CN114632564A - 一种集成微流控芯片及原代循环肿瘤细胞体外处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种集成微流控芯片及原代循环肿瘤细胞体外处理方法。该芯片设置有微液滴生成部、连通部和捕获培养部；微液滴生成部出口与连通部入口连接，连通部出口与捕获培养部入口连接；微液滴生成部包括样本入口和油相入口；捕获培养部包括至少一个捕获通道和至少一个流体出口，捕获通道包括捕获空腔和设置于捕获空腔底面的多个各自独立的捕获小室；捕获空腔的出口与流体出口连接；捕获小室为上宽下窄结构，上方开口、侧壁呈圆台状、底面下陷呈球冠状。该集成微流控芯片能够实现原代循环肿瘤细胞高效捕获以及CTCs肿瘤细胞球有效培养，并能对培养的CTCs肿瘤细胞球进行培养、染色、分析及集合药物筛选。

Description

一种集成微流控芯片及原代循环肿瘤细胞体外处理方法
技术领域
本发明涉及一种适用于原代循环肿瘤细胞(CTCs)体外捕获、培养以及药物筛选的微流控芯片以及使用该微流控芯片进行的原代循环肿瘤细胞体外处理方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)是从原生瘤或再生瘤脱落，进入血液循环系统或淋巴系统中的肿瘤细胞。血液循环系统CTCs的数目极其稀少，但是CTCs对于肿瘤病程监测及药物筛选是极为必要的，因此提高循环肿瘤球的体外培养通量并实现高通量药物筛选对肿瘤的诊断和治疗评价具有重要意义。
微流控芯片能充分模拟病人的体内生理环境来实现肿瘤细胞及类器官的体外培养。通过泵或手动移液枪注射能及时换液、染色、观察，实现在时间和空间上的精确操控，微流控芯片逐步成为新一代细胞研究的重要平台。微流控芯片集细胞培养、染色、观察于一体，能够达到实时追踪、实时调控的目的，为药物筛选提供便捷、安全、有效的手段。集成微流控芯片能将单一芯片的优势结合起来，例如具备如下有益效果：(1)芯片微结构具有较好的生物安全性，能充分模拟体内环境，进行细胞的培养及药物的体内模拟筛选；(2)芯片微结构的密集分布，能提高细胞培养的通量；(3)能对药物筛选过程进行有效的监控；(4)芯片能进行多功能多方向的集成；(5)微流控芯片对流体的精准操控，更接近体内真实环境。集成型微流控芯片通常由上层(液路控制层)、下层(气路控制层)和底面(空白玻璃底板)三层顺序串联贴合布置而成。
尽管目前已经报道了很多利用微流控芯片实现肿瘤细胞培养的例子，但现有微流控芯片用于CTCs培养通常存在如下问题：(1)只能实现细胞系的培养；(2)操作繁琐；(3)可能造成极少量存在的CTCs的损伤及丢失；(4)培养过程中可能发生污染；(5)难以实现高通量、高效、准确可控的原代CTCs体外培养及药物筛选评价；(6)很难全面满足对抗癌药物体外筛选实验的需要。
目前利用集成微流控芯片进行全封闭式原代CTCs捕获、原代CTCs的肿瘤细胞球体外扩增培养及染色观察和药物筛选的整合研究分析及芯片开发还处于空白阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全封闭集成微流控芯片，该集成微流控芯片能够实现原代循环肿瘤细胞(CTCs)高效捕获以及基于捕获的原代CTCs进行CTCs肿瘤细胞球有效培养，并能对培养的CTCs肿瘤细胞球进行培养、染色、分析及集合药物筛选。
本发明的另一目的在于提供一种原代循环肿瘤细胞体外处理方法，该方法能够实现原代循环肿瘤细胞(CTCs)高效捕获，进一步地可以实现基于捕获的原代CTCs进行CTCs肿瘤细胞球有效培养，再进一步地可以实现对培养的CTCs肿瘤细胞球进行药物筛选。
为了实现上述目的，本发明提供了一种集成微流控芯片，其中，该芯片设置有微液滴生成部、连通部和捕获培养部；微液滴生成部的出口与连通部的入口连接，连通部的出口与捕获培养部的入口连接；其中，
所述微液滴生成部包括样本入口和油相入口；
所述捕获培养部包括至少一个捕获通道和至少一个流体出口，所述捕获通道包括捕获空腔和设置于捕获空腔底面的多个各自独立的捕获小室；捕获空腔的出口与流体出口连接；捕获空腔的入口作为捕获培养部的入口与连通部的出口连接；
其中，捕获小室上方开口，捕获小室上方开口、侧壁呈圆台状、底面下陷呈球冠状。
在上述集成微流控芯片中，上宽下窄结构的捕获小室有助于高效实现将捕获到的细胞聚集到一起，使共培养的细胞之间充分接触、相互作用，并在长时间培养(超过7天)后形成肿瘤细胞球状结构。
在上述集成微流控芯片中，捕获小室内表面接触角为室温下离子水在捕获小室内表面的接触角。
现有技术中通常利用微孔芯片进行随机的免疫细胞及CTCs共捕获，鉴于血液循环系统CTCs的数目极其稀少，利用现有技术中常见的微孔芯片进行检测血样的免疫细胞及原代CTCs共捕获时，CTCs的捕获效率极低。发明人经过大量实验研究发现利用微液滴进行检测血样的免疫细胞及CTCs的共捕获能显著提高CTCs的捕获效率。在基于此，发明人基于微液滴捕获及微孔培养设计了上述适用于原代CTCs体外培养和药物筛选的集成微流控芯片。通过设计一种特殊的捕获小室实现对于微液滴的高效捕获来降低血液中极为稀少的原代CTCs的损失概率，进而对捕获的微液滴进行破乳并对原代CTCs培养有效实现培养形成CTCs肿瘤细胞，从而实现高通量单个CTCs肿瘤细胞球培养。此外，还可以利用本发明提供的集成微流控芯片对培养得到的CTCs肿瘤细胞球进行药物作用的有效监测。本发明提供的集成微流控芯片能够实现高通量、高效集成化原代CTCs捕获和原代CTCs肿瘤细胞球体外扩增培养及药物筛选一体检测。
