CN112210536A - 一种可连续收获且无需酶消化的2d、3d细胞共培养体系及其构建方法和应用 - Google Patents

一种可连续收获且无需酶消化的2d、3d细胞共培养体系及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系及其构建方法和应用。其构建方法为：(1)制备带有微阵列图案的印章；(2)带微阵列图案培养基底的制备；(3)2D、3D细胞共培养于微图案培养基底；(4)获得3D细胞微球与2D细胞共培养体系。本发明提供的可连续收获、无需酶消化的细胞2D、3D共培养体系，能够使细胞在同一环境下实现2D、3D共存的培养，如需获取3D细胞微球，可通过简单的吸管吹打收获，无需酶消化；且基底细胞仍可继续生成3D细胞微球，如同种植植物可实现连续的收获，同时，3D细胞微球的形成无需添加胶原、海藻酸钠等材料，减少研究中外源细胞外基质的影响。

Description

一种可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系及其 构建方法和应用
技术领域
本发明属于细胞共培养体系技术领域，具体涉及一种可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系及其构建方法和应用。
背景技术
细胞培养是生物、医学研究中的重要实验技术，在基础研究、药物评价等实验中具有不可替代的作用。然而，目前细胞培养技术仍然有一些问题亟待解决。
1、2D的培养条件无法反映细胞真实的3D培养环境。
2、目前常用的3D细胞培养体系需要添加胶原、海藻酸钠等凝胶或固体成分作为支架，如果选择不善，材料组成与真实细胞环境差异很大。
3、也有某些特定细胞(如肿瘤细胞)，由于具有很强自我更新能力能够在悬浮培养时自行形成微球，但是微球自由在培养液中悬浮，无法固定，影响定点、定时观察。
4、目前3D细胞培养相对于2D培养，技术复杂，需要每次按需制备，无法实现可持续获取。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种可连续收获且无需酶消化的 2D、3D细胞共培养体系及其构建方法和应用，实现了3D细胞培养与2D细胞培养同时进行、无需添加凝胶类细胞支架、可连续获得3D培养的细胞团、实现固定化培养的细胞2D、3D共培养体系。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，包括以下步骤：
(1)制备带有微阵列图案的印章；
(2)在印章表面滴加胞外基质蛋白工作液，孵育30～60min后，于50～60℃烘干，然后加压使印章与培养基底底部接触5～10min，使培养基底带有微阵列图案，再封闭微阵列图案中不含细胞外基质的位点；
(3)向步骤(2)所得培养基底中以1.0～5.0×104个/mL的密度接种细胞，然后35～37℃，5～10％CO2培养至90％以上的微阵列团中均有细胞贴壁后，更换新鲜培养基；其中，新鲜培养基的选择根据培育的细胞种类而定，每种细胞对应的培养基参考ATCC推荐使用的基础培养基；
(4)于37℃继续培养3～5天后，即可获得合适大小的3D细胞微球与2D 细胞共培养体系。
进一步地，带有微阵列图案的印章的制备过程为：
利用UV光刻制备规格为100×100μm的图案阵列，然后使用道康宁184倒模，即可制备得到PDMS印章，清洗备用。
进一步地，微阵列图案的单一图形形状无特殊要求，以圆形、矩形等规则图形容易分辨为优，面积大小为40-10000μm2。
进一步地，细胞外基质为纤连蛋白(Fibronectin)、胶原(Collagen)、核纤层蛋白(Lamin)、等细胞外基质或市售Matrigel等细胞外基质复合物，工作浓度为10～1000μg/mL。
进一步地，胞外基质蛋白工作液为浓度为20μg/mL的纤连蛋白工作液。
进一步地，步骤(2)中使用两亲性共聚物封闭微阵列图案中不含细胞外基质的位点。
进一步地，两亲性共聚物为浓度为0.1％-10％的泊洛沙姆F-127。
进一步地，泊洛沙姆F-127的浓度为1％。
进一步地，培养基底中接种的细胞密度为10000个/mL。
进一步地，培养基底为培养皿。
进一步地，培养皿材质为常用市售的聚苯乙烯培养产品或硅烷化玻璃。
上述方法构建得到的2D、3D细胞共培养体系。
上述2D、3D细胞共培养体系在肿瘤药物测试中的应用。
上述2D、3D细胞共培养体系中的3D细胞微球阵列在高通量药物测试中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的可连续收获、无需酶消化的细胞2D、3D共培养体系，通过利用微图案技术构建单细胞或数个细胞形成特定2D形态的微阵列，在几何形态提供的力学调控下进一步形成3D细胞微球，实现2D、3D培养方式的共存。
2、本发明构建得到的细胞2D、3D共培养体系中，3D细胞微球被固定在培养基底的固定位置，可方便对同一微球进行长时间观察与分析；如需获取3D细胞微球，可通过简单的吸管吹打收获，无需酶消化；且基底细胞仍可继续生成 3D细胞微球，如同种植植物可实现连续的收获。
