대(zona) 부재 햄스터 난세포를 사용한다(Fertility Technologies, Natick, Mass). 햄스터 난세포는 임의의 종의 정자에 대한 분석에서 적합하다. 18시간동안 소 혈청 알부민과 함께 배양된 것들과 같은 기능화된 정자를 햄스터 난세포와 함께 3시간동안 배양한다. 배양 후, 난세포를 아세토락모이드 또는 이의 등가물 염료로 염색시키고 각각의 난세포를 침투하는 정자의 수를 현미경으로 계수한다. 반투명대 분석은 정자가 기능화되어 난세포에 결합하는 능력을 측정한다. 간략하게, 당해 분석에서, 생존하는 정상적인 정자는 기능화를 유발하는 소 혈청 알부민을 갖는 배지에서 배양한다. 이어서 정자는 난세포의 비세포 피복물인 투명대에 의해 둘려싸여진 죽은 난세포와 함께 항온처리한다. 기능화된 정자는 투명대에 결합하고 정자의 결합 수를 현미경으로 계수한다.
실시예 3
본 실시예는 정자 및 정자 함유 샘플을 세척하고 분리하여 정자가 풍부한 샘플 및 대부분의 정자가 운동성인 샘플을 수득하기 위한 방법을 기재한다. 당해 샘플은 기능이 개선된 정자를 함유한다. 정자는 정자 함유 샘플을 폴리사카라이드-함유 용액과 접촉시켜 세척하고 여기서, 폴리사카라이드는 아라비노갈락탄이 아니다(문헌참조: 제이.이.엘링톤의 미국 특허 제6,593,309호). 정자 함유 샘플을 폴리사카라이드(여기서, 폴리사카라이드는 아라비노갈락탄이 아니다)를 포함하는 배지 용액과 접촉시키고 혼합물을 정자를 분리하기에 충분한 조건에 적용함에 의해 분리한다. 당해 배지는 Tyrode's 알부민 락테이트 포스페이트(TALP), 인간 관 유체(HTF; Fertility Technology, Natick, Mass), Ham's F10, Ham's F12, Earle's 완충 염, 비거스, 휘텐 및 휘팅햄(BWW), CZB, T6, Earle's MTF, KSOM, SOF 및 Benezo's B2 또는 B3 배지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 배지의 조성은 널리 공지되어 있고 예비 제형화된 배지는 구입할 수 있다(예를 들어, 제조원: Gibco Co. or Fertility Technologies, Natick, Mass.). 추가로, 양쪽성 완충제(예를 들어, MOPS, PIPES, HEPES)가 첨가될 수 있다. 폴리사카라이드는 정자를 분리하고 세척하기 위해 펙틴, 구아검 또는 아라비아 검을 포함할 수 있다. 아라비아 검은 약 20%로 첨가되거나 구아검은 약 5%로 첨가된다. NAC 아미드는 산화방지제 성분으로서 첨가될 수 있다.
이들 배지는 용액이 균염 용액으로 유지되는 한 거대분자를 추가로 함유할 수 있다. 당해 거대분자는 폴리비닐 알콜, 알부민(소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민), 오비덕틴(Gandolfi et al., Repro. Fert. Dev. 5:433, 1993), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 비타민 E, 젤라틴, 하이알루론산, 카탈라제, 난황, 카세인 또는 기타 단백질을 포함한다. 알부민 또는 젤라틴은 일반적으로 0.5%로 첨가되고 하이알루론산 또는 폴리비닐 알콜은 1.0%로 첨가된다; 기타 거대분자는 유사한 농도(예를 들어, 0.05 - 5%)로 첨가된다. 정자 분리 배지는 원심분리용 밀도 구배 화합물 또는 유영 증진 분리 방법용의 거대분자 뿐만 아니라 하나 이상의 폴리사카라이드를 약 0.01 - 5%(예를 들어, 0.1-5%, 0.1-1%, 1%-5%)로 함유한다. 밀도 구배 물질은 일반적으로 5 - 90%의 농도로 첨가된다. 당해 물질은 덱스트란, 요오딕산올, 슈크로스 중합체, 니코덴즈 또는 폴리비닐피롤리돈 피복된 실리카(즉, 퍼콜)을 포함한다. 전형적인 응용에 있어서, 정자 함유 용액은 구배 물질, 바람직하게는, 30 내지 90%에서 퍼콜상에 적층시키고 0.05% 펙틴과 혼합시킨 다음, 원심분리시켜 기능이 개선된 정자를 수거한다. 정자를 분리하기 위해, 정자 유영 증진이 사용되는 경우, 상기된 바와 같은 거대분자를 첨가한다. 바람직하게, 1 내지 10mg/ml의 하이알루론산을 사용한다. 이들 임의의 과정에 사용되는 배지는 균염 용액을 추가로 포함할 수 있다.
