CN102851199A - 微流控细胞分选获取装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种无标记的、可以直接获取目标细胞的微流控细胞分选装置。这种微流控细胞分选装置主要由一条主通道与至少一条副通道组成，主通道与各副通道之间流动沟通，与主通道接合处的副通道端口置有的固状体表面上裱衬有促细胞粘附分子层，主通道内流动内涵细胞遍历各接合处的固状体表面，在由副通道内流向主通道的溶液中所含预定的促目标细胞迁移因子的影响下，目标细胞粘附在固状体表面，从而使人们通过固状体的操作而方便地而获得目标细胞。这种微流控分选装置，分选与获取目标细胞的工作过程简化，效能显著提高。

Description

微流控细胞分选获取装置

技术领域

本发明涉及一种用于细胞分选的微流控装置，具体针对有不同迁移与粘附潜能的混合细胞群中目标细胞的分选与获取，属于微流控技术领域。

背景技术

从复杂的组织环境或混合细胞群中分选获取所需要的目标细胞，对于细胞分子生物学的基础研究，应用干细胞于临床治疗，诊断包括癌症在内的许多疾病等生物医学领域具有重要意义。已知有多类常规技术以及结合有微流动原理的微流控技术应用于细胞的分选，如利用不同种类细胞的体积大小、密度、表面荷电性等之间存在的差异，分别有过滤法、离心法、沉降法以及电泳与介电电泳法（Diaelectrophoresis，DEP）来分离分选细胞。但是当混合细胞群中的细胞在其大小、密度与表面荷电性等方面的差异不显著时，上述这些方法就很难奏效；DEP法操作时，还需要在所分选的细胞溶液中混入调节介电性的离子缓冲液，而且要施加相对高的电压，对细胞的影响有时难以预料。人们在分选细胞的实际应用中，更倾向于采用有标记的或者利用亲合结合的技术，如基于荧光激活的细胞流式技术（Fluorescent Activated Cell Sorting，FACS）、磁力分选技术（Magnetic Activated Cell Sorting,MACS）等。其中最为流行的是FACS，这种技术结合荧光标志，可以根据细胞对荧光结合物的结合情况作出分选，分选速度快速并可作多参数分析，但目前商业化中即使具有最高性能的如MoFlo（DakoCytomation Inc.,San Diego,CA)也拥有庞大体积且价格昂贵，其高分析效率是以大样本量（至少上万个细胞）为基础的，而能使不同细胞分开是以针对细胞作荧光染色处理为基础的，有许多染色物对细胞生理过程的影响有时无法控制，而且操作过程需要训练有素的操作员。从Fu等[见文献Anne Y.Fu,Charles Spence,Axel Scherer,Frances H.Arnold,and Stephen R.Quake:Amicrofabricated fluorescence-activated cell sorter,Nature Biotechnology，17,1109-111(1999).]最早提出利用电动力驱动流动的微型荧光激活的细胞流式技术（μFACS），后来众多专利与文献不断提出μFACS技术的改进版本，取得很大进展，如在功能上增加了微流控水动力流动切换[见文献A.WolffI.Perch-Nielsen,U.Larsen,P.Friis,G.Goranovic,C.Poulsen,J.Kutter and P.Telleman,Integrating advanced functionality in a microfabricated high-throughput fluorescent-activated cell sorter Lab Chip,2003,3,22.与文献H.Bang,C.Chung,J.Kim,S.Kim,S.Chung,J.Park,W. Lee,H.Yun,J.Lee and K.Cho,Microfabricatedfluorescence-activated cell sorter through hydrodynamic flow manipulation Microsyst.Technol.,2006,12,746.]以及光压力梯度[见文献M.Wang,E.Tu,D.Raymond,J.Yang,H.Zhang,N.Hagen,B.Dees,E.Mercer,A.Forster and I.Kariv，Microfluidicsorting of mammalian cells by optical force switching Nat.Biotechnol.,2005,23,83.]等更加精细的技术环节。但由于缺乏快速的致动执行机制或高速实时控制系统的技术支撑，因而停留在实验室原型阶段。另外，MACS分选法，虽不需要如FACS那样多的细胞样本量，也没有必须采用染色，但是在实际使用中有时特异性结合不高，细胞与磁珠之间要发生聚集，而且磁珠本身在后续处理过程中会发生干扰。

