CN104560715A - 基于微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法，包括如下步骤：1）微流控芯片的消毒：将微流控芯片置于乙醇中进行消毒，然后置于紫外线下照射1h，再置于PBS缓冲液中漂洗；2）肺癌细胞的接种及培养:将培养的肺癌细胞制成细胞悬浮液，从进口处垂直注入；入孵箱培养30min后，取出，取新鲜培养基注入；再置于孵箱中培养；3）肺癌细胞代谢物的检测：每隔8h观察肺癌细胞形态及生长状态，拍照；将制好的卟啉传感芯片放入代谢液收集池内进行检测。可实时检测肺癌细胞的生理区别，可区分不同种类肺癌细胞代谢液的不同，采用发明微流控芯片培养出的细胞代谢液与人体组织产生的代谢液相似度更高，更适用于研究肺癌早期诊断的标志物。

Description

基于微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法。

背景技术

肺癌又名支气管癌，其发生于支气管粘膜上皮，是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。由于肺癌早期症状不明显，常常发现时已经到了晚期，因此，对肺癌进行早期诊断和早期治疗是防治肺癌并降低病死率的最有效方法。目前临床上，肺癌的常见诊断方法有如下几种：X射线检测、电子计算机断层扫描（CT）、磁共振断层扫描（MRI）、痰脱落细胞检查、纤维支气管检查、经皮肺穿刺活检等，虽然此类检查方法能达到预期肺癌诊断的效果，但是采用这些方法的设备庞大、价格昂贵，对病人创伤大，还需要熟练操作的专业人员进行操作，并且得到的结果还要专业的医务人员进行分析处理，大大加大了医务人员的负担。

微流控芯片(microfluidic chip), 又称微全分析系统(micro total analysis system, ì-TAS)或者芯片实验室(lab-on-a-chip), 是指把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上, 由微通道形成网络, 以可控流体贯穿整个系统, 用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台，其具有分离效率高、分析速度快、分离模式多、所需样品少、应用范围广、自动化程度高等优点。但是，微流控芯片技术在当前主要还处于起步阶段，其用于肺癌细胞培养及检测领域的相关技术和方法尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明主要目的是提供一种基于微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法，该方法可对单个肺癌细胞进行培养，并对其生长状况进行实时监控。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

基于微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法，该方法采用一种微流控芯片，该微流控芯片由下至上依次包括细胞培养层、微通道层和封盖层，细胞培养层和微通道层由水凝胶材料制成；

所述细胞培养层上设有细胞培养室和代谢物收集池a部；所述细胞培养室为向下凹陷的圆形凹孔，细胞培养室为60个，60个细胞培养室呈5×12阵列排列，每个细胞培养室直径为1.5mm；所述代谢物收集池a部为16mm×11mm的矩形槽结构，该代谢物收集池a部的一侧紧邻细胞培养室，另一侧靠近芯片的端部；

所述微通道层上设有模拟人体肺部结构的流体微通道和代谢物收集池b部；所述流体微通道包括总通道、第一支通道、第二支通道和微通道，总通道的一端为进样口，另一端分化为两个第一支通道，每个第一支通道再分化为两个第二支通道，第二支通道再分化为多个相互连通的微通道；所述微通道为网状结构，在多条微通道交汇处、且对应于细胞培养室的位置设有与细胞培养室相通的细胞捕获孔，该细胞捕获孔的直径为1.5mm；所述代谢物收集池b部为镂空结构，其形状与代谢物收集池a部相匹配、且与代谢物收集池a部相重合，代谢物收集池a部与代谢物收集池b部共同形成一代谢物收集池；

所述封盖层覆盖在微通道层上，在封盖层的一端设有与进样口相通的进口，在封盖层上、且对应于代谢液收集池的位置设有检测窗口，该检测窗口为镂空结构，在检测窗口上设有可覆盖该检测窗口的门，该门与封盖层滑动配合；所述门上设有通气孔和泵孔；

其中，所述水凝胶材料由预聚物和光引发剂制成，其中，预聚物包括PEGDA、HEMA和NVP，PEGDA与HEMA的体积比为(1.5~2.33)：1, NVP的体积为PEGDA与HEMA总体积的10%~15%,所述光引发剂采用Irgacure2959，Irgacure2959的质量为预聚物质量的0.3%~0.45%；

该方法包括如下步骤：

1）微流控芯片的消毒：将微流控芯片置于浓度为75%的乙醇中进行初步消毒，然后将初步消毒完成后的微流控芯片置于紫外线下照射1h，再将微流控芯片置于PBS缓冲液中进行漂洗；