在上述集成微流控芯片中，优选地，捕获小室的开口处直径为0.1-0.3mm(例如0.25mm)、底面与侧壁连接处直径为0.06-0.18mm(例如0.15mm)、底部到顶部的扩张角为10-30度。
在上述集成微流控芯片中，优选地，所述集成微流控芯片由上层芯片和下层芯片上下叠放粘合形成；其中，上层芯片上刻蚀有微液滴生成部、连通部和捕获培养部的捕获空腔和流体出口；下层芯片上刻蚀有捕获培养部的捕获小室。
在上述集成微流控芯片中，优选地，所述集成微流控芯片的材质为聚二甲基硅氧烷。
在上述集成微流控芯片中，优选地，所述微液滴生成部包括至少两个样本入口；
更优选地，所述微液滴生成部包括：
第一样本入口、第二样本入口、油相入口、第一样本进液通道、第二样本进液通道、样本进液汇集通道、油相进液通道、第一油相分流通道、第二油相分流通道、微液滴生成十字通道；其中，
微液滴生成十字通道由顺时针设置的第一通道、第二通道、第三通道和第四通道组成；
第一样本入口与第一样本进液通道入口连接，第二样本入口与第二样本进液通道入口连接，第一样本进液通道出口、第二样本进液通道出口分别与样本进液汇集通道入口连接，油相入口与油相进液通道入口连接，油相进液通道出口分别与第一油相分流通道入口、第二油相分流通道入口连接，第一油相分流通道出口、样本进液汇集通道出口、第二油相分流通道出口分别与微液滴生成十字通道的第一通道、第二通道、第三通道对应连接，微液滴生成十字通道的第四通道作为微液滴生成部的出口与所述连通部的入口连接；
进一步优选地，所述样本进液汇集通道的宽度为100-200微米、深度为100-200微米，第一油相分流通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，第二油相分流通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，微液滴生成十字通道的第一通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，微液滴生成十字通道的第二通道的宽度为70-200微米、深度为70-200微米，微液滴生成十字通道的第三通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，微液滴生成十字通道的第四通道的宽度为100-200微米、深度为100-200微米；
进一步优选地，所述第一样本进液通道的宽度为100-200微米、深度为100-200微米，第二样本进液通道的宽度为100-200微米、深度为100-200微米，油相进液通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米；
在一具体实施方式中，第一样本进液通道可以选用S型通道，第二样本进液通道可以选用S型通道，第一样本进液通道与第二样本进液通道优选形状(包括尺寸)相同且以样本进液汇集通道所在直线为基准对称设置；
在一具体实施方式中，第一油相分流通道与第二油相分流通道优选形状(包括尺寸)相同且以微液滴生成十字通道的第二通道、第四通道所在直线为基准对称设置；
在一具体实施方式中，微液滴生成十字通道的第一通道、第三通道优选形状(包括尺寸)相同。
在上述集成微流控芯片中，优选地，每个捕获空腔的长度为10-100mm、宽度为1-20mm。
在上述集成微流控芯片中，优选地，每个捕获空腔底面设置的捕获小室的数量为1000-5000个。
在上述集成微流控芯片中，优选地，对于每个捕获空腔底面设置的捕获小室的排列方式满足：
形成多个等间距平行设置的捕获小室行，各捕获小室行由多个等间距设置的捕获小室组成，相邻捕获小室行的捕获小室交叉排列；
更优选地，每个捕获小室行中相邻的捕获小室之间的间隔距离为0.1-0.5mm，相邻捕获小室行的间隔距离为0.1-0.4mm。
在上述集成微流控芯片中，优选地，捕获小室内表面接触角为110-150度。
在上述集成微流控芯片中，优选地，所述捕获小室的内表面进行过全氟表面修饰剂修饰，实现捕获小室的内表面非粘附修饰；
在一具体实施方式中，所述全氟表面修饰剂选用CYTOP、Teflon AF、和/或、Pluronic F127。
利用全氟表面修饰剂进行过内表面非粘附修饰的捕获小室，能够有效减少CTCs细胞与捕获小室内表面的粘附性，减少CTCs贴壁，在捕获小室内部更易实现CTCs成球，有助于更高效的实现肿瘤细胞球的培养。
在上述集成微流控芯片中，优选地，不同捕获通道的捕获空腔的出口连接不同的流体出口；
利用该优选技术方案提供的集成微流控芯片进行药物筛选，能够实现自不同的流体出口向不同的捕获通道中注入不同的检测试剂实现对不同指标的同步检测，有助于实现高通量、高内涵药物筛选。
