CN101165161A - 一种微流体浓度梯度细胞培养芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，包括二个进样口、三层蜿蜒管道及形成五条线性浓度梯度分布的树状结构、五个细胞培养通道和一个出样口；所述的形成浓度梯度的树状结构直接与细胞培养通道相连接，细胞培养通道中存在“坝状凹槽”结构，二个进样口对称位于水平连接管道的上方。本发明的微流体浓度梯度细胞培养芯片的制备采用软刻蚀的方法，包括下列步骤：(1)以SU－8 2000光刻胶制备模具，聚二甲基硅氧烷注塑成型；(2)经氧等离子体处理后与玻璃基片键合制作完成微流体浓度梯度细胞培养芯片。本发明的细胞培养芯片可用于细胞药物筛选和细胞毒理实验。
Description
技术领域
本发明涉及微流体芯片，具体涉及一种微流体浓度梯度细胞培养芯片及其制备方法和应用。
背景技术
细胞培养技术在人类的生活中扮演了非常重要的角色。各种疫苗大规模的生产、单克隆抗体技术的开发、各类新药的研究等等都离不开细胞培养。传统细胞培养技术存在着需要培养箱或发酵罐、培养液消耗量大等问题。微系统技术的出现，把细胞生物学与微系统技术有机的联系起来，构成细胞培养微系统。与传统的细胞培养技术相比较，基于微系统技术的细胞培养芯片，除克服了传统方法中存在的问题之外，还具有一些特有的优势：由于芯片管道都是微米量级的，有助更好地模拟人体内的细胞生活的生理环境；可以实现单个细胞的培养；可以更好的控制细胞生长发育所需营养物的量；有利于从更深层次来研究微环境改变时细胞反映的分子机理。
细胞培养技术最重要的研究应用领域之一就是细胞毒理性试验以及药物筛选，传统的细胞毒理性试验以及药物筛选方法采用的是高通量筛选模式(High-Throughput Screening，HTS)，它需要大量昂贵的基因工程细胞系、试剂以及试验性的化合物。随着微系统技术的发展，使之具备了克服常规方法存在的不足并且可以将细胞毒理性监测转变为微型化模式。要实现这样的目标，微系统技术必须具备二种属性：①在微系统平台上可以进行正常的细胞培养；②便于操控细胞培养的微环境。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，本发明提供的微流体浓度梯度细胞培养芯片包括二个进样口1、三层蜿蜒管道4及形成五条线性浓度梯度分布的树状结构2、五个细胞培养通道5和一个出样口7；所述的形成浓度梯度的树状结构2直接与细胞培养通道5相连接，细胞培养通道5中存在“坝状凹槽”结构6，二个进样口1对称位于水平连接管道3的上方。
所述的二个进样口1进样口的直径相同，进样口管道的长度、宽度均一；
所述的三层蜿蜒管道4自上而下第一层蜿蜒管道的数目为3，随着层数的增加，蜿蜒管道的数目相应增加；同一层面的蜿蜒管道对称分布，所有蜿蜒管道的长度、宽度均一；不同层面的蜿蜒管道经水平连接管道相连；
所述的水平连接管道3的长度、宽度均一；
所述的五条细胞培养通道5的长度、宽度均一；细胞培养通道5中的“坝状凹槽”结构6的凹槽直径均一，分布均匀。
浓度梯度的形成原理是：含有不同组分的溶液从不同入口进入具有树状结构的通道，在水平连接管道的分支节点相遇，通过蜿蜒通道扩散混和，如此反复，最后按照空间分布形成线性的浓度梯度。细胞培养通道中的“坝状凹槽”结构，主要目的是拦截流经细胞培养通道的单个或少量几个细胞，对细胞进行定位培养和检测。
本发明的微流体浓度梯度细胞培养芯片目标溶液可以是药物分子水溶液或普通物质水溶液，也可以是缓冲溶液或非缓冲溶液；目标细胞可以是贴壁依赖型细胞或悬浮细胞，也可以是正常体细胞或肿瘤细胞，还可以是动物细胞或植物细胞。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种微流体浓度梯度细胞培养芯片的制备方法，本发明提供的微流体浓度梯度细胞培养芯片的制备方法采用软刻蚀的方法，包括下列步骤：以SU-8 2000光刻胶制备模具，聚二甲基硅氧烷(PDMS)注塑成型，经氧等离子体处理后与玻璃基片键合制作完成微流体浓度梯度细胞培养芯片。
本发明的微流体浓度梯度细胞培养芯片将微流体浓度梯度结构与细胞培养集成一种微型分析系统，为细胞培养提供了具有梯度浓度的培养环境，具有制作简单、操作方便、体积小、微型化等优点。
本发明的细胞培养芯片，该芯片能够通过微流体结构形成一系列浓度梯度，作用于不同管道中的细胞阵列，可望用于细胞药物筛选和细胞毒理实验。
附图说明
图1本发明的微流体浓度梯度细胞培养芯片结构示意图；
图2五个管道中形成的溶液浓度梯度分布图；
图3芯片上小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)的培养、贴壁、增殖图；
图4五条管道中的细胞的荧光信号强度图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
罗丹明溶液的浓度梯度实验
1.取制作的PDMS细胞培养芯片，灌注充满蒸馏水，抽真空15min；
2.将二支分别装有罗丹明染料(0.048mg/l)和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.1M，pH9.4)的微量注射器放置入微量注射泵并检查；
3.以10μl/min推样速率，去除微量注射器以及连接导管内的气泡，并使二个微量注射器推样速率保持一致；