정자는 세척하거나 정자 함유 배지 혼합물을 샘플 기원의 목적하는 정자를 분리하기에 충분한 조건에 적용하여 분리한다. 간략하게, 세포를 짧은 시간에서 4시간동안의 항온처리까지 세포를 용액내 위치시켜 용액과 접촉시킨다. 바람직하게, 접촉이 일어나는 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃이다. 이러한 초기 접촉 후, 원심분리, 유영 증진, 분리 칼럼 등과 같은 상이한 방법을 사용하여 정자를 분리할 수 있다. 예를 들어, 그러한 하나의 방법은 정자 샘플을, 폴리사카라이드, 특히, 문헌[제이.이.엘링톤의 미국 특허 제6,593,309호]에 기재된 바와 같은 PCAGH를 포함하는 용액의 연속 농도 구배를 통해 원심분리하는 것이다. 당해 방법에서, PCAGH를 포함하는 용액을 원심분리 튜브에 위치시키고, 정액 샘플 또는 정자 세포를 대략적으로 1부 정액(또는 샘플) 대 1부 배지의 비로 배지상에 적층시킨다. 당해 튜브를 10 내지 20분동안 약 300 x g에서 원심분리한다. 기능이 개선되어 수정 잠재력이 증진된 정자가 풍부한 분획물을 튜브 바닥에서 펠렛으로 회수한다. PCAGH는 정자에 비독성이기 때문에, PCAGH를 제거하기 위한 후속하는 세척 단계를 필요로 하지 않는다. 분리는 상기 세척 과정과 유사한 방법으로 수행할 수 있다. 그러나, PCAGH 용액은 정자 샘플하에 적층될 수 있거나 퍼콜과 같은 밀도 구배의 상부에 적층될 수 있거나 퍼콜 농도 구배에 직접 혼합될 수 있다. 또한, 정자는 유영 증진 방법으로 분리한다. 간략하게, 정자 유영 증진 튜브를 1.5ml의 세척 매질을 12 x 75mm 환저 튜브에 위치시켜 제조한다. 정자는 27게이지 바늘 및 1ml의 주사기를 사용하여 1부 정자 현탁액 대 2부 세척 배지로 당해 세척 배지하에 적층시킨다. 당해 튜브를 1시간동안 방치한다. 항온처리 후, 세척 배지(운동성 정자의 유영이 증진된)를 제거하고 300x g에서 10분동안 원심분리한다. 이어서 운동성 정자의 최종 펠렛을 분석 또는 사용을 위해 회수한다. 칼럼 분리와 같은 기타 방법이 또한 사용될 수 있다. 정자는 추가로 정자 분리후, 예를 들어, 퍼콜 농도 구배를 통한 원심분리에 의해 세척될 수 있다. 정자 세척은 정자를 한 용액에서 다른 용액으로 이전시키는데 사용될 수 있다. 임의의 이들 방법을 위해, 당해 샘플은 정액, 부분적으로 정제된 정자 또는 정제된 정자일 수 있다. 더욱이, 본 발명에 적합한 정자는 인간, 소, 개, 말, 돼지, 양, 설치류, 조류, 또는 사자, 호랑이, 기린, 원숭이, 얼룩말, 팬더, 재규어, 코끼리, 코뿔소등과 같은 외래 동물을 포함하는 동물 종으로부터 수득될 수 있다.
