CN105504327A - 一种具有3d微图案的生物材料及其制备方法 - Google Patents

一种具有3d微图案的生物材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种具有3D微图案形状的生物材料及其制备方法。所述生物材料包括三维微孔阵列，所述三维微孔孔内铺展有一层可以与细胞外基质蛋白因子有效结合的功能层；所述三维微孔孔外有一层能阻止细胞粘附生长的抗蛋白吸附层。本发明突破了细胞图案化从2维到3维的限制，利用Sulfo？SANPAH活化基团可以有效结合细胞外基质蛋白因子，进而引导单细胞入微孔，同时利用PEG不利于细胞粘附，进而阻止单细胞粘度在孔外，采用本发明所述具有3D微图案形状的生物材料种植细胞，单细胞入孔率可达到90％，而微孔外部几乎无细胞生长。

Description

一种具有3D微图案的生物材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种具有3D微图案的生物材料及其制备方法。
背景技术
目前细胞图案化技术局限在二维水平。二维水平上的细胞图案化是通过微接触影印将目标图案影印在不同材料表面，或者通过金导形成特定的图案引导细胞粘附及生长。但是机体组织实际上是由一系列纳米-微米复合体系所构成，细胞在机体内的各种行为实际上受到不同尺度3D微结构因素的影响和调控(而非仅仅是2D水平)。因此，如何将上述二维图案研究拓展到三维微结构空间，更具实际意义和价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种具有3D微图案的生物材料及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括三维微孔阵列，所述三维微孔孔内铺展有一层可以与细胞外基质蛋白因子有效结合的功能层；所述三维微孔孔外有一层能阻止细胞粘附生长的抗蛋白吸附层。
上述方案中，所述三维微孔为非中通孔，且各三维微孔的开口方向相同。
上述方案中，所述三维微孔阵列是由PAAm或PDMS材料制备而成。
上述方案中，所述功能层是由铺展在三维微孔孔内的SulfoSANPAH层经紫外光照射活化后所得。
上述方案中，所述抗蛋白吸附层是在聚赖氨酸层(PLL)或乙二胺层上化学键合了聚乙二醇(PEG)后形成的复合层。
上述方案中，所述三维微孔的横截面形状为圆形、三角形、正方形、长方形、菱形和纺锤形中的一种或几种。
上述方案中，所述三维微孔的当量直径为目标细胞悬浮状态下直径的2～5倍。
上述方案中，所述细胞外基质蛋白因子为纤连蛋白(FN)、聚赖氨酸(PLL)、层连蛋白(LN)、胶原蛋白Col、或RGD序列。
上述具有3D微图案形状的生物材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备三维微孔阵列：采用CAD软件绘制三维微孔阵列图案，制成掩膜版，用掩膜版通过软刻蚀技术将负光刻胶光刻在硅片上制备三维微孔阵列，然后在负光刻胶表面浇筑PDMS或PAAm胶预聚物，交联固化后得到PMDS或PAAm胶三维微孔阵列；
(2)SulfoSANPAH改性：将步骤(1)所得PMDS或PAAm胶三维微孔阵列浸泡在SulfoSANPAH溶液中，抽真空，使三维微孔的孔内外都均匀地铺展上一层SulfoSANPAH，然后置于紫外光下照射活化SulfoSANPAH上的活性基团；
(3)将琼脂糖凝固成表面光滑的印面，将琼脂糖印面浸泡在PLL溶液或乙二胺溶液中，随后取出，用氮气将其表面的液体吹均匀，将印面覆盖在经步骤(2)SulfoSANPAH改性之后的三维微孔阵列开口表面，轻施压力，使PLL或乙二胺均匀地印在三维微孔阵列孔外表面上，然后取下琼脂糖印面，用氮气速干三维微孔阵列孔外表面；
(4)将步骤(3)处理后的三维微孔阵列浸没在PEG溶液中，室温下孵育一段时间，用氮气速干，三维微孔阵列孔外表面上均匀铺展的PLL或乙二胺与PEG通过化学键结合，形成抗蛋白吸附层；