在上述集成微流控芯片中，优选地，所述连通部选用浓度梯度形成结构，包括n个分流出口，n≥2；所述捕获通道的数量为n，所述流体出口的数量不小于n；所述连通部的各分流出口与各捕获通道的捕获空腔的入口一一对应连接；
更优选地，所述连通部包括m层分流通路，m≥1；其中，第i层分流通路包括2i-1个分流支路，1≤i≤m；每个分流支路均包括两个分流通道；每个分流通道的出口均与下一层分流通路中的某一个分流支路的两个分流通道的入口连接并且不同分流通道的出口连接不同的分流支路，最后一层分流通路的各分流通道的出口即为所述分流出口，第一层分流通路的分流通道的入口作为连通部的入口与微液滴生成部的出口连接；
在该优选技术方案中，可以根据调节连通部的分流出口个数和分流通路数量实现线性及指数级别的大范围药物浓度梯度；
在一具体实施方式中，连通部中各个通道的宽度为100-200微米、深度100-200微米；
在一具体实施方式中，同一层分流通路中的各分流通道优选形状(包括尺寸)相同；
在一具体实施方式中，所述连通部包括8个分流出口；所述捕获通道的数量为8，所述流体出口的数量为8；所述连通部的各分流出口与各捕获通道的捕获空腔的入口一一对应连接，各捕获通道的捕获空腔的入口与各流体出口一一对应连接；所述连通部包括3层分流通路，第1层分流通路包括1个分流支路，第2层分流通路包括2个分流支路，第3层分流通路包括4个分流支路；每个分流支路均包括两个分流通道；第1层分流通路的第1分流通道的出口与第2层分流通路中的第1分流支路的两个分流通道的入口连接，第1层分流通路的第2分流通道的出口与第2层分流通路中的第2分流支路的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第1分流支路的第1分流通道的出口与第3层分流通路中的第1分流支路的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第1分流支路的第2分流通道的出口与第3层分流通路中的第2分流支路的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第2分流支路的第1分流通道的出口与第3层分流通路中的第3分流支路的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第2分流支路的第2分流通道的出口与第3层分流通路中的第4分流支路的两个分流通道的入口连接，第1层分流通路的第1分流支路、第2分流支路的入口作为连通部的入口与微液滴生成部的出口连接，第3层分流通路的各分流通道的出口即为所述分流出口。
本发明还提供了一种原代循环肿瘤细胞体外处理方法，该方法使用本发明提供的上述集成微流控芯片进行，其中，该方法包括：
1)、将含有原代循环肿瘤细胞和免疫细胞的起始样本作为水相自样本入口注入，同时将油相自油相入口注入；两相在液滴生成部中汇合乳化形成包裹原代循环肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴，所述包裹原代循环肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴为油包水乳化液滴；微液滴经连通部流入捕获通道的捕获空腔，进入捕获空腔的微液滴基于油水密度差进入下方的捕获小室；
2)、当不少于90％的捕获小室含有微液滴后，通入破乳剂进行破乳，原代循环肿瘤细胞捕获完成。
在上述原代循环肿瘤细胞体外处理方法中，优选地，步骤1)中，在捕获空腔的出口收集未进入捕获小室的微液滴，并将收集到的微液滴通过样本入口注入；
在上述原代循环肿瘤细胞体外处理方法中，优选地，该方法进一步包括：
原代循环肿瘤细胞捕获完成后，通入培养基进行原代循环肿瘤细胞培养形成肿瘤细胞球，完成肿瘤细胞球培养；
微液滴捕获后破乳后进行培养可进行连续的培养基及代谢物的交换，对培养时间没有太大限制，能够有效保障原代循环肿瘤细胞培养形成肿瘤细胞球，通常原代循环肿瘤细胞培养形成肿瘤细胞球需要两周以上时间；
更优选地，该方法进一步包括：
肿瘤细胞球培养完成后，通入待筛选药物，对肿瘤细胞球作用一定时间后进行指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
进一步优选地，当微液滴生成部包括至少两个样本入口、连通部选用浓度梯度形成结构时，通过控制一个样本入口通入药品、控制另一个样本入口通入培养基在连通部形成不同浓度的药物梯度，对肿瘤细胞球作用一定时间后进行指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
进一步优选地，当微液滴生成部包括至少两个样本入口、连通部选用浓度梯度形成结构时，通过控制一个样本入口通入一种药品、控制另一个样本入口通入另一种在连通部形成两种药物浓度梯度组合，对肿瘤细胞球作用一定时间后进行指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
