CN102140422A - 用于控制不同种细胞相互作用的装置、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于控制不同种细胞相互作用的装置、其制备方法及用途。本发明所提供的装置，包括：1)玻璃基底；和2)具有多个凹槽的聚二甲基硅氧烷印章，其贴附于玻璃基底表面，分别形成多个微流道，且各个微流道内的玻璃基底可以被选择性地通过孵育细胞外基质蛋白修饰成促进细胞粘附的基底，或者通过组装聚乙二醇硅氧烷水溶液修饰成抗细胞粘附的基底，或者未经任何修饰。本发明所提供的装置简单易操作，且可控制不同种细胞固定、全部运动或者部分运动，达到任意操纵多种细胞的目的，可用于研究多种细胞间相互作用，病理学研究和细胞生物发育学研究，并可用于药物筛选。

Description

用于控制不同种细胞相互作用的装置、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种用于控制不同种细胞相互作用的装置、其制备方法及用途。

背景技术

目前基于仅仅对一种细胞观察和操纵的体外研究系统，已无法满足基础细胞生物学和病理学研究的需要，人们常常需要在模仿生命体条件下，体外观察和操纵两种或多种细胞，通过考察它们之间的相互作用来了解生命体发育、疾病产生和发展的过程，并进一步进行药物筛选和干预。

市场上现有的研究两种细胞相互作用的装置，如美国Costar公司产品Transwell Chamber，利用带孔的薄膜将两种细胞分隔成上下两层培养，只能观察上层细胞向下的侵袭，而无法观测它们之间的相互运动，并且只能观察两种细胞之间的作用，对多种细胞相互作用无法研究。

为克服上述缺陷，本发明人先后提出了将多种细胞粘附到同一基底上的装置，如在2008年2月13日公开的中国专利申请CN101121930A中，公开了结合纳米尺度的自组装单分子膜、电化学以及微流控技术，把本来不能使细胞粘附的基底表面某些区域选择性“活化”，使得不同种细胞在指定空间粘附。此外，本发明人又在中国专利申请CN101333522A(公开日2008年12月31日)和CN101363019A(公开日2009年2月11日)中分别公开了将多种细胞在同一基底上以有序阵列方式粘附或者能够实现同时束缚、释放和选择性释放的装置及方法。这些发明中，所使用的基底均采用在玻璃表面蒸镀一层金的方法在超净间利用高真空设备来制备，成本较高，并且金层性质不稳定，不可以长期保存，不利于在生物实验室推广。

发明内容

因此，本发明的目的在于，提供一种用于控制不同种细胞相互作用的装置。

本发明的另一个目的在于，提供上述装置的制备方法及其用途。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种用于控制不同种细胞相互作用的装置，所述装置包括：1)玻璃基底；和2)具有多个凹槽的聚二甲基硅氧烷印章，其贴附于玻璃基底表面，分别形成多条微流孔道，且各条微流孔道内的玻璃基底可以被选择性地修饰成促进细胞粘附的基底或抗细胞粘附的基底，或者未经任何修饰。

优选地，所述微流孔道以三个为一组进行的修饰如下：中间微流孔道内的玻璃基底被修饰成促进细胞粘附的基底，两侧微流孔道内的玻璃基底被修饰成抗细胞粘附的基底或者未经任何修饰。

优选地，所述微流孔道内的玻璃基底通过孵育细胞外基质蛋白或促进细胞粘附的分子而被修饰成促进细胞粘附的基底；优选地地所述细胞外基质蛋白选自浓度为50～200μg/mL的纤维粘联蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，或者浓度为10～10000μg/mL的多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶；更优选地，所述孵育条件为：20～30℃，1～3小时。

优选地，所述微流孔道内的玻璃基底通过组装聚乙二醇硅氧烷水溶液而被修饰成抗细胞粘附的基底；优选地，所述聚乙二醇硅氧烷选自(CH₃O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_n CH₃和(CH₃CH₂O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃，其中n＝3～100，其体积百分比为0.2～5.0％；更优选地，所述组装条件为：60～80℃，40分钟～16小时。