人们利用不断认识到的微流控技术原理也提出了许多其他技术形式的微流控细胞分选装置，包括微流控DEP芯片（见文献J.Voldman,M.Gray,M.Tonerand M.Schmidt,A microfabrication-based dynamic array cytometer,Anal.Chem.,2002,74,3984.与综述文献Khashayar Khoshmanesh,Saeid Nahavandi,SaraBaratchi,Arnan Mitchell,Kourosh Kalantar-zadeh:Dielectrophoretic platforms forbio-microfluidic systems,Biosensors and Bioelectronics,Vol26(5):1800-1814,2011）、微流控磁泳芯片（见文献N.Pamme and C.Wilhelm,Continuous sorting ofmagnetic cells via on-chip free-flow magnetophoresis,Lab Chip,2006,6,974.与综述文献Martin A.M.Gij s,Frederic Lacharme,Ulrike Lehmann:MicrofluidicApplications of Magnetic Particles for Biological Analysis and Catalysis ChemicalReviews,Vol.110(3):1518-1563,2010,Kim,JS;Ligler,FS:Utilization ofmicroparticles in next-generation assays for microflow cytometers,Analytical AndBioanalytical Chemistry，Vol.398(6):2373-2382,2010）。

可以从以下近年来陆续公开的专利文献中看出微流控技术应用于细胞分选领域的状况。例如，美国专利（U.S.Pat.No.6074827/Jun 13,2000）构建的一种微流控纯化与处理装置中，利用在微通道出入口配置电极在通道内实施电泳来“分离/富集”目标细胞或者有亲合性试剂偶联的微珠与及其结合其上的细胞。美国专利（US Pat.No.6692952/Feb 17,2004）提出的细胞分选装置中，在各个被编址的区位（如微孔）中，俘获并维持细胞（如用电场陷阱），然后可选择性地通过气泡驱动或电力致动的方式释放。K.Takahashi等[J.Nanobiotechnology,2,5(Jun.13,2004)]在PDMS（聚二甲基硅氧烷）中构建有多个微通道，它们可汇聚导向中央的细胞分选区，并辅以琼脂凝胶被覆的电极对进入分选区的非目标细胞施以静电力使其进入并行连续流动的缓冲液中。美国专利（USPat.No.7964078/Jun 21,2011）提出的微流控细胞分选装置，在微通道相对的两壁上布置有许多电极对，沿上下游定义成聚集区域与分离区域，分别用相应的电极对操纵，进一步在该微通道下游端延伸布置有多个分支通道，来收集由分离区域电极对操纵下所获得的不同细胞。美国专利（US Pat.No.7389879/Jun24,2008）公开的一种分选装置中，在一个基底上结合有流动障碍物并与基底之间形成具有一个入口与二个出口的通道，在此通道与流动障碍物之间的基底中另外加工有薄膜导电结构（如电热元件或压电元件），如此在通道的入口与出口之间形成两种流动传输机制，一种是可驱使流动中的一种或二种粒子从入口流向第一个出口；另一种是利用薄膜导电结构向流过的粒子流施加一个瞬时压力脉冲，使二种粒子中的一种选择性地移动到第二个出口。国际专利（WO2004/029221）公开的一种微流控装置中，在引入细胞的微通道中加工有许多障碍结构，这些障碍结构表面上结合有许多可以结合到细胞表面的偶联物如抗体等，并认为这样的装置可以从母体血液中分离出胎儿红细胞。美国专利（U.S.Pat.No.2004/038315）将一种可释放的连接臂结合在毛细管内表面，在连接臂被目标细胞识别并结合后，在毛细管内流入剪切试剂切断连接臂与管壁表面的结合使之释放出来，从而回收到被识别的目标细胞。美国专利（USPat.No.7569788/Augu 4,2009）公开的微流控分选装置中，来自主通道上游入口的粒子流由下游出口分叉通道前安置的两个传感器检测，一个传感器用来检测具有预定特征的目标粒子，另一个传感器用来测量该目标粒子的流动速度；同时在下游出口分叉通道前安置的执行器（如气泡阀）有选择性地产生压力脉冲作用在所识别的目标粒子上使之发生位移，有选择性地进入其中的一个分支通道中，而所产生的脉冲压力则由缓冲结构来吸收。美国专利（USPat.No.7497334/Mar 3,2009）的思路基本上类似，所不同的是产生压力的机构安排方式上有所分别。

