KR20190096968A - 세포 배양 기재 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 기재가 수팽윤성 점토 광물 및 실리카로부터 선택되는 1종 이상의 무기 재료를 함유하고, 추가로 기재 중에 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재를 제공한다. 또한, 상기 세포외 매트릭스가 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트로부터 선택되는 적어도 1종이고/이거나 접착성 합성 기질이 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드] 또는 올리고펩티드 담지 중합체인 세포 배양 기재를 제공하는 것이다.

Description

세포 배양 기재
본 발명은 세포 배양용 기재(基材)에 관한 것이다.
인간 iPS 세포나 ES 세포와 같은 인간 다능성 줄기 세포는, 병리 해명이나 신약 개발 및 재생 의료에의 응용 가능성으로부터 주목받고 있다. 인간 다능성 줄기 세포의 이용에는, 안정하면서 안전하게 배양하고, 나아가 배양한 세포를 회수한 후에, 창약이나 의료에 응용할 필요가 있다.
종래부터 인간 다능성 줄기 세포는 그의 낮은 배양율이 과제로 되어 왔다. 해결법의 하나로서, 피더 세포를 이용한 배양법이 시도되어 왔지만, 사용한 피더 세포가 오염된다는 문제가 있는 점에서, 안전하다고 할 수는 없었다.
그것에 대한 해결책으로서, 특허문헌 1에서는, 세포 배양 기재 상에 세포외 매트릭스인 라미닌 및 라미닌 프래그먼트를 도포함으로써, 피더 세포가 없어도 인간 다능성 줄기 세포가 배양 가능한 것이 보고되어 있다.
한편, 특허문헌 1에서는 기재 상에서의 배양은 가능하기는 하지만, 배양 세포의 회수에 대해서는 언급되어 있지 않고, 배양 세포를 이용한다는 점에서는 과제가 남겨져 있다. 예를 들어 상기 방법으로 배양된 세포는, 세포외 매트릭스와의 접착이 강한 점에서, 효소 처리한 후에 셀 스크래퍼(고무 또는 수지제 주걱) 등으로 물리적으로 세포를 긁어모으는 방법으로 세포를 회수하고 있어, 작업 효율이 낮을 뿐 아니라 물리적 자극을 부여하는 점에서 세포의 생존율에 악영향을 미친다는 과제가 있었다.
한편, 라미닌 등의 세포외 매트릭스를 인간 다능성 줄기 세포에 이용하는 데 있어서는, 세포외 매트릭스가 실활되기 쉽다는 과제가 있다. 특히, 기재 표면이 건조되면 세포외 매트릭스가 실활되어, 인간 다능성 줄기 세포의 배양 효율이 저하된다. 세포 배양 기재의 보존 수송 등을 생각하면, 건조 상태에서도 배양 효율을 유지하는 것이 중요하다. 특허문헌 2에서는, 라미닌 이외의 단백질을 코팅함으로써, 건조 상태를 견딜 수 있는 세포 배양 기재가 개시되어 있지만, 이것에 대해서도 배양은 가능하기는 하지만, 배양 세포의 회수라는 과제는 해결되지 않았다.
WO2011/043405 WO2014/199754
본 발명의 과제는, 인간 다능성 줄기 세포라도 고효율로 배양 가능하며, 또한 배양 후의 세포를 높은 생존율을 유지한 채 박리시켜 회수하는 것이 가능한 세포 배양 기재를 제공하는 데 있다. 또한, 나아가 세포 박리 가능하며 또한 건조 상태에도 견딜 수 있는 세포 배양 기재를 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 기재가 수팽윤성 점토 광물 및 실리카로부터 선택되는 1종 이상의 무기 재료를 함유하고, 추가로 기재 중에 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재가, 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하였다.
또한, 세포외 매트릭스가 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트로부터 선택되는 적어도 1종인 세포 배양 기재를 제공한다.
또한, 접착성 합성 기질이 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드] 또는 올리고펩티드 담지 중합체인 세포 배양 기재를 제공한다.
상기 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체가,
하기 식 (1)로 표시되는 모노머 (a)와 친수성 아미드계 비닐 모노머 (b)의 공중합체 (B1),
또는 상기 모노머 (a)와 하기 식 (2)로 표시되는 모노머 (c)의 공중합체 (B2), 또는 모노머 (a)와 하기 식 (3)으로 표시되는 폴리에틸렌글리콜쇄 함유 모노머 (d)의 공중합체 (B3) 중 적어도 1종이며,
세포 배양 기재 전체에 대한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체의 함유율이 5질량％ 내지 99질량％인 세포 배양 기재를 제공한다.
Figure pct00001
(식 중, R1은 수소 원자 또는 메틸기, R2는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기, R3은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기를 나타낸다.)
Figure pct00002
(식 중, R4는 수소 원자 또는 메틸기, R5는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기를 나타낸다.)
Figure pct00003
(식 중, n은 2 내지 20의 정수를 나타낸다.)
또한 나아가, 상기 수팽윤성 점토 광물이 수팽윤성 헥토라이트, 수팽윤성 몬모릴로나이트, 수팽윤성 사포나이트 및 수팽윤성 합성 운모로부터 선택되는, 물 매체 (W) 중에서 1 내지 10층으로 층상 박리되는 1종 이상의 점토 광물이며, 상기 실리카가 수분산성 콜로이달 실리카인 세포 배양 기재를 제공한다.
또한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 함유하는 세포 배양 기재 상에, 추가로 젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재를 제공한다.
또한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 상에,
젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질을 함유하는 용액을 도포하는 공정과,
추가로 청구항 1에 기재된 접착 기질을 함유하는 용액을 도포하여 세포 배양 기재로 하는 공정과,
얻어진 세포 배양 기재를 건조시키는 공정을 갖는, 건조 세포 배양 기재의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 배양 기재는, 인간 다능성 줄기 세포를 고효율로 배양 가능할 뿐 아니라, 배양 후의 세포를 높은 생존율인 채로 기재로부터 박리시켜 회수할 수 있다.
또한, 건조 상태를 거쳐도 배양 가능하며 또한 세포 박리 가능한 기재를 개시한다.
본 발명은, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 기재가 수팽윤성 점토 광물 및 실리카로부터 선택되는 1종 이상의 무기 재료를 함유하고, 추가로 기재 상에 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재를 제공하는 것이다.
[하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체]
본 발명에 있어서의 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체란, 어떤 일정 온도 이하가 되면 물에 용해되는 중합체이다. 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체로서는, 하기 1) 및 2)를 들 수 있다.
1) 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체
2) 소수화 모노머와 친수성 모노머의 공중합체
1)은, 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머만을 중합시켜 얻어지는 중합체이다. 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머로서는, 예를 들어 N-이소프로필(메트)아크릴아미드, N-n-프로필(메트)아크릴아미드, N-시클로프로필(메트)아크릴아미드, N-에톡시에틸(메트)아크릴아미드, N-테트라히드로푸르푸릴(메트)아크릴아미드, N-에틸아크릴아미드, N-에틸-N-메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N-메틸-N-n-프로필아크릴아미드, N-메틸-N-이소프로필아크릴아미드, N-아크릴로일피페리딘 및 N-아크릴로일피롤리딘이 예시된다. 이들 모노머는 단독으로도 복수종을 동시에 이용해도 상관없다.
1)인 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체는, 간편하게 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 제조하는 것이 가능하다. 그러나 이들 모노머는 플라스틱 표면과의 사이에 접착성이 낮아, 물에 접촉하면, 도포된 중합체층이 박리되기 쉽다는 과제가 있지만, 본원의 세포 배양 기재는, 수팽윤성 점토 광물 및 실리카와 같은 무기 재료를 함유하는 점에서, 중합체와 무기 재료 사이에 이온 결합이나 수소 결합에 의해 삼차원 그물눈 구조를 형성하고, 내수성이 우수하기 때문에, 세포 배양 기재가 박리되지 않고 사용할 수 있다.