优选地，所述聚二甲基硅氧烷印章的各个凹槽的两端分别向外以相对于凹槽形成任意角度的方向延伸；优选地，所述各个凹槽两端端点处分别设有加样通孔。

优选地，所述中间微流孔道的宽度为200～1000微米、深度为80～1000微米，两侧微流孔道的宽度为100～1000微米、深度为30～200微米；所述微流孔道的长度为1200～1800微米，各微流孔道之间的间距为100～500微米。

另一方面，本发明提供一种制备上述装置的方法，所述方法包括以下步骤：1)制备具有多个凹槽的聚二甲基硅氧烷印章；2)将步骤1)所制备的聚二甲基硅氧烷印章贴附于玻璃基底表面，形成多条微流孔道；3)对步骤2)所得到的各条微流孔道内的玻璃基底进行如下之一的处理：通过组装聚乙二醇硅氧烷水溶液修饰成抗细胞粘附的基底，或者孵育细胞外基质蛋白修饰成促进细胞粘附的基底，或者未经任何修饰。

优选地，所述方法步骤1)中聚二甲基硅氧烷印章是通过软刻蚀方法制备的。

优选地，所述方法步骤3)中的细胞外基质蛋白选自浓度为50～200μg/mL的纤维粘联蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，或者浓度为10～10000μg/mL的多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶；更优选地，所述孵育条件为：20～30℃，1～3小时；优选地，所述方法步骤3)中的聚乙二醇硅氧烷选自(CH₃O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃和(CH₃CH₂O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃，其中n＝3～100，其体积百分比为0.2～5.0％，组装条件为：60～80℃，40分钟～16小时。

又一方面，本发明提供了上述装置在研究不同种哺乳动物细胞相互作用中的用途；优选地，所述用途包括药物筛选、病理学研究、细胞生物学及细胞发育学研究。

此外，本发明还提供了一种控制不同种细胞相互作用的方法，所述方法包括使用上述装置同时培养不同种细胞的步骤。

优选地，所述方法包括以下步骤：1)根据上述方法制备出控制不同种细胞相互作用的装置，其中的微流孔道包括被选择性地修饰成促进细胞粘附的基底或抗细胞粘附的基底；2)制备不同种细胞的悬浮溶液，细胞密度优选为10⁵～10⁷个/mL，更优选为10⁶个/mL；3)将步骤2)所制备的细胞悬浮溶液分别通入步骤1)中被选择性地修饰成促进细胞粘附的基底的微流孔道，经培养后，揭掉聚二甲基硅氧烷印章，继续培养，得到多种细胞粘附于同一基底，且细胞生长受控于对基底的不同修饰的多种细胞相互作用体外模型。

此外，本发明目的还可采用以下技术方案来实现。本发明提供的在同一玻璃表面的基底上粘附和操纵多种细胞的装置，包括：

一基底；所述基底为玻璃表面的基底；

一下表面上具有至少一微凹槽单元的聚二甲基硅氧烷印章；所述聚二甲基硅氧烷印章的下表面贴覆于所述基底的玻璃表面上；

所述微凹槽单元由从左至右依次排列的九条凹槽组成；

其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度0.8～1.5厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为100～1000微米，凹槽深度为80～1000微米，此空间大小的凹槽有利于细胞生长(参考文献H Yu，I Meyvantsson，I Shkel，D Beebe.Lab on a Chip，2005，5，1089-1095)；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为100～1000微米，凹槽深度为30～200微米，此设计有利于促进抗拒细胞粘附基底的快速生成并节省试剂；

所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5～0.8厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.3～0.5厘米，然后再垂直折向中部0.3～0.5厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以30～60度斜角折向左右两侧0.5～0.8厘米，此设置是为了在实验中方便加入修饰试剂或细胞悬浮液，同时避免不同种细胞相互混杂；

所述左侧第四条凹槽的中间段之外的两端段以30～60度斜角折向右侧0.5～0.8厘米；

所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述六条凹槽之间的间距为100～500微米；所述九条凹槽长度在1.2～1.8厘米范围内，此设计有利于模板加工并与实验中所用器材尺寸匹配；