3、本发明提供的可连续收获、无需酶消化的细胞2D、3D共培养体系，能够使细胞在同一环境下实现2D、3D共存的培养，为细胞学研究提供一个可同时研究细胞2D、3D生长状况的技术，同时，3D细胞微球的形成无需添加胶原、海藻酸钠等材料，减少研究中外源细胞外基质的影响。
附图说明
图1为本申请构建得到的培养基底中的微图案阵列及限定生长的肿瘤细胞；其中可以清楚看到在同一为图案中的细胞分别呈现2D、3D的生长状态；
图2为本申请构建得到的2D、3D细胞微阵列图案共培养体系；其中，A 为图案中细胞(Hela)团3D结构图(光亮部分表示细胞肌动蛋白骨架；斑点表示细胞核)；B为图案中细胞(MDA-MB-231)的生长情况；
图3为从本申请构建得到的2D、3D细胞共培养体系中收获的3D细胞团；其中，A为图案中的细胞(Hela)团；B为机械吹打下的细胞(Hela)团。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
一种人宫颈癌细胞(Hela)的可连续收获、无需酶消化的细胞2D、3D共培养体系构建，包括以下步骤：
1、微图案阵列印章的制备；
利用UV光刻制备具有100×100μm的矩形图案阵列，使用道康宁184倒模制备PDMS印章，清洗备用。
2、带微阵列图案培养基底的制备；
(1)滴加200μl的Fibronectin工作液到PDMS印章表面，孵育30min。
(2)吸走多余的Fibronectin工作液，将PDMS放入50℃烘箱中烘干。
(3)将PDMS印章置于培养皿(广州洁特3.5mm2培养皿)底面，施加约 50N的压力，5min后移去PDMS印章。
(4)将带微图案培养皿用两亲性共聚物封闭不含细胞外基质图案的位点。优选地，1％泊洛沙姆(Poloxamer)F-127处理1h，ddH2O清洗3次后灭菌备用。
3、2D、3D细胞共培养于微图案培养基底；
Hela、MDA-MB-231细胞融合度达到90％左右时即可消化传代，吸出培养基，用无菌PBS清洗细胞表面，洗去残留的培养基。加入1ml胰酶，静置2min。显微镜观察多数细胞变为球形时，弃去胰酶，加入含有FBS的1640培养基终止消化。吸出细胞悬液，血球计数板计数，再以1.0×104个/ml的密度接种于含微图案的培养皿中，置于37℃，5％CO2动物细胞培养箱中培养，待多数细胞贴壁后，弃去未贴壁细胞，更换新鲜培养基。
4、3D细胞球的可连续生长与收获
于37℃继续培养3-5天后可获得合适大小的3D细胞微球与2D细胞共培养体系。由于力学微环境的作用，3D微球的生长周期可以极大缩短。待3D细胞微球达到合适大小后，可选择使用移液器枪头轻轻吹打或轻摇培养皿的方式分离、收集3D细胞微球备用，也可利用3D细胞微球阵列直接进行实验。
实施例2
一种人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的可连续收获、无需酶消化的细胞2D、 3D共培养体系构建，包括以下步骤：
多样性是肿瘤细胞的特点是，每个肿瘤细胞在特定条件下都有着自己独特的基因表达、蛋白水平与生物学行为特点。将当个细胞作为研究对象能更好的研究肿瘤的多态性。
1、微图案阵列印章的制备；
利用UV光刻制备具有100×100μm的矩形图案阵列，使用道康宁184倒模制备PDMS印章，清洗备用。
2、带微阵列图案培养基底的制备；
(1)滴加200μl的Fibronectin工作液到PDMS印章表面，孵育30min。
(2)吸走多余的Fibronectin工作液，将PDMS放入50℃烘箱中烘干。
(3)将PDMS印章置于培养皿(广州洁特3.5mm2培养皿)底面，施加约 50N的压力，5min后移去PDMS印章。
(4)将带微图案培养皿用两亲性共聚物封闭不含细胞外基质图案的位点。优选地，1％泊洛沙姆(Poloxamer)F-127处理1h，ddH2O清洗3次后灭菌备用。
3、2D、3D细胞共培养于微图案培养基底；
MDA-MB-231细胞融合度达到80％左右时即可消化传代，吸出培养基，用无菌PBS清洗细胞表面，洗去残留的培养基。加入1ml胰酶，静置2min。显微镜观察多数细胞变为球形时，弃去胰酶，加入含有FBS的L-15培养基终止消化。吸出细胞悬液，血球计数板计数，再以500个/ml的密度接种于含微图案的培养皿中，置于37℃，5％CO2动物细胞培养箱中培养，待多数细胞贴壁后，弃去未贴壁细胞，更换新鲜培养基。
4、3D细胞球的可连续生长与收获
于37℃继续培养3-5天后可获得合适大小的3D细胞微球与2D细胞共培养体系。由于力学微环境的作用，3D微球的生长周期可以极大缩短。待3D细胞微球达到合适大小后，可选择使用移液器枪头轻轻吹打或轻摇培养皿的方式分离、收集3D细胞微球备用，也可利用3D细胞微球阵列直接进行实验。
根据图1～3的检测结果可知，根据本申请方法能够成功的构建得到可连续收获、无需酶消化的细胞2D、3D共培养体系，且从其中成功的分离得到了3D 细胞。

