KR20160142340A - 간세포용 배지 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배지 성능의 안정을 유지하는 한편, 알부민의 사용이 저감된 배양 성적이 좋은 간세포의 증식용 배지를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 폴리비닐알코올 등의 수용성 중합체와 알부민을 함유하는 것을 특징으로 하는 iPS 세포의 배양용 배지 등을 제공한다.

Description

간세포용 배지{MEDIUM FOR STEM CELL USE}

본 발명은 간세포용 배지, 당해 배지의 제조 방법 등에 관한 것이다.

종래 간세포(배성 간세포, 인공 다능성 간세포(iPS 세포) 등)의 배양은 혈청을 함유하는 배지를 사용하여 실시되어 왔다. 예를 들면, 소 태자 혈청(FBS) 등은 세포 증식에 중요한 첨가물로서 세포 배양에 범용되고 있다. 그러나 배양 후의 간세포를 의료 목적으로 사용할 경우, 이종(異種) 유래 성분은 혈액 매개 병원균의 감염원이나 이종 항원이 될 가능성이 있다. 또한, 혈청의 로트 간 차이에 의해 배양 결과에 편차가 생길 가능성도 있다. 따라서 최근에는 화학적 조성이 분명한 배지(화학적으로 정의된 배지)를 사용하여 간세포를 배양하는 것이 주류가 되고 있으며, 무혈청 배지의 개발이 진행되고 있다.

무혈청 배지에서 중요성이 높은 성분의 하나로서 알부민을 들 수 있다. 알부민을 첨가함으로써 배지 성능의 안정 유지 효과를 기대할 수 있고, 세포 배양용으로서 수 종류의 알부민이 시판되고 있다. 그러나 알부민은 비교적 고가이며, 또한, 세포 배양, 특히 간세포의 배양에서 모든 알부민이 동등한 효과를 갖고 있는 것은 아니고, 알부민의 품질에 의해 배양 성적이 영향을 받고, 때로는 알부민의 첨가가 세포의 증식에 불리하게 작용하는 경우도 있다. 또한, 배지 중의 알부민의 열화도 문제가 되고 있다.

비교적 저렴한 알부민으로서는 사람이나 소 등의 동물 중의 혈청에서 추출한 알부민을 들 수 있지만, 기증자가 바이러스 등에 감염되어 있을 경우, 이것이 전파 될 위험성을 가진다. 따라서 이들 동물 혈청 유래의 알부민은 임상 용도로의 사용이 현저히 제한되는 데다, 사용이 허용되는 경우에도 그 사용량을 극히 낮추는 것이 요구된다.

감염 리스크가 낮고, 임상 용도로의 사용이 선호되는 유전자 재조합(recombinant) 법에 의해 작성되는 알부민은 현저히 고가이기 때문에 이를 세포 배양에 제공하여 충분한 양의 세포를 확보하려고 하면 매우 비용이 높아진다. 따라서 이들 재조합 알부민을 세포 배양에 사용하기 위해서는 그 사용량을 극히 낮추는 것이 요구된다.

그래서 알부민의 사용량이 저감된, 또는 알부민이 포함되지 않은 배지의 개발이 시도되고 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에서는 알부민 대체물로서 폴리에틸렌글리콜을 배지에 사용하는 것이 보고되어 있다. 특허문헌 2에서는 알부민을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 폴리비닐알코올 함유 배지가 보고되어 있다. 특허문헌 3에서는 배성 간세포(HESC)용의 배지에 폴리비닐알코올을 사용하는 것이 보고되어 있다. 특허문헌 4에서는 만능 세포에서 중배엽계 간세포를 분화시킴에 있어서 배지 중에 폴리비닐알코올 등을 사용하는 것이 보고되어 있다.

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 특개2004-135672호 특허문헌 2: 일본 공개특허공보 특개2007-228815호 특허문헌 3: US2010/0317104A1 특허문헌 4: WO2011/100286A2

본 발명은 배지 성능의 안정을 유지하는 한편, 알부민의 함유량이 저감된 배양 성적이 좋은 간세포, 특히 iPS 세포의 증식용 배지를 제공하는 것, 당해 증식용 배지를 제조하기 위한 배지 첨가제나 배지의 열화를 방지하는 제(劑)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 알부민 함유 배지에서 특정한 성질을 갖는 수용성 중합체, 특히 폴리비닐알코올을 병용함으로써 알부민 함유량을 저감하면서 뛰어난 배양 성적이 얻어지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 수용성 중합체와 알부민을 함유하는 것을 특징으로 하는, iPS 세포의 배양용 배지.