2）肺癌细胞的接种及培养:将培养的肺癌细胞以胰酶消化，制成细胞悬浮液，用注射器吸取细胞悬浮液从进口处垂直注入，直至整个芯片的细胞培养室中皆铺满细胞悬浮液；将接种了肺癌细胞的微流控芯片入孵箱培养30min后，取出，取新鲜培养基从进口注入，冲去位于流体微通道中多余的细胞悬浮液，在出口用注射器吸取代谢液收集池内的多余培养液；再将芯片置于孵箱中培养；

3）肺癌细胞代谢物的检测：每隔8h观察肺癌细胞形态及生长状态，拍照；将制好的卟啉传感芯片放入代谢液收集池内，对细胞代谢液进行检测。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、通过本发明方法，可实时检测肺癌细胞的生理区别，可区分不同种类肺癌细胞代谢液的不同，采用本发明微流控芯片培养出的细胞代谢液与人体组织产生的代谢液相似度更高，更适用于研究肺癌早期诊断的标志物。

2、本发明方法采用的微流控芯片，在微通道层上设置有模拟人体肺部组织结构的流体微通道，可通过流体微通道进样口注入细胞悬浮液或培养液，细胞悬浮液或培养液通过流体微通道的分流作用均匀的充满每个细胞培养室，该流体微通道完全模拟人体肺部组织结构，为细胞提供更接近于人体的生长环境，其代谢产物非常接近于人体细胞的代谢产物，使检测数据更加贴近于人体真实情况，为后续的分析工作提供更准确的科学依据，以利于对肺癌的早期诊断。

3、采用本发明配方制成的水凝胶材料，具有良好的生物相容性、细胞粘附力、易得性、低消耗性，制成的水凝胶芯片进一步的模拟人体内部组织环境，为下一步的肺癌细胞代谢液标志物检测打下基础。

附图说明

图1为细胞培养层结构示意图；

图2为微通道层结构示意图；

图3为封盖层结构示意图。

其中，1为细胞培养室，2为代谢液收集池a部，3为流体微通道，4为细胞捕获孔，5为代谢液收集池b部，6为细胞培养层，7为微通道层，8为封盖层，9为门，10为检测窗口，11为进口，12为通气孔，13为泵孔。

具体实施方式

下面结合附图和实例对本发明作进一步详细地说明。

参见图1~图3：本发明方法采用了一种微流控芯片，该微流控芯片为三层片状物叠合而成的三层结构，其由下至上依次包括细胞培养层6、微通道层7和封盖层8。细胞培养层6和微通道层7由水凝胶材料制成。细胞培养层6的厚度为1mm，在细胞培养层6上设有细胞培养室1和代谢液收集池a部2。细胞培养室1为向下凹陷的圆形凹孔。本实施例中，在细胞培养层6上设置有60个细胞培养室1，60个细胞培养室1呈矩阵排列，每排12个，共5排。每个细胞培养室1的直径为1.5mm。代谢液收集池a部2的一侧紧邻细胞培养室1，另一侧靠近芯片的端部。代谢液收集池a部2为矩形槽结构，其长度为16mm，宽度为11mm。在微通道层7上设有模拟人体肺部结构的流体微通道3和代谢液收集池b部5。流体微通道3与位于细胞培养层6上的每个细胞培养室1相通。本实施例中，流体微通道3包括总通道，总通道的一端为进样口，用于注入细胞悬浮液或培养液；另一端分化为两个第一支通道，每个第一支通道再分化为两个第二支通道，第二支通道再分化为多个相互连通的微通道，微通道为网状结构，在多条微通道交汇处、且对应于细胞培养室1的位置设有与细胞培养室相通的细胞捕获孔4，该细胞捕获孔4的直径为1.5mm，用于捕获细胞，细胞由细胞捕获孔4捕获后进入细胞培养室1进行培养。总通道、第一支通道、第二支通道与微通道均为平滑过渡，即总通道与第一支通道之间、第一支通道与第二支通道之间、第二支通道与微通道之间均为平滑过渡。总通道的内径为2.5mm，第一支通道的最大内径为5mm，微通道的内径为1mm；总通道进样口至微通道入口端的直线距离为18mm，微通道入口端至其出口端的直线距离为35mm。代谢液收集池b部5为镂空结构，其形状与代谢液收集池a部2相匹配，代谢液收集池a部2与代谢液收集池b5部共同形成一个完整的代谢液收集池，代谢液收集池与流体微通道相连通，用于收集细胞代谢液。封盖层8覆盖在微通道层7上，在封盖层8的一端设有与进样口相通的进口11，在封盖层8上、且对应于代谢液收集池的位置设有检测窗口10，该检测窗口10为镂空结构。在检测窗口10上设有可覆盖该检测窗口10的门9，该门9与封盖层8滑动配合，可通过推拉方式打开或关闭检测窗口10。在门上设有通气孔12和泵孔13。