2)는, 소수화 모노머와 친수성 모노머의 공중합체이다. 소수화 모노머와 친수성 모노머의 공중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖기 위해서는,
2-1) 친수성 모노머가, 전술한 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머인 경우와,
2-2) 하기 식 (1)로 표시되는 모노머 (a)와 친수성 아미드계 비닐 모노머 (b)의 공중합체 (B1), 또는 상기 모노머 (a)와 하기 식 (2)로 표시되는 모노머 (c)의 공중합체 (B2), 또는 모노머 (a)와 하기 식 (3)으로 표시되는 폴리에틸렌글리콜쇄 함유 모노머 (d)의 공중합체 (B3)을 들 수 있다.
Figure pct00004
(식 중, R1은 수소 원자 또는 메틸기, R2는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기, R3은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기를 나타낸다.)
Figure pct00005
(식 중, R4는 수소 원자 또는 메틸기, R5는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기를 나타낸다.)
Figure pct00006
(식 중, n은 2 내지 20의 정수를 나타낸다.)
소수화 모노머란, 모노머 시는 수용성이지만 중합하면 수성 용매에 불용화되는 모노머이다. 이러한 모노머가 공중합체에 함유되어 있는 경우, 내수성이 우수하며 지지체로부터 박리되기 어려운 세포 배양 기재로 할 수 있다.
소수화 모노머로서는, 상기 식 (1)로 표시되는 화합물이나, 디아세톤아크릴아미드, (메트)아크릴산폴리프로필렌글리콜, 메톡시디에틸렌글리콜아크릴레이트, 메톡시트리에틸렌글리콜아크릴레이트를 들 수 있다. 이들은 단독으로도 복수종을 동시에 사용해도 상관없다. 그 중에서도 아크릴산2메톡시에틸, 아크릴산2에톡시에틸, 아크릴산3메톡시프로필이 바람직하고, 아크릴산2메톡시에틸, 아크릴산2에톡시에틸이 특히 바람직하다.
2-2)에서 개시되는 공중합체의 경우, 얻어지는 공중합체의 하한 임계 용해 온도를, 모노머의 종류나 비율에 의해 폭넓게 제어할 수 있고, 또한 세포의 종류에 따라서, 적절하게 모노머의 종류나 비율을 바꾸어, 보다 양호한 세포 접착성과 증식성을 가지고 세포를 배양할 수 있는 점에서 바람직하다. 예를 들어, 모노머 (a)에 대하여 모노머 (b 또는 c 또는 d)의 비율이 증가됨에 따라서, 얻어지는 공중합체의 하한 임계 용해 온도가 고온측으로 시프트된다. 이 비율과 하한 임계 용해 온도가 거의 직선 관계에 있다. 세포 배양 온도는 통상 37℃이기 때문에, 얻어지는 공중합체의 하한 임계 용해 온도는 20 내지 32℃ 부근이 되도록 조제하는 것이 바람직하다.
[무기 재료]
본 발명의 무기 재료는, 수팽윤성 점토 광물 및 실리카로부터 선택되는 1종 이상의 무기 재료이다. 수팽윤성 점토 광물로서는, 층상으로 박리 가능한 수팽윤성 점토 광물을 들 수 있고, 바람직하게는 물 또는 물과 유기 용제의 혼합 용액 중에서 팽윤하여 균일하게 분산 가능한 점토 광물, 특히 바람직하게는 물 중에서 분자상(단일층) 또는 그것에 가까운 레벨로 균일 분산 가능한 무기 점토 광물이 사용된다. 구체적으로는 나트륨을 층간 이온으로서 포함하는 수팽윤성 헥토라이트, 수팽윤성 몬모릴라이트, 수팽윤성 사포나이트, 수팽윤성 합성 운모 등을 들 수 있다. 이들 점토 광물을 혼합하여 사용해도 된다.
본 발명에 사용하는 실리카(SiO2)로서는, 콜로이달 실리카를 들 수 있고, 바람직하게는 수용액 중에서 균일하게 분산 가능하며, 입경이 10nm 내지 500nm인 콜로이달 실리카, 특히 바람직하게는 입경이 10 내지 50nm인 콜로이달 실리카가 사용된다.
본 발명의 무기 재료를 배합함으로써, 내수성이 향상되어 지지체에 대한 밀착성이 향상된다. 또한, 본 발명의 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체와 무기 재료는, 주로 이온 결합이나 수소 결합 등에 의해 상호 작용하여 결합되어 있다. 이 결합력은 강하여, 용이하게 중합체와 무기 재료를 분리할 수는 없다. 그 상호 작용 때문에, 멸균용 방사선(γ선, 전자선)에 노출되어도 중합체가 가교되기 어려운 점에서, 내방사선 멸균성을 갖는다.
[모노머 (a)의 중합체 (A)]
본 발명의 세포 배양 기재는, 추가로 상기 모노머 (a)의 중합체 (A)를 함유해도 된다. 중합체 (A)를 함유함으로써, 세포 배양 기재의 내수성이 향상된다.
[제조 방법]
이어서, 본 발명의 제조 방법에 대하여 설명한다.
물 매체 (W) 중에 있어서의 본 발명의 무기 재료 (C)의 농도가 하기 식 (4) 또는 식 (5)로 표시되는 범위가 되도록, 상기 모노머 (a)와 상기 무기 재료 (C)와 중합 개시제 (D)를 물 매체 (W)에 혼합한 후, 모노머 (a)를 중합시킴으로써, 중합체 (A)와 상기 무기 재료 (C)의 복합체 (XMC)의 분산액 (LMC)를 제조하는 제1 공정,
상기 분산액 (L)에 상기 중합체 (B)를 첨가하고, 균일하게 혼합하여 지지체에 도포한 후, 건조시키는 제2 공정을 순차로 행하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재의 제조 방법이다.
식 (4) Ra<0.19일 때
무기 재료 (C)의 농도(질량％)<12.4Ra+0.05
식 (5) Ra≥0.19일 때
무기 재료 (C)의 농도(질량％)<0.87Ra+2.17
(식 중, 무기 재료 (C)의 농도(질량％)는, 무기 재료 (C)의 질량을 물 매체 (W)와 무기 재료 (C)의 합계 질량으로 나누어 100을 곱한 수치, Ra는 무기 재료 (C)와 중합체 (A)의 질량비((C)/(A))이다.)
이 제조 방법에 사용되는 모노머 (a)와 무기 재료 (C) 및 중합체 (B)는, 상기 세포 배양 기재의 설명에서 설명한 것과 동일한 것을 사용할 수 있으므로, 생략한다.
본 발명의 제조 방법에 사용하는 물 매체 (W)는 모노머 (a)나 무기 재료 (C) 등을 포함할 수 있고, 중합에 의해, 물성이 양호한 유기 무기 복합체 분산액이 얻어지면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 물 또는 물과 혼화성을 갖는 용제 및/또는 기타 화합물을 포함하는 수용액이면 되고, 그 중에는 추가로, 방부제나 항균제, 착색료, 향료, 효소, 단백질, 콜라겐, 당류, 펩티드류, 아미노산류, 세포, DNA류, 염류, 수용성 유기 용제류, 계면 활성제, 고분자 화합물, 레벨링제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 중합 개시제 (D)로서는, 공지된 라디칼 중합 개시제를 적시에 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 수용성 또는 수분산성을 가지고, 계 전체에 균일하게 포함되는 것이 바람직하게 사용된다. 구체적으로는 중합 개시제로서, 수용성 과산화물, 예를 들어 퍼옥소이황산칼륨이나 퍼옥소이황산암모늄, 수용성 아조 화합물, 예를 들어 VA-044, V-50, V-501(모두 와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤제) 외에도, Fe2+와 과산화수소의 혼합물 등이 예시된다.
촉매로서는, 3급 아민 화합물인 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 등은 바람직하게 사용된다. 단, 촉매는 반드시 사용하지 않아도 된다. 중합 온도는, 중합 촉매나 개시제의 종류에 따라서 예를 들어 0℃ 내지 100℃가 사용된다. 중합 시간도 수십초 내지 수십시간 사이에 행할 수 있다.
