CN104195104B - 一种鸡精液纯化的新方法 - Google Patents

Abstract

一种鸡精液纯化的新方法，通过加入改进的精子培养液(1份鸡血清加4份Earle氏液)，经19％percoll工作液分离，然后800rpm离心，恒温培养箱培养后可显著提高精子质量，通过利用精子密度与精液其他成分密度的差异及精子的直线运动的能力，达到纯化精液的目的。

Description

一种鸡精液纯化的新方法

技术领域：

本发明涉及动物细胞培养领域具体涉及细胞培养、分离技术。

技术背景：

鸡精液由精子和精清组成。精清是曲精细管、附睾和输精管的分泌物，此外还含有透明液。透明液中有提高精子活力、呼吸和葡萄糖消耗因子，促使精子早衰。目前，现代化家禽生产中普遍采用人工授精技术，其极易造成交叉感染、精子高死亡率和降低精液利用率。另外，养鸡业出现繁殖力持续下降，每年商业品种和我国地方品种中淘汰10％左右的弱精子症鸡，这给生产和地方遗传资源保护带来了巨大的损失，如何利用一些弱精子症公鸡，改进其精子质量，最终提高鸡生产和保种效率是本发明的基本目标。本发明以狼山鸡为研究对象，通过利用精子密度与精液其他成分密度的差异及精子的直线运动的能力，达到纯化精液的目的。

发明内容：

为克服人工受精造成的交叉感染、精子质量低下(高精子死亡率和低利用率等)等，提高鸡生产和保种效率，本发明提供了一种新型鸡精液纯化方法，使用19％percoll工作液能有效分离精液中精子，具体步骤如下：

(1)采用“按摩法”采集正常产精狼山鸡的精液200-500ul，待液化后，即采集后半小时，加入3倍体积的精子培养液，混匀，800rpm离心，弃上清，所述精子培养液为1份鸡血清加4份Earle氏液；

(2)将经所述精子培养液重悬沉淀后的精液，沿管壁缓慢加到2ml浓度为19％percoll工作液层上，所述19％percoll工作液置于5ml的指形管中，800rpm离心20min，弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散；

(3)沿管壁再向上述指形管中缓慢加入0.5ml精子培养液，放入37℃CO₂恒温培养箱中培养40min，精子在此期间会上游，吸取上游后的精子培养液，即可获得纯净的精液。

相关试剂配方：

1、19％Percoll工作液：

100％Percoll储备液：9倍体积Percoll原液(购自sigma公司)、1倍体积10xNaCl；

19％Percoll工作液：1.9倍体积100％Percoll储备液、8.1倍体积1xNaCl溶液；

2、Earle氏液：

原液甲：NaCl68g、NaHCO₃22g、KCl4g、葡萄糖10g、NaH₂PO₄·2H₂O1.4g、双蒸馏水1000ml

原液乙：CaCl₂2.55g、MgCl₂·6H₂O1.7g、0.1gL-谷氨酰胺、双蒸馏水500ml

Earle氏液：原液甲2份、原液乙1份、双馏水17份。

本发明通过利用精子密度与精液其他成分密度的差异及精子的直线运动的能力，达到纯化精液的目的。

附图说明

图1：纯化前精液涂片；

图2：纯化后精液涂片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述：

实施例

本发明的技术方案是：一种新型鸡精液纯化方法，使用19％percoll工作液能有效分离精液中精子，具体步骤如下：

(1)采用“按摩法”采集正常产精狼山鸡的精液200-500ul，待液化后，即采集后半小时，加入3倍体积的精子培养液，混匀，800rpm离心，弃上清，所述精子培养液为1份鸡血清加4份Earle氏液；

(2)将经所述精子培养液重悬沉淀后的精液，沿管壁缓慢加到2ml浓度为19％percoll工作液层上，所述19％percoll工作液置于5ml的指形管中，800rpm离心20min，弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散；

(3)沿管壁再向上述指形管中缓慢加入0.5ml精子培养液，放入37℃CO₂恒温培养箱中培养40min，精子在此期间会上游，吸取上游后的精子培养液，即可获得纯净的精液。

相关试剂配方：

1、19％Percoll工作液：

100％Percoll储备液：9倍体积Percoll原液(购自sigma公司)、1倍体积10xNaCl。

19％Percoll工作液：1.9倍体积100％Percoll储备液、8.1倍体积1xNaCl溶液。

2、Earle氏液：

原液甲：NaCl68g、NaHCO₃22g、KCl4g、葡萄糖10g、NaH₂PO₄·2H₂O1.4g、双蒸馏水1000ml。

原液乙：CaCl₂2.55g、MgCl₂·6H₂O1.7g、0.1gL-谷氨酰胺、双蒸馏水500ml

Earle氏液：原液甲2份、原液乙1份、双馏水17份。

纯化后的精液，精子形态清晰，无杂质，精子活力显著提高。具体见表1和附图。

表1纯化前后鸡精子质量比较

注：*表示同列之间差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01).