进一步优选地，当捕获培养部包括多个捕获通道和多个流体出口、且不同捕获通道的捕获空腔的出口连接不同的流体出口时，通入待筛选药物，对肿瘤细胞球作用一定时间后，自不同的流体出口向不同的捕获空腔中加入不同检测试剂进行不同指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
再优选地，所述指标检测通过下述方式实现：
在流体出口向捕获空腔中加入检测试剂进行检测；
在一具体实施方式中，所述进行原代循环肿瘤细胞培养在37℃，1％CO2环境下进行培养；
在一具体实施方式中，所述进行指标检测包括IC50值、循环肿瘤细胞形态尺寸，循环肿瘤细胞存活率，抗体表型，血管形成，凋亡，自噬，分化，肿瘤球细胞核密度等等；
该优选技术方案能够实现为临床应用筛选确定合适的抗癌药。
在上述原代循环肿瘤细胞体外处理方法中，优选地，所述含有原代循环肿瘤细胞和免疫细胞的起始样本通过下述方式制备得到：
将含有原代循环肿瘤细胞的全血样本进行红细胞的裂解，并将裂解后剩余细胞利用培养基重悬得到含有原代循环肿瘤细胞和免疫细胞的起始样本；
在一具体实施方式中，所述含有原代循环肿瘤细胞的全血样本选用带有循环肿瘤细胞的外周血样本。
本发明提供的集成微流控芯片是一种基于微液滴及微孔式集成型全封闭微流控芯片，可以用于液体活检和药物筛选。本发明提供的集成微流控芯片能够实现高效捕获原代CTCs及培养CTCs肿瘤细胞球解决CTCs肿瘤球形成率低、原代CTCs损失高难捕获等问题，能够用于利用明场观察CTCs肿瘤细胞球的生长状态、尺寸，能够用于基于CTCs肿瘤细胞球进行荧光场下细胞的死活染色、特定通路蛋白染色，能够用于基于CTCs肿瘤细胞球进行药物筛选等等。本发明提供的集成微流控芯片能够提供封闭的捕获、培养、药物筛选环境，可以减少加工过程中的细胞污染和失水。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的集成微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明实施例1提供的集成微流控芯片的上层芯片的结构示意图。
图3为本发明实施例1提供的集成微流控芯片的下层芯片的结构示意图。
图4A为本发明实施例1提供的微流控芯片的局部A(参见图1)放大示意图。
图4B为本发明实施例1提供的微流控芯片的局部A(参见图1)的上层芯片放大示意图。
图4C为本发明实施例1提供的微流控芯片的局部A(参见图1)的下层芯片放大示意图。
图4D为本发明实施例1提供的微流控芯片的局部B(参见图4A、图4C)的捕获小室的尺寸示意图。
图4E为本发明实施例1提供的微流控芯片的捕获小室的剖面图。
图5A为本发明实验例1中利用对比例1提供的集成微流控芯片进行原代循环肿瘤细胞体外培养的结果图。
图5B为本发明实验例1中利用实施例1提供的集成微流控芯片进行原代循环肿瘤细胞体外培养的结果图。
图6A为本发明实验例2中利用对比例2提供的集成微流控芯片进行贴壁测试的结果图。
图6B为本发明实验例2中利用实施例1提供的集成微流控芯片进行贴壁测试的结果图。
图7为本发明实验例2中模拟原代循环肿瘤细胞捕获结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种集成微流控芯片(结构如图1-图4E所示)，用于原代CTCs捕获、原代CTCs捕获体外培养形成CTCs肿瘤细胞球以及药物筛选。
该集成微流控芯片设置有微液滴生成部1、连通部2和捕获培养部3；
微液滴生成部1由第一样本入口11、第二样本入口12、油相入口13、第一样本进液通道14、第二样本进液通道15、样本进液汇集通道16、油相进液通道17、第一油相分流通道18、第二油相分流通道19和微液滴生成十字通道10组成；其中，液滴生成十字通道10由顺时针设置的第一通道101、第二通道102、第三通道103和第四通道104组成；第一样本入口11与第一样本进液通道14入口连接，第二样本入口12与第二样本进液通道15入口连接，第一样本进液通道14出口、第二样本进液通道15出口分别与样本进液汇集通道16入口连接，油相入口17与油相进液通道17入口连接，油相进液通道17出口分别与第一油相分流通道18入口、第二油相分流通道19入口连接，第一油相分流通道出口18、样本进液汇集通道出口16、第二油相分流通道19出口分别与微液滴生成十字通道10的第一通道101、第二通道102、第三通道103对应连接；
连通部2包括3层分流通路，第1层分流通路包括1个分流支路，第2层分流通路包括2个分流支路，第3层分流通路包括4个分流支路；每个分流支路均包括两个分流通道；第1层分流通路的分流支路211的第1分流通道2111的出口与第2层分流通路中的第1分流支路221的两个分流通道的入口连接，第1层分流通路的分流支路211的第2分流通道2112的出口与第2层分流通路中的第2分流支路222的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第1分流支路221的第1分流通道2211的出口与第3层分流通路中的第1分流支路231的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第1分流支路221的第2分流通道2212的出口与第3层分流通路中的第2分流支路232的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第2分流支路222的第1分流通道2221的出口与第3层分流通路中的第3分流支路233的两个分流通道的入口连接，第2层分流通路中第2分流支路222的第2分流通道2222的出口与第3层分流通路中的第4分流支路234的两个分流通道的入口连接；