4.微量注射器分别经连接导管连接入PDMS芯片的进样口，左侧进样口连接罗丹明荧光染料，右侧进样口连接碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液；
5.调节微量注射泵，以1μl/min的推样速率进样，含有不同组分的溶液从不同入口1进入具有树状结构2的通道，在水平连接管道3的分支节点相遇，通过蜿蜒通道4扩散混和，如此反复，流经三层，最后按照空间分布形成线性的浓度梯度；不同浓度的溶液分别流入细胞培养通道5；
6.通过倒置荧光显微镜(Olympus，IX51)发射波长在590nm检测，镜载CCD相机(OlympusDP70)拍摄记录。
实验结果如图2所示，五条管道中呈现了五个不同罗丹明荧光信号强度且荧光信号强度从左至右依次减小。结果表明五个管道中形成了溶液浓度梯度分布。
实施例2
芯片上小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)的培养
1.PDMS芯片管道中灌满75％乙醇，放置2hr；
2.取出，灌流PBS溶液，去除乙醇。芯片放置于超净台，紫外照射4hr；
3.胎牛血清灌注满整个芯片微管道，并将芯片的进/出样口封闭，放入37℃恒温培养箱过夜；
4.将小鼠胚胎成纤维细胞(3T3细胞)悬液经微量注射泵以拉样方式灌注入芯片管道，其中的“坝状凹槽”结构6可以拦截单个或少量几个细胞，对细胞进行定位培养和检测。显微镜观察细胞在芯片管道中的分布。将芯片放入37℃、5％CO2恒温培养箱培养，镜载CCD相机照相记录。
实验结果如图3所示，3T3细胞进入凹槽中经4天的培养表现出正常的贴壁、生长、增殖。
实施例3
荧光染料经形成浓度梯度标记不同培养通道中的细胞
利用管道内实现罗丹明荧光染料浓度梯度分布的方法，在管道内形成Fluo-4AM染料浓度梯度标记管道内培养的PIEC细胞。Fluo-4AM染料浓度为10μM，1μl/min的进样速率，荧光显微镜观察记录，其中发射波长选择520nm。
实验结果如图4，五条管道中的细胞的荧光信号强度依次呈现明显的变化趋势，说明不同管道中的细胞确实吸收了不同浓度的荧光染料。
Claims (12)
1.一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：包括二个进样口(1)、三层蜿蜒管道(4)及形成五条线性浓度梯度分布的树状结构(2)、五个细胞培养通道(5)和一个出样口(7)；所述的形成浓度梯度的树状结构(2)直接与细胞培养通道(5)相连接，细胞培养通道(5)中存在“坝状凹槽”结构(6)，二个进样口(1)对称位于水平连接管道(3)的上方。
2.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的二个进样口(1)的直径相同，进样口管道的长度、宽度均一。
3.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的三层蜿蜒管道(4)自上而下第一层蜿蜒管道的数目为3，随着层数的增加，蜿蜒管道的数目相应增加；同一层面的蜿蜒管道对称分布，所有蜿蜒管道的长度、宽度均一；不同层面的蜿蜒管道经水平连接管道(3)相连。
4.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的水平连接管道(3)的长度、宽度均一。
5.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的五条细胞培养通道(5)的长度、宽度均一；细胞培养通道(5)中的“坝状凹槽”结构(6)的凹槽直径均一，分布均匀。
6.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的微流体浓度梯度细胞培养芯片目标溶液是药物分子水溶液或普通物质水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的微流体浓度梯度细胞培养芯片目标溶液是缓冲溶液或非缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的微流体浓度梯度细胞培养芯片目标细胞是贴壁依赖型细胞或悬浮细胞。
9.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的微流体浓度梯度细胞培养芯片目标细胞是正常体细胞或肿瘤细胞。
10.根据权利要求1所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片，其特征在于：所述的微流体浓度梯度细胞培养芯片目标细胞是动物细胞或植物细胞。
11.如权利要求1-10所述的一种微流体浓度梯度细胞培养芯片的制备方法，其特征在于采用软刻蚀的方法，包括下列步骤：
(1)以SU-8 2000光刻胶制备模具，聚二甲基硅氧烷注塑成型；
(2)经氧等离子体处理后与玻璃基片键合制作完成微流体浓度梯度细胞培养芯片。
12.一种微流体浓度梯度细胞培养芯片用于细胞药物筛选和细胞毒理实验。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131030 Termination date: 20190727 |
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