(5)将步骤(4)处理后的三维微孔阵列浸泡在PBS中，然后经灭菌处理后，得到具有3D微图案形状的生物材料。
上述方案中，步骤(2)所述紫外照射活化的时间为20min～30min；步骤(4)所述室温下孵育的时间为30min～1h。
上述方案中，步骤(2)所述SulfoSANPAH溶液的浓度为0.25～0.3mmol/ml，步骤(3)所述PLL溶液或乙二胺溶液的浓度为1～2mg/ml；步骤(4)所述PEG溶液的浓度为10～20mg/ml。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明所述具有3D微图案形状的生物材料，其三维微孔孔内的SulfoSANPAH活性基团可以与细胞外基质蛋白因子通过化学键有效结合，相比较二维微图案化生物材料中细胞外基质蛋白因子通过物理吸附沉积的方式更加地稳定、牢固。
(2)本发明通过SulfoSANPAH对三维微孔阵列进行改性，采用抽真空的方式处理有利于SulfoSANPAH进入并均匀铺展在三维微孔孔内；同时采用紫外光照射活化的方式激活SulfoSANPAH活性基团，具有操作简便高效的优点。
(3)本发明利用SulfoSANPAH活化基团可以有效结合细胞外基质蛋白因子，进而引导单细胞入微孔，同时利用PEG不利于细胞粘附的特性，在三维微孔孔外形成抗蛋白吸附层，进而阻止单细胞粘附，采用本发明所述具有3D微图案形状的生物材料种植细胞，单细胞入孔率可达到90％，而微孔孔外几乎无细胞生长。
(4)本发明所述制备方法操作简单，反应条件温和，突破了细胞图案化从2维到3维的限制，实现了三维水平的单细胞入孔培养，为单细胞水平研究材料-机体细胞相互作用提供了新的方法；本发明所提出的3D微图案孔结构对单细胞的限定，在细胞生物学基础研究、细胞机械力学研究、组织工程、药物筛选等领域具有广泛应用前景。
附图说明
图1为本发明所述制备方法的工艺流程图。
图2为本发明所述具有3D微图案形状的生物材料种植细胞之后倒置显微镜拍摄的效果图，其中(1)是三维微孔的横截面为长方形形状的三维阵列，(2)是三维微孔的横截面为正方形形状的三维阵列，(3)是三维微孔的横截面为圆形形状的三维阵列，(4)是三维微孔的横截面为菱形形状的三维阵列，(5)是三维微孔的横截面为三角形形状的三维阵列，(6)是三维微孔的横截面为椭圆形形状的三维阵列。
图3为单细胞入微孔后形成的微孔阵列荧光图。
图4为单细胞入微孔后其形态受到三维微孔限制的荧光图，其中DAPI是细胞核的荧光染色图，FITC-ACTIN是细胞骨架的荧光染色图，Membrace是细胞膜的荧光染色图，Merge是细胞核、细胞骨架和细胞膜的荧光染色图合并后显示的单细胞形态。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种具有3D微图案形状的生物材料，通过如下方法制备得到：
(1)制备三维微孔阵列：采用CAD软件绘制横截面为长方形图案、当量直径为目标细胞悬浮状态下直径的2～5倍的三维微孔阵列，制成掩膜版，用掩膜版通过软刻蚀技术将负光刻胶光刻在硅片上制备三维微孔阵列微图案，然后在负光刻胶表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后得到PMDS胶三维微孔阵列；
(2)SulfoSANPAH改性：将步骤(1)所得PMDS胶三维微孔阵列切成适合放入24孔板的大小，浸泡在0.25mmol/mlSulfoSANPAH溶液中，抽真空，使三维微孔孔内孔外都均匀地铺展上一层SulfoSANPAH，然后置于紫外光下照射30min活化SulfoSANPAH上的活性基团；
(3)将5％的低熔点琼脂糖凝固成表面光滑的印面，切成2)中PMDS胶三维微孔阵列的大小，将琼脂糖印面浸泡在1mg/mlPLL溶液中30min，随后取出，用氮气将其表面液体吹均匀，将印面覆盖在经步骤(2)SulfoSANPAH改性之后的三维微孔阵列开口表面，在其上放置一个1元硬币，使PLL能均匀地印在PMDS胶三维微孔阵列的表面，30分钟后，取下硬币、三维微孔阵列表面用氮气速干，使PDMS的微孔外部PLL均匀铺展；
