CN112430542A - 集成微流控三维肿瘤芯片及仿生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种集成微流控三维肿瘤芯片及仿生方法。芯片包括流动层和控制层。流动层包括设有入口和出口的微腔、化学梯度发生微管道和化学梯度发生微柱阵列。化学梯度发生微管道设置于微腔侧面，并与微腔共用化学梯度发生微柱阵列作为侧壁。控制层设有弹性微结构和末端封闭的微管道。弹性微结构在注入预设压力的流体后膨胀成侧壁上开有一个开口的三维筒状结构并伸入至微腔内。微管道连接弹性微结构，且数量至少为两根，并平行于化学梯度发生微管道设置，每根微管道上至少连通一个弹性微结构。本发明可在单个芯片内连续性完成阵列化肿瘤细胞捕获定位、高通量三维肿瘤仿生制备、浓度梯度式肿瘤刺激作用、特定浓度刺激的肿瘤样本回收操作。

Description

集成微流控三维肿瘤芯片及仿生方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种集成微流控三维肿瘤芯片及其用于阵列化肿瘤细胞捕获定位、高通量三维肿瘤仿生制备、浓度梯度式肿瘤刺激与其分析、特定浓度刺激的肿瘤样本回收的精确时空控制操作的仿生方法。
背景技术
癌症是一个主要的全世界公共卫生问题。根据世界卫生组织最新的统计数据显示，在90多个国家中，癌症可能将成为人类死亡的第一或第二大原因。在体外建立有效的三维肿瘤仿生模型系统，对肿瘤的病理机制和治疗方法进行探索，一直是全人类广泛关注的研究课题。在过去的几十年里，国内外研究人员先后建立了不同的体外三维肿瘤制备与模型构建操作方法，包括悬滴法、抗黏附界面法、旋转培养法、多孔支架法等，并将其用于开展抗肿瘤分析与治疗评估。然而，这些方法仍存在着操作繁琐、费时、费力、三维肿瘤尺寸不均匀、操作通量低等缺点，严重阻碍其后期应用。
微流控芯片技术，是本世纪极具代表性的一种微流体界面精确操作技术。微流控芯片的特点在于，它可以实现常规实验室诸多基本功能的微型化和集成化；特别是，微流控芯片技术能够完成在微米级尺度下对细胞的时间与空间控制。目前，微流控芯片技术已经实现了高通量、尺寸均一的三维肿瘤制备及抗肿瘤分析初步应用。所制备的三维肿瘤直径一般小于300μm。但是，微流控芯片内高度仿生三维肿瘤的高通量制备、单个芯片内三维肿瘤的不同浓度物质同步刺激作用与分析、芯片内特定肿瘤样本的精确回收等相关的时间与空间精确控制性操作方法仍在进一步研究与开发中。因此，开发新型的微流控三维肿瘤芯片系统，有利于进一步推动体外肿瘤生物学研究的仿生化与微型化发展。
发明内容
本发明目的在于，提供一种集成微流控三维肿瘤芯片，并提供一种用于阵列化肿瘤细胞捕获定位、高通量三维肿瘤仿生制备、浓度梯度式肿瘤刺激与其分析、特定浓度刺激的肿瘤样本回收的仿生方法。该芯片操作简单，易于研究人员掌握。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
一种集成微流控三维肿瘤芯片，其特征在于，包括流动层和控制层；所述的流动层包括微腔、化学梯度发生微管道和化学梯度发生微柱阵列，所述的微腔上设有微腔入口和微腔出口，所述的化学梯度发生微管道设置于微腔侧面，并与微腔共用化学梯度发生微柱阵列作为侧壁，以将化学梯度发生微管道内通入的物质由化学梯度发生微柱阵列扩散至微腔内；所述的控制层包括弹性微结构和末端封闭的微管道，所述的弹性微结构在注入预设压力的流体后膨胀成侧壁上开有一个开口的三维筒状结构并伸入至微腔内，以捕获注入至微腔内的细胞，并在流体压力消失后自行收缩为平面的二维结构，所述的微管道连接弹性微结构，以向弹性微结构内注入并保持稳定压力的流体及在停止注入后回收流体，微管道的数量至少为两根，且平行于化学梯度发生微管道设置，每根微管道上至少连通一个弹性微结构。
所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，所述的化学梯度发生微管道和化学梯度发生微柱阵列的数量为两对，且设置于微腔的相对两侧。