捕获培养部3包括8个捕获通道31和8个流体出口32，每个捕获通道31包括捕获空腔311和设置于捕获空腔底面的2000个各自独立的捕获小室312；各捕获空腔311的出口与流体出口32一一对应连接；
微液滴生成十字通道10的第四通道104的出口作为微液滴生成部1的出口，第1层分流通路的分流支路211的第1分流通道2111的入口、第2分流通道2112的入口作为连通部2的入口，第四通道104的出口分别与第1层分流通路的分流支路211的第1分流通道2111的入口、第2分流通道2112的入口连接；第3层分流通路中的第1分流支路231的第1分流支路2311的出口和第2分流支路2312的出口、第3层分流通路中的第2分流支路232的第1分流支路2321的出口和第2分流支路2322的出口、第3层分流通路中的第3分流支路233的第1分流支路2331的出口和第2分流支路2332的出口、第3层分流通路中的第4分流支路234的第1分流支路2341的出口和第2分流支路2342的出口作为微液滴生成部的出口作为连通部2的分流出口，捕获空腔311的入口作为捕获培养部3的入口，连通部2的各分流出口与各捕获空腔311的入口一一对应连接；
本实施例提供的集成微流控芯片由上层芯片和下层芯片上下叠放粘合形成；在上层芯片上刻蚀微液滴生成部1、连通部2和捕获培养部3的捕获空腔311和流体出口32；下层芯片上刻蚀有捕获培养部的捕获小室312(先通过3D打印方法获取捕获小室3D打印模板，利用该3D打印模板通过软刻蚀方法在下层芯片上刻蚀捕获小室312)。
其中，上层芯片和下层芯片的材质为聚二甲基硅氧烷。
其中，捕获小室312为上宽下窄结构，捕获小室上方开口、侧壁呈圆台状、底面下陷呈球冠状，球冠状底面与侧壁相切。其中，捕获小室312的内表面进行过全氟表面修饰剂CYTOP修饰，捕获小室312的内表面接触角为115度。
其中，每个捕获空腔31底面设置的捕获小室的排列方式满足：
形成多个等间距平行设置的捕获小室行，各捕获小室行由多个等间距设置的捕获小室组成，相邻捕获小室行的捕获小室交叉排列；每个捕获小室行中相邻的捕获小室312之间的间隔距离G2为0.2mm，相邻捕获小室行的间隔距离G1为0.14mm；各捕获小室的开口处直径d1为0.25mm、底面与侧壁连接处直径d2为0.15mm、开口处到底面最低点的距离h为0.28mm。
其中，样本进液汇集通道16的宽度为100微米、深度为100微米，第一油相分流通道18的宽度为200微米、深度为100微米，第二油相分流通道19的宽度为200微米、深度为100微米，微液滴生成十字通道10的第一通道101的宽度为200微米、深度为100微米，微液滴生成十字通道10的第二通道102的宽度为75微米、深度为100微米，微液滴生成十字通道10的第三通道103的宽度为200微米、深度为100微米，微液滴生成十字通道10的第四通道104的宽度为100微米、深度为100微米，第一样本进液通道14的宽度为100微米、深度为100微米，第二样本进液通道15的宽度为100微米、深度为100微米，油相进液通道17的宽度为200微米、深度为100微米；每个捕获空腔311的长度为50mm、宽度为80mm。
其中，微液滴生成十字通道10的第一通道101、第三通道103形状(包括尺寸)相同。
其中，第一样本进液通道14选用S型通道，第二样本进液通道15选用S型通道，第一样本进液通道14与第二样本进液通道15形状(包括尺寸)相同且以样本进液汇集通道16所在直线为基准对称设置。
其中，第一油相分流通道18与第二油相分流通道19形状(包括尺寸)相同且以以微液滴生成十字通道10的第二通道102、第四通道104所在直线为基准对称设置。
其中，连通部2各层分流通路中的各分流通道均设置有S型缓冲区。
其中，同一层分流通路中的各分流通道形状(包括尺寸)相同，第1层分流通路的分流支路211的第1分流通道2111、第2分流通道2112以微液滴生成十字通道10的第四通道104所在直线为基准对称设置，第2层分流通路的第1分流支路221、第2分流支路222以微液滴生成十字通道10的第四通道104所在直线为基准对称设置，第3层分流通路的第1分流支路231、第4分流支路234以微液滴生成十字通道10的第四通道104所在直线为基准对称设置，第3层分流通路的第2分流支路232、第3分流支路233以微液滴生成十字通道10的第四通道104所在直线为基准对称设置。
其中，第1层分流通路的分流通道的宽度为100微米、深度为100微米；第2层分流通路的分流通道的宽度为100微米、深度为100微米；第3层分流通路的分流通道的宽度为100微米、深度为100微米。
实施例2