利用微加工的电极来实施混合群细胞的介电电泳（DEP）分选，也陆续有技术专利报道。例如，如Yang等利用微加工的电极实施介电电泳（DEP）以及重力场流配分（G-FFF）来分离细胞的技术[Yang et al.,Cell separation onmicrofabricated electrodes using dielectrophoretic/gravitational field-flowfractionation,Anal.Chem.,71(5):911-918(1999).]，其中在DEP力与重力之间的平衡作用下不同细胞被悬浮在不同的高度，不过在微流动条件下维持这种力之间的平衡似有难度。美国专利（US Pat.No.7294249/Nov 13,2007）公开的一种微流式仪，是一种含有至少一个通道的夹心式结构，其中每个通道至少拥有一个入口与至少两个出口；所述通道里有三个区域：制备区（优先采用DEP力来特异性地影响与分离粒子）、测量通道区（沿着流动方向至少串行配置有两个电阻抗传感器，通过测量粒子的阻抗与速度用实现粒子的表征）、分选区（配置有电极作为切换单元，利用DEP力来主动引导所选粒子进入二个或更多的子通道中）；这种技术加工特征还体现在几何上：测量通道区域中传感器区域的横截面尺寸显著地小于制备区与分选区的横截面尺寸；此外分选区下游的子通道尺寸也与测量通道所定义的特征阈值相对应。美国专利（US Pat.No.7425253/Sep16,2008）提出利用DEP陷捕粘附细胞的方案，其中的DEP微电极围绕一个微小区域（浅孔）布置，并以阵列式扩展分布在具有入口与出口的微通道内。当混合有细胞的溶液由入口注入流过此微电极及浅孔作为单元的阵列时，微电极向流过细胞施加DEP力使细胞被陷捕在各个浅孔中，并使细胞粘附其中，然后作出测试，发现到目标细胞时使之释放流向出口处收集。美国专利（No.7658829/Feb 9,2010）也利用两步DEP力来实现分选细胞，具体过程是：通过第一对电极产生第一步DEP力来使液流形成第一股流路并延伸到中继电极，而第二对电极产生第二步DEP力在上述流路上形成第二股流路并延伸到下游的多电极区，而中继电极上建立的行波DEP电场梯度可分离其上液流中的粒子。

美国专利（US Pat.No.2002/132316;No.6936811/Aug 30,2005;No6744038/Jun 1,2004;No.7745221/Jun 29,2010）公开的微流控分选装置，根据细胞的介电特性利用光压力梯度所致移动来有选择性地在微通道内分离不同细胞。美国专利（US Pat.No.7276170/Oct 2,2007）在充分利用微流动层流的同时，采用光力来选择性地使目标粒子离开主流来实现分选。同一作者的后续专利（US Pat.No.7472794/Jan 6,2009）提出利用微流动的层流特性来分离分选粒子的技术方法，其分选装置主要由拥有一个入口端与两个出口分支的主通道（或腔）构成，主通道（或腔）内布置有流动障碍结构，使来流粒子分别受到作用而发生流线上的分离，其中特别强调入口粒子流引入时维持层流条件，而两个出口分别接受层流中处于不同流线上的粒子。美国专利（US Pat.No.8,021,614/Sep.20,2011）公开的微流控分选细胞装置中，在微通道内布置有定量关系的障碍物阵列结构。

显然，微流控装置中固有的层流性质的充分利用是许多技术发明的出发点。例如，美国专利（U.S.Pat.No.6432630/Aug 13,2002）公开的一种微流控装置，驱使含有生物粒子（包括细胞）在不同微通道内流动，利用不同粒子在层流扩散过程上径向偏离而实现有选择的分离，并认为这样的技术方式可用于从母体血样中分离出稀有的胎儿细胞。

美国专利（U.S.Pat.No.8076127/Dec.13,2011）公开的一种微流控装置，在被作为收集区域的微通道的顶面与底面之间，间隔随机布置有横向的微柱，微柱可呈平直状，也可呈弓形状，目的是扰动沿微通道的直线层流；并且，在此微通道收集区域的所有表面上先结合上一层亲水性成分如含有异氰酸成分的水凝胶或者具有足够长度的聚乙二醇或多聚甘氨酸，然后捕获试剂如抗体等固定其上；如此结构几何与化学的安排，在实现扰动微通道内所流过液的层流行为基础上，可以高效地俘获目标细胞。