所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，所述的注入到弹性微结构中的流体为气体或液体。
所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，微腔内设有均匀分布的支撑微柱，所述的支撑微柱的高度与微腔内部高度一致，以支撑整个微腔。
所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，所述的微腔入口为设有一个管道进口和至少两个管道出口的管道结构，且管道出口连接至微腔一侧并等距均匀分布，所述的微腔出口设置于微腔上相对微腔入口的另一侧；所述的弹性微结构所形成的三维筒状结构的高度与微腔内部高度一致，开口朝向微腔入口，且在开口相对另一侧设有小于注入微腔内细胞大小的缝隙。
所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，所述的化学梯度发生微柱阵列包括多列交错排列的微柱，微柱之间的间距为1-5μm，所述的弹性微结构形成的三维筒状结构内径为500-900μm。
一种集成微流控三维肿瘤芯片的仿生方法，采用前述的芯片，包括如下步骤，
关闭化学梯度发生微管道，由微腔入口灌注肿瘤细胞悬液；
向弹性微结构注入流体以形成具有开口的三维筒状结构，从而捕获细胞；
灌注新鲜细胞培养液，使捕获的肿瘤细胞自组装聚集形成三维肿瘤；
关闭微腔入口和微腔出口，打开化学梯度发生微管道，在相同的流速条件下，将含有特定刺激物质的细胞培养液和不含特定刺激物质的细胞培养液分别灌注进入不同的化学梯度发生微管道，特定刺激物质通过分子扩散穿过化学梯度发生微柱阵列，并在微腔内形成浓度梯度，使微腔内不同微管道上的弹性微结构内的三维肿瘤受到不同浓度特定刺激物质的刺激作用；
当需要对微腔内特定刺激物质浓度作用的三维肿瘤进行回收时，停止与特定浓度位置对应的单根微管道的流体注入，连接该微管道的弹性微结构自行收缩为平面的二维结构，对应的三维肿瘤被释放并随液流排出，到达样品出口。
所述的方法，在灌注肿瘤细胞悬液前，还包括向微腔和化学梯度发生微管道内注入具有亲水和抗细胞黏附作用的物质水溶液，进行亲水修饰和抗细胞黏附修饰的步骤，所述具有亲水和抗细胞黏附作用的物质为Pluronic F-127、Pluronic F-108、Pluronic F-98中的一种；在修饰完成后，还包括清洗微腔和化学梯度发生微管道的步骤。
所述的方法，所述的肿瘤细胞为哺乳动物的原代肿瘤细胞或者肿瘤细胞系。
所述的方法，所述的特定刺激物质为抗肿瘤药物、细胞因子、生长因子、蛋白质和核酸中的一种或几种。
本发明的集成微流控三维肿瘤芯片，其有益技术效果在于：可以在单个芯片内连续性完成阵列化肿瘤细胞捕获定位、高通量三维肿瘤仿生制备、浓度梯度式肿瘤刺激作用、特定浓度刺激的肿瘤样本回收操作。特别是能够根据研究需要，实现在单次仿生操作中培养出多个不同浓度梯度刺激物质作用下的三维肿瘤，并能够单独对指定浓度下培养出的三维肿瘤样本进行单独回收，相较于以往的微流控芯片内肿瘤细胞操作与三维肿瘤构建方法，其具有更好的时间与空间控制性及灵活性，且具有更好的三维肿瘤体外仿生效果，同时具有操作简单快捷、高效等特点，能够广泛用于各种仿生三维肿瘤相关的体外细胞操作与分析应用。
附图说明
图1为本发明实施例集成微流控三维肿瘤芯片的流动层和控制层平面结构示意图，其中1为流动层微腔的微腔入口，2和3分别为流动层的两个化学梯度发生微管道的入口、4为流动层微腔的微腔出口、5和6分别为流动层的两个化学梯度发生微管道的出口，7为流动层的化学梯度发生微管道中的一根，8为流动层的化学梯度发生微柱阵列，9为流动层的微腔，10为流动层的微腔入口管道结构，11为流动层的微腔支撑微柱，12和13为控制层的各微管道流体入口，14为控制层的弹性微结构，15为控制层的末端封闭的微管道。