相关指标的测定方法：

1、精子密度：指单位体积内的精液中的精子数。用移液枪吸10μL精液与490μL的0.9％NaCl(提前预热至37℃,此温度下精子活力最高)吹打均匀。采用血球计数器法计数，在显微镜下观察(400倍)，数出血球计数板正中间和四个角的五个中方格中的精子数。压在计数室边线上的精子计数时计头不计尾、计上不计下、计左不计右。用计数器记录技术室内5个中方格的精子总数。每个样本重复计数3次，每次计数重复3次。精子密度计算：1mL内精子数＝5个中方格中精子总数/5×400×1000×50(稀释倍数)。

2、精子活率：指活精子数占单位总精子数的比值。用移液枪吸10μL精液与490μL的0.9％NaCl(提前预热至37℃)吹打均匀。用移液枪吸取10μL的精液稀释液和10μL的台盼蓝染色液于PCR管中，轻轻吹打混匀，静止3分钟后，用血球计数板计数，重复3次。活的精子细胞细胞膜结构完整，不被着色，而死细胞能够被染成蓝色。计算方法：精子活率(％)＝未着色精子数/精子总数×100％。

3、精子畸形率：指畸形精子占精子总数的比值。畸形精子指头部、体部和尾部的非正常形态的精子(头部畸形包括头部过大或过小、顶体异常或空泡；体畸形有体部粗大、折裂、不完整等；尾部畸形包括过短、不规则、断裂或卷曲及多尾等)。吸取2μL精液加入到0.9％生理盐水(预热至37℃)中，充分混匀(用枪头吹吸，速度不宜太快，避免精子损伤)。用蜡笔将载玻片两侧密封，然后用移液枪吸取20μL混合液滴在载玻片上，并用盖玻片推片。用胶头滴管滴3-4滴无水乙醇，固定精子2-3min。参照快速瑞氏-吉姆萨复合染色试剂盒说明书，进行染色，观察并计数，计数重复3次。计算方法：精子畸形率(％)＝畸形精子数/精子总数×100％。

Claims (1)

1.一种鸡精液纯化的方法，其特征在于：使用19％percoll工作液能有效分离精液中精子，具体步骤如下：

(1)采用“按摩法”采集正常产精狼山鸡的精液200-500ul，待液化后，即采集后半小时，加入3倍体积的精子培养液，混匀，800rpm离心，弃上清，所述精子培养液为1份鸡血清加4份Earle氏液；

(2)将经所述精子培养液重悬沉淀后的精液，沿管壁缓慢加到2ml浓度为19％percoll工作液层上，所述19％percoll工作液置于5ml的指形管中，800rpm离心20min，弃上清，用手指轻弹管底，使沉淀松散；

(3)沿管壁再向上述指形管中缓慢加入0.5ml精子培养液，放入37℃CO₂恒温培养箱中培养40min，精子在此期间会上游，吸取上游后的精子培养液，即可获得纯净的精液；

所述19％Percoll工作液配制成分和比例如下：以重量份计算，1.9倍体积100％Percoll储备液、8.1倍体积1xNaCl溶液；

所述100％Percoll储备液液配制成分和比例如下：以重量份计算，9倍体积Percoll原液、1倍体积10xNaCl；

所述Earle氏液配制成分和比例如下：以重量份计算，原液甲2份、原液乙1份、双馏水17份；

所述原液甲配制成分和比例为，NaCl 68g、NaHCO₃ 22g、KCl 4g、葡萄糖10g、NaH₂PO₄·2H₂O 1.4g、双蒸馏水1000ml；所述原液乙为，CaCl₂ 2.55g、MgCl₂·6H₂O 1.7g、0.1g L-谷氨酰胺、双蒸馏水500ml。