所述聚二甲基硅氧烷印章的下表面贴覆于所述玻璃基底表面上，在聚二甲基硅氧烷印章与所述玻璃表面之间形成九条封闭的微流道，所述部分微流道内的玻璃表面通过0.2～5.0％(体积比)末端为聚乙二醇硅氧烷的水溶液自组装而被修饰成抗细胞粘附的惰性区域。上述聚乙二醇硅氧烷浓度是通过实验优化获得的，利用扫描电镜观察结果如图2所示，表明0.2～5.0％(体积比)聚乙二醇硅氧烷修饰后的基底表面均匀(具体操作步骤可参考Z Yang，J A Galloway，H Yu.Langmuir 1999，15，8405-8411.)。此处在微流孔道内利用聚乙二醇硅氧烷自组装形成抗细胞粘附惰性区域的方法为本发明人首次发明，解决了在玻璃表面多种细胞图案化的关键问题，直接实现以玻璃表面作为基底，而无需在玻璃表面再蒸镀一层金；

另一部分微流道内的玻璃表面利用细胞外基质蛋白被修饰成促进细胞粘附的活性区域。

本发明提供的在同一玻璃基底上粘附和操纵多种细胞的方法，包括如下的步骤：

1)玻璃表面首先用飞虎酸溶液(浓硫酸∶双氧水＝3∶1)浸泡20-60分钟，以便在玻璃表面形成Si-OH结构，然后用大量双蒸水清洗至中性，干燥，待用；

2)使用微机械加工技术，在一有机玻璃板上制备包含至少一组凹型线型微结构单元的模板，该模板的凹型线型微结构单元由九条凹型条组成，即为制备聚二甲基硅氧烷印章的模板；

其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度0.8～1.5厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为200～1000微米，凹槽深度为80～1000微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为100～1000微米，凹槽深度为30～200微米；

所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5～0.8厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.3～0.5厘米，然后再垂直折向中部0.3～0.5厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以30～60度斜角折向左右两侧0.5～0.8厘米；

所述左侧第四条凹槽的中间段分为上、中、下三段，所述左侧第四条凹槽的中间段中段凹槽截面宽度向右侧宽于左侧第四条凹槽的中间段上段凹槽截面宽度100～300微米；所述左侧第四条凹槽的中间段下段凹槽截面宽度向右侧宽于左侧第四条凹槽的中间段中段凹槽截面宽度100～300微米；而且该左侧第四条凹槽中间段之外的两端段以30～60度斜角折向右侧0.5～0.8厘米；

3)用聚二甲基硅氧烷对步骤2)得到的具有至少一组凹型线型微结构单元进行二次翻膜，得到一与所述凹型线型微结构单元相对应的具有至少一组微凹型单元的聚二甲基硅氧烷印章；该聚二甲基硅氧烷印章下表面上的微凹槽单元由从左至右依次排列的九条凹槽组成；

其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度0.8～1.5厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为200～1000微米，凹槽深度为80～1000微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为100～1000微米，凹槽深度为30～200微米；所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5～0.8厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.3～0.5厘米，然后再垂直折向中部0.3～0.5厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以30～60度斜角折向左右两侧0.5～0.8厘米；

所述左侧第四条凹槽的中间段分为上、中、下三段，所述左侧第四条凹槽的中间段中段凹槽截面宽度向右侧宽于左侧第四条凹槽的中间段上段凹槽截面宽度100～300微米；所述左侧第四条凹槽的中间段下段凹槽截面宽度向右侧宽于左侧第四条凹槽的中间段中段凹槽截面宽度100～300微米；而且该左侧第四条凹槽中间段之外的两端段以30～60度斜角折向右侧0.5～0.8厘米；

所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述六条凹槽之间的间距为100～500微米；所述九条凹槽长度在1.2～1.8厘米范围内；