한편, 광중합 개시제는 산소 저해의 영향을 받기 어렵고, 중합 속도가 빠르기 때문에, 중합 개시제 (D)로서 적합하게 사용된다. 구체적으로는 p-tert-부틸트리클로로아세토페논 등의 아세토페논류, 4,4'-비스디메틸아미노벤조페논 등의 벤조페논류, 2-메틸티오크산톤 등의 케톤류, 벤조인메틸에테르 등의 벤조인에테르류, 히드록시시클로헥실페닐케톤 등의 α-히드록시케톤류, 메틸벤조일포르메이트 등의 페닐글리옥실레이트류, 메탈로센류 등을 들 수 있다.
상기 광중합 개시제는 비수용성의 것이다. 여기에서 말하는 비수용성이란, 중합 개시제의 물에 대한 용해량이 0.5질량％ 이하인 것을 의미한다. 비수용성 중합 개시제를 사용함으로써, 개시제가 보다 점토 광물의 근방에 존재하기 쉬워, 점토 광물 근방에서의 개시 반응점이 많아지고, 얻어지는 중합체 (A)와 무기 재료 (C)의 복합체 (X)의 입경 분포가 좁고, 분산액 (L)의 안정성이 높아 바람직하다.
상기 광중합 개시제를, 물 매체 (W)와 상용하는 용매 (E)에 용해시킨 용액을 상기 물 매체 (W) 내에 첨가하는 것이 바람직하다. 이 방법에 의해 광중합 개시제가 보다 균일하게 분산될 수 있어, 보다 입경이 정렬된 복합체 (X)가 얻어진다.
광중합 개시제 (D)를 용매 (E)에 용해시킨 용액 중에 있어서의 광중합 개시제 (D)와 용매 (E)의 질량비 (D)/(E)는, 0.001 내지 0.1인 것이 바람직하고, 0.01 내지 0.05가 더욱 바람직하다. 0.001 이상이면, 자외선의 조사에 의한 라디칼의 발생량이 충분히 얻어지기 때문에 적합하게 중합 반응을 진행시킬 수 있고, 0.1 이하이면, 개시제에 의한 발색이나 악취를 실질적으로 발생하는 일이 없고, 또한 비용의 저감이 가능하다.
본 발명의 용매 (E)로서는, 광중합 개시제 (D)와 비수용성 중합 개시제 (D)를 용해시킬 수 있고, 또한 일정 이상의 수용성을 갖는 용제를 사용할 수 있다. 여기에서 말하는 수용성을 갖는 용제란, 물 100g에 대하여 50g 이상 용해할 수 있는 용제인 것이 바람직하다. 물에 대한 용해성이 50g 이상이면, 비수용성 중합 개시제 (D)의 물 매체 (W)에 대한 분산성이 양호하여, 얻어지는 복합체 (X)의 입경이 정렬되기 쉬워지고, 분산액 (L)의 안정성이 높아 바람직하다.
예를 들어 수용성 용제로서는, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드 등의 아미드류, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 등의 알코올류, 디메틸술폭시드, 테트라히드로푸란 등을 들 수 있다. 이들 용제를 혼합하여 사용해도 된다
광중합 개시제 (D)를 용매 (E)에 용해시킨 용액의 첨가량이, 모노머 (a), 무기 재료 (C), 물 매체 (W), 중합 개시제 (D) 및 용매 (E)의 총 질량에 대하여, 0.1질량％ 내지 5질량％인 것이 바람직하고, 0.2질량％ 내지 2질량％인 것이 더욱 바람직하다. 해당 분산량이 0.1질량％ 이상이면, 중합이 충분히 개시되고, 5질량％ 이하이면, 복합체 (X) 중의 중합 개시제의 증가에 의한 악취의 발생, 또한 일단 분산된 광중합 개시제가 다시 응집되거나 하는 문제를 저감시킬 수 있어, 균일한 복합체 (X)의 분산액 (L)을 얻을 수 있기 때문에 바람직하다.
무기 재료 (C)의 물 매체에 대한 농도(질량％)는 식 (4) 또는 식 (5)로 표시되는 범위인 것이 본 발명의 세포 배양 기재 제조법의 특징이다. 무기 재료 (C)의 물 매체에 대한 농도(질량％)가 상기 범위 내이면, 양호한 복합체 (X)의 분산액 (L)이 얻어지고, 지지체에 대한 도포가 용이하여, 평활하고 균일한 얇은 도막이 얻어져 바람직하다.
본 발명의 제조 방법으로 제조되는 분산액 (L)은 그대로 사용해도 되고, 수세 등에 의한 정제 공정을 거치고 나서 사용해도 된다. 또한 해당 분산액 (L)에 추가로 레벨링제나 계면 활성제, 펩티드, 단백질, 콜라겐, 아미노산류, 펩티드류, 다당류, 고분자 화합물 등을 첨가하여 사용해도 된다.
본 제조 방법의 제1 공정에 사용되는 중합용 광으로서는, 전자선, γ선, X선, 자외선, 가시광 등을 사용할 수 있지만, 그 중에서도 장치나 취급의 간편함으로부터 자외선을 사용하는 것이 바람직하다. 조사하는 자외선의 강도는 10 내지 500mW/cm2가 바람직하고, 조사 시간은 일반적으로 0.1초 내지 200초 정도이다. 통상의 가열에 의한 라디칼 중합에 있어서는, 산소가 중합의 저해 인자로서 작용하지만, 본 발명에서는, 반드시 산소를 차단한 분위기에서 용액의 조제 및 자외선 조사에 의한 중합을 행할 필요가 없고, 공기 분위기에서 이들을 행하는 것이 가능하다. 단, 자외선 조사를 불활성 가스 분위기 하에서 행함으로써, 더욱 중합 속도를 빠르게 하는 것이 가능하여, 바람직한 경우가 있다.
본 제조 방법의 제2 공정에 사용되는 도포 방법은, 공지 관용의 방법이면 되고, 예를 들어 분산액을 지지체에 유연시키는 방법이나 바 코터나 스핀 코터에 의한 도포법, 또는 분무 등의 스프레이법을 들 수 있고, 또한 패턴 형상으로 도포하는 경우에는, 모양이 있는 고무판에 분산액을 침지시키고 나서 지지체에 전사하는 방법, 또한 지지체에 도포하지 않는 부분을 미리 차폐하여 도포 후 차폐 부분을 제거하는 방법, 잉크젯 프린터 방식에 의한 도포 방법을 들 수 있다.
건조 방법도, 분산액 (L) 중의 휘발 성분이 휘발되고, 복합체 (X)의 박층이 생긴다면, 임의의 방법이면 된다. 예를 들어, 실온 자연 건조, 실온의 바람이나 가열 또는 열풍에 의한 건조, 원적외선 건조 등을 들 수 있다. 또는 분산액을 스핀 코터로 회전하면서 열풍을 접촉시키거나 가열하거나 하는 방법도 들 수 있다.
본 제조 방법에 있어서의 중합체 (B)는, 그의 중량 평균 분자량 Mw가 1×104 내지 2×107인 것이 바람직하고, 1×105 내지 5×106인 것이 더욱 바람직하다. 1×104 이상이면, 충분한 세포 박리성을 유지할 수 있고, 또한 2×107 이하이면, 충분한 세포 증식성을 유지할 수 있어, 성능이 양호한 세포 배양 기재를 제조할 수 있다.
본 제조 방법은, 모노머 (a)와 무기 재료 (C)의 비율을 조정함으로써, 세포의 증식 속도를 폭넓게 조정할 수 있고, 또한 중합체 (B)의 종류나 하한 임계 용해 온도 및 함유량을 조정함으로써, 온도 변화에 의한 세포의 박리 속도를 제어할 수 있다는 특징을 갖는다.
본 제조 방법으로 얻은 세포 배양 기재의 표면은, 중합체 (B)가 한층 덮여 있는 것이 아니라, 복합체 (X)의 박층 내로부터 중합체 (B)가 신장하여, 해당 박층의 표면도 적절하게 노출되어 있는 구조로 되어 있다. 중합체 (B)는, 복합체 (X)의 박층 내로부터 표면까지 이온 결합이나 수소 결합 등에 의해 점토 광물 또는 실리카에 결합되어 있어, 물리적인 힘이나 물 중에서도 그 결합이 끊어지지 않아, 안정된 구조로 되어 있다.