[2] 수용성 중합체가 폴리비닐알코올인, 상기 [1]에 기재된 배지.

[3] 폴리비닐알코올의 임계 미셀 농도가 0.1 내지 5㎎/㎖인, 상기 [2]에 기재된 배지.

[4] 폴리비닐알코올의 가수분해율이 60 내지 95%인, 상기 [2] 또는 [3]에 기재된 배지.

[5] 알부민이, 지방산 담지량이 저감된 알부민인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 배지.

[6] 수용성 중합체를 유효 성분으로 하는, 배지 첨가제.

[7] 수용성 중합체가 폴리비닐알코올인, 상기 [6]에 기재된 제.

[8] 폴리비닐알코올의 임계 미셀 농도가 0.1 내지 5㎎/㎖인, 상기 [7]에 기재된 제.

[9] 폴리비닐알코올의 가수분해율이 60 내지 95%인, 상기 [7] 또는 [8]에 기재된 제.

[10] 배지가 알부민 함유 배지인, 상기 [6] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 제.

[11] 알부민이, 지방산 담지량이 저감된 알부민인, 상기 [10]에 기재된 제.

[12] 배지가 간세포 증식용 배지인, 상기 [6] 내지 [11] 중 어느 한 항에 기재된 제.

[13] 간세포가 iPS 세포인, 상기 [12]에 기재된 제.

[14] 알부민 함유 배지의 열화 방지제인, 상기 [6] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 제.

[15] 수용성 중합체를 첨가하는 것을 포함하는, 알부민 함유 배지의 열화를 방지하는 방법.

[16] 수용성 중합체가 폴리비닐알코올인, 상기 [15]에 기재된 방법.

[17] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 배양용 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, iPS 세포의 배양 방법.

본 발명의 배지를 사용하면 배지 중의 알부민 양을 줄일 수 있다. 따라서 보다 저용량의 알부민의 첨가로 배지 성능의 안정을 유지할 수 있다. 알부민 사용량의 저감화는 보다 안전하면서 안정된 간세포의 증식을 가능하게 한다. 따라서 배양 중인 배지 교환의 빈도를 낮출 수 있고, 간세포의 배양 비용을 삭감하는 것이 가능해진다.

도 1은 본 발명의 배양 방법에 의해 증식된 iPS 세포가 미분화 성질을 갖고 있는 것을 확인한 도면이다.

본 명세서 중 「간세포」란, 자기 복제능 및 분화/증식능을 갖는 미숙한 세포를 의미한다. 간세포에는 분화 능력에 따라 다능성 간세포(pluripotent stem cell), 복능성 간세포(multipotent stem cell), 단능성 간세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 간세포란, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 복능성 간세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수종의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단능성 간세포란, 특정한 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.

다능성 간세포로서는 배성 간세포(ES 세포), 배성 생식세포(EG 세포), 인공 다능성 간세포(iPS 세포), 스트레스나 세포 자극에 의해 유도·선발되는 다능성 간세포 등을 들 수 있다. 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제작된 초기 배(胚)를 배양함으로써 수립한 간세포도 다능성 간세포로서 또한 바람직하다(Nature, 385, 810(1997); Science, 280, 1256(1998); Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Nature, 394, 369(1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999); Nature Genetics, 24, 109(2000)).

복능성 간세포로서는 간엽계 간세포, 조혈계 간세포, 신경계 간세포, 골수 간세포, 생식 간세포 등의 체성 간세포 등을 들 수 있다. 복능성 간세포는 바람직하게는 간엽계 간세포, 보다 바람직하게는 골수 간엽계 간세포이다. 간엽계 간세포란, 골아세포, 연골아세포 및 지방아세포 등의 간엽계 세포 전체 또는 몇 가지로의 분화가 가능한 간세포 또는 이의 전구세포의 집단을 폭넓게 의미한다.