图2为未施加外源流体压力作用条件下的弹性微结构示意图，其中21为弹性微结构的二维状态，22为未施加外源流体压力作用条件下控制层的末端封闭的微管道。
图3为施加一定外源气压作用条件下的弹性微结构示意图，其中31为弹性微结构的三维状态，32为施加外源气压作用条件下控制层的末端封闭的微管道，33为微管道施加外源流体压力的流体入口，34为弹性微结构上相对开口设置的缝隙。
图4为本发明微腔内肿瘤细胞进样示意图，其中41和42为关闭状态的化学梯度发生微管道入口，43和44为关闭状态的化学梯度发生微管道出口，45为收缩为二维状态的弹性微结构，46为肿瘤细胞。
图5为本发明微腔内肿瘤细胞捕获示意图，其中51为膨胀为三维状态的弹性微结构，52为已捕获的肿瘤细胞群。
图6为本发明弹性微结构内肿瘤细胞自组装形成肿瘤示意图，其中61为自组装形成的三维肿瘤。
图7为本发明微腔内浓度梯度式刺激处理肿瘤示意图，其中71为关闭状态的微腔入口，72为关闭状态的微腔出口，73为特定刺激物质，74为微腔内形成的特定刺激物质浓度梯度，75为特定浓度刺激的三维肿瘤。
图8为本发明微腔内特定浓度刺激的肿瘤样本回收示意图，其中81为从一根微管道上的单组弹性微结构中释放的三维肿瘤。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。应当理解，本发明所述的实例是说明性的，而不是限定性的，因此本发明不限于具体实施方式中所述的实例，凡是由本领域技术人员根据本发明的技术方案得出的其他实施方式，不脱离本发明宗旨和范围的，不论是修改还是替换，同样属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例所使用的集成微流控芯片，材料为聚二甲基硅氧烷，通过氧等离子体处理后不可逆封接于玻璃表面。该集成微流控三维肿瘤芯片由流动层和控制层组成。
如图1所示，本实施例的芯片流动层包含1个微腔9，并在微腔的一侧设有微腔入口10，该微腔入口为设有一个管道进口1和至少两个管道出口的管道结构，且管道出口连接至微腔一侧并等距均匀分布，以使输入到微腔内的物质尽可能均匀的分散到微腔内。相应的微腔出口4设置在微腔上相对微腔入口的另一侧，以使输入到微腔内的物质能够在通过整个微腔后再由微腔出口流出。微腔的另外两侧分别设有2个化学梯度发生微柱阵列8作为微腔的两个侧壁，两根化学梯度发生微管道分别与微腔共用1个化学梯度发生微柱阵列，使微腔两侧均存在一个用于实现微腔内化学浓度梯度化的结构。化学梯度发生微柱阵列8包括多列交错排列的微柱，微柱之间的间距可设为1-5μm，本实施例中设置为2μm，以使刺激物质有效的分散至微腔内，在微腔内实现浓度梯度。每根化学梯度发生微管道上分别设有入口和出口，以使含有刺激物质的溶液在化学梯度发生微管道流动。微腔内还设有均匀分布的支撑微柱，支撑微柱的高度与微腔内部高度一致，以支撑整个微腔，防止微腔坍塌。芯片控制层包含弹性微结构和末端封闭的微管道，弹性微结构在注入预设压力的流体后膨胀成侧壁上开有一个开口的三维筒状结构并伸入至微腔内，以捕获注入至微腔内的肿瘤。本实施例中的弹性微结构的内径为500μm，即用于制备直径尺寸为500μm的三维肿瘤。注入到弹性微结构中的流体可以是气体或者液体，本实施例中使用的是气体，由于弹性微结构是由具有弹性的材料聚二甲基硅氧烷制成，故在在注入的气体回收后，该弹性微结构能够自行收缩为平面的二维结构。微管道连接弹性微结构，以向弹性微结构内注入并保持稳定压力的流体及在停止注入后回收流体。微管道的数量根据需要设置，但为了实现微腔内不同梯度浓度刺激物质对于三维肿瘤的刺激，其数量至少为两根，本实施例中设置了15根微管道。每根微管道上根据需要至少连通一个弹性微结构，即每根微管道上的弹性微结构为同一组，本实施例一组弹性微结构的数量为7个。而为了实现同一梯度浓度刺激物质对同一组弹性微结构内的三维肿瘤进行刺激处理，微管道是平行于化学梯度发生微管道设置的。同时为了在对于三维肿瘤样本进行回收时，能够精确的选择特定梯度浓度培养下的三维肿瘤回收，每根微管道都设置了单独的注入口。在需要对特定的一组弹性微结构内的三维肿瘤进行回收时，只要撤除相应微管道内流体压力，弹性微结构即回弹为二维状态，所培养的三维肿瘤即被释放，由微腔出口处进行回收即可。