실시예 4
본 실시예는 돼지 난세포 성숙화, 수정 및 배아 배양동안에 난세포 성숙화 후의 GSH의 세포내 농도, IVF 파라미터, 세포질내 정자 주입(ICSI) 성공, 및 ICSI 및 전핵 미세주사 후 배아 발달에 대한, 배양 배지로 보충되는 NAC 아미드의 효과를 조사한다.
달리 특정되지 않는 경우, 모든 화학물질은 제조원[Sigma Chemical Company(St. Louis, MO)]으로부터 구입하였고 배아 등급 품질의 것이었다. 골드슈타인 글렌 박사 및 이의 동료가 NAC 아미드를 제공하였다. 난세포(BoMed, Madison, WI)를 무기 오일하에 Earle's 염, 0.01U/ml LH 및 FSH, 항생제 및 10% 태아 소 혈청이 보충된 조직 배양 배지 199(Specialty Media, Phillipsburg, NJ)에서 39℃, 5% CO2 대기에서 20 내지 24시간에 이어서 호르몬 부재하에 추가로 20 내지 24시간동안 성숙화시켰다.
시험관내 성숙화 후, 난구 세포를 0.1% 하이알루로니다제를 함유하는 성숙화 배지에서 반복적으로 피펫팅하여 난세포로부터 제거하였다. 이어서 난세포를 10mM EDTA(pH 7.2)를 함유하는 0.2M 인산나트륨 완충액의 100㎕ 적가물에서 세척하였다. 약 30개의 난세포를 10mM EDTA(pH 7.2)를 함유하는 5㎕의 0.2M 인산나트륨 완충액을 사용하여 1.5ml의 미세원심분리 튜브(Fischer Scientific, Pittsburgh, PA)로 이전시키고 분석이 수행될때까지 -80℃에 보관하였다. 각각의 튜브는 1.25M 인산 5㎕를 함유하였고 난세포를 무딘 유리 막대를 사용하여 파열하였다. 각 튜브의 내용물을 각각의 웰 분광측정기 튜브에 첨가하였다. 본 분석을 문헌[B.D. Whitaker and J.W. Knight, 2004, Theriogenology, 62:311-322]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 샘플의 흡광도를 총 10분동안 412nm에서 분광측정기를 사용하여 연속으로 판독하였다. 이어서 GSH의 양을 흡광도 변화율에 대한 GSH 농도의 표준 곡선을 사용하여 결정하였다.
난구 세포를 0.1% 하이알루니다제와 진탕시켜 제거하고 세척하고 무기 오일 오버레이를 갖는 트리스-수정 배지(113.1mM NaCl, 3mM KCl, 7.5mM CaCl2ㆍ2H2O, 20mM Tris, 11mM D(+)-글루코스, 5mM 나트륨 피루베이트, 1mg/ml BSA, 2mM 카페인)중에 위치시키고 동결 해동된 정자를 난세포당 2000개 정자의 농도로 첨가하였다. 생식자를 약 6시간동안 5% CO2 대기 중의 39℃에서 배양하였다.
수정은 난세포를, 실온에서 48시간동안 에탄올 중의 25%(v:v) 아세트산을 사용하여 현미경 슬라이드상에 고정시킴에 의해 IVF 후 12시간째에 분석하였다. 난세포를 45%(v:v) 아세트산중의 1% 오르세인으로 염색시키고 400X 배율로 상-대비 현미경을 사용하여 조사하였다.