본 발명에서 사용하는 기초 배지에는 자체 공지된 것을 사용할 수 있고, 간세포의 증식을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, DMEM, EMEM, IMDM(이스코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)), GMEM(글라스고 MEM(Glasgow's MEM)), RPMI-1640, α-MEM, 햄 배지(Ham's Medium) F-12, 햄 배지 F-10, 햄 배지 F12K, 배지(Medium) 199, ATCC-CRCM30, DM-160, DM-201, BME, 피셔(Fischer), 맥코이(McCoy's) 5A, 라이보비츠(Leibovitz's) L-15, RITC80-7, MCDB105, MCDB107, MCDB131, MCDB153, MCDB201, NCTC109, NCTC135, 웨이머스(Waymouth's) MB752/1, CMRL-1066, 윌리엄 배지 E(Williams' medium E), 브린스터 BMOC-3 배지(Brinster's BMOC-3 medium), E8 배지(Nature Methods 2011, 8, 424-429), ReproFF2 배지(리프로셀사) 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다. 또한, 간세포 배양용으로 개변된 배지나 상기 기초 배지와 다른 배지와의 혼합물 등을 사용해도 좋다.

본 발명에서 「알부민 함유 배지」는 상기 기초 배지에 알부민이 첨가되어 이루어지는 배지이다(「알부민」에 대해서는 후술).

본 발명에서 「알부민 함유 배지의 열화」란, 제조 직후의 알부민 함유 배지에 비해 그 세포 증식을 지지하는 능력이나 세포의 미분화 상태를 유지시키는 능력이 저하된 상태를 의미하며, 구체적으로는 알부민 함유 배지를 조제하여 일정 기간 경과한 후에 배양에 제공한 경우, 배양 세포의 증식 수나 미분화 마커량 등이 조제 직후의 배지에서 배양한 경우에 비해 낮은 값이 되는 현상을 의미한다. 이러한 현상의 원인으로서는 예를 들면, 배지를 조제 후 일정 기간 경과하는 동안에 배지 중의 알부민이 분해나 변성, 배지 용기에 대한 흡착 등에 의해 배지 중의 알부민 양이 세포 배양에서 유효하게 작용하는데 충분하지 않게 되는 것을 들 수 있다.

본 발명에서 사용하는 배지에는 자체 공지된 첨가물을 포함할 수 있다. 첨가물로서는 간세포의 증식을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 성장 인자(예를 들면 인슐린 등), 철원(예를 들면 트랜스페린 등), 폴리아민류(예를 들면 푸트레신 등), 미네랄(예를 들면 셀렌산나트륨 등), 당류(예를 들면 글루코오스 등), 유기산(예를 들면 피루브산, 락트산 등), 아미노산(예를 들면 L-글루타민 등), 환원제(예를 들면 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류(예를 들면 아스코르빈산, d-비오틴 등), 스테로이드(예를 들면 β-에스트라디올, 프로게스테론 등), 항생 물질(예를 들면 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제(예를 들면 HEPES 등) 등을 들 수 있다. 또한, 종래부터 간세포의 배양에 사용되어 온 첨가물도 적절히 포함할 수 있다. 첨가물은 각각 자체 공지된 농도 범위 내에서 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 배지에는 혈청이 포함되어 있어도 좋다. 혈청으로서는 동물 유래의 혈청이면 간세포의 증식을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 포유동물 유래의 혈청(예를 들면 소 태자 혈청, 사람 혈청 등)이다. 혈청의 농도는 자체 공지된 농도 범위 내이면 좋다. 단, 혈청 성분에는 사람 ES 세포의 분화 인자 등도 포함되어 있는 것이 알려져 있고, 또한, 혈청의 로트간 차이에 의해 배양 결과에 편차가 생길 가능성도 있기 때문에 혈청의 함유량은 낮을수록 바람직하고, 혈청을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다. 또한, 배양 후의 간세포를 의료 목적으로 사용할 경우, 이종 유래 성분은 혈액 매개 병원균의 감염원이나 이종 항원이 될 가능성이 있기 때문에 혈청을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 혈청을 포함하지 않는 경우, 혈청의 대체 첨가물(예를 들면, 녹아웃 혈청 대체물(Knockout Serum Replacement)(KSR)(인비트로겐(Invitrogen)), 화학적으로-정의된 농축 지질(Chemically-defined Lipid concentrated)(깁코(Gibco)), 글루타맥스(Glutamax)(깁코) 등)을 사용해도 좋다.