또한, 본 발명의 제2 제조 방법으로서, 하기 방법을 들 수 있다. 즉, 물 매체 (W) 중의 상기 무기 재료 (C)의 농도가 상기 식 (4) 또는 식 (5)로 표시되는 범위가 되도록, 중합하여 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체가 되는 모노머{예를 들어 (a)와 (b)의 조합, (a)와 (c)의 조합, (a)와 (d)의 조합, 또는 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머 (e)}와, 상기 무기 재료 (C)와 중합 개시제 (D)를 물 매체 (W)에 혼합한 후, 모노머를 중합시킴으로써, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 (B)와 상기 무기 재료 (C)의 복합체 (XNC)의 분산액 (LNC)를 제조하는 제1 공정, 상기 분산액 (LNC)를 지지체에 도포한 후, 건조시키는 제2 공정을 순차로 행하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재의 제조 방법이다.
이 제2 제조 방법에 사용되는 모노머 (a), (b), (c), (d), (e)와 무기 재료 (C) 및 중합체 (B)는, 상기 세포 배양 기재의 설명에서 설명한 것과 동일한 것을 사용할 수 있으므로 생략한다. 또한, 분산액의 중합 방법이나 기재의 제조 방법은, 제1 제조 방법과 동일하므로 생략한다.
본 제2 제조 방법으로 얻은 세포 배양 기재는, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 (B)와 무기 재료가 층상으로 겹쳐지고, 중합체 (B)와 무기 재료 사이에 이온 결합이나 수소 결합 등에 의해 결합되어 있어, 물리적인 힘이나 물 중에서도 그 결합이 끊어지지 않아, 안정한 구조로 되어 있다. 또한 표면에는, 중합체 (B)가 두껍게 덮고 있고, 수용액 중에서 하한 임계 용해 온도보다 높은 온도로부터, 하한 임계 용해 온도보다 낮은 온도까지 온도 변화를 행한 경우, 중합체 (B)의 분자가 크게 신장되는 운동이 일어나서, 높은 세포 박리성이 얻어진다고 생각된다.
[접착 기질]
본 발명의 세포 배양 기재는, 접착 기질을 기재 중에 가짐으로써, 인간 다능성 줄기 세포의 배양성이 향상되는 접착 기질로서는, 세포외 매트릭스와 접착성 합성 기질을 들 수 있다.
세포외 매트릭스로서는, 구체적으로는 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트를 들 수 있다. 바람직하게는 라미닌 및 비트로넥틴 및 그들의 프래그먼트를 들 수 있다. 세포외 매트릭스로서는 동물 유래라면 이용할 수 있지만, 바람직하게는 인간 및 마우스 유래의 세포외 매트릭스이다. 더욱 바람직하게는 재조합 단백질로서 제조된 것이다. 시판품으로서, 마트리겔(코닝사제), 겔트렉스(서모 피셔 사이언티픽사제), iMatrix-511(닛삐사제), Laminin521(BioLamina사) 등이 이용 가능하다.
세포외 매트릭스와 동시에, ROCK(Rho-associated coiled-coil kinase) 저해제를 사용해도 된다. ROCK 저해제를 사용함으로써, 단일 세포에 분산된 인간 다능성 줄기 세포의 배양이 더욱 용이해진다. ROCK 저해제로서는, Y-27632(와코 쥰야꾸 고교)나 파수딜 히드로클로라이드(Fasudil hydrochloride)(도꾜 가세이 고교 가부시키가이샤제)를 들 수 있다.
접착성 합성 기질로서는, 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드](이후 PMEDSAH라 약칭) 또는 올리고펩티드 담지 중합체를 들 수 있다. 올리고펩티드 담지 중합체는, 세포 접착 활성을 갖는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 서열을 갖는 올리고펩티드를 중합체에 공유 결합시킨 기질이다. 시판품으로서 Synthemax(코닝사제)을 들 수 있다.
접착 기질은, 기재에 대하여 어떤 방법으로 제공해도 상관없다. 예를 들어 접착 기질을 기재 중에 혼합해도 되고, 도포해도 상관없다. 또한, 세포 배양용 배지에 접착제 기질을 함유시켜, 배지와 동시에 기재와 접촉시키는 형태로 제공해도 된다.
당해 접착 기질은, 기재 중에 균일하게 존재하고 있어도, 불균일하게 존재하고 있어도 상관없다. 바람직하게는 기재 표면에 존재하는 경우이다. 도포에 의한 접착제 기질의 공급을 행하는 경우, 도포 방법으로서는 접착 기질의 용액을 공지 관용의 방법을 사용하여 도포하면 되고, 스프레이 코팅, 스핀 코팅, 잉크젯 등으로 도포해도 되고, 판을 사용하여 스탬프해도 상관없다. 용액을 기재 상에 주입하여, 일정 기간 정치한 뒤에 용액을 제거하는 방법이어도 되고, 사용 방법에 따라서 적절하게 선택하면 된다.
접착 기질을 세포 배양 기재 표면에 도포하는 경우, 도포량으로서는, 세포 배양 기재의 면적당 0.01 내지 5μg/cm2가 바람직하고, 0.2 내지 2μg/cm2가 더욱 바람직하고, 0.5 내지 1μg/cm2가 특히 바람직하다.
[기타 배합물]
본 발명의 세포 배양 기재는 세포외 매트릭스, 젤라틴 또는 콜라겐 외에도, 배합물을 갖고 있어도 된다. 예를 들어 방부제나 항균제, 착색료, 향료, 효소, 당류, 단백질, 펩티드류, 아미노산류, 세포, DNA류, 염류, 수용성 유기 용제류, 계면 활성제, 고분자 화합물, 레벨링제 등을 포함해도 상관없다.
[젤라틴, 콜라겐 또는 알부민]
더욱 접착 기질의 활성 유지나 세포 배양 효율을 높이기 위해서, 세포 배양 기재 상에 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민을 존재시켜도 상관없다. 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민은, 상기 접착 기질과 동일하게, 세포 배양 기재 중에 혼합해도 되고, 도포해도 상관없다. 도포하는 경우에는, 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민을 먼저 도포한 후에 접착 기질을 도포하는 쪽이, 접착 기질의 활성 유지나 세포 배양 효율에 있어서는 바람직하다. 또한, 젤라틴, 콜라겐 또는 알부민은 1종이어도 되고 복수종을 동시에 사용해도 상관없다.
젤라틴, 콜라겐 또는 알부민의 도포량으로서는, 0.5 내지 500μg/cm2가 바람직하고, 5 내지 200μg/cm2가 더욱 바람직하고, 20 내지 100μg/cm2가 특히 바람직하다.
[세포 배양 기재]
본 발명의 세포 배양 기재의 형상은 세포 배양할 수 있고, 저온 처리에 의해 배양 세포를 용이하게 박리할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 필름 형상의 것, 접시 형상의 것, 보틀(병) 형상의 것, 튜브 형상의 것, 굵기 5nm 내지 5mm의 실 형상 또는 막대 형상의 것, 가방(주머니) 형상의 것, 멀티웰 플레이트 형상의 것, 마이크로유로 형상의 것, 다공질막 형상 또는 망 형상의 것(예를 들어 트랜스 웰, 셀 스트레이너), 입경이 바람직하게는 10 내지 2000㎛, 보다 바람직하게는 100 내지 500㎛인 구 형상의 것 등을 들 수 있다.
본 발명의 세포 배양 기재는 단체로 사용해도 되지만, 지지체 상에 기재를 형성한 세포 배양 기재(器材)로서 사용하는 것이 바람직하다. 세포 배양 기재(器材)로 한 경우, 수송이나 보관 등의 편리성이 우수한 것 이외에도, 그대로 배양 용기나 배양용 담체로서 사용할 수도 있기 때문이다.