난구 세포를 0.1% 하이알루로니다제와 진탕시켜 제거하고 세척하며 15000 x g에서 원심분리 한 후 39℃에서 무기 오일 오버레이를 갖는 NCSU-23 배양 배지(108.73mM NaCl, 4.78mM KCl, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4ㆍ7H2O, 5.5mM 글루코스, 1mM 글루타민, 7mM 타우린, 5mM 하이포타우린, 25.07mM NaHCO3, 1.7mM CaCl2ㆍ2H2O, 75㎍/ml의 페니실린 G, 50㎍/ml의 스트렙토마이신, 4mg/ml의 BSA, pH 7.4)의 미세적가물에 위치시켰다. 이어서 동결 해동된 정자를 인접 미세적가물에 위치시켰다. 나리쉬게(Narishige) 조작기 및 호프만 조절기 광학렌즈가 장착된 니콘 역상 현미경을 사용하여 파라핀 오일하에 10㎕ 점적의 HbT에서 조작하였다. 난세포를 외부 직경이 약 200㎛이고 내부 직경이 약 50㎛인 홀딩 피펫으로 안정화시켰다. 정자를 외부 직경이 8 내지 9㎛이고 내부 직경이 6㎛인 PiezoDrill 미세피펫(Humagen, Charlottesville VA)을 사용하여 주사하였다. 난세포의 극체를 6시 또는 12시에 위치시키고 주사 시점은 3시였다. 미세피펫을 각각의 난세포를 주입하여 침투시키고 소량의 세포질을 미세피펫내로 인출하여 난세포가 침투되게 하였다. 이어서, 하나의 정자 및 소량의 배지와 함께 세포질을 난세포에 주사하였다. 난세포질 주사 후 바로, 주사 피펫을 신속하게 빼내고 홀딩 피펫으로부터 난세포를 방출시켜 세포질내 압력을 감소시켰다.
추정 수정란을 세척하고 39℃, 5% CO2의 대기하에 48시간동안 무기 오일 오버레이를 갖는 NCSU-23 배양 배지(108.73mM NaCl, 4.78mM KCl, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4ㆍ7H2O, 5.5mM 글루코스, 1mM 글루타민, 7mM 타우린, 5mM 하이포타우린, 25.07mM NaHCO3, 1.7mM CaCl2ㆍ2H2O, 75㎍/ml의 페니실린 G, 50㎍/ml의 스트렙토마이신, 4mg/ml의 BSA, pH 7.4)에서 배양하였다. 48시간 후, 제1 세포 분열이 일어난 배아를 배반포 형성(IVF 후 144시간) 때까지 상기된 바와 동일한 방식으로 신선한 NCSU 23 배양 배지에 위치시켰다.
여기서의 결과는 NAC 아미드 보충물이 대조군과 비교하여 우수한 결과를 산출함을 보여준다.
처리 수정 방법 난세포 총 수 2-세포 발달 단계예 도달하는 배아의 수 배반포 발달 단계에 도달하는 배아의 수
대조군 IVF 67 10 6
NAC 아미드 IVF 70 22 12
대조군 ICSI 25 5 2
NAC 아미드 ICSI 24 12 5
상기 방법 및 조성물에는 기재된 본 발명의 범위 및 취지에서 벗어나지 않고 다양한 변화가 이루어 질 수 있기 때문에, 상기 기재에 포함되고 첨부된 도면에 나타내고 첨부된 청구항에 정의된 모든 내용은 설명을 위해 제공된 것이지 이를 제한하기 위한 것이 아니다.

Claims (56)

  1. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 산화성 스트레스를 감소시키거나 방지하는데 유효한 양으로 함유하도록 보충된 배지내에서 난세포, 정자 또는 배아 중 하나 이상을 배양함을 포함하는, 시험관내에서 배양된 난세포, 정자 또는 배아 중 하나 이상에서 산화성 스트레스를 감소시키거나 방지하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 난세포, 정자 또는 배아 중 하나 이상이 비-인간 동물 기원인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 난세포, 정자 또는 배아 중 하나 이상이 인간 기원인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 난세포, 정자 또는 배아 중 하나 이상이 형질 전환(transgenic) 동물 기원인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 배지가 GM-CSF와 함께 NAC 아미드를 함유하도록 보충되는 것인 방법.
  6. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 자유 라디칼 형성을 감소시키거나 방지하는데 유효한 양으로 함유하도록 보충된 배지내에서 난세포를 배양함을 포함하는, 시험관내에서 배양된 난세포에서 자유 라디칼 형성을 감소시키거나 방지하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 난세포가 비-인간 동물 기원인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 난세포가 인간 기원인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 난세포가 형질 전환 동물 기원인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 배지가 GM-CSF와 함께 NAC 아미드를 함유하도록 보충되는 것인 방법.