본 발명은 간세포, 특히 iPS 세포용의 증식용 배지로서, 수용성 중합체와 알부민을 함유하는 것을 특징으로 하는 배지(이후, 본 발명의 배지라고도 칭함)를 제공한다. 증식용 배지란, 간세포의 복제능이나 다능성, 단능성을 유지한 상태에서 당해 세포의 복제(즉, 증식)를 가능하게 하는 배지이다.

1. 본 발명의 배지

본 발명의 배지는 어느 간세포의 증식에도 적합하게 사용할 수 있지만, 바람직하게는 ES 세포 또는 iPS 세포, 보다 바람직하게는 iPS 세포의 증식용이다.

또한, 본 발명의 배지는 어느 동물 유래의 간세포의 증식에도 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 배지를 사용하여 배양될 수 있는 간세포는, 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목, 개, 고양이 등의 식육목, 사람, 원숭이, 붉은털 원숭이, 마모셋(marmoset), 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등 유래의 간세포이며, 바람직하게는 사람 유래의 간세포이다.

본 발명에서 사용되는 알부민은 세포 배양용으로서 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 지방산 담지량이 저감된 것이 사용된다. 이미 지방산 담지량이 저감된 것이면 그대로, 지방산 담지량이 저감되지 않은 것이면 탈지방산 처리를 한 후 배지에 첨가된다.

지방산으로서는 탄소수 8 내지 20으로 이루어진 포화 지방산(예를 들면, 팔미트산, 스테아르산) 및 탄소수 16 내지 20으로 이루어진 불포화 지방산(예를 들면, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산)을 들 수 있다.

알부민으로서 구체적으로는 난백 알부민, 돼지 유래 알부민, 소 유래 알부민, 사람 유래 알부민 등의 천연 유래의 알부민이나, 소형, 돼지형 또는 사람형 등의 유전자 재조합체의 알부민 등을 들 수 있고, 특히 혈청 유래의 알부민이나 사람형의 유전자 재조합체 알부민(재조합 사람 알부민(rHSA))을 바람직하게 예시할 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 것을 사용할 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 것으로서는, rHSA로서는 시그마 알드리치사 A9731(형번), 사이언셀 리서치 라보라토리스사 OsrHSA-10(형번), 우한 헬스젠 바이오테크놀로지스사 HY01E-10g(형번), 이 엔자임사 HSA-1r(형번), 바이오베르데사 IBK-A1-10(형번) 등의 재조합 벼 유래의 제품이나 시그마 알드리치사 A7223(형번), A6608(형번), A7736(형번), 노보자임사의 알부컬트(Albucult)(등록상표)(제품명), 레콤부민 알파(Recombumin alpha)(등록상표)(제품명), AlbIX(등록상표)(제품명) 등의 재조합 효모 유래의 제품을 들 수 있다. 사람 혈장 유래 알부민으로서 시그마 알드리치사 A1887(형번), A1653(형번), A9511(형번), A3782(형번), A8763(형번), A4327(형번), 바이오로지컬 인더스트리즈사 바이오-퓨어 HSA 10% 용액(Bio-Pure HSA 10% Solution)(제품명) 등의 제품을 들 수 있다.

알부민은 다양한 물질과 결합하는 능력이 높은 단백질이며, 칼슘과 아연 등의 미량 원소나 지방산, 효소, 호르몬 등과 결합한다. 예를 들면, 혈청 유래의 알부민은 혈청 중에 포함되는 다양한 물질과 결합하고 있고, 지방산의 경우이면 알부민 1분자는 통상 지방산 2분자와 결합하는 능력을 가진다.

알부민의 탈지방산 처리는 알부민의 지방산 담지량을 저감시킬 수 있는 처리이면 특별히 한정되지 않고, 활성탄 처리, 이온 교환 처리, 가열 처리 등을 들 수 있지만, 경제성, 간편성 등의 관점에서 바람직하게는 활성탄 처리이다. 또한, 활성탄 처리에 의해 알부민의 지방산 담지량은 알부민 1g에 대해 바람직하게는 9㎎ 이하, 보다 바람직하게는 7㎎ 이하, 더욱 바람직하게는 2.2㎎ 이하로 저감할 수 있다.