美国专利（US Pat.No.7452725/Nov 18,2008）提出用通道逐级分支形成的通道网络结构来分选的技术方式，但其分选对象的分析识别仍旧需要外部设备来实现。

美国专利（US Pat.No.5,147,607/Sep 15,1992）公开了一种免疫测试微流控装置，其中的微通道中固定有抗体，并且在微通道底面中安排有凹陷区，其中有从底面向上的一组突起，抗体就结合其上。

美国专利（US Pat.No.7,993,908/Augu 9,2011）提出一种堰坝式微流动分选装置，在一凹槽内有入口与出口，在出入口之间的分离单元上布置有梯坎或呈斜坡，此凹槽整体可用盖片覆盖闭合，在盖片与梯坎顶之间留有确定高度的间隔，只有那些尺寸（或经过变形）小于或等于此间隔高度的细胞才能通过。

中国专利（申请号200910219282.3，2009.12.03）中公开的一种用于细胞分选的微网筛结构，包括至少两层分布有若干分选孔的分选薄膜，其中至少一层分选薄膜与驱动装置连接。使用时，通过驱动装置调节相邻两层分选薄膜相应分选孔的重叠面积，以实现待分选细胞的逐次分选。但是在微尺度条件下，表面力占据主导，实现真正分选的目的是很困难的。

要指出的是，上述所提到的绝大多数技术发明中，基本上将活细胞作为“粒子”来看待，忽略了在流动操纵过程中细胞处于一种“活”的生命活动过程之中；各种“外力”作用对后续的细胞事件产生重要影响，尤其是干细胞，不适当的外力可能导致其不确定的分化状态，而且干细胞生理状态受来自微环境中各种“线索”的影响很大。所提到的上述多数技术，因为对细胞混合群的外来干预因素太多，有可能使原本就很稀少的珍贵细胞样本在处理中损失掉，或者所分选到的细胞本身的存活性已经有不可预见的下降。另外，对于从原代组织样本中分选到珍贵的、小量目标细胞如干细胞，往往需要接着直接获取并转移出来，用于各种目的的基础研究，或者在临床上实施定位的细胞治疗，而在上述许多技术方式实施中时这种要求往往不能有效满足。

发明内容

本发明的目的是提供一种无标记的、可以直接获取目标细胞的微流控细胞分选技术。具体而言，是提供一种在维持有微流动条件下通过生理孵育使目标细胞粘附于确定定位并可从中获取的一种微流控分选装置。这种微流控细胞分选装置可由一条主通道与至少一条副通道组成，主通道与各副通道之间流动沟通，其关键特征在于：与主通道接合处的副通道端口置有固状体，该固状体的表面上裱衬有促细胞粘附分子层，主通道内的流动可遍历各接合处，副通道内流向主通道的溶液中含有促目标细胞迁移的生物分子。

本发明所述的主通道与副通道的横截面形状可以呈方形、梯形、圆形或半圆形，甚至在微加工工艺条件允许的情况下可以是这些形状的组合。本发明所述主通道的轴向形状可以是直通道或弯曲（包括圆环状）通道，并在两端分别有一个入口与一个出口；副通道的轴向形状则呈直通道。在装置中主通道与副通道之间的位置关系可以呈以下三种情形之一，一是副通道位于主通道之外，二是副通道位于主通道之内，三是副通道与主通道之间交叉，取何种位置的搭配关系，在具体实施时可根据所分选细胞对象所确定的通道几何及加工便利性而定。

本发明所述装置中置于副通道端口的固状体，其几何形状可以是球状、片状、柱状，要求有表面（平面或曲面）面向主通道，用于提供细胞粘附的有效表面面积范围为5平方微米~300平方微米，并且其横向尺寸应小于副通道的横向尺寸，并使其与副通道之间留有间隙，间隙的尺寸应处于5微米~80微米之间，具体取值可参考分选细胞对象的几何大小来确定。

本发明所述装置中置于副通道端口的固状体，其背向主通道的方向上有固连的把柄，或者在有利于取出该固状体的方向上有固连的把柄。例如，当该固状体是球状或柱状时，其背向主通道面固连有直杆（见图1，实施例1与实施例2），该直杆沿着副通道轴向布置，在通过孵化确定有细胞粘附后可以从副通道的另一端取走；当该固状体是短圆柱状时，其固连的把柄可以是覆盖通道顶面的盖片（见图6，实施例6），在通过孵化确定有细胞粘附后可以揭盖取走；在一种实施例中，柱状固状体与固连直杆可简化为微丝（见图1~图5，实施例1~实施例5）。