将微流控芯片设置为三层结构，底层为设置有多个细胞培养室的细胞培养层，为细胞提供三维生长环境，最多可同时培养60组细胞样本；将每个细胞培养室的直径设置为1.5mm，可在同等厚度的情况下，大大增加细胞培养室的体积，有利于细胞贴壁，有利于细胞触角、鞭毛立体生长。中间层为微通道层，其上设置有模拟人体肺部组织结构的流体微通道，可通过流体微通道进样口注入细胞悬浮液或培养液，细胞悬浮液或培养液通过流体微通道的分流作用均匀的充满每个细胞培养室，该流体微通道完全模拟人体肺部组织结构，为细胞提供更接近于人体的生长环境，其代谢产物非常接近于人体细胞的代谢产物，使检测数据更加贴近于人体真实情况，为后续的分析工作提供更准确的科学依据，以利于对肺癌的早期诊断。代谢液收集池可收集多余的细胞悬浮液和细胞代谢液，由于本微流控芯片可同时培养60组肺癌细胞，每组肺癌细胞生长环境完全相同，加之代谢液体收集池积较大，由代谢液收集池收集的细胞代谢液体积完全满足检测需要，可直接采用卟啉传感器可视阵列芯片或其他检测仪器对代谢液收集池中的细胞代谢液进行实时检测。本发明微流控芯片实现了细胞培养-分离-代谢-检测一体化，可做到对单个细胞状况的实时监控，可实现对多平行样本的实时监测。

细胞培养层和微通道层采用水凝胶材料制成，水凝胶材料由预聚物和光引发剂制成，其中，预聚物包括PEGDA（聚乙二醇双丙烯酸酯）、HEMA（甲基丙烯酸羟乙酯）和NVP（N-乙烯基吡咯烷酮），PEGDA与HEMA的体积比为(1.5~2.33)：1，NVP的体积为PEGDA与HEMA总体积的10%~15%。光引发剂采用Irgacure2959，Irgacure2959的质量为预聚物质量的0.3%~0.45%。

PEGDA（聚乙二醇双丙烯酸酯）在光引发剂和紫外光作用下能在室温下迅速聚合成聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶。HEMA（甲基丙烯酸羟乙酯），可有效地进一步提高芯片表面的亲水性，能够明显改善聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶材料的细胞亲和性。NVP（N-乙烯基吡咯烷酮）有较好固化特性，增加水凝胶芯片的韧性。采用如上配方制成的水凝胶材料，具有良好的生物相容性、细胞粘附力、易得性、低消耗性，制成的水凝胶芯片进一步的模拟人体内部组织环境，为下一步的肺癌细胞代谢液标志物检测打下基础。

以下以具体配方为例，对水凝胶材料的配方加以说明：

配方1：预聚物包括PEGDA、HEMA和NVP，其中，PEGDA为1.8ml，HEMA为1.2ml，NVP为0.3ml，预聚物的总质量为3.5g，加入Irgacure2959，其质量为0.0140g，搅拌均匀。采用该配方水凝胶材料制成的微流控芯片生物相容性好、细胞粘附力强、消耗材料较少，容胀率小，具有较好的韧性，可重复使用5次以上。

配方2：预聚物包括PEGDA、HEMA和NVP，其中，PEGDA为2.1ml，HEMA为0.9ml，NVP为0.3ml，预聚物的总质量为3.4g，加入Irgacure2959同，其质量为0.0135g，搅拌均匀。采用该配方水凝胶材料制成的微流控芯片生物相容性好、细胞粘附力强、消耗材料较少，容胀率小，具有较好的韧性，可重复使用5次以上。

配方3：预聚物包括PEGDA和HEMA，其中，PEGDA为2ml，HEMA为2ml，预聚物的总质量为3.3g，加入Irgacure2959，其质量为0.012g，搅拌均匀。采用该配方水凝胶材料制成的微流控芯片生物较为柔软，容胀率大，吸水速率快，放进水里30min发生降解，仅能使用一次。

配方4：预聚物包括PEGDA、HEMA和NVP，其中，PEGDA为2.1ml，HEMA为0.7ml，NVP为0.6ml，预聚物的总质量为3.84g，加入Irgacure2959，其质量为0.016g，搅拌均匀。采用该配方水凝胶材料制成的微流控芯片硬度较高，生物相容性差，无法使用。