본 발명에서 사용되는 지지체의 재질은, 배양 기재가 충분히 접착될 수 있고, 또한 접착된 배양 기재 상에서 세포 배양을 할 수 있으며, 저온 처리에 의해 배양 세포를 용이하게 박리할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 폴리스티렌과 같은 스티렌계 수지, 폴리프로필렌과 같은 폴리올레핀계 수지, 폴리우레탄계 수지, 폴리카르보네이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리술폰계 수지, 불소계 수지, 셀룰로오스와 같은 다당류 천연 고분자, 유리나 세라믹스와 같은 무기 재료, 스테인리스, 티타늄과 같은 금속류 재료가 적합하게 사용된다.
지지체의 형상에는 특별히 한정은 없고, 본 발명의 세포 배양 기재의 지지체가 될 수 있는 형상이면 된다. 예를 들어 필름 형상의 것, 막 형상의 것, 판 형상의 것, 구 형상의 것, 다각 형상의 것, 막대 형상의 것, 접시 형상의 것, 보틀(병) 형상의 것, 튜브 형상의 것, 바늘·실 형상의 것, 섬유 형상의 것, 가방(주머니) 형상의 것, 멀티웰 플레이트 형상의 것, 마이크로유로 형상의 것, 다공질막 형상 또는 망 형상의 것(예를 들어 트랜스 웰, 셀 스트레이너) 등을 들 수 있다. 이들을 조합한 형상이어도 되고, 특정한 형상을 갖지 않는 부정 형상의 지지체여도 된다.
또한, 본 발명의 세포 배양 기재가, 지지체와 일체화되어 세포 배양 기재로서 사용되는 것은 물론, 지지체로부터 박리하여 단독으로 사용해도 된다.
[건조 세포 배양 기재]
본 발명의 세포 배양 기재는, 건조 상태를 거쳐도 인간 다능성 줄기 세포의 배양이 가능하다. 따라서, 장기간 보존이나 수송에 견딜 수 있는 점에서, 산업상 이용 가능성이 매우 높다.
건조 방법으로서는 특별히 한정은 없고, 후술하는 지지체 상에 세포 배양 기재를 적층한 후, 건조시키면 된다. 예를 들어 실온 건조(18 내지 30℃, 습도 20％ 내지 60％RH), 가열 건조(30 내지 37℃), 항온 건조기나 데시케이터에 의한 건조 등을 들 수 있다. 단백의 변성을 방지하는 관점에서, 실온 건조가 바람직하다.
건조 시의 세포 배양 기재의 막 두께는, 1000nm 이하인 것이 바람직하고, 500nm 이하이면 더욱 바람직하다. 1000nm 이하이면, 세포 배양성이 양호하기 때문이다.
[배양 세포]
본 발명의 세포 배양 기재는, 각종 세포, 특히 동물 세포를 적합하게 배양하는 것이 가능하다. 동물 세포로서는, 유래는 동물이면 되고, 인간, 마우스, 원숭이 등을 들 수 있고, 인공 세포여도 상관없다. 세포종으로서는 특별히 한정은 없지만, 상피 세포(각막 상피 세포 등), 내피 세포(인간 탯줄 정맥 내피 세포 등), 섬유아세포(인간 피부 섬유아세포, 마우스 섬유아세포 등), 혈구 세포, 수축성 세포(골격근 세포, 심근 세포 등), 혈액과 면역 세포(적혈구, 마크로파지 등), 신경 세포(뉴런, 신경교세포 등), 색소 세포(망막 색소 세포 등), 간세포, 연골 세포, 골아세포, 줄기 세포(ES 세포, iPS 세포, 조혈 간세포, 피부 줄기 세포, 생식 줄기 세포, EC 세포, EG 세포, 신경 줄기 세포) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 본 발명의 세포 배양 기재는, 배양이 어려운 줄기 세포, 특히 ES 세포나 iPS 세포에 대하여 적합하게 이용 가능하다.
[세포의 배양 방법]
배양 방법으로서는, 공지 관용의 방법을 사용하면 되고, 예를 들어 접시 형상 용기의 저면에 형성시킨 배양 기재에, 소정량의 배지나 배양 시약을 넣고, 세포를 파종하여, 소정 온도, CO2 농도 조건에서 배양해도 되고, 실 형상이나 구 형상으로 형성시킨 배양 기재를, 배지가 들어간 시판 폴리스티렌 용기에 넣고, 세포를 파종하여 배양해도 상관없다. 후자의 경우, 세포는 폴리스티렌 용기에 접착되지 않고, 실 형상이나 구 형상 배양 기재의 표면에 접착되어 증식한다. 예를 들어 굵기 50㎛의 실 형상 배양 기재를 사용한 경우, 세포는 실의 길이 방향으로 증식되기 때문에, 세포 형상을 제어한 형태로 배양할 수도 있다. 또한, 구 형상 배양 기재를 사용한 경우, 통상적인 접시 형상 용기에 비해, 표면적이 크고, 보다 많은 세포를 배양할 수 있는 이점이 있다.
[세포의 박리 방법(온도 조절법)]
배양된 세포를 기재로부터 박리하는 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 배양 종료 후, 소정 온도(6℃ 내지 30℃)의 배지로 37℃의 배지를 치환하고, 소정 온도(6℃ 내지 30℃)에서 정치하여, 세포의 자연 박리를 기다려도 되고, 배양 용기를 가볍게 흔들거나, 피펫으로 배지를 빨아들이거나 내거나 하는 「피펫팅」 조작으로, 온화한 수류로 세포에 물리적 자극을 주어, 세포를 박리해도 된다.
[세포의 박리 방법(효소법)]
세포끼리의 결합을 잘라내어, 단일 세포로 하고자 하는 경우에는, 효소 처리에 의한 박리법을 사용해도 된다. 사용하는 단백 분해 효소의 종류는, 세포의 종류에 의해 적절하게 선택하면 된다. 예를 들어, 트립신, 트립신/EDTA, TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific사)를 들 수 있다. 처리 온도나 시간은 세포의 종류나 기재와의 접착 강도에 의해 적절하게 조정하면 된다. 예를 들어, 배양 종료 후, 배지를 제거하고, 완충액 등으로 세포를 세정하여, 효소 용액을 첨가하고, 37℃ 일정 시간 정치한 후, 효소 용액을 제거하여, 소정 온도(6℃ 내지 37℃)의 완충액 또는 배지를 첨가하고, 정치 또는 「피펫팅」 조작에 의해 세포를 박리하는 방법을 들 수 있다. 물론, 저온 처리와 효소 사용을 합쳐서 세포를 박리해도 된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
<GPC>
GPC의 측정 방법은 이하와 같음.
장치: Shodex GPC System-21(쇼와 덴코 가부시키가이샤제)
용매: N,N-디메틸포름아미드(DMF) 용액 (10mmol/L LiBr 함유)
칼럼: KF-705L 2개 연결
표준 물질: 폴리스티렌 STANDARD SH-75, SM-105 키트(쇼와 덴코 가부시키가이샤제)
<점도>
수지 용액의 점도는 이하의 장치로 측정하였다.
DIGITAL VISCOMATE 점도계(MODEL VM-100A, 야마이치 덴키 가부시키가이샤제)
<하한 임계 용해 온도(LCST)의 측정 방법>
이하 조건에서 수지 용액의 투과도를 측정하고, 변곡점의 온도를 하한 임계 용해 온도(LCST)로 하였다.
장치: 자외 가시 분광 광도계(V-530, 니혼 분코 가부시키가이샤제)
파장: 600nm(투과율)
온도 범위: 25℃ 내지 40℃
승온 속도: 10℃/60min
(합성예 1) (MC114)
[중합 개시제 (D)를 용매 (E)에 용해시킨 용액의 조정]
용매 (E)로서, 메탄올 9.8g, 중합 개시제 (D)로서 1-히드록시시클로헥실페닐케톤 「이르가큐어 184」(시바 가이기사제) 0.2g을, 균일하게 혼합하여 용액 (DE)를 조제하였다.