当对微管道未施加外源气压作用时，弹性微结构处于关闭状态，呈二维状态21，即如图2所示。当施加外源气压作用时，弹性微结构处于开启状态，呈三维状态31即如图3所示，可用于完成肿瘤细胞的捕获定位以及后续细胞培养过程中自组装三维肿瘤的定位。而为了更好的捕获肿瘤细胞，本实施例中的弹性微结构的开口33是朝向微腔入口方向的，同时在开口相对另一侧设有小于注入微腔内细胞大小的缝隙34。这样可以让肿瘤细胞流入至弹性微结构中后被捕获，而承载肿瘤细胞的液体仍可以由缝隙34处流出。
本实施例同样提供了基于集成微流控三维肿瘤芯片实现的仿生方法。
首先对微流控芯片进行亲水修饰和抗细胞黏附修饰，本实施例使用微量注射泵将浓度为5mg/mL的Pluronic F127溶液以5μL/min的流量由芯片微腔入口1注入。待PluronicF127进入芯片流动层内所有微管道和微腔后，室温孵育2小时。亲水修饰是为了大幅度提高聚二甲基硅氧烷表面对水的亲和力，便于芯片内水溶液和含样品水溶液的操作。抗细胞黏附修饰是为了大幅度降低聚二甲基硅氧烷表面的细胞黏附性，抑制细胞在其表面的黏附，进而实现细胞自组装聚集。
然后再从微腔入口灌注新鲜细胞培养液，清洗芯片流动层内所有微管道和微腔。
参见图4，关闭化学梯度发生入口和化学梯度发生出口，将细胞密度为1×106个/mL的乳腺癌细胞悬液由微腔入口1灌注进入微腔。
对弹性微结构施加一定气压作用，本实施例中为15psi，使其开启并呈三维结构状态，进而如图5所示的捕获乳腺癌细胞，一定数量的乳腺癌肿瘤细胞群被捕获定位于弹性微结构对应的流动层微腔位置52。
将该芯片放置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下连续培养9天，使乳腺癌细胞自组装形成三维肿瘤组织，如图6所示。
然后对微流控三维肿瘤芯片内进行浓度梯度式肿瘤刺激处理。
首先关闭芯片流动层的微腔入口和微腔出口。
以相同的流量条件(3μL/min)条件下，将含有长春瑞滨(浓度为100μg/mL)的细胞培养液和不含长春瑞滨的新鲜细胞培养液分别由不同的化学梯度发生入口灌注进入不同的化学梯度发生微管道，长春瑞滨73通过分子扩散穿过化学梯度发生微柱阵列，并在微腔内形成浓度梯度74，进一步，微腔内不同弹性微结构组对应的三维肿瘤75受到不同浓度长春瑞滨的刺激处理作用，如图7所示。这里采用双侧化学梯度发生微管道同时灌注含刺激物质和不含刺激物质的新鲜细胞培养液，是考虑到需要保持微腔内多梯度浓度的需要。如果只是单侧灌注含刺激物质的培养液，那么通过扩散作用，刚开始微腔内是有浓度梯度的。但是在扩散一段时间后，微腔内的浓度分布就会逐渐趋向均匀分布，导致最终不再有梯度的浓度。而采用双侧灌注的话，不管一侧的刺激物质扩散多久，都会被对侧的培养液在微腔扩散过程中稀释，可以形成长久稳定的浓度梯度。
当需要对芯片微腔内特定浓度长春瑞滨刺激后的三维肿瘤进行回收时，可任意选择时间点将与该三维肿瘤对应的单组弹性微结构的外源气压作用撤销，该组弹性微结构由开启状态时的三维结构如图3所示转变为关闭状态时的二维结构如图2所示。微腔内该组弹性微结构对应的三维肿瘤被释放。打开微腔入口和微腔出口，注入新鲜细胞培养液，使被释放的三维肿瘤随液流到达流动层微腔出口如图8所示，进而完成特定浓度刺激的三维肿瘤样本回收，完成整个仿生过程。若还需要继续进行肿瘤培养，则重复前述的浓度梯度式肿瘤刺激处理即可。
实施例2
本实施例所采用的芯片结构与实施例1中的相同。进行仿生时，则包括以下步骤：
首先对微流控芯片进行亲水修饰和抗细胞黏附修饰，本实施例使用微量注射泵将浓度为6mg/mL的Pluronic F108溶液以4μL/min的流量由芯片微腔入口注入。待PluronicF108进入芯片流动层内所有微管道和微腔后，室温孵育2小时。