本发明所述装置中置于副通道端口的固状体，其表面上裱衬有促细胞粘附分子层。其中所述“表面”优先是指该固状体面向主通道的侧表面，但具体实施中也可以扩展至固状体处于端口处的部分表面，甚至该固状体的全部表面。所述裱衬的“促细胞粘附分子层”，其厚度在300纳米至数微米左右，最厚不超过5微米。其中所述的“促细胞粘附分子”，其种类主要是细胞的胞外基质（extracellular matrixs，ECMs），如纤粘蛋白（fibronectin）、层粘蛋白（laminin）、胶原蛋白（collagens，I-VI等型）、透明质酸（hyaluronan）、各种蛋白聚糖（proteoglycans），等等。可针对所要分选细胞对象来确定，尤其是选用所分选对象细胞天然生存状态最贴近的ECM成分。在分选时可以采用它们的组合，也可以与水凝胶、筛网状聚合物等结合在一起使用。在利用本发明的微流控装置实施分选细胞之前，可以采取两种方式来在固状体表面上裱衬“促细胞粘附分子层”：一是固状体在置入副通道之前，预先通过层层组装的方式裱衬；二是固状体在置入副通道后，通过在副通道内先行流动“促细胞粘附分子层”溶液，或者注入通道孵化一段时间的方式，来实现裱衬。

本发明所述主通道，其中流动的主要成分是混合细胞群悬浮液，其方向可以是从入口流向出口，可以在主通道内循环流动或来回流动，以实现流动内涵物遍历主通道与副通道的接合处为目的。为了使细胞存活并达到迁移与粘附活化，常规的培养液也是主通道中流动的必需成分。

本发明所述副通道，其中流动的主要成分是“促目标细胞迁移的生物分子”，例如各种趋化因子，包括根据其N端半胱氨酸残基的位置和数目所分为的4个亚族——C、CC、CXC和CX3C，尤其侧重选用其中可溶性的内环境稳定性趋化因子(homeostatic chemokine)，以及与所分选细胞有明确维持性作用的细胞因子。这些种类的因子的生物信息，可在许多数据库中查询到，如意大利Napoli大学专门维持的细胞因子数据库（http://www.cro-m.eu/CytokineDB/）以及通用的各种细胞因子蛋白质数据库如美国NCBI中数据库等。在使用时，可以跟踪查询试剂商如Sigma所提供的各种进展信息。

具体视分选对象细胞而确定；其流动方向是由副通道的另一端流向与主通道的接合处，其流程上流经该接合处所置的固状体“促细胞粘附分子层”的裱衬面并向主通道内扩散；其流动速度应选择缓慢，优先的流动速度是使这些“促目标细胞迁移的生物分子”在副通道内趋于自由扩散。

细胞迁移(cell migration)是细胞在接收到确定的信号线索，例如在流体环境中某些物质的浓度梯度后，调整其首尾极性而产生的定向移动。对于被消化后散在培养液流动环境中的组织细胞，这种活动性能的再现，是其后续各种生命事件呈现的首要过程，无论是胚胎的发生(生长)、伤口的愈合(组织修复与再生)、对入侵病原的免疫反应(炎症反应)以及癌细胞的侵袭转移等等。

在本发明所述分选装置闭合的主副通道中分别流入混合细胞群悬浮液与“促目标细胞迁移的生物分子”溶液后，置于二氧化碳培养箱中孵化，在孵化5~6个小时后，即可取出在显微镜下观测，或从副通道中取出固状体，获取所需要的细胞对象。

另外，依据副通道数量与加工位置，结合孵化前流入的“促目标细胞迁移的生物分子”成分，可对各副通道作出编址，以方便对所分选细胞的确认。

附图说明

图1为副通道在直主通道外的一种分选装置结构示意。

图2为副通道在弯曲主通道外的一种分选装置结构示意。

图3为副通道阵列围绕圆环状主通道周边的一种分选装置结构示意。

图4为副通道阵列配置在主通道内的一种分选装置结构示意。

图5为副通道阵列与主通道呈交叉的一种分选装置结构示意。

图6为副通道阵列在弯曲主通道外但固状体分布在盖片上的一种分选装置结构示意。

图7为图6中的A-A’剖面示意图。

上述各图中，1为主通道，2为副通道，3为固状体及延伸把柄，4为主通道与副通道的交合处，5为固状体，6为主通道连接软管，7为作为主通道组成部分的有助于单向流动的阀状通道，8为作为主通道组成部分的延缓流动的阻力通道；粗线箭头表示主通道内的流向，细线箭头表示副通道内的流向。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进一步描述如下：