  11. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 자유 라디칼 형성을 감소시키거나 방지하는데 유효한 양으로 함유하도록 보충된 배지내에서 정자를 배양함을 포함하는, 시험관내에서 배양된 정자에서 자유 라디칼 형성을 감소시키거나 방지하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 정자가 비-인간 동물 기원인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 정자가 형질 전환 동물 기원인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 정자가 인간 기원인 방법.
  15. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 자유 라디칼 형성을 감소시키거나 방지하는데 유효한 양으로 함유하도록 보충된 배지내에서 이식전 배아를 배양함을 포함하는, 시험관내에서 배양된 이식전 배아에서 자유 라디칼 형성을 감소시키거나 방지하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 이식전 배아가 배반포 단계로 발달된 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 이식전 배아가 비-인간 동물 기원인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 이식전 배아가 인간 기원인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 이식전 배아가 형질 전환 동물 기원인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 배지가 GM-CSF와 함께 NAC 아미드를 함유하도록 보충되는 것인 방법.
  21. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 함유하도록 보충된 배지내에서 난세포 및 정자를 배양함을 포함하고, 이때 당해 난세포가 당해 NAC 아미드-보충된 배지에서 당해 정자에 의해 수정되는 것인, 시험관내 수정 방법.
  22. 제21항에 있어서, 난세포 및 정자가 비-인간 동물 기원인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 난세포 및 정자가 인간 기원인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 난세포 및 정자가 형질 전환 동물 기원인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 배지가 GM-CSF와 함께 NAC 아미드를 함유하도록 보충되는 것인 방법.
  26. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 이식전 배아가 배반포로 발달하게 하는데 유효한 양으로 함유하도록 보충된 배지내에서 이식전 배아를 배양함을 포함하는, 이식전 배아가 배반포로 발달하도록 배양하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 이식전 배아가 비-인간 동물 기원인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 이식전 배아가 인간 기원인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 이식전 배아가 형질 전환 동물 기원인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 배지가 GM-CSF와 함께 NAC 아미드를 함유하도록 보충되는 것인 방법.
  31. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 산화성 스트레스를 방지하거나 감소시키는데 유효한 양으로 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 미숙아 또는 신생아 유아에게 투여함을 포함하는, 당해 유아에서 산화성 스트레스를 방지하거나 감소시키는 방법.
  32. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 이식후 산화성 스트레스를 방지하거나 감소시키는데 유효한 양으로 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 배아 이식후 암컷에게 투여함을 포함하는, 당해 암컷에서 이식후 산화성 스트레스와 연관된 증상을 방지하거나 감소시키는 방법.
  33. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 자유 라디칼 형성 또는 산화성 스트레스를 방지하거나 감소시키는데 유효한 양으로 포함하는 제약학적으로 허용되는 조성물을 수컷에 투여함을 포함하는, 당해 수컷에서 정자 생성 및 발달과 연관된 자유 라디칼 형성 또는 산화성 스트레스를 방지하거나 감소시키는 방법.
  34. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는, 시험관내 배양된 난세포, 정자 또는 배아에서 산화성 스트레스를 감소시키거나 방지하기 위한 세포 배양 배지.
  35. 제34항에 있어서, 난세포, 정자 또는 배아가 비-인간 동물 기원인 배지.
  36. 제34항에 있어서, 난세포, 정자 또는 배아가 인간 기원인 배지.
  37. 제34항에 있어서, 난세포, 정자 또는 배아가 형질 전환 동물 기원인 배지.
  38. 제34항에 있어서, M199, 합성 난관 유체, PBS, BO, 시험-난황, Tyrode's, HBSS, Ham's F10, HTF, Menezo's B2, Menezo's B3, Ham's F12, DMEM, TALP, 어얼스 완충염, CZB, KSOM, BWW 배지 및 emCare 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 균염 용액(balanced salt solution)을 추가로 포함하는 배지.
  39. 제38항에 있어서, 세포가 정자이고 균염 용액이 TALP 또는 HTF인 배지.