[중합체 (B) 수용액의 조제]
모노머로서 N-이소프로필아크릴아미드(가부시키가이샤 고진사제) 2.3g, 물 100g, 중합 개시제로서 2질량％의 과황산칼륨 수용액 2mL, 촉매로서 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 80μL를 혼합한 후, 실온(20 내지 28℃)에서 15시간 정치하여, 폴리N-이소프로필아크릴아미드(PNIPA) 수용액 (AqB)를 조제하였다. 이 용액의 점도는 19.6mPa·s, 측정 시의 용액 온도는 25.7℃였다.
또한, 이 PNIPA의 중량 평균 분자량 Mw는 3.40×106이었다.
[모노머 (a), 무기 재료 (C), 물 매체 (W)를 포함하는 반응 용액의 조제]
모노머 (a)로서 아크릴산2메톡시에틸(도아 고세 가부시키가이샤제) 0.32g, 무기 재료 (C)로서 수팽윤성 점토 광물 Laponite XLG(Rockwood Additives Ltd.사제) 0.02g, 물 매체 (W)로서 물 10g, 개시제로서 용액 (DE) 50μL를 균일하게 혼합하여 반응 용액 (1)을 조제하였다.
[복합체 (X)의 분산액 (L)의 조제]
상기 반응 용액 (1)을 365nm에 있어서의 자외선 강도가 40mW/cm2인 자외선을 180초 조사하여 유백색의 복합체 (X)의 분산액 (L1)을 제작하였다.
이 반응계의 Ra=0.06, 무기 재료 (C)의 농도(질량％)=0.20(％)<12.4Ra+0.05=0.79
[코팅액의 조제]
상기 분산액 (L1) 전체량에, 상기 PNIPA 수용액 (AqB)를 3.12g(고형분 0.07g) 넣고, 균일하게 혼합하여 코팅액 1(MC114)을 얻었다.
세포 배양 기재 전체에 대한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 PNIPA의 함유율은 17질량％이다.
(합성예 2) (MC414)
합성예 1의 무기 재료 (C)로서의 수팽윤성 점토 광물 Laponite XLG 0.02g을 0.08g으로 변경한 것 이외에는, 합성예 1과 동일하게 하여 코팅액 2(MC414)를 조제하였다.
이 반응계의 Ra=0.25, 무기 재료 (C)의 농도(질량％)=0.79(％)<0.87Ra+2.17=2.39
세포 배양 기재 전체에 대한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 PNIPA의 함유율은 15질량％이다.
(합성예 3) (MC814)
합성예 1의 무기 재료 (C)로서의 수팽윤성 점토 광물 Laponite XLG 0.02g을 0.16g으로 변경한 것 이외에는, 합성예 1과 동일하게 하여 코팅액 3(MC814)을 조제하였다.
이 반응계의 Ra=0.5, 무기 재료 (C)의 농도(질량％)=1.57(％)<0.87Ra+2.17=2.61
세포 배양 기재 전체에 대한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 PNIPA의 함유율은 13질량％이다.
(합성예 4) (NC214)
[모노머 (a), 무기 재료 (C), 물 매체 (W)를 포함하는 반응 용액의 조제]
모노머로서 N-이소프로필아크릴아미드 0.28g, 무기 재료 (C)로서 수팽윤성 점토 광물 Laponite XLG 0.04g, 물 매체 (W)로서 물 10g, 개시제로서 용액 (DE) 50μL를 균일하게 혼합하여 반응 용액 (4)를 조제하였다.
[코팅액의 조제]
상기 반응 용액 (4)를 넣은 유리 용기의 둘레를 냉각시키면서(약 10℃), 365nm에 있어서의 자외선 강도가 40mW/cm2인 자외선을 180초 조사하여 유백색의 복합체 (X)의 분산액 (L4)인 코팅액 4(NC214)를 제작하였다.
이 반응계의 Ra=0.14, 무기 재료 (C)의 농도(질량％)=0.40(％)<12.4Ra+0.05=1.79
세포 배양 기재 전체에 대한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 PNIPA의 함유율은 88질량％이다.
Figure pct00007
MEA: 아크릴산2메톡시에틸
NIPA: N-이소프로필아크릴아미드
Irg184: 이르가큐어 184
(알칼리 포스파타아제 염색(AP 염색)예)
미분화 iPS 세포는 높은 알칼리 포스파타아제 활성을 나타내기 때문에, 짙게 염색된다. 반대로, 분화 세포는 알칼리 포스파타아제 활성을 나타내지 않아 염색되지 않는다.
시약으로서 Sigma-Aldrich제의 「백혈구 알칼리 포스파타아제 키트(Leukocyte Alkaline Phosphatase Kit)」를 사용하였다. 조작 수순으로서는, 배양 종료 후, 샤알레 중의 배지를 제거하고 PBS(완충액)을 첨가하여 세포를 세정한 후 PBS를 제거한다. 이어서, 고정액을 첨가하여 약 1분간 정치하고 나서 고정액을 제거하여 물로 세정한 후, 염색액을 첨가하여 실온(25℃)에서 1시간 정치한다. 염색액을 제거하고, 물로 세정하여, 봉입제를 넣고 커버 유리로 덮어 현미경으로 관찰한다. 알칼리 포스파타아제 활성을 나타내는 경우(양성), 붉게 염색된다.
(세포의 박리율과 생존율 및 배양성의 측정)
배양 종료 후, 온도 조절법 또는 효소법으로 세포 박리 조작을 행하여, 박리된 세포 현탁액을 세포 계측 전용 카세트에 흡입하고, 세포 계수 장치 NC-100(가부시키가이샤 엠에스 테크노시스템즈사제)을 사용하여 세포 현탁액 중의 사세포수를 계측한다. 또한, 박리된 세포 100μL를 1.5ml의 튜브에 옮기고, 시약(Reagent) A와 시약 B(가부시키가이샤 엠에스 테크노시스템즈사제)를 100μl씩 첨가하고, 수회 피펫팅하여 균일하게 혼동(混同)한 후, 동일하게 새로운 카세트로 액을 흡입하고, 세포 계수 장치 NC-100에 세팅하여 박리된 세포수를 계측한다. 또한, 박리 조작 후의 박리 세포를 모두 제거한 샤알레에 시약 A를 적량 첨가하고, 실온(25℃)에서 10분간 정치하여 스크레이퍼(고무 주걱)를 사용하여 샤알레에 잔존한 세포를 완전히 박리·용해시킨 후, 시약 B를 적량 첨가하고, 수회 피펫팅하여 균일하게 혼동하여 세포 계수 장치 NC-100에 세팅하고 샤알레에 남은 미박리된 세포수를 계측한다. 세포 박리율과 생존율 및 배양성은 각각 하기 식 (6), (7), (8)로부터 산출한다.
박리율=[박리된 세포수/(박리된 세포수+미박리된 세포수)]×100···(6)
생존율=(1-박리 세포 중의 사세포수/박리된 세포수)×100···(7)
배양성=배양 기재에서 얻은 세포 총 수/TCPS(시판되는 조직 배양용 샤알레)에서 얻은 세포 총 수*···(8)
* 세포 총 수=박리된 세포수+미박리된 세포수
(실시예 1)
배양 기재 표면에 콜라겐, 라미닌, ROCK 저해제를 순차로 코팅하여 건조시킨 후 ReproFF2 배지에서 평가한 예이다.
[배양 기재의 제작]
합성예 1에서 조제한 코팅액 1(MC114)을 35mm 폴리스티렌제 샤알레(TCPS, 35mm/조직 배양 접시(Tissue Culture Dish), AGC 테크노글라스 가부시키가이샤제)에 적량을 넣고, 스핀 코터를 사용하여 샤알레의 표면에 얇게 도포하고, 80℃의 항온기 중에서 20분간 건조시켰다. 이어서, 멸균수에 의해 샤알레를 세정한 후, 멸균 주머니 중에서 샤알레를 40℃, 5시간 건조시켜, 세포 배양 기재 1(MC114)을 얻었다. AFM(원자간력 현미경, Bruker AXS제, NanoScope(R) IIIa, 측정 모드: DFM, 샘플 측정 2군데의 평균)을 사용하여 도막의 두께를 측정한 결과, 막 두께는 약 20nm였다.