实施例1：

如图1所示的微流控细胞分选装置，当涉及通道尺寸小于100μm时，可以利用常规软刻工艺或结合精密数控机械加工工艺来加工。其过程概要如下：

首先根据所要求的主通道（1）与副通道（2）的几何设计（例如主通道宽90μm、深80μm，副通道宽50μm、深80μm），在硅片上通过腐蚀蚀刻来构建主模。然后用PDMS（聚二甲硅氧烷）来浇铸模塑：预先在硅主模上蒸发上一层氟化物助脱模剂后烘干，以10：1重量比配比PDMS预聚物和固化剂（Sylgard 184，Dow Corning，Midland,Michigan,U.S.A.），混合均匀后置于真空抽气罐内抽气40分钟左右，以排除掉聚合物中的空气，然后浇注液态PDMS聚合物与盛放在洁净培养皿中的上述硅主模上，并在90℃下加热60分钟使其固化。固化后，将固化的PDMS块从硅主模上揭下来。并与作为封闭通道顶面的盖片（如玻片或有机玻璃等塑料片）一起在氧等离子气体中处理数十秒，两者表面立即贴合在一起。在各通道作为出入口适宜处（如靠近装置边沿的顶表面与/或装置侧表面），钻出入孔（大致在粗箭头与细箭头所处位置）。接着在显微镜辅助下，在各副通道（2）内置放预先制备好的固状体（3）及（5），以将固状体的细胞粘附端（5）到达与主通道的交合处4为宜。

图1中所示的固状体细胞粘附端（5），有球状的、也有方形的，这可以用直径20微米~60微米的金属微丝（如为低成本起见可采用不锈钢微丝）在其端部通过电化学合成与/或腐蚀过程，并结合聚合物如聚乙二醇或者生物可降解类的聚合物如聚乳酸的沉积，加工而成。所选择聚合物以有利于后续的“促细胞粘附分子层”裱衬为标准；在沉积了这些聚合物的薄层（一般在几百纳米厚），可进一步采取层层组装的方式实现不同粘附分子层的裱衬。

实施例2：

在涉及通道宽度与深度较大（如主通道宽350μm、深120μm，副通道宽350μm、深100μm）时，这种微流控分选装置的主、副通道及附属的出入孔道，也可利用计算机数控精密钻铣床，在有机玻璃基底中直接加工而成；然后在敞口通道中置放端部作了“促细胞粘附分子层”裱衬的金属或塑料微丝，经过PDMS薄膜密封紧固而实现装置的整体加工。

对于固状体细胞粘附端（5）可以在300μm环直径的接种环的基础上加工而成。如将接种环的环通过锡焊方式将环填满形成圆片状。在其上蒸镀上一层金薄膜，然后在胶原I（或者其他促细胞粘附分子）的缓冲溶液（3μg/mL）中浸泡5min，晾干，即可使用。

实施例3：

如图2与图3所示的分选装置，基本上也可按照实施例2所提示的低成本工艺加工。将分选装置中的主通道（1）分别设计加工成弯曲的波浪状与圆环状，这样的设计目的是加强主通道内流动的非层流化，增加微流动的Dean流（即二次流），使其中混合着的细胞群中的不同细胞有充分接触到周边[因而在主副通道交合处（4）的固状体（5）表面）的机会，提高目标细胞受来自副通道的“促细胞迁移分子”的影响，为目标细胞在固状体上着床粘附提供必要活化条件。并且，在副通道（2）中布置的固状体（3）是不经过端部几何改形的直微丝（如316L不锈钢微丝，尼龙66微丝），尤其进一步简化并降低装置制作与使用成本。在利用这样的装置实施分选细胞时，可先将作为粘附细胞面的微丝端面作粗毛化处理（如浸入稀酸），可以增大吸附表面积。