(4)将步骤(3)处理后的三维微孔阵列浸没在10mg/mlPEG溶液中，室温下孵育30min，用氮气速干，使三维微孔孔外均匀铺展的PLL与PEG通过化学键结合，形成抗蛋白吸附层；
(5)将步骤(4)处理后的三维微孔阵列放入24孔板中，每孔加入1mlPBS洗三次后，浸泡在PBS中，用紫外光照射灭菌处理30分钟后，得到具有3D微图案形状的生物材料。
然后在上述24孔板的每孔加入含有1*105个细胞的培养液，放入二氧化碳培养箱中培养四个小时后，细胞被引导进入三维微孔内，倒掉培养液，更换上纯细胞培养基，即得到单细胞入孔的三维单细胞阵列。
实施例2
一种具有3D微图案形状的生物材料，通过如下方法制备得到：
(1)制备三维微孔阵列：采用CAD软件绘制横截面为圆形图案、当量直径为目标细胞悬浮状态下直径2～5倍的三维微孔阵列，制成掩膜版，用掩膜版通过软刻蚀技术将负光刻胶光刻在硅片上制备三维微孔阵列微图案，然后在负光刻胶表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后得到PMDS胶三维微孔阵列；
(2)SulfoSANPAH改性：将步骤(1)所得PMDS胶三维微孔阵列切成适合放入24孔板的大小，浸泡在0.25mmol/mlSulfoSANPAH溶液中，抽真空，使三维微孔孔内孔外都均匀地铺展上一层SulfoSANPAH，然后置于紫外光下照射30min活化SulfoSANPAH上的活性基团；
(3)将5％的低熔点琼脂糖凝固成表面光滑的印面，切成2)中PMDS胶三维微孔阵列的大小，将琼脂糖印面浸泡在2mg/ml的乙二胺溶液中30min，随后取出，用氮气将其表面液体吹均匀，将印面覆盖在经步骤(2)SulfoSANPAH改性之后的三维微孔阵列开口表面，在其上放置一个1元硬币，使乙二胺均匀地印在PMDS胶三维微孔阵列的表面，30分钟后，取下硬币、三维微孔阵列表面用氮气速干，使PDMS的微孔外部乙二胺均匀铺展；
(4)将步骤(3)处理后的三维微孔阵列浸没在10mg/mlPGE溶液中，室温下孵育30min，用氮气速干，使三维微孔孔外均匀铺展的乙二胺与PEG通过化学键结合，形成抗蛋白吸附层；
(5)将步骤(4)处理后的三维微孔阵列放入24孔板中，每孔加入1mlPBS洗三次后，浸泡在PBS中，用紫外光照射灭菌处理30分钟后，得到具有3D微图案形状的生物材料；
然后在上述24孔板的每孔加入含有1*105个细胞的培养液，放入二氧化碳培养箱中培养四个小时后，细胞被引导进入三维微孔内，倒掉培养液，更换上纯细胞培养基，即得到单细胞入孔的三维单细胞阵列。
实施例3
一种具有3D微图案形状的生物材料，通过如下方法制备得到：
(1)制备三维微孔阵列：采用CAD软件绘制横截面为正方形图案、当量直径为目标细胞悬浮状态下直径2～5倍的三维微孔阵列，制成掩膜版，用掩膜版通过软刻蚀技术将负光刻胶光刻在硅片上制备三维微孔阵列微图案，然后在负光刻胶表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后得到PMDS胶三维微孔阵列；
(2)SulfoSANPAH改性：将步骤(1)所得PMDS胶三维微孔阵列切成适合放入24孔板的大小，浸泡在0.25mmol/mlSulfoSANPAH溶液中，抽真空，使三维微孔孔内孔外都均匀地铺展上一层SulfoSANPAH，然后置于紫外光下照射30min活化SulfoSANPAH上的活性基团；
(3)将5％的低熔点琼脂糖凝固成表面光滑的印面，切成2)中PMDS胶三维微孔阵列的大小，将琼脂糖印面浸泡在1mg/ml的乙二胺溶液中30min，随后取出，用氮气将其表面液体吹均匀，将印面覆盖在经步骤(2)SulfoSANPAH改性之后的三维微孔阵列开口表面，在其上放置一个1元硬币，使乙二胺均匀地印PMDS胶三维微孔阵列的表面，30分钟后，取下硬币、三维微孔阵列表面用氮气速干，使PDMS的微孔外部乙二胺均匀铺展；
(4)将步骤(3)处理后的三维微孔阵列浸没在10mg/mlPGE溶液中，室温下孵育30min，用氮气速干，使三维微孔孔外均匀铺展的乙二胺与PEG通过化学键结合，形成抗蛋白吸附层；