本实施例提供了一种原代循环肿瘤细胞体外处理方法，该方法使用实施例1提供的集成微流控芯片进行，其中，该方法包括：
(1)将掺杂A549细胞的全血通过红细胞裂解后收集白膜层获取肿瘤细胞与白细胞混合物，并重悬于含10％胎牛血清(FBS)和1％双抗的DMEM完全培养基中，得到即为芯片上样起始样本。
(2)将起始样本作为水相自样本入口注入，同时将石蜡油自油相入口注入；两相在液滴生成部中汇合乳化形成包裹肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴，所述包裹肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴为油包水乳化液滴；微液滴经连通部流入捕获通道的捕获空腔，进入捕获空腔的微液滴基于油水密度差进入下方的捕获小室，收集出口处未进入捕获小室的微液滴并再次由样本入口通入到捕获空腔中；
(3)当不少于90％的捕获小室含有微液滴后，继续通入石蜡油，填充剩余捕获空腔，进而以0.5μL/min的流速通入破乳剂进行破乳，捕获完成；
(4)捕获完成后，以同样的流速缓慢通入完全培养基，将芯片置于37摄氏度，5％CO2，1％O2环境下培养形成肿瘤细胞球，完成肿瘤细胞球培养；使用显微镜对CTCs肿瘤球形成进行24小时的实施监控和记录；
(5)肿瘤细胞球培养完成后，通过控制一个样本入口通入药品、控制另一个样本入口通入培养基在连通部形成不同浓度的药物梯度，对肿瘤细胞球作用一定时间后，通过与其他检测仪器配合检测IC50值等指标，基于检测的指标实现药物筛选。
实施例3
本实施例提供了一种原代循环肿瘤细胞体外处理方法，该方法使用实施例1提供的集成微流控芯片进行，其中，该方法包括：
(1)收集10mL肿瘤病人血样于无菌EDTA采血管中，将10mL全血及20mL红细胞裂解液加入50mL离心管中，裂解3min，轻柔混合，直至获得深红色悬浮液；裂解的血样室温下1000g离心5min，去除上清，注意避免冲散沉淀；然后用5mL PBS重悬沉淀，再次室温300g离心3min，去除红细胞碎片，若还有碎片可选择再次离心；然后利用1mLDMEM+10％FBS+1％双抗重悬细胞，得到芯片上样起始样本。
(2)将起始样本作为水相自样本入口注入，同时将石蜡油自油相入口注入；两相在液滴生成部中汇合乳化形成包裹肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴，所述包裹肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴为油包水乳化液滴；微液滴经连通部流入捕获通道的捕获空腔，进入捕获空腔的微液滴基于油水密度差进入下方的捕获小室；收集出口处未进入捕获小室的微液滴并再次由样本入口通入到捕获空腔中；
(3)当不少于90％的捕获小室含有微液滴后，继续通入石蜡油，填充剩余捕获空腔，进而以0.5μL/min的流速通入破乳剂进行破乳，捕获完成；
(4)捕获完成后，以同样的流速缓慢通入完全培养基，将芯片置于37摄氏度，5％CO2，1％O2环境下培养形成肿瘤细胞球，完成肿瘤细胞球培养；使用显微镜对CTCs肿瘤球形成进行24小时的实施监控和记录；
(5)肿瘤细胞球培养完成后，通过控制一个样本入口通入药品、控制另一个样本入口通入培养基在连通部形成不同浓度的药物梯度，对肿瘤细胞球作用一定时间后，通过与其他检测仪器配合检测IC50值等指标，基于检测的指标实现药物筛选。
对比例1
本对比例提供了另外一种集成微流控芯片，该集成微流控芯片与实施例1提供的微流控芯片的区别在于微流控小室的形状以及表面亲疏水性不同；具体而言，本对比例提供的集成微流控芯片中微流控小室形状为圆柱状(直径为0.25mm、深度为0.28mm)，微流控小室内表面没有进行过全氟表面修饰剂CYTOP修饰，此时捕获小室的内表面接触角为105度。
对比例2
本对比例提供了另外一种集成微流控芯片，该集成微流控芯片与实施例1提供的微流控芯片的区别在于微流控小室的表面亲疏水性不同；具体而言，本对比例提供的集成微流控芯片中微流控小室内表面没有进行过全氟表面修饰剂CYTOP修饰，此时捕获小室的内表面接触角为105度。
对比例3
本对比例提供了另外一种开放芯片，该开放式芯片与实施例1提供的微流控芯片的区别在于每个捕获空腔上端为开放式，且芯片不含液滴生成部和连通部；具体而言，经过重悬的样本不需要生成液滴后再捕获，而是直接从开放的上端进行加样，细胞通过重力作用进行沉降及捕获，其下层芯片的捕获小室的尺寸及分布与实施例1中的一致。
实验例1
分别利用实施例1、对比例1提供的集成微流控芯片进行相同条件下的原代循环肿瘤细胞体外培养；具体过程包括：分别利用实施例1及对比例1提供的集成式微流控芯片对样本细胞进行捕获后(过程参见实施例2步骤(1)-步骤(3))，以同样的流速(0.5μL/min)缓慢通入DMEM完全培养基，将芯片置于37摄氏度，5％CO2，1％O2环境下培养14天，使用显微镜对肿瘤球形成过程进行24小时的实施监控和记录。
结果如图5A、图5B所示。
对比图5A、图5B可以明显看出实施例1提供的集成微流控芯片更有利于实现原代循环肿瘤细胞体外培养得到肿瘤细胞球。
实验例2