所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的通孔，用于向微流孔道中添加试剂或细胞悬液，优选为垂向通孔；所述六条凹槽之间的间距为100～500微米；所述九条凹槽长度在1.2～1.8厘米范围内，宽度在20～1000微米范围内；然后把聚二甲基硅氧烷印章的具有微凹型单元的面朝上，高压消毒；

4)将步骤3)经高压消毒后的无菌聚二甲基硅氧烷印章取出后，把具有微凹型单元的面朝下与步骤1)所述玻璃基底进行接触性连接，在聚二甲基硅氧烷印章与玻璃基底之间形成封闭的九条微流管道；所述聚二甲基硅氧烷印章的下表面贴覆于所述玻璃基底上，在聚二甲基硅氧烷印章与所述玻璃表面之间形成九条封闭的微流道，所述微流道内的玻璃表面通过0.2～2.0％聚乙二醇硅氧烷的水溶液于60～80℃自组装而被修饰成抗细胞粘附的惰性区域；或者，部分微流道内的玻璃表面通过0.2～2.0％聚乙二醇硅氧烷的水溶液于60～80℃自组装而被修饰成抗细胞粘附的惰性区域；另一部分微流道内的玻璃表面用50～200μg/mL细胞外基质蛋白被修饰成促进细胞粘附的活性区域；孵育1～3小时；

5)制备不同种类的粘附细胞的悬浮溶液，细胞密度为10⁶个/mL，然后把不同种细胞通入相应设计培养细胞的微流孔道中，再放入细胞培养箱，在37℃，二氧化碳体积浓度5％，培养30～60分钟，细胞粘附在微流管道内的玻璃表面上；揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将生长有细胞的玻璃表面放入普通细胞培养液中，12～24小时后，细胞在各自限定区域内生长，以完成多种细胞粘附于同一基底上并束缚在各自的区域内；

6)若操纵基底上全部种类的细胞都可以自由移动，则在步骤4)中的孔道中不通入聚乙二醇硅氧烷水溶液，将细胞直接接种于各自的管道中，揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将生长有细胞的玻璃表面放入普通细胞培养液后，图案化的各种细胞将自由移动；

7)若操纵基底上的部分种类细胞移动，而其余种类细胞在原位固定，则在步骤4)中把含有50～200μg/mL细胞外基质蛋白的PBS磷酸盐缓冲液通入设计培养细胞的微流孔道中；然后在设计需要原位固定细胞的微流孔道两侧微流孔道中通入0.2～5.0％聚乙二醇硅氧烷的水溶液于60～80℃自组装而被修饰成抗细胞粘附的惰性区域；而设计种植细胞的微流孔道中通入PBS溶液进行分隔，以防止酸或碱溶液渗透干扰细胞存活和生长；孵育1～3小时；

8)制备不同种类的粘附细胞的悬浮溶液，细胞密度为10⁶个/ml，然后把不同种细胞通入相应设计培养细胞的微流管道中，再放入细胞培养箱，在37℃，二氧化碳体积浓度5％，培养30～60分钟，细胞粘附在微流管道内的基底上；揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将生长有细胞的基底放入普通细胞培养液中，4～8小时后，被固定的细胞在各自限定区域内生长，而用PBS分隔的细胞开始移动，以完成选择性操纵细胞移动和固定的目的。

由此可见，本发明涉及的装置和方法可用于将多种细胞在同一玻璃基底上进行粘附和操纵，粘附的细胞间通过分泌的可溶性生物分子相互作用(参考文献Z L Chen，Y Li，W W Liu，D Z Zhang，Y Y Zhao，B Yuan，X Y Jiang.Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，8303-8305)。通过本发明所提供的装置和方法，将多种细胞粘附和操纵于同一玻璃基底可以用于药物筛选，在粘附的细胞培养的条件下加入待筛选的药物，与没有加入药物的样品进行比较，可以了解哪种药物可以影响这几种细胞之间的相互作用；也可以用于观察全部种类细胞的移动；或者选择性固定一种或几种细胞，观察其余细胞的移动，从而为新药筛选提供一种极为便利的方法。具体而言，本发明的优点在于以下几方面：