Claims (10)

1.一种构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备带有微阵列图案的印章；
(2)在印章表面滴加胞外基质蛋白工作液，孵育30～60min后，于50～60℃烘干，然后加压使印章与培养基底底部接触5～10min，使培养基底带有微阵列图案，再封闭微阵列图案中不含细胞外基质的位点；
(3)向步骤(2)所得培养基底中以1.0～5.0×104个/mL的密度接种细胞，然后35～37℃，5～10％CO2培养至90％以上的微阵列团中均有细胞贴壁后，更换新鲜培养基；
(4)于37℃继续培养3～5天后，即可获得2D、3D细胞共培养体系。
2.根据权利要求1所述的构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，其特征在于，所述带有微阵列图案的印章的制备过程为：
利用UV光刻制备具有面积大小为40-10000μm2的微图案阵列，然后使用道康宁184倒模，即可制备得到PDMS印章，清洗备用。
3.根据权利要求1所述的构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，其特征在于，所述胞外基质蛋白工作液为浓度为2～200μg/mL的纤连蛋白工作液。
4.根据权利要求1所述的构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中使用两亲性共聚物封闭微阵列图案中不含细胞外基质的位点。
5.根据权利要求4所述的构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，其特征在于，所述两亲性共聚物为浓度为0.1％-10％的泊洛沙姆F-127。
6.根据权利要求5所述的构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，其特征在于，所述泊洛沙姆F-127的浓度为1％。
7.根据权利要求1所述的构建可连续收获且无需酶消化的2D、3D细胞共培养体系的方法，其特征在于，所述培养基底中接种的细胞密度为10000个/mL。
8.权利要求1～7任一项所述方法构建得到的2D、3D细胞共培养体系。
9.权利要求8所述的2D、3D细胞共培养体系在肿瘤药物测试中的应用。
10.权利要求8所述的2D、3D细胞共培养体系中的3D细胞微球阵列在高通量药物测试中的应用。
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