(5)将步骤(4)处理后的三维微孔阵列放入24孔板中，每孔加入1mlPBS洗三次后，浸泡在PBS中，用紫外光照射灭菌处理30分钟后，得到具有3D微图案形状的生物材料；
然后在上述24孔板的每孔加入含有1*105个细胞的培养液，放入二氧化碳培养箱中培养四个小时后，细胞被引导进入三维微孔内，倒掉培养液，更换上纯细胞培养基，即得到单细胞入孔的三维单细胞阵列。
实施例4
一种具有3D微图案形状的生物材料，通过如下方法制备得到：
(1)制备三维微孔阵列：采用CAD软件绘制横截面为圆形图案、当量直径为目标细胞悬浮状态下2～5倍的三维微孔阵列，制成掩膜版，用掩膜版通过软刻蚀技术将负光刻胶光刻在硅片上制备三维微孔阵列微图案，然后在负光刻胶表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后得到PMDS胶三维微孔阵列；
(2)SulfoSANPAH改性：将步骤(1)所得PMDS胶三维微孔阵列切成适合放入24孔板的大小，浸泡在0.3mmol/mlSulfoSANPAH溶液中，抽真空，使三维微孔孔内孔外都均匀地铺展上一层SulfoSANPAH，然后置于紫外光下照射20min活化SulfoSANPAH上的活性基团；
(3)将5％的低熔点琼脂糖凝固成表面光滑的印面，切成2)中PMDS胶三维微孔阵列的大小，将琼脂糖印面浸泡在2mg/ml的PLL溶液中30min，随后取出，用氮气将其表面液体吹均匀，将印面覆盖在经步骤(2)SulfoSANPAH改性之后的三维微孔阵列开口表面，在其上放置一个1元硬币，使PLL能均匀地印PMDS胶三维微孔阵列的表面，30分钟后，取下硬币、三维微孔阵列表面用氮气速干，使微孔孔外的PLL均匀铺展；
(4)将步骤(3)处理后的三维微孔阵列浸没在10mg/mlPGE溶液中，室温下孵育30min，用氮气速干，使三维微孔孔外均匀铺展的PLL与PEG通过化学键结合，形成抗蛋白吸附层；
(5)将步骤(4)处理后的三维微孔阵列放入24孔板中，每孔加入1mlPBS洗三次后，浸泡在PBS中，用紫外光照射灭菌处理30分钟后，得到具有3D微图案形状的生物材料；
然后在上述24孔板的每孔加入含有1*105个细胞的培养液，放入二氧化碳培养箱中培养四个小时后，细胞被引导进入三维微孔内，倒掉培养液，更换上纯细胞培养基，即得到单细胞入孔的三维单细胞阵列。
实施例5
一种具有3D微图案形状的生物材料，通过如下方法制备得到：
(1)制备三维微孔阵列：采用CAD软件绘制横截面为菱形图案、当量直径为目标细胞悬浮状态下直径2～5倍的三维微孔阵列，制成掩膜版，用掩膜版通过软刻蚀技术将负光刻胶光刻在硅片上制备三维微孔阵列微图案，然后在负光刻胶表面浇筑PDMS胶预聚物，60℃烘箱中交联固化12小时后得到PMDS胶三维微孔阵列；
(2)SulfoSANPAH改性：将步骤(1)所得PMDS胶三维微孔阵列切成适合放入24孔板的大小，浸泡在0.25mmol/mlSulfoSANPAH溶液中，抽真空，使三维微孔孔内孔外都均匀地铺展上一层SulfoSANPAH，然后置于紫外光下照射30min活化SulfoSANPAH上的活性基团；
(3)将5％的低熔点琼脂糖凝固成表面光滑的印面，切成2)中PMDS胶三维微孔阵列的大小，将琼脂糖印面浸泡在1mg/ml的乙二胺溶液中30min，随后取出，用氮气将其表面液体吹均匀，将印面覆盖在经步骤(2)SulfoSANPAH改性之后的三维微孔阵列开口表面，在其上放置一个1元硬币，使乙二胺均匀地印PMDS胶三维微孔阵列的表面，30分钟后，取下硬币，三维微孔阵列表面用氮气速干，使PDMS得微孔外部乙二胺均匀铺展；
(4)将步骤(3)处理后的三维微孔阵列浸没在20mg/mlPGE溶液中，室温下孵育30min，用氮气速干，使三维微孔孔外均匀铺展的乙二胺与PEG通过化学键结合，形成抗蛋白吸附层；
(5)将步骤(4)处理后的三维微孔阵列放入24孔板中，每孔加入1mlPBS洗三次后，浸泡在PBS中，用紫外光照射灭菌处理30分钟后，得到具有3D微图案形状的生物材料；