알부민의 지방산 담지량의 측정은 당해 분야에서 통상 실시되고 있는 방법 또는 그에 준한 방법을 사용하여 실시할 수 있고, 예를 들면, 유리 지방산을 메틸에스테르화 후 GC-MS에 의한 검출이나 적외 분광에 의한 정량에 더하여 던콤(Duncombe)의 추출법, 아실-CoA 신테타아제(ACS)와 아실-CoA 옥시다아제(ACOD)를 사용한 ACS-ACOD법 등을 들 수 있다. 모두 측정 키트로써 시판되고 있는 것을 이용할 수 있다.

본 발명에서 배지 중의 알부민의 함유량은 통상 세포 배양용 배지에 첨가될 수 있는 양이면 특별히 한정되지 않지만, 본 발명에서는 수용성 중합체와 병용함으로써 그 함유량을 줄일 수 있다. 구체적으로는 종농도(終濃度)가 0.01 내지 10㎎/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 5㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.2 내지 3.5㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 3㎎/㎖가 되도록 간세포 배양용의 기초 배지에 첨가된다. 함유량이 너무 적으면, 배지 성능의 안정 유지 효과를 기대할 수 없고, 너무 많으면 배지의 제조 비용이 높아져서 실용성이 낮아진다.

알부민은 배지 중에서 3차원상의 구조를 형성하여 지용성 물질의 담체로서의 역할을 비롯한 다양한 기능을 나타내고 있다고 되어 있기 때문에, 이러한 입체 구조를 모방함으로써 알부민의 기능을 대체 또는 보조하는 것이 가능하다고 생각된다. 화합물의 입체 구조화는 계면활성 기능을 갖는 화합물을 미셀 형성에 의해 집합체화시킴으로써 실현할 수 있기 때문에 미셀 형성에 의한 알부민 대체 또는 보조의 가능성을 생각할 수 있다. 그 점에서, 본 발명에서 수용성 중합체는 이의 미셀 형성능에 의해 알부민의 대체 또는 보조가 될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 수용성 중합체는 세포 배양용으로서 사용 가능한 것, 즉, 세포 독성을 나타내지 않는 것이면서 알부민과 병용함으로써 알부민의 사용량을 줄일 수 있는 것이다. 본 발명에서 사용되는 수용성 중합체의 일 형태는 임계 미셀 농도(CMC)가 0.1 내지 10㎎/㎖, 바람직하게는 0.1 내지 5㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1㎎/㎖인 것이다. 본 발명에서 사용되는 수용성 중합체의 일 형태는 폴리비닐알코올이며, CMC가 0.1 내지 5㎎/㎖, 바람직하게는 0.5 내지 5㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1㎎/㎖인 것이다. 여기서 미셀이란, 수용액 중에서 친수기 부분이 수상 측에 소수기 부분이 내측을 향하여 배향함으로써, 분자가 일정 수 모임으로써 형성되는 수용성 중합체 분자의 집합체이다. 본 발명에서 「미셀」이란, 이러한 협의(狹義)의 미셀에 더하여 의사(疑似) 미셀이라고 불리는 콜로이드상의 응집체(예를 들면, Revue Roumaine de Chimie, 54권, 577-581쪽, 2009년)도 포함된다. CMC가 너무 낮으면 이의 극도로 높은 미셀 형성능에 의해 배지에 포함되는 계면활성제 등을 응집화하여 세포 배양에 영향을 미치는 것이 우려되고, 너무 높으면 미셀 형성을 위해 대량으로 첨가할 필요가 생기며, 이 경우, 배지의 점도나 침투압이 상승하여 배양 세포에 영향을 미치는 것이 우려된다. CMC가 낮을수록 미셀 형성능이 높다.

CMC의 측정은 당해 분야에서 통상 실시되고 있는 방법 또는 그에 준한 방법을 사용하여 실시할 수 있고, 예를 들면, 전기 전도법, 점도법, 색소법, 표면 장력법, 광 산란법 등을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 최근 형광 물질 피렌을 사용한 형광 강도를 측정함으로써 산출하는 방법도 사용되고 있다.