分别对实施例1、对比例2提供的集成微流控芯片在相同条件下进行贴壁测试；具体过程包括：将转染GFP基因的小鼠骨髓间充质干细胞用于比对芯片表面处理前后的细胞黏附情况。细胞接种前，芯片灭菌30min。细胞悬浮于细胞培养液中，以10000/cm-2细胞密度接种。在培养基中培养24h后，用DPBS缓冲液冲洗去除未附着的细胞，用共聚焦显微镜观察细胞在处理前后的芯片表面的黏附情况。
结果如图6A、图6B所示。
对比图6A、图6B可以明显看出实施例1提供的集成微流控芯片更有利于减少细胞对于芯片表面的黏附，从而为肿瘤细胞成球提供条件。
实验例3
分别利用实施例1、对比例3提供的微流控芯片进行相同条件下的模拟循环肿瘤细胞捕获；具体过程包括：
(1)将掺杂利用Calcein-AM染色的A549细胞的全血通过红细胞裂解后收集白膜层获取肿瘤细胞与白细胞混合物，并重悬于含10％胎牛血清(FBS)和1％双抗的DMEM完全培养基中，得到即为芯片上样起始样本。
(2)利用实施例1提供的微流控芯片进行原代循环肿瘤细胞捕获；具体过程包括：
将起始样本作为水相自样本入口注入，同时将石蜡油自油相入口注入；两相在液滴生成部中汇合乳化形成包裹肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴，所述包裹肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴为油包水乳化液滴；微液滴经连通部流入捕获通道的捕获空腔，进入捕获空腔的微液滴基于油水密度差进入下方的捕获小室，收集出口处未进入捕获小室的微液滴并再次由样本入口通入到捕获空腔中；当不少于90％的捕获小室含有微液滴后，继续通入石蜡油，填充剩余捕获空腔，进而以0.5μL/min的流速通入破乳剂进行破乳，捕获完成；
(3)利用对比例3提供的开放芯片进行原代循环肿瘤细胞捕获；具体过程包括：
将同样体积的起始样本从捕获空腔的开放上端加入，使细胞利用重力自然沉降到下方捕获小室内。
在荧光显微镜下对于捕获小室内的肿瘤细胞进行计数，并与起始投入量进行比较，结果如图7所示。
由图7可以明显看出实施例1提供的集成微流控芯片更有利于实现模拟循环肿瘤细胞捕获。
以上参照附图描述了本发明的优选实施方式。这些实施方式的许多特征和优点根据该详细的说明书是清楚的，因此权利要求旨在覆盖这些实施方式的落入其真实精神和范围内的所有这些特征和优点。此外，由于本领域的技术人员容易想到很多修改和改变，因此不是要将本发明的实施方式限于所例示和描述的精确结构和操作，而是可以涵盖落入其范围内的所有合适修改和等同物。

Claims (10)

1.一种集成微流控芯片，其中，该芯片设置有微液滴生成部、连通部和捕获培养部；微液滴生成部的出口与连通部的入口连接，连通部的出口与捕获培养部的入口连接；其中，
所述微液滴生成部包括样本入口和油相入口；
所述捕获培养部包括至少一个捕获通道和至少一个流体出口，所述捕获通道包括捕获空腔和设置于捕获空腔底面的多个各自独立的捕获小室；捕获空腔的出口与流体出口连接；捕获空腔的入口作为捕获培养部的入口与连通部的出口连接；
其中，捕获小室为上宽下窄结构，捕获小室上方开口、侧壁呈圆台状、底面下陷呈球冠状。
2.根据权利要求1所述的集成微流控芯片，其中，所述集成微流控芯片由上层芯片和下层芯片上下叠放粘合形成；其中，上层芯片上刻蚀有微液滴生成部、连通部和捕获培养部的捕获空腔和流体出口；下层芯片上刻蚀有捕获培养部的捕获小室。
3.根据权利要求1所述的集成微流控芯片，其中，所述微液滴生成部包括：
第一样本入口、第二样本入口、油相入口、第一样本进液通道、第二样本进液通道、样本进液汇集通道、油相进液通道、第一油相分流通道、第二油相分流通道、微液滴生成十字通道；其中，
微液滴生成十字通道由顺时针设置的第一通道、第二通道、第三通道和第四通道组成；
第一样本入口与第一样本进液通道入口连接，第二样本入口与第二样本进液通道入口连接，第一样本进液通道出口、第二样本进液通道出口分别与样本进液汇集通道入口连接，油相入口与油相进液通道入口连接，油相进液通道出口分别与第一油相分流通道入口、第二油相分流通道入口连接，第一油相分流通道出口、样本进液汇集通道出口、第二油相分流通道出口分别与微液滴生成十字通道的第一通道、第二通道、第三通道对应连接，微液滴生成十字通道的第四通道作为微液滴生成部的出口与所述连通部的入口连接；
优选地，所述样本进液汇集通道的宽度为100-200微米、深度为100-200微米，第一油相分流通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，第二油相分流通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，微液滴生成十字通道的第一通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，微液滴生成十字通道的第二通道的宽度为70-200微米、深度为70-200微米，微液滴生成十字通道的第三通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米，微液滴生成十字通道的第四通道的宽度为100～200微米、深度为100-200微米；