由上述配方可看出，由配方1和配方2的水凝胶材料制成的微流控芯片性能最优，更能模拟人体组织环境，更利于细胞的培养。

基于该微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法包括如下步骤：

1）微流控芯片的消毒：将微流控芯片置于浓度为75%的乙醇中进行初步消毒，去除制作过程中芯片上的污染物。然后将初步消毒完成后的微流控芯片置于紫外线下照射1h，除去不易杀死的细菌等，保证芯片的洁净。再将微流控芯片置于PBS缓冲液（磷酸缓冲液）中浸泡12h，对芯片进行清洗，去除酒精消毒时的残留酒精，使其适合细胞培养。该PBS缓冲液的ph值为7.4。

2）肺癌细胞的接种及培养:将培养的细胞以胰酶消化，制成细胞悬浮液，用注射器吸取细胞悬浮液从进口处垂直注入，直至整个芯片的细胞培养室中皆铺满悬浮液。入孵箱培养30min后，取出，取新鲜培养基从进口注入，冲去位于流体微通道中多余的细胞悬浮液，在出口用注射器吸取代谢液收集池内的多余培养液。将芯片置于孵箱中培养。培养基采用Gibco公司的1640培养基。每次做六组平行样。

3）肺癌细胞代谢物的检测：每隔8h观察细胞形态及生长状态，拍照，对细胞代谢液进行检测。检测时，将制好的卟啉传感芯片放入代谢液收集池内，代谢液中的特异物质会与芯片上的敏感材料进行反应。采用卟啉可视阵列传感系统对卟啉传感芯片与细胞代谢液反应前后的可见光区阵列光谱图进行分析，得出结果。

通过本发明方法，可实时检测肺癌细胞的生理区别，可区分不同种类肺癌细胞代谢液的不同，采用本发明微流控芯片培养出的细胞代谢液与人体组织产生的代谢液相似度更高，更适用于研究肺癌早期诊断的标志物。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.基于微流控芯片培养及检测肺癌细胞的方法，其特征在于，该方法采用一种微流控芯片，该微流控芯片由下至上依次包括细胞培养层、微通道层和封盖层，细胞培养层和微通道层由水凝胶材料制成；

所述细胞培养层上设有细胞培养室和代谢物收集池a部；所述细胞培养室为向下凹陷的圆形凹孔，细胞培养室为60个，60个细胞培养室呈5×12阵列排列，每个细胞培养室直径为1.5mm；所述代谢物收集池a部为16mm×11mm的矩形槽结构，该代谢物收集池a部的一侧紧邻细胞培养室，另一侧靠近芯片的端部；

所述微通道层上设有模拟人体肺部结构的流体微通道和代谢物收集池b部；所述流体微通道包括总通道、第一支通道、第二支通道和微通道，总通道的一端为进样口，另一端分化为两个第一支通道，每个第一支通道再分化为两个第二支通道，第二支通道再分化为多个相互连通的微通道；所述微通道为网状结构，在多条微通道交汇处、且对应于细胞培养室的位置设有与细胞培养室相通的细胞捕获孔，该细胞捕获孔的直径为1.5mm；所述代谢物收集池b部为镂空结构，其形状与代谢物收集池a部相匹配、且与代谢物收集池a部相重合，代谢物收集池a部与代谢物收集池b部共同形成一代谢物收集池；

所述封盖层覆盖在微通道层上，在封盖层的一端设有与进样口相通的进口，在封盖层上、且对应于代谢液收集池的位置设有检测窗口，该检测窗口为镂空结构，在检测窗口上设有可覆盖该检测窗口的门，该门与封盖层滑动配合；所述门上设有通气孔和泵孔；

其中，所述水凝胶材料由预聚物和光引发剂制成，其中，预聚物包括PEGDA、HEMA和NVP，PEGDA与HEMA的体积比为(1.5~2.33)：1, NVP的体积为PEGDA与HEMA总体积的10%~15%,所述光引发剂采用Irgacure2959，Irgacure2959的质量为预聚物质量的0.3%~0.45%；

该方法包括如下步骤：

1）微流控芯片的消毒：将微流控芯片置于浓度为75%的乙醇中进行初步消毒，然后将初步消毒完成后的微流控芯片置于紫外线下照射1h，再将微流控芯片置于PBS缓冲液中进行漂洗；

2）肺癌细胞的接种及培养:将培养的肺癌细胞以胰酶消化，制成细胞悬浮液，用注射器吸取细胞悬浮液从进口处垂直注入，直至整个芯片的细胞培养室中皆铺满细胞悬浮液；将接种了肺癌细胞的微流控芯片入孵箱培养30min后，取出，取新鲜培养基从进口注入，冲去位于流体微通道中多余的细胞悬浮液，在出口用注射器吸取代谢液收集池内的多余培养液；再将芯片置于孵箱中培养；

3）肺癌细胞代谢物的检测：每隔8h观察肺癌细胞形态及生长状态，拍照；将制好的卟啉传感芯片放入代谢液收集池内，对细胞代谢液进行检测。