图3中，在圆环状的主通道（1）上下游还可加工许多有利于混合细胞群悬浮液非层流化流动的微流控功能单元，包括可接各种泵源的软管（6）（如PTFE软管）、增强流动单向性的两个串联“缩放通道”（7）以及增加流阻的迂回通道（8）。这些微流控单元的组合，可以大大促进混合细胞群悬浮液在主通道内循环流动时对于各副通道（2）端口的遍历性。

实施例4：

如图4是副通道阵列（2）布置在主通道（1）内的分选装置情形。在主、副通道径向尺寸较微小时，如实施例1中那样提示的，可通过光刻工艺结合软刻技术加工而成。

实施例5：

如图5是副通道阵列（2）穿进主通道（1）中的分选装置示意。这种情形也可采用实施例1中的工艺过程来加工。另有一种加工方式是，在有机玻璃中将主通道（1）加工在材料边界附近，然后在其侧壁上开适宜尺寸的微槽，然后插入副通道阵列（2）。副通道阵列（2）的制作可采用微丝PDMS微丝模塑的工艺进行。将微丝（如不锈钢微丝，直径100微米）在有机玻璃框架上以并行阵列方式布排，然后浇铸PDMS预聚液，固化。然后脱框架取出微丝阵列PDMS固化块，在其一端用锋利薄刃斜切成图5中那样的副通道阵列（2）端口，并使该微丝阵列PDMS固化块的另一端在副通道轴向方向上留足最小长度10mm。然后将其沉浸在乙醇溶液中数小时，使微丝PDMS固化块微略膨胀，抽取其中直径100微米的微丝，小心插入洁净的或已裱衬有生物基质分子、直径80微米的不锈钢微丝，即可形成所要求的副通道阵列（2）。

实施例6：

图6及图7是副通道阵列（2）在弯曲主通道（1）外但固状体（5）分布在盖片（3）上的一种分选装置结构示意。主通道（1）与副通道（2），可采取实施例1或2中的工艺过程来构建，带有短微圆柱阵列的盖片（3），可以用PDMS软刻工艺制作。要使盖片（3）上的PDMS短微圆柱阵列吸附生物基质分子，可以通过综述文献[Zhou J,Ellis AV，Voelcker NH.:Recent developments inPDMS surface modification for microfluidic devices.Electrophoresis.2010Jan;31(1):2-16.]中所提示的方法来实现。

在上述各实施例中，利用透明的材料如PDMS、有机玻璃PMMA来制作通道的盖片，尤其是本实施例中的盖片（3），因为其透明性，一旦孵化后目标细胞粘附其上，对于后续观测将是十分有利与方便的。

实施例7：

本例说明利用图3所示装置同时分选人脐血中的间充质干细胞（MSCs）与造血干细胞（HSCs）的方案。

使用前可将图3装置的各副通道编址（加工时即可给定通道序号），例如将由软管6进入圆环状主通道入口处逆时针对各副通道编序列，分别为1~15（实际装置不限于此副通道数量，按照需要可以是成千上万个副通道）。

将软管6与各副通道入口分别接到流动驱动装置上，并将流动驱动装置的引线或引管连接至常规二氧化碳孵箱内，以便控制本发明分选装置内的流动。对于副通道数量增多的情况下，应采用集成的微泵与微阀技术；在多数情况下，这可以结合最新进展的技术与本发明装置一起考虑制作。为方便起见，可将本实施例中靠近主通道圆环状入口按逆时针方向编序的最后两个副通道作为主通道的出口，它们的开合依据主通道1中的流速需要而调节。剩余的副通道可根据本实施例分选细胞需要选用若干或全部，可根据其所编号顺序及其中所流动的“促细胞迁移”因子来实现编址。本实施例副通道中布置的微丝的材质分为两类，一类为不锈钢微丝，针对HSCs分选；另一类是塑料微丝（如尼龙66），针对MSCs分选；它们的表面均作纤粘蛋白分子裱衬。其中所加工的副通道为圆形，直径为100微米，采用的微丝直径为85微米左右，如此在微丝与副通道的横向截面上留有平均15微米左右的间隙。在低压力差下，副通道入口进入的溶液流动在间隙中向主通道流动时可保持相当稳定的层流，并在沿程上建立确定的线性浓度梯度。为方便说明起见，按照本实施例分选目的，将图3所示意的副通道分为三类来实施“促细胞迁移”因子溶液的灌流，如按上编号的第1~5个副通道中流动的溶液针对分选HSCs，第6~10个副通道中流动的溶液针对分选MSCs，剩余的3个则流入对照溶液。针对分选HSCs的溶液因子是趋化因子IL-8、Mip-1α、Groβ或SDF-1中的任意一种，并且可以与G-CSF、GM-CSF、IL-7、IL-3、IL-12、flt-3配基中的任意一种或多种实施组合；针对分选MSCs的溶液因子是趋化因子CCL-2,6,7,9,CXCL-1,2,12中的任意一种，并且可以与IL-1,6、TGF-β1,β2、TNF-II中的任意一种或多种实施组合。它们的浓度均为0.05μg/mL。