然后在上述24孔板的每孔加入含有1*105个细胞的培养液，放入二氧化碳培养箱中培养四个小时后，细胞被引导进入三维微孔内，倒掉培养液，更换上纯细胞培养基，即得到单细胞入孔的三维单细胞阵列。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括三维微孔阵列，所述三维微孔孔内铺展有一层可以与细胞外基质蛋白因子有效结合的功能层；所述三维微孔孔外有一层能阻止细胞粘附生长的抗蛋白吸附层。
2.根据权利要求1所述的具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述三维微孔阵列是由PAAm或PDMS材料制备而成。
3.根据权利要求1所述的具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述功能层是由铺展在三维微孔孔内的SulfoSANPAH层经紫外光照射活化后所得。
4.根据权利要求1所述的具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述抗蛋白吸附层是在聚赖氨酸层或乙二胺层上化学键合了聚乙二醇后形成的复合层。
5.根据权利要求1所述的具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述三维微孔的横截面形状为圆形、三角形、正方形、长方形、菱形和纺锤形中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述三维微孔的当量直径为目标细胞悬浮状态下直径的2~5倍。
7.根据权利要求1所述的具有3D微图案形状的生物材料，其特征在于，所述细胞外基质蛋白因子为纤连蛋白、聚赖氨酸、层连蛋白、胶原蛋白、或RGD序列。
8.权利要求1~7任一所述具有3D微图案形状的生物材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备三维微孔阵列：采用CAD软件绘制三维微孔阵列图案，制成掩膜版，用掩膜版通过软刻蚀技术将负光刻胶光刻在硅片上制备三维微孔阵列，然后在负光刻胶表面浇筑PDMS或PAAm胶预聚物，交联固化后得到PMDS或PAAm胶三维微孔阵列；
（2）SulfoSANPAH改性：将步骤（1）所得PMDS或PAAm胶三维微孔阵列浸泡在SulfoSANPAH溶液中，抽真空，使三维微孔的孔内外都均匀地铺展上一层SulfoSANPAH，然后置于紫外光下照射活化SulfoSANPAH上的活性基团；
（3）将琼脂糖凝固成表面光滑的印面，将琼脂糖印面浸泡在聚赖氨酸溶液或乙二胺溶液中，随后取出用氮气将表面液体吹均匀，将印面覆盖在经步骤（2）SulfoSANPAH改性之后的三维微孔阵列开口表面，轻施压力，使聚赖氨酸或乙二胺均匀地印在三维微孔阵列孔外表面上，然后取下琼脂糖印面，用氮气速干三维微孔阵列孔外表面；
（4）将步骤（3）处理后的三维微孔阵列浸没在聚乙二醇溶液中，室温下孵育一段时间，用氮气速干，三维微孔阵列孔外表面上均匀铺展的聚赖氨酸或乙二胺与聚乙二醇通过化学键结合，形成抗蛋白吸附层；
（5）将步骤（4）处理后的三维微孔阵列浸泡在PBS中，然后经灭菌处理后，得到具有3D微图案形状的生物材料。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述紫外照射活化的时间为20min~30min；步骤（4）所述室温下孵育的时间为30min~1h。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述SulfoSANPAH溶液的浓度为0.25~0.3mmol/ml，步骤（3）所述聚赖氨酸溶液或乙二胺溶液的浓度为1~2mg/ml；步骤（4）所述聚乙二醇溶液的浓度为10~20mg/ml。
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