1)所采用的基底为玻璃表面，便宜易得；

2)玻璃基底对荧光无猝灭效应，有利于细胞生物学研究中利用荧光检测结果的观察；

3)对粘附和操纵细胞装置的制作进行改进，使之更加适用于生物实验室的日常操作；

3)本发明利用表面化学和微流控技术的结合，来构筑复杂的细胞培养体系，可以让多种细胞在可调控的空间，有序地在表面的粘附、生长，见图；

4)控制几种细胞使之局限于一定区域完全不能移动；也可以使部分种类细胞移动，其余种类细胞不移动；也可以使所有细胞都移动；

5)在这种方法得到的粘附了多种细胞的基底为细胞生物学、组织生物学，细胞发育学的基础研究提供了平台，同时，还可以作为基于细胞和细胞之间作用的药物检测，为发现药物和有毒物质的分析提供了新的途径。

6)当全部种类的细胞均被限制时，可以让细胞之间仅仅通过溶液中的物质进行信号交换而相互作用；当全部种类细胞全部释放，或部分释放时，也可以让细胞直接接触进行信号交相互作用。

7)对多种细胞粘附、全释放和部分释放的操作方法更加简便易行。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明所提供的用于控制不同种细胞相互作用的装置的结构示意图。

图2为本发明所提供的采用不同体积浓度(A为0.2％，B为1.0％，C为5.0％)聚乙二醇硅氧烷修饰玻璃基底后的扫描电镜图片。

图3为采用本发明实施例1中所提供的可粘附并固定三种不同细胞的装置进行细胞培养的相差显微镜图片，其中A为培养0小时，B为培养24小时。

图4为采用本发明实施例2中所提供的可粘附并固定一种细胞，而另外两种细胞扩散的装置进行细胞培养的相差显微镜图片，其中A为培养0小时，B为培养24小时。

图5为采用本发明实施例3中所提供的可使三种不同细胞扩散的装置进行细胞培养的相差显微镜图片，其中A为培养0小时，B为培养24小时。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

本实施例为本发明所提供的可粘附、固定和限制三种不同细胞的装置的制备方法及其粘附细胞的方法，具体详述如下。其中，装置的结构示意图如图1所示。

1)玻璃载玻片(帆船牌，60×20毫米)，表面首先用飞虎酸溶液(浓硫酸∶双氧水＝3∶1，体积比)浸泡20分钟，然后用大量双蒸水清洗至中性，干燥，待用；

2)把步骤1)的基底切成2x2厘米的小块，备用；

3)委托北京佰仁医疗科技有限公司使用微机械加工技术，在一有机玻璃板上制备一组凹型线型微结构单元，该凹型线型微结构单元由九条凹型条组成；其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度1.5厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为300微米，凹槽深度为300微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为200微米，凹槽深度为100微米；所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米，然后再垂直折向中部0.3厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以60度斜角折向左右两侧0.5厘米；所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述九条凹槽之间的间距为300微米；所述九条凹槽长度在1.8厘米范围内；

4)用聚二甲基硅氧烷(PDMS)(Polydimethylsiloxane)(Dow Corning，USA)通过软刻蚀技术对步骤2)得到的具有至少一组凹型线型微结构单元进行二次翻膜(参考文献Z L Chen，Y Li，W W Liu，D Z Zhang，Y Y Zhao，BYuan，X Y Jiang.Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，8303-8305)，得到一与所述凹型线型微结构单元相对应的具有一组微凹型单元的聚二甲基硅氧烷印章；该聚二甲基硅氧烷印章下表面上的微凹槽单元由从左至右依次排列的九条凹槽组成；

其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度1.5厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为300微米，凹槽深度为300微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为第二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为200微米，凹槽深度为100微米；所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米，然后再垂直折向中部0.3厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以60度斜角折向左右两侧0.5厘米；所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述九条凹槽之间的间距为300微米；所述九条凹槽长度1.8厘米；