본 발명에서 사용되는 수용성 중합체로서는, 구체적으로는 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 PVA이다.

본 발명에서 수용성 중합체로서 사용되는 PVA는, 바람직하게는 가수분해율이 60 내지 95%, 바람직하게는 70 내지 90%, 보다 바람직하게는 75 내지 90%인 것이다. 여기서 말하는 가수분해율이란, PVA의 원료인 폴리비닐아세트산의 아세틸기를 가수분해에 의해 하이드록실기로 변환한 비율이다. %가 높을수록 가수분해가 진행되고 있는 것을 나타낸다. 가수분해율이 너무 낮으면 수용성이 충분하지 않고, 너무 높아도 고분자끼리 하이드록실기가 수소 결합하여 오히려 물에 대한 용해성, 분산성이 나빠진다. 보다 균일한 세포에 대한 접촉이 가능해지도록 PVA는 용액화된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 용액화에 사용하는 용매는 세포 배양용 배지에 첨가되어 세포 증식에 악영향을 갖지 않는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 물이나 생리 완충액 등을 들 수 있다.

본 발명에서 배지 중의 수용성 중합체의 함유량은 통상 세포 배양용 배지에 첨가될 수 있는 양이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 수용성 중합체가 PVA인 경우이면, 종농도가 0.1 내지 20㎎/㎖, 바람직하게는 1 내지 20㎎/㎖, 보다 바람직하게는 1 내지 10㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 3 내지 7㎎/㎖가 되도록 간세포 배양용의 기초 배지에 첨가된다. 또한, 알부민과 수용성 중합체의 배지 중 함유량의 비는 사용하는 수용성 중합체의 종류에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 예를 들면, 수용성 중합체가 PVA인 경우이면 1:1.1 내지 100, 바람직하게는 1:1.1 내지 50, 보다 바람직하게는 1:1.1 내지 25, 더욱 바람직하게는 1:3 내지 15로 할 수 있다. 함유량이 너무 적으면 알부민의 대체로서의 효과를 기대할 수 없고, 너무 많으면 세포 독성이 우려된다.

본 발명은 수용성 중합체를 유효 성분으로 하는 배지 첨가제(이후, 본 발명의 배지 첨가제라고도 칭함)를 제공한다.

2. 본 발명의 배지 첨가제

본 발명의 배지 첨가제에 사용되는 수용성 중합체는 상기 「1. 본 발명의 배지」에 사용되는 것과 동일하다. 수용성 중합체를 함유하는 본 발명의 배지 첨가제는 기초 배지 등에 필요량이 첨가되지만, 배지 성능의 유지에서 알부민의 대체가 될 수 있기 때문에, 특히 알부민을 함유하는 배지에 첨가할 때에 적합하다. 여기서 배지에 포함되는 알부민은 상기 「1. 본 발명의 배지」에 사용되는 것과 동일하다.

본 발명의 배지 첨가제에는 유효 성분인 수용성 중합체 이외에, 배지에 첨가하는 것이 바람직한 각종 인자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 「1. 본 발명의 배지」의 항에서 예시한 자체 공지된 첨가물을 포함할 수 있다.

본 발명의 배지 첨가제는 배지 성능의 유지에서 알부민의 대체가 될 수 있는, 즉, 배지의 열화를 방지하는 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 배지 첨가제는 알부민 함유 배지의 열화 방지제로서도 적합하게 사용할 수 있다.

본 발명의 배지 첨가제의 기초 배지에 대한 첨가량은 원하는 효과나 포함되는 수용성 중합체의 종류에 따라 적절히 선택된다. 예를 들면, 수용성 중합체로서 PVA를 사용한 배지 첨가제의 경우, 알부민 함유 배지, 예를 들면, 간세포(특히 iPS 세포)의 증식 배양용의 알부민 함유 배지에 첨가되는 경우에는 유효 성분인 수용성 중합체의 양으로, 통상, 0.1 내지 20㎎/㎖, 바람직하게는 1 내지 20㎎/㎖, 보다 바람직하게는 1 내지 10㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 3 내지 7㎎/㎖가 되도록 첨가된다. 또한, 알부민과 수용성 중합체의 최종 조정 후의 배지 중에서의 함유량의 비는 1:1.1 내지 100, 바람직하게는 1:1.1 내지 50, 보다 바람직하게는 1:1.1 내지 25, 더욱 바람직하게는 1:3 내지 15로 할 수 있다.