然后再从微腔入口灌注新鲜细胞培养液，清洗芯片流动层内所有微管道和微腔。
关闭化学梯度发生入口和化学梯度发生出口，将细胞密度为1×106个/mL的肺癌细胞悬液由微腔入口1灌注进入微腔。
本实施例中，通过微管道对弹性微结构施加一定液压作用，液体采用纯水，本实施例中压力为20psi，使其开启并呈三维结构状态，进而捕获肺癌细胞，一定数量的肺癌肿瘤细胞群被捕获定位于弹性微结构对应的流动层微腔位置52。
将该芯片放置于36.5℃、4％CO2、饱和湿度条件下连续培养10天，使肺癌细胞自组装形成三维肿瘤组织。
然后对微流控三维肿瘤芯片内进行浓度梯度式肿瘤刺激处理。
首先关闭芯片流动层的微腔入口和微腔出口。
以相同的流量条件(3μL/min)条件下，将含有人表皮生长因子(浓度为100ng/mL)的细胞培养液和不含人表皮生长因子的新鲜细胞培养液分别由不同的化学梯度发生入口灌注进入不同的化学梯度发生微管道，人表皮生长因子通过分子扩散穿过化学梯度发生微柱阵列，并在微腔内形成浓度梯度，进一步的，微腔内不同弹性微结构组对应的三维肿瘤受到不同浓度人表皮生长因子的刺激处理作用。
当需要对芯片微腔内特定浓度人表皮生长因子刺激后的三维肿瘤进行回收时，可任意选择时间点将与该三维肿瘤对应的单组弹性微结构的外源液压作用撤销，该组弹性微结构由开启状态时的三维结构如图3所示转变为关闭状态时的二维结构如图2所示。微腔内该组弹性微结构对应的三维肿瘤被释放。打开微腔入口和微腔出口，注入新鲜细胞培养液，使被释放的三维肿瘤随液流到达流动层微腔出口如图8所示，进而完成特定浓度刺激的三维肿瘤样本回收，完成整个仿生过程。
实施例3
本实施例所采用的芯片结构与实施例1中的相同。进行仿生时，则包括以下步骤：
首先对微流控芯片进行亲水修饰和抗细胞黏附修饰，本实施例使用微量注射泵将浓度为5mg/mL的Pluronic F98溶液以6μL/min的流量由芯片微腔入口注入。待PluronicF98进入芯片流动层内所有微管道和微腔后，室温孵育2小时。
然后再从微腔入口灌注新鲜细胞培养液，清洗芯片流动层内所有微管道和微腔。
关闭化学梯度发生入口和化学梯度发生出口，将细胞密度为1×106个/mL的肝癌细胞悬液由微腔入口1灌注进入微腔。
本实施例中，通过微管道对弹性微结构施加一定气压作用，气体采用氮气，本实施例中压力为25psi，使其开启并呈三维结构状态，进而捕获肝癌细胞，一定数量的肝癌肿瘤细胞群被捕获定位于弹性微结构对应的流动层微腔位置52。
将该芯片放置于36℃、5％CO2、饱和湿度条件下连续培养10天，使肝癌细胞自组装形成三维肿瘤组织。
然后对微流控三维肿瘤芯片内进行浓度梯度式肿瘤刺激处理。
首先关闭芯片流动层的微腔入口和微腔出口。
以相同的流量条件(3μL/min)条件下，将含有胶原蛋白(浓度为100μg/mL)的细胞培养液和不含胶原蛋白的新鲜细胞培养液分别由不同的化学梯度发生入口灌注进入不同的化学梯度发生微管道，胶原蛋白通过分子扩散穿过化学梯度发生微柱阵列，并在微腔内形成浓度梯度，进一步的，微腔内不同弹性微结构组对应的三维肿瘤受到不同浓度胶原蛋白的刺激处理作用。
当需要对芯片微腔内特定浓度胶原蛋白刺激后的三维肿瘤进行回收时，可任意选择时间点将与该三维肿瘤对应的单组弹性微结构的外源液压作用撤销，该组弹性微结构由开启状态时的三维结构如图3所示转变为关闭状态时的二维结构如图2所示。微腔内该组弹性微结构对应的三维肿瘤被释放。打开微腔入口和微腔出口，注入新鲜细胞培养液，使被释放的三维肿瘤随液流到达流动层微腔出口如图8所示，进而完成特定浓度刺激的三维肿瘤样本回收，完成整个仿生过程。

Claims (10)