进一步优选地，所述第一样本进液通道的宽度为100-200微米、深度为100-200微米，第二样本进液通道的宽度为100-200微米、深度为100-200微米，油相进液通道的宽度为100-300微米、深度为100-300微米。
4.根据权利要求1所述的集成微流控芯片，其中，捕获小室内表面接触角为110-150度；
优选地，所述捕获小室的内表面进行过全氟表面修饰剂修饰；
更优选地，所述全氟表面修饰剂选用CYTOP、Teflon AF、和/或、Pluronic F127。
5.根据权利要求1所述的集成微流控芯片，其中，
捕获小室的开口处直径为0.1-0.3mm、底面与侧壁连接处直径为0.06-0.18mm、底部到顶部的扩张角为10-30度；
每个捕获空腔的长度为10-100mm、宽度为1-20mm；
每个捕获空腔底面设置的捕获小室的数量为1000-5000个。
6.根据权利要求1、4、5中任一项所述的集成微流控芯片，其中，对于每个捕获空腔底面设置的捕获小室的排列方式满足：
形成多个等间距平行设置的捕获小室行，各捕获小室行由多个等间距设置的捕获小室组成，相邻捕获小室行的捕获小室交叉排列；
优选地，每个捕获小室行中相邻的捕获小室之间的间隔距离为0.1-0.5mm，相邻捕获小室行的间隔距离为0.1-0.4mm。
7.根据权利要求1所述的集成微流控芯片，其中，不同捕获通道的捕获空腔的出口连接不同的流体出口。
8.根据权利要求1、3、7中任一项所述的集成微流控芯片，其中，所述连通部选用浓度梯度形成结构，包括n个分流出口，n≥2；所述捕获通道的数量为n，所述流体出口的数量不小于n；所述连通部的各分流出口与各捕获通道的捕获空腔的入口一一对应连接；
优选地，所述连通部包括m层分流通路，m≥1；其中，第i层分流通路包括2i-1个分流支路，1≤i≤m；每个分流支路均包括两个分流通道；每个分流通道的出口均与下一层分流通路中的某一个分流支路的两个分流通道的入口连接并且不同分流通道的出口连接不同的分流支路，最后一层分流通路的各分流通道的出口即为所述分流出口，第一层分流通路的分流通道的入口作为连通部的入口与微液滴生成部的出口连接；
更优选地，连通部中各个通道的宽度为100-200微米、深度100-200微米。
9.一种原代循环肿瘤细胞体外处理方法，该方法使用权利要求1-8任一项所述的集成微流控芯片进行，其中，该方法包括：
1)将含有原代循环肿瘤细胞和免疫细胞的起始样本作为水相自样本入口注入，同时将油相自油相入口注入；两相在液滴生成部中汇合乳化形成包裹原代循环肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴，所述包裹原代循环肿瘤细胞与免疫细胞的微液滴为油包水乳化液滴；微液滴经连通部流入捕获通道的捕获空腔，进入捕获空腔的微液滴基于油水密度差进入下方的捕获小室；
2)当不少于90％的捕获小室含有微液滴后，通入破乳剂进行破乳，原代循环肿瘤细胞及免疫细胞混合物捕获完成；
优选地，步骤1)中，在捕获空腔的出口收集未进入捕获小室的微液滴，并将收集到的微液滴通过样本入口注入；
优选地，所述含有原代循环肿瘤细胞和免疫细胞的起始样本通过下述方式制备得到：
将含有原代循环肿瘤细胞的全血样本进行红细胞的裂解，并将裂解后剩余细胞利用培养基重悬得到含有原代循环肿瘤细胞和免疫细胞的起始样本。
10.根据权利要求9所述的处理方法，其中，该方法进一步包括：
原代循环肿瘤细胞捕获完成后，通入培养基进行原代循环肿瘤细胞培养形成肿瘤细胞球，完成肿瘤细胞球培养；
优选地，该方法进一步包括：
肿瘤细胞球培养完成后，通入待筛选药物，对肿瘤细胞球作用一定时间后进行指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
更优选地，当微液滴生成部包括至少两个样本入口、连通部选用浓度梯度形成结构时，通过控制一个样本入口通入药品、控制另一个样本入口通入培养基在连通部形成不同浓度的药物梯度，对肿瘤细胞球作用一定时间后进行指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
更优选地，当微液滴生成部包括至少两个样本入口、连通部选用浓度梯度形成结构时，通过控制一个样本入口通入一种药品、控制另一个样本入口通入另一种在连通部形成两种药物浓度梯度组合，对肿瘤细胞球作用一定时间后进行指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
更优选地，当捕获培养部包括多个捕获通道和多个流体出口、且不同捕获通道的捕获空腔的出口连接不同的流体出口时，通入待筛选药物，对肿瘤细胞球作用一定时间后，自不同的流体出口向不同的捕获空腔中加入不同检测试剂进行不同指标检测，基于检测的指标实现药物筛选；
进一步优选地，所述指标检测通过下述方式实现：
在流体出口向捕获空腔中加入检测试剂进行检测。
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