[접착 기질의 코팅]
세포 배양 기재 1(MC114)에, 농도 1mg/ml의 콜라겐(상품명: Cellmatrix Type I-C, 니쓰타 젤라틴 가부시키가이샤제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 50μg/cm2 상당), 37℃에서 1시간 정치한 후, 해당 수용액을 버리고, 이어서 농도 1μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.05μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 또한 농도 100㎛ol/L의 ROCK 저해제 Y-27632(와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.005㎛ol/cm2 상당), 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 건조시켜, 배양 용기 1을 얻었다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
배양 용기 1에 ReproFF2 배지(가부시키가이샤 리프로셀제)를 2ml 첨가하고, 추가로 인간 iPS 세포(201B7주, iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤제)를 일정량(약 1×104개/cm2) 넣어, 5％ CO2 분위기의 37℃ 항온기 내에 정치하고, 5일간 배양을 행하였다. 배지는 2일에 1회의 빈도로 교환을 행하였다. 이어서, 온도 조절 박리법으로 세포를 박리하였다. 즉, 4℃의 냉매지로 배지 교환을 하고, 실온에서 10분간 정치한 후, 피펫으로 배지를 빨아들이거나 내거나 하는 「피펫팅 조작」을 약 10회 행하여, 세포 박리를 행하였다. 이어서, 상기 「세포의 박리율과 생존율 및 배양성의 측정」 방법에 따라서, 박리된 세포수와 박리 세포 중의 사세포수, 및 전체 배양 세포수를 계측하고, 식 (6), (7), (8)로부터 박리율, 생존율 및 배양성을 산출하였다.
(실시예 2)
실시예 1에 비해, 무기 재료량을 증가시킨 예이다.
[배양 기재의 제작]
합성예 1의 코팅액 1(MC114) 대신에 합성예 2의 코팅액 2(MC414)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 한 세포 배양 기재 2(MC414)를 샤알레 상에 형성하여, 배양 용기 2를 제작하였다. AFM을 사용하여 도막의 두께를 측정한 결과, 막 두께는 약 20nm였다.
또한, 실시예 1과 동일하게 접착 기질의 코팅 및 iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다.
(실시예 3)
실시예 1에 비해, 무기 재료량을 증가시킨 예이다.
[배양 기재의 제작]
합성예 1의 코팅액 1(MC114) 대신에 합성예 3의 코팅액 3(MC814)을 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 한 세포 배양 기재 3(MC814)을 제작하였다. AFM을 사용하여 도막의 두께를 측정한 결과, 막 두께는 약 20nm였다.
또한, 실시예 1과 동일하게 접착 기질의 코팅 및 iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다.
(실시예 4)
배양 기재 3의 표면에 콜라겐, 라미닌을 순차로 코팅하여 건조시킨 후 ReproFF2 배지에서 평가한 예이다.
[배양 기재의 제작]
실시예 3과 동일한 세포 배양 기재 3(MC814)을 사용하였다.
[접착 기질의 코팅]
실시예 1과 동일하게 하여, 배양 기재 3의 표면에 콜라겐, 라미닌을 순차로 코팅하고, ROCK 저해제는 코팅하지 않고 건조를 행하였다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
최초에 사용되는 ReproFF2 배지 대신에 ROCK 저해제 Y27632(첨가량: 0.5μg/mL 배지)를 첨가한 배지를 사용하는 것과, 1회째의 배지 교환 시에, 배지 대신에 ROCK 저해제 Y27632(첨가량: 0.5μg/mL 배지)를 첨가한 ReproFF2 배지를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 iPS 세포의 박리율, 생존율 및 배양성을 평가하였다.
(실시예 5)
배양 기재 3의 표면에 라미닌만을 코팅하여 건조시킨 후, StemFit Ak02N 배지에서 평가한 예이다.
[배양 기재의 제작]
실시예 3과 동일한 세포 배양 기재 3(MC814)을 사용하였다.
[접착 기질의 코팅]
실시예 1에 있어서, 콜라겐과 ROCK 저해제를 사용하지 않는 것, 및 농도 1μg/mL의 라미닌 수용액 대신에 농도 10μg/mL의 라미닌 수용액을 사용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 배양 기재 3의 표면에 라미닌을 코팅하고, 건조를 행하였다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
실시예 1의 ReproFF2 배지 대신에 StemFit Ak02N 배지를 사용하는 것과, 세포 파종 시에는 배지 대신에 ROCK 저해제 Y27632(첨가량: 0.5μg/mL 배지)를 첨가한 StemFit Ak02N 배지를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 iPS 세포의 박리율, 생존율 및 배양성을 평가하였다.
(실시예 6)
배양 기재 4의 표면에 라미닌만을 코팅하여 건조시킨 후, StemFit Ak02N 배지에서 평가한 예이다.
[배양 기재의 제작]
합성예 1의 코팅액 1(MC114) 대신에 합성예 4의 코팅액 4(NC214)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 한 세포 배양 기재 4(NC214)를 제작하였다. AFM을 사용하여 도막의 두께를 측정한 결과, 막 두께는 약 30nm였다.
또한, 실시예 5와 동일하게 접착 기질의 코팅 및 iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다.
(실시예 7)
배양 기재 4의 표면에 라미닌과 젤라틴 혼합액을 코팅하여 건조시킨 후, StemFit Ak02N 배지에서 평가한 예이다.
[접착 기질의 코팅]
세포 배양 기재 4(NC214)에, 농도 0.2mg/ml의 젤라틴(니쓰타 젤라틴 가부시키가이샤제)과 농도 10μg/mL의 라미닌을 포함한 수용액을 500μL 넣고(젤라틴 코팅량 10μg/cm2 상당, 라미닌 코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃에서 1시간 정치한 후, 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 건조시켰다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
실시예 5와 동일하게 iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다.
결과를 표 3에 나타냈다.
또한, 라미닌을 코팅하고, 실온 25℃에서 건조시킨 배양 기재 4를, 추가로 실온(25℃, 40％RH)에서 1일, 30일간 정치하여, 동일한 배양 평가 시험을 행하였다.
(실시예 8)
배양 기재 4의 표면에 라미닌을 코팅하고, 건조시키지 않고 배양에 제공한 예이다.
[배양 기재의 제작]
실시예 6과 동일한 세포 배양 기재 4(NC214)를 사용하였다.
[접착 기질의 코팅]
세포 배양 기재 4(NC214)에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 건조시키지 않고 즉시 세포 배양에 제공하였다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
실시예 5와 동일하게 iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다.
(비교예 1)
시판되고 있는 조직 배양용 샤알레(TCPS)의 표면에 라미닌을 코팅하고, 건조시키지 않고 배양에 제공한 것, 및 배지에 ROCK 저해제를 첨가한 예이다.
[접착 기질의 코팅]
35mm 폴리스티렌제 샤알레(AGC 테크노글라스(주)제)에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 즉시 세포 배양에 제공하였다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
세포 파종 시, 실시예 1의 ReproFF2 배지 대신에 ROCK 저해제 Y27632(첨가량: 0.5μg/mL 배지)를 첨가한 배지를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 iPS 세포의 박리율, 생존율 및 배양성을 평가하였다.
(비교예 2)
시판되고 있는 조직 배양용 샤알레(TCPS)의 표면에 라미닌을 코팅하고, 건조시키지 않고 배양에 제공한 것, 및 배지에 ROCK 저해제를 첨가하지 않은 예이다.
[접착 기질의 코팅]
35mm 폴리스티렌제 샤알레(AGC 테크노글라스(주)제)에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여, 해당 수용액을 버리고, 즉시 세포 배양에 제공하였다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
실시예 1과 동일하게 하여 iPS 세포의 박리율, 생존율 및 배양성을 평가하였다.
(비교예 3)
시판되고 있는 조직 배양용 샤알레(TCPS)의 표면에 라미닌만을 코팅하여 건조시킨 후 StemFit Ak02N 배지에서 평가한 예이다.