본 발명은 간세포의 배양 방법(이후, 본 발명의 배양 방법이라고도 칭함)을 제공한다.

3. 본 발명의 배양 방법

본 발명의 배양 방법은 간세포(바람직하게는 iPS 세포)를 본 발명의 배지(상기 「1. 본 발명의 배지」의 항 참조)에서 배양하는 공정을 포함한다.

간세포의 배양에 사용되는 배양기는 간세포의 배양이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로슬라이드, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양백 및 회전병을 들 수 있다.

배양기는 세포 접착성이어도 세포 비접착성이어도 좋고, 목적에 따라 적절히 선택된다. 세포 접착성의 배양기는 배양기 표면의 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로, 세포 외 매트릭스(ECM) 등의 임의의 세포 지지용 기질로 코팅된 것일 수 있다. 세포 지지용 기질은 간세포 또는 피더세포(feeder cell)(사용되는 경우)의 접착을 목적으로 하는 임의의 물질일 수 있다.

그 외의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃일 수 있다. CO₂ 농도는 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 2 내지 5%일 수 있다. 산소분압은 1 내지 10%일 수 있다.

본 발명의 배양 방법에서 본 발명의 배지에 의한 간세포의 배양 또는 본 발명의 배지 첨가제의 간세포 배양에 대한 첨가 타이밍은 원하는 간세포 증식 촉진 효과가 얻어진다면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 배지 중에 간세포를 파종(播種)해도 좋고, 알부민 함유 배지에 간세포를 파종하여 배양 후 1 내지 수일, 바람직하게는 1일 배양한 후에 당해 배지에 본 발명의 배지 첨가제를 첨가해도 좋다. 또는, 본 발명의 배지에서 배지 교환해도 좋다.

본 발명의 배양 방법에 의해 증식시킨 iPS 세포는 미분화 성질을 유지하고 있다. iPS 세포가 미분화 성질을 갖고 있는지 여부를 확인하는 방법으로서 미분화 마커를 지표로 확인하는 방법이 있다. 미분화 마커로서는 알칼리포스파타제, Oct3/4, Sox2, Nanog, ERas, Esgl 등을 들 수 있다. 이들 미분화 마커를 검출하는 방법으로서는 mRNA를 검출하는 방법, 면역학적 검출법 등을 들 수 있다.

이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예

(재료와 방법)

1. 폴리비닐알코올(PVA)

PVA는 이하의 것을 사용했다.

[니혼고세이가가쿠사 제조]

고세놀 EG-05PW(가수분해율 88%)

고세놀 NL-05(가수분해율 99%)

고세놀 KL-05(가수분해율 79%)

고세놀 EG-03P(가수분해율 88%)

[아크로스 오가닉스(ACROS Organics)사 제조]

302780250(가수분해율 78%)

[칸토가가쿠사 제조]

32283-02(가수분해율 86.5 내지 89%).

2. 알부민

재조합 사람 알부민은 노보자임스(Novozymes)사 제조의 것을 사용했다.

품명: 레콤부민 및 알부컬트

사람 혈청 알부민은 박스터(Baxter)사 제조의 것을 활성탄(와코준야쿠사 제조) 처리하여 사용했다. 활성탄 처리에 의해 알부민에 담지되는 지방산량(와코준야쿠사 제조: 라보어세이 NEFA를 사용하여 정량)은 알부민 1g당 1 내지 2㎎까지 저감했다.

3. 임계 미셀 농도(CMC)의 측정

PVA의 임계 미셀 농도(CMC)는 비특허문헌(Journal of Controlled Release, 143권, 201-206쪽, 2010년)에 기재된 방법에 기초하여, 형광 물질 피렌을 사용한 형광 강도 측정법에 의해 산출했다. 다른 농도(0.01 내지 50㎎/㎖)의 PVA 수용액에 6mM 피렌/아세톤 용액을 혼합한 후, 실온에서 1시간 진탕했다. 혼합액의 여기 파장 333nm 및 339nm에 대한 방출 파장 390nm의 형광 강도(I-333 및 I-339)를 측정했다. PVA 농도에 대한 형광 강도비(I-339/I-333)를 플롯하고, 형광 강도비가 급격히 상승할 때의 PVA 농도를 CMC로 했다. 결과를 표 1에 기재한다.