  40. 제38항에 있어서, 세포가 배아이고 균염 용액이 CZB인 배지.
  41. 제34항에 있어서, 완충 용액, 하나 이상의 거대분자, 하나 이상의 추가의 자유 라디칼 스캐빈저, 하나 이상의 효소, 하나 이상의 성장 인자, 하나 이상의 중합체 분자, 하나 이상의 항생제, 하나 이상의 항진균제, 하나 이상의 호르몬 또는 하나 이상의 단백질을 추가로 포함하는 배지.
  42. 제34항에 있어서, 세포가 정자이고, 배지가 정자 운동성 자극제를 포함하거나 포함하지 않는 것인 배지.
  43. 제42항에 있어서, 정자 운동성 자극제가 카페인, 여포 유체, 칼슘, 옥시토신, 칼리크레인, 프로스타글란딘, 흉선 추출물, 펜톡시필린, 2-데옥시아데노신, 이노시톨, 플라바노이드, 혈소판 활성화 인자, 하이포타우린, 콘드로이틴 설페이트 또는 머캅토에탄올을 포함하는 것인 배지.
  44. 제34항에 있어서, GM-CSF를 추가로 포함하는 배지.
  45. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는, 시험관내 배양된 난세포, 정자 또는 배아에서 산화성 스트레스를 감소시키거나 방지하기 위한 세포 배양 보충물.
  46. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르, 침투성 및/또는 비침투성 제제 및 임의로 보조제 화합물을 포함하는, 동결된 난세포, 정자 또는 배아에서 산화성 스트레스를 감소시키거나 방지하기 위한 냉동보존용 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 침투성 제제가 DMSO, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 냉동보존용 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 비침투성 제제가 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 동결 억제 어류 또는 식물 단백질, 카복시메틸셀룰로스, 혈청 알부민, 하이드록시에틸 전분, 피콜, 덱스트란, 젤라틴, 알부민, 난황, 우유 단백질, 지질 비히클 또는 렉시틴을 포함하는 것인 냉동보존용 조성물.
  49. 제46항에 있어서, 보조제 화합물이 당 알콜, 단순 당, 글리코사미노글리칸, 부틸화된 하이드록실 톨루엔, 세제, 자유 라디칼 스캐빈저, 추가의 산화방지제, 아미노산, 플라보노이드 또는 탁솔을 포함하는 것인 냉동보존용 조성물.
  50. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르, 및 비-살정성 윤활 화합물을 포함하는, 비-살정성 윤활제 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 윤활 화합물이 글리세린, 메틸셀룰로스, 프로필렌 글리콜, 식물성 오일, 석유 젤리, 야채 오일, 폴리카보필, 하이드록시에틸셀룰로스, 규소 오일, 카보머, 알기네이트, 메틸파라벤, 야자나무 오일, 코코아 버터, 알로에 베라, 알기네이트 프로필렌 글리콜, 유니베이스(unibase), 광유, 폴리에틸렌 옥사이드, 나트륨 카복시폴리메틸렌 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 윤활제 조성물.
  52. 제50항에 있어서, pH 안정화제 및 추가의 산화 방지제를 추가로 포함하는 윤활제 조성물.
  53. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는, 이식후 산화성 스트레스와 연관된 증상을 방지하거나 감소시키기 위해 배아 이식 후 암컷에 주입하기 위한 제약 조성물.
  54. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는, 정자 생산 및 발달에서 자유 라디칼 형성 또는 산화성 스트레스를 감소시키거나 방지하기 위해 수컷에 주입하기 위한 제약 조성물.
  55. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는, 동물의 불임과 연관된 산화성 스트레스를 방지하거나, 감소시키거나, 방해하거나 완화시키기 위한 제약 조성물.
  56. N-아세틸시스테인 아미드(NAC 아미드) 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염 또는 에스테르를 포함하는, 미숙 신생아에서 과량의 헴 옥시게나제 및/또는 빌리루빈과 연관된 산화성 스트레스를 방지하거나, 감소시키거나, 방해하거나 완화시키기 위한 제약 조성물.
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