[접착 기질의 코팅]
35mm 폴리스티렌제 샤알레(AGC 테크노글라스(주)제)에, 농도 10μg/mL의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 500μL 넣고(코팅량 0.5μg/cm2 상당), 37℃, 1시간 정치하여 해당 수용액을 버리고, 실온 25℃(상대 습도 35 내지 55％RH)에서 건조시켰다.
[iPS 세포의 배양, 박리율의 평가]
실시예 1의 ReproFF2 배지 대신에 StemFit Ak02N 배지를 사용하는 것과, 세포 파종 시에는 배지 대신에 ROCK 저해제 Y27632(첨가량: 0.5μg/mL 배지)를 첨가한 StemFit Ak02N 배지를 사용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 iPS 세포의 박리율, 생존율 및 배양성을 평가하였다.
실시예 및 비교예에 대하여, 결과를 표 2 내지 4에 나타냈다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
wet: 라미닌을 코팅하여 건조시키지 않고 즉시 세포 배양에 제공하였다.
dry: 라미닌을 코팅하여 실온(25℃, 40％RH)에서 건조시킨 후, 세포 배양에 제공하였다.
(실시예 9 내지 12, 비교예 4)
<보존 안정성 시험>
상기에서 제작한 배양 용기 3, 5 내지 7, 비교 배양 용기 3에 대하여, 25℃ 40％RH에서 1일 보존한 용기와, 25℃ 40％RH에서 30일 보관한 용기에 대하여, 실시예 1과 동일하게 iPS 세포의 박리율, 생존율 및 배양성을 평가하고, 결과를 표 5에 기재하였다.
Figure pct00011
상기 실시예 및 비교예로부터, 본 발명의 세포 배양 기재를 사용한 배양 용기는, 높은 배양성과 박리성 및 박리 후 생존율을 양립시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
나아가, 본 발명의 배양 기재는, 젖은 상태에서도 건조 상태에서도 적합하게 사용이 가능하고, 또한 콜라겐이나 젤라틴 등의 세포외 매트릭스를 병용하지 않아도, 건조 상태에서의 높은 보존 안정성을 나타냈다.
(실시예 13)
실시예 6의 세포 배양 기재 4를 사용하여, 하기 iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다.
즉, 배양 용기 4에, 농도 0.5ug/ul의 라미닌(상품명: iMatrix, 가부시키가이샤 닛삐제) 수용액을 4.8ul, 농도 3.4ug/ul의 ROCK 저해제 Y27632를 1.5ul 및 1.3x104개의 iPS 세포(201B7주, iPS 아카데미아 재팬 가부시키가이샤제)를 첨가한 배지(StemFit Ak02N, 아지노모또 가부시키가이샤제) 1.5ml를 넣고, 5％ CO2 분위기의 37℃ 항온기 내에서 정치하여, 8일간 배양을 행하였다. 배양 개시일의 3일째부터 연속 5일간 매일 배지 교환을 행하였다.
이어서, 4℃의 냉매지로 배지 교환을 하고, 실온에서 10분간 정치한 후, 피펫으로 배지를 빨아들이거나 내거나 하는 「피펫팅 조작」을 약 10회 행하여, 세포 박리를 행하였다. 상기 「세포의 박리율과 생존율 및 배양성의 측정」 방법에 따라서 구한 세포 배양성은 1, 0(TCPS 동등), 세포 박리율은 85％, 회수 세포의 생존율은 70％였다.
(비교예 5)
35mm 폴리스티렌제 샤알레(35mm/조직 배양 접시, IWAKI제)를 사용하는 것 이외에는, 실시예 13과 동일하게 하여 iPS 세포의 배양, 박리율의 평가를 행하였다. 그 결과, 세포 배양성은 1.0, 세포 박리율은 5％, 회수 세포의 생존율은 20％였다.
본 발명의 세포 배양 기재는, 인간 다능성 줄기 세포라도 고효율로 배양 가능하며, 또한 배양 후의 세포를 높은 생존율을 유지한 채 박리시켜 회수하는 것이 가능한 점에서, 예를 들어 재생 의료 대상 세포 배양 기재와 같은 용도에 적합하게 사용된다.

Claims (15)

  1. 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 함유하는 세포 배양 기재이며, 해당 기재가 수팽윤성 점토 광물 및 실리카로부터 선택되는 1종 이상의 무기 재료를 함유하고, 추가로 기재 중에 접착 기질을 가지고, 해당 접착 기질이 세포외 매트릭스 및/또는 접착성 합성 기질인 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
  2. 제1항에 있어서, 세포외 매트릭스가, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 그들의 프래그먼트로부터 선택되는 적어도 1종인 세포 배양 기재.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 접착성 합성 기질이, 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-술포프로필)암모늄히드록시드] 또는 올리고펩티드 담지 중합체인 세포 배양 기재.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체가, 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머를 중합시켜 얻어지는 중합체이며, 단독 중합체가 하한 임계 용해 온도를 갖는 모노머가, N-이소프로필(메트)아크릴아미드, N-n-프로필(메트)아크릴아미드, N-시클로프로필(메트)아크릴아미드, N-에톡시에틸(메트)아크릴아미드, N-테트라히드로푸르푸릴(메트)아크릴아미드, N-에틸아크릴아미드, N-에틸-N-메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N-메틸-N-n-프로필아크릴아미드, N-메틸-N-이소프로필아크릴아미드, N-아크릴로일피페리딘 및 N-아크릴로일피롤리딘으로부터 선택되는 적어도 1종인 세포 배양 기재.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체가,
    하기 식 (1)로 표시되는 모노머 (a)와 친수성 아미드계 비닐 모노머 (b)의 공중합체 (B1),
    또는 상기 모노머 (a)와 하기 식 (2)로 표시되는 모노머 (c)의 공중합체 (B2), 또는 모노머 (a)와 하기 식 (3)으로 표시되는 폴리에틸렌글리콜쇄 함유 모노머 (d)의 공중합체 (B3) 중 적어도 1종이며,
    세포 배양 기재 전체에 대한, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체의 함유율이 5질량％ 내지 99질량％인 세포 배양 기재.
    Figure pct00012

    (식 중, R1은 수소 원자 또는 메틸기, R2는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기, R3은 탄소 원자수 1 내지 2의 알킬기를 나타낸다.)
    Figure pct00013

    (식 중, R4는 수소 원자 또는 메틸기, R5는 탄소 원자수 2 내지 3의 알킬렌기를 나타낸다.)
    Figure pct00014

    (식 중, n은 2 내지 20의 정수를 나타낸다.)
  6. 제5항에 있어서, 상기 친수성 아미드계 비닐 모노머 (b)가, N-치환 (메트)아크릴아미드 유도체, N,N-디치환 (메트)아크릴아미드 유도체 및 N-비닐피롤리돈으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 모노머인 세포 배양 기재.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 상기 모노머 (a)의 중합체 (A)를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 수팽윤성 점토 광물이, 수팽윤성 헥토라이트, 수팽윤성 몬모릴로나이트, 수팽윤성 사포나이트 및 수팽윤성 합성 운모로부터 선택되는, 물 매체 (W) 중에서 1 내지 10층으로 층상 박리되는 1종 이상의 점토 광물이고, 상기 실리카가 수분산성 콜로이달 실리카인 세포 배양 기재.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체를 함유하는 세포 배양 기재 상에, 추가로 젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
  10. 제9항에 있어서, 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체, 젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질, 접착 기질의 순서대로 적층되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 건조 세포 배양 기재인 세포 배양 기재.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 상에 적층된 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
  13. 제12항에 있어서, 평균 막 두께가 1000nm 이하인 세포 배양 기재.
  14. 하한 임계 용해 온도를 갖는 중합체 상에,
    젤라틴, 콜라겐 및/또는 알부민으로부터 선택되는 적어도 1종의 단백질을 함유하는 용액을 도포하는 공정과,
    추가로 제1항에 기재된 접착 기질을 함유하는 용액을 도포하여 세포 배양 기재로 하는 공정과,
    얻어진 세포 배양 기재를 건조시키는 공정을 갖는, 건조 세포 배양 기재의 제조 방법.
  15. 지지체와 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포 배양 기재를 갖는 세포 배양 기재(器材).
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