5)然后把PDMS印章具有微凹槽的面向上，于121℃下灭菌20分钟；

6)将步骤4)经高压灭菌的PDMS印章取出后，把具有微凹槽单元的面向下按压至步骤2)的玻璃基底表面，使二者紧密接触，在PDMS印章与基底玻璃表面之间形成封闭的九条微流孔道；然后把0.2％聚乙二醇硅氧烷(CH₃CH₂O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃，其中n＝17)水溶液加入第一、三、四、六、七、九条微流孔道中，再于第二、五、八条微流孔道中加入PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)，放置于60℃烘箱过夜，约16小时；取出，冷却至室温，再于第二、五、八条微流孔道中加入包含浓度为200μg/mL的纤维结合蛋白的PBS磷酸盐缓冲液；

7)制备不同种的粘附细胞——Hela细胞、NIH3T3细胞和3T6细胞(均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)的悬浮溶液(具体制备方法参见R.I.弗雷谢尼著《动物细胞培养：基本技术指南》，科学出版社，2004.9)，细胞密度均为10⁶个/mL，然后把NIH3T3细胞的悬浮溶液通入第二条微流孔道中，将Hela细胞的悬浮溶液通入第五条微流孔道中，将3T6细胞的悬浮溶液通入第八条微流孔道中放入细胞培养箱，于37℃、二氧化碳浓度5％(体积浓度)，培养60分钟，细胞粘附在微流孔道内的基底表面上；把PDMS印章揭掉，把长有细胞的基底表面放入普通DMEM细胞培养液(胎牛血清浓度10％)中，24小时后，细胞就会长满各自的限定区域，得到一粘附并固定了三种细胞的基底，具体结果如图3所示。

同样的方法和步骤可以得到粘附、固定和限制多种细胞的玻璃载玻片基底。

实施例2

本实施例为本发明所提供的可粘附、固定和限制一种细胞，而另外两种细胞释放扩散的装置的制备方法及其粘附细胞的方法，具体详述如下。

1)玻璃盖玻片表面首先用飞虎酸溶液(浓硫酸∶双氧水＝3∶1)浸泡20分钟，然后用大量双蒸水清洗至中性，干燥，待用；

2)把步骤1)的基底切成2x2厘米的小块，备用；

3)使用微机械加工技术，在一有机玻璃板上制备包含四组凹型线型微结构单元的模板，该模板的凹型线型微结构单元由九条凹型条组成；其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度1厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为300微米，凹槽深度为500微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为200微米，凹槽深度为100微米；所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.6厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.6厘米，然后再垂直折向中部0.4厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以30度斜角折向左右两侧0.6厘米；

所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述九条凹槽之间的间距为500微米；所述九条凹槽长度在1.5厘米；

4)用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane)对步骤2)得到的具有四组凹型线型微结构单元的模板进行二次翻模，得到一与所述凹型线型微结构单元相对应的具有四组微凹型单元的聚二甲基硅氧烷印章；该聚二甲基硅氧烷印章下表面上的微凹槽单元由从左至右依次排列的九条凹槽组成；其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度1厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为300微米，凹槽深度为500微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为200微米，凹槽深度为100微米；所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.6厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.6厘米，然后再垂直折向中部0.4厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以30度斜角折向左右两侧0.6厘米；所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述六条凹槽之间的间距为500微米；所述九条凹槽长度1.5厘米；

5)然后把PDMS印章具有微凹槽的面向上，于121℃下灭菌20分钟；

6)将步骤4)经高压灭菌后PDMS印章取出后，把具有微凹槽单元的面向下与步骤2)的基底玻璃表面紧密接触，在PDMS印章与基底玻璃表面之间形成封闭的九条微流孔道；然后把0.5％聚乙二醇硅氧烷((CH₃O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃)，其中n＝17水溶液通入至第一和三条微流孔道中，第二、四、五、六、七、八和九条微流孔道通入PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，放置于80℃烘箱40分钟；取出，冷却至室温，再于第二、五、八条微流孔道通入包含浓度为100μg/mL的层粘连蛋白的PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)；