按照国际通用的Galanakis指南[Galanakis D.,Dracker R.,Fricke W.,Gomensoro-Garcia A.E.,Rosales L.,Skerrett D.,Novello,A.C.,Linden J.V.(2003).Guidelines for collection,processing and storage of cord blood stem cells,2^nd Edition,New York State Department of Health.]获取的冻存人脐血，解冻至室温。将脐血样品用Dulbecco’s PBS溶液A（无钙镁离子）（简写为PBSA）按1∶1比例稀释，加入造血干细胞（HSCs）和MSCs共培养液IMDM（Iscove’s modifiedDulbecco’s medium,Invitrogen，USA）（并添加10%热灭活胎牛血清FBS，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）。

将10μL上述制备的脐血样品用注射针加样至图3装置连接主通道的软管6中。将上述制备的“促细胞迁移因子”溶液1μL加样至相应的副通道中。置放进二氧化碳孵箱中，打开泵运设备，使不同的溶液在此分选装置中运动，主通道内的溶液以缓慢的“推磨”方式流转，而各副通道内的溶液几乎近于“停滞”状速度缓行流动（从入口到与主通道交合处形成以分子扩散为主要运动方式的浓度梯度）。如此孵化6~12小时后，取出该装置，置于显微镜下观测，从所编址的副通道及微丝可分辨出所分选细胞种类，或可以撤移出相应的微丝，将分别贴附的MSCs细胞或HSCs细胞作为后续应用。

Claims (9)

1.一种微流控细胞分选装置，由一条主通道与至少一条副通道组成，主通道与各副通道之间流动沟通，其特征在于：与主通道接合处的副通道端口置有固状体，该固状体的表面上裱衬有促细胞粘附分子层，主通道内的流动可遍历各接合处，副通道内的溶液流向主通道，其溶液中含有促目标细胞迁移的生物分子。

2.如权利要求1所述装置，其特征在于：主通道的内壁面分布有微凸结构，微凸结构在与主通道内壁面垂直方向的最大径向尺寸不超过5微米。

3.如权利要求1所述装置，其特征在于：主通道沿轴向呈弯曲状，最小弯曲弧度的半径与该主通道的最大径向尺寸之比大于20倍。

4.如权利要求1所述装置，其特征在于：主通道内从入口端到出口端沿其轴向置有长条状结构，沿主通道轴向全程长条状结构与主通道内壁面之间留有间隙，间隙的尺寸范围为5微米~80微米。

5.如权利要求1所述装置，其特征在于：与主通道接合处的副通道端口所置固状体呈片状，其上至少有一个通孔，通孔直径大小范围为1纳米~20微米，该片状物朝向主通道的表面面积范围为5平方微米~300平方微米。

6.如权利要求1所述装置，其特征在于：与主通道接合处的副通道端口所置固状体是一细杆，与副通道内壁面之间留有间隙，间隙的最大尺寸不大于20微米；细杆轴向长度上延伸至副通道的另一端口，细杆受力时可在副通道内可活动，并可移出副通道。

7.如权利要求1与权利要求4所述装置，其特征在于：主通道内置的长条状结构的一个侧面固定在主通道底面上，或者该长条状结构是主通道底面的一个组成部分；该长条状结构在轴向沿程上可以有间断，其间距最大不超过60微米。

8.如权利要求1与权利要求4所述装置，其特征在于：主通道内长条状结构中置有副通道，并与长条状结构结合在一起，长条状结构连同结合在一起的副通道在外力作用下可从主通道中取出。

9.如权利要求1与权利要求6所述装置，其特征在于：副通道位于主通道之内，副通道轴向与主通道轴向并行，主通道与副通道之间的间隙尺寸范围为5微米~80微米。

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