1.一种集成微流控三维肿瘤芯片，其特征在于，包括流动层和控制层；所述的流动层包括微腔、化学梯度发生微管道和化学梯度发生微柱阵列，所述的微腔上设有微腔入口和微腔出口，所述的化学梯度发生微管道设置于微腔侧面，并与微腔共用化学梯度发生微柱阵列作为侧壁，以将化学梯度发生微管道内通入的物质由化学梯度发生微柱阵列扩散至微腔内；所述的控制层包括弹性微结构和末端封闭的微管道，所述的弹性微结构在注入预设压力的流体后膨胀成侧壁上开有一个开口的三维筒状结构并伸入至微腔内，以捕获注入至微腔内的细胞，并在流体压力消失后自行收缩为平面的二维结构，所述的微管道连接弹性微结构，以向弹性微结构内注入并保持稳定压力的流体及在停止注入后回收流体，微管道的数量至少为两根，且平行于化学梯度发生微管道设置，每根微管道上至少连通一个弹性微结构。
2.根据权利要求1所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，其特征在于，所述的化学梯度发生微管道和化学梯度发生微柱阵列的数量为两对，且设置于微腔的相对两侧。
3.根据权利要求1所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，其特征在于，所述的注入到弹性微结构中的流体为气体或液体。
4.根据权利要求1所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，其特征在于，微腔内设有均匀分布的支撑微柱，所述的支撑微柱的高度与微腔内部高度一致，以支撑整个微腔。
5.根据权利要求1所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，其特征在于，所述的微腔入口为设有一个管道进口和至少两个管道出口的管道结构，且管道出口连接至微腔一侧并等距均匀分布，所述的微腔出口设置于微腔上相对微腔入口的另一侧；所述的弹性微结构所形成的三维筒状结构的高度与微腔内部高度一致，开口朝向微腔入口，且在开口相对另一侧设有小于注入微腔内细胞大小的缝隙。
6.根据权利要求1所述的一种集成微流控三维肿瘤芯片，其特征在于，所述的化学梯度发生微柱阵列包括多列交错排列的微柱，微柱之间的间距为1-5μm，所述的弹性微结构形成的三维筒状结构内径为500-900μm。
7.一种集成微流控三维肿瘤芯片的仿生方法，其特征在于，采用如权利要求1-6任一所述的芯片，包括如下步骤，
关闭化学梯度发生微管道，由微腔入口灌注肿瘤细胞悬液；
向弹性微结构注入流体以形成具有开口的三维筒状结构，从而捕获细胞；
灌注新鲜细胞培养液，使捕获的肿瘤细胞自组装聚集形成三维肿瘤；
关闭微腔入口和微腔出口，打开化学梯度发生微管道，在相同的流速条件下，将含有特定刺激物质的细胞培养液和不含特定刺激物质的细胞培养液分别灌注进入不同的化学梯度发生微管道，特定刺激物质通过分子扩散穿过化学梯度发生微柱阵列，并在微腔内形成浓度梯度，使微腔内不同微管道上的弹性微结构内的三维肿瘤受到不同浓度特定刺激物质的刺激作用；
当需要对微腔内特定刺激物质浓度作用的三维肿瘤进行回收时，停止与特定浓度位置对应的单根微管道的流体注入，连接该微管道的弹性微结构自行收缩为平面的二维结构，对应的三维肿瘤被释放并随液流排出，到达样品出口。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在灌注肿瘤细胞悬液前，还包括向微腔和化学梯度发生微管道内注入具有亲水和抗细胞黏附作用的物质水溶液，进行亲水修饰和抗细胞黏附修饰的步骤，所述具有亲水和抗细胞黏附作用的物质为Pluronic F-127、Pluronic F-108、Pluronic F-98中的一种；在修饰完成后，还包括清洗微腔和化学梯度发生微管道的步骤。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的肿瘤细胞为哺乳动物的原代肿瘤细胞或者肿瘤细胞系。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的特定刺激物质为抗肿瘤药物、细胞因子、生长因子、蛋白质和核酸中的一种或几种。
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