7)制备不同种的粘附细胞——NIH3T3细胞、Hela细胞和3T6细胞的悬浮溶液，细胞密度均为10⁶个/mL，然后把NIH3T3细胞的悬浮溶液通入第二条微流孔道中，将Hela细胞的悬浮溶液通入第五条微流孔道中，将3T6细胞的悬浮溶液通入第八条微流孔道中放入细胞培养箱，于37℃、二氧化碳浓度5％(体积浓度)，培养40分钟，细胞粘附在微流孔道内的基底表面上；把PDMS印章揭掉，把长有细胞的基底放入普通DMEM细胞培养液(胎牛血清浓度10％)中，24小时后，NIH3T3细胞就会长满限定区域，位于中间的Hela细胞和旁边的3T6细胞生长并扩散出其种植的微流孔道，得到一粘附并固定了一种细胞，而另外两种细胞扩散的基底，具体结果如图4所示。

同样的方法和步骤可以得到粘附固定多种细胞并释放多种细胞的玻璃盖玻片基底。

实施例3

本实施例为本发明所提供的三种不同细胞扩散的装置的制备方法及其粘附细胞的方法，具体详述如下。

1)玻璃培养皿表面首先用飞虎酸溶液(浓硫酸∶双氧水＝3∶1)浸泡20分钟，然后用大量双蒸水清洗至中性，干燥，待用；

2)使用微机械加工技术，在一有机玻璃板上制备四组凹型线型微结构单元，该凹型线型微结构单元由九条凹型条组成；其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度1.2厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为300微米，凹槽深度为800微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行，宽度为300微米，凹槽深度为150微米；所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米，然后再垂直折向中部0.3厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以45度斜角折向左右两侧0.5厘米；所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述九条凹槽之间的间距为200微米；所述九条凹槽长度在1.5厘米范围内；

3)用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane)，对步骤2)得到的具有四组凹型线型微结构单元进行二次翻模，得到一与所述凹型线型微结构单元相对应的具有四组微凹型单元的聚二甲基硅氧烷印章；该聚二甲基硅氧烷印章下表面上的微凹槽单元由从左至右依次排列的九条凹槽组成；

其中，九个凹槽的中间段相互平行，中间段长度1.2厘米；所述左侧第二、五、八条凹槽为第一组等截面的凹槽，宽度为300微米，凹槽深度为800微米；左侧第一、三、四、六、七、九条凹槽为二组等截面的凹槽，该左侧三条凹槽的中间段相互平行宽度为300微米，凹槽深度为150微米；所述左侧第二条和第五条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米；所述左侧第一条和第九条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂直折向左右两侧伸出0.5厘米，然后再垂直折向中部0.3厘米；所述左侧第三、四、六、七条凹槽中间段之外的两端段由该凹槽中间段的两端垂由该凹槽中间段的两端以45度斜角，折向左右两侧0.5厘米；

所述九条凹槽的槽端处分别设有与相应的凹槽相通的垂向通孔；所述六条凹槽之间的间距为200微米；所述九条凹槽长度在1.5厘米；

4)然后把印章有微凹槽的面向上，于121℃下灭菌20分钟；

5)将步骤4)经高压灭菌后PDMS印章取出后，把具有微凹槽单元的面向下与步骤2)的基底玻璃表面紧密接触，在PDMS印章与基底玻璃表面之间形成封闭的九条微流孔道，于第二、五、八条微流孔道通入包含浓度为100μg/mL的层粘连蛋白，以PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)为溶剂；

7)制备不同种的粘附细胞——NIH3T3细胞、Hela细胞和3T6细胞的悬浮溶液，细胞密度均为10⁶个/mL，然后把NIH3T3细胞的悬浮溶液通入第二条微流孔道中，将Hela细胞的悬浮溶液通入第五条微流孔道中，将3T6细胞的悬浮溶液通入第八条微流孔道中放入细胞培养箱，于37℃、二氧化碳浓度5％(体积浓度)，培养40分钟，细胞粘附在微流孔道内的表面上；把PDMS印章揭掉，把长有细胞的玻璃表面放入普通DMEM细胞培养液(胎牛血清浓度10％)中，24小时后，NIH3T3细胞、3T6细胞和Hela细胞生长并扩散出其种植的微流孔道，得到三种细胞扩散的基底，具体结果如图5所示。

Claims (11)

1.一种用于控制不同种细胞相互作用的装置，其特征在于，所述装置包括：1)玻璃基底；和2)具有多个凹槽的聚二甲基硅氧烷印章，其贴附于玻璃基底表面，分别形成多条微流孔道，且各条微流道内的玻璃基底可以被选择性地修饰成促进细胞粘附的基底或抗细胞粘附的基底，或者未经任何修饰。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述微流孔道以三个为一组进行的修饰如下：中间微流孔道内的玻璃基底被修饰成促进细胞粘附的基底，两侧微流道内的玻璃基底被修饰成抗细胞粘附的基底或者未经任何修饰。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述微流孔道内的玻璃基底通过孵育细胞外基质蛋白而被修饰成促进细胞粘附的基底；优选地，所述细胞外基质蛋白选自浓度为50～200μg/mL的纤维粘联蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，或者浓度为10～100μg/mL的多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶；更优选地，所述孵育条件为：20～30℃，1～3小时。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，其特征在于，所述微流道内的玻璃基底通过组装聚乙二醇硅氧烷水溶液而被修饰成抗细胞粘附的玻璃基底；优选地，所述聚乙二醇硅氧烷选自(CH₃O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃和(CH₃CH₂O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃，其中n＝3～100，其体积百分比为0.2～5.0％；更优选地，所述组装条件为：60～80℃，40分钟～16小时。

5.根据权利要求1至4中任一项的装置，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷印章的各个凹槽的两端分别向外以相对于凹槽形成任意角度的方向延伸；优选地，所述各个凹槽两端端点处分别设有通孔；更优选地，所述中间微流道的宽度为200～1000微米、深度为80～1000微米，两侧微流道的宽度为100～1000微米、深度为30～200微米；所述微流道的长度为1200～1800微米，各微流道之间的间距为100～500微米。

6.制备权利要求1至5中任一项所述装置的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备具有多个凹槽的聚二甲基硅氧烷印章；

2)将步骤1)所制备的聚二甲基硅氧烷印章贴附于玻璃基底表面，形成多条微流孔道；

3)对步骤2)所得到的各个微流孔道内的玻璃基底进行如下之一的处理：通过孵育细胞外基质蛋白修饰成促进细胞粘附的基底，或者通过组装聚乙二醇硅氧烷水溶液修饰成抗细胞粘附的基底，或者未经任何修饰。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法步骤1)中聚二甲基硅氧烷印章是通过软刻蚀方法制备的。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法步骤3)中的细胞外基质蛋白选自浓度为50～200μg/mL的纤维粘联蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，或者浓度为10～10000μg/mL的多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶；，孵育时间为1～3小时；优选地，所述方法步骤3)中的聚乙二醇硅氧烷选自(CH₃O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃和(CH₃CH₂O)₃Si(CH₂)₂CN(OCH₂OCH₂)_nCH₃，其中n＝3～100，其体积百分比为0.2～2.0％，组装条件为：60～80℃，40分钟～16小时。

9.权利要求1至5中任一项所述装置在研究不同种哺乳动物细胞相互作用中的用途；优选地，所述用途为药物筛选、病理学研究和细胞生物发育学研究。

10.一种控制不同种细胞相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1至5中任一项所述装置同时培养不同种细胞的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)根据权利要求6至8中任一项所述方法制备出控制不同种细胞相互作用的装置，其中的微流孔道包括被选择性地修饰成促进细胞粘附的基底或抗细胞粘附的基底；

2)制备不同种细胞的悬浮溶液，细胞密度优选为10⁵～10⁷个/mL；

3)将步骤2)所制备的细胞悬浮溶液分别通入步骤1)中被选择性地修饰成促进细胞粘附的基底的微流孔道，经培养后，揭掉聚二甲基硅氧烷印章，继续培养，得到的多种细胞粘附于同一基底，其生长受控于对基底的不同修饰。

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