(결과)

실시예 1: iPS 세포 증식계에서의 평가-1

다양한 수용성 중합체를 사용하여 인공 다능성 간세포(iPS 세포)의 증식 효과를 평가했다. iPS 세포는 iPS 아카데미아 재팬사로부터 구입한 201B7주를 사용했다. 세포 배양은 기저막 매트릭스(니혼 벡톤 디킨슨사 제조의 매트리겔)를 코트한 배양 용기(니혼 벡톤 디킨슨사, 팔콘(Falcon) 배양 샬레 또는 팔콘 배양 플레이트)를 사용하여 5% CO₂/37℃의 조건으로 실시했다. iPS 세포용 피더레스 배지인 필수 8배지(인비트로겐사 제조)에 각종 PVA 및 각종 알부민을 소정의 농도가 되도록 첨가하여 피험 배지로 했다. 이것을 즉시 또는 4℃ 중 2 내지 4주간 보관한 후에 배양에 사용함으로써 그 효과를 검토했다. 파종시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이 테스크사 제조: 08945-84)했다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하지 않은 피험 배지에서 배양했다. 2 내지 3일마다 배지 교환을 실시하여 1주간 배양 후, 세포 수를 측정했다. 세포 수의 측정은 「개정 세포 배양 입문 노트, 77 내지 83쪽, 2010년, 요도사」에 기재된 방법에 의해 실시했다. 또한, 컨트롤로서 알부민만 첨가하고 PVA를 첨가하지 않은 배지에서 동일하게 배양을 실시했다.

평가 기준은 이하와 같다.

◎: 세포 수가 컨트롤의 그것에 대하여 150% 이상

○: 세포 수가 컨트롤의 그것에 대하여 120% 이상 150% 미만

□: 세포 수가 컨트롤의 그것에 대하여 100% 이상 120% 미만

―: 세포 수가 컨트롤의 그것에 대하여 50% 이상 100% 미만

×: 세포 수가 컨트롤의 그것에 대하여 50% 미만

결과를 표 2 내지 4에 기재한다.

표 1에 기재한 바와 같이, 가수분해율이 79% 또는 88%인 PVA는 CMC가 1㎎/㎖ 이하이며, 가수분해율이 99%인 PVA의 CMC(20㎎/㎖)에 비해 분명히 저농도이기 때문에 미셀 형성능이 높다.

표 2, 3에 기재한 바와 같이, 가수분해율이 79% 또는 88%인 PVA는 가수분해율이 99%인 PVA에 비해, 첨가 농도 1㎎/㎖ 및 5㎎/㎖ 중 어느 것에서도 iPS 세포의 증식 촉진 활성이 양호했다. 특히 첨가 농도 5㎎/㎖에서는 세포 수가 컨트롤의 그것에 대하여 120% 이상이 되는 빈도가 가수분해율이 79% 또는 88%의 PVA에서는 각각 12개 샘플 중 9개 샘플인 것에 대해, 가수분해율이 99%의 PVA에서는 12개 샘플 중 3개 샘플 밖에 없고, 효과의 차이는 분명하다.

또한, 표 4에 기재한 바와 같이, 가수분해율이 88%인 PVA는 사람 혈청 알부민과 함께 첨가한 경우에서도 iPS 세포의 증식 촉진 활성이 양호하다.

실시예 2: iPS 세포 증식계에서의 평가-2

수용성 중합체로서 PVA를 사용하여 알부민 함유 배지에서의 iPS 세포의 증식 효과를 평가했다. PVA로서는 고세놀 EG-05PW를, 알부민으로서는 사람 혈청 알부민을 사용했다. iPS 세포의 입수 및 배양은 실시예 1과 동일하게 하여 실시했다. iPS 세포용 피더레스 배지인 필수 8배지(인비트로겐사 제조)에 PVA 및 알부민을 소정의 농도가 되도록 첨가하여 피험 배지로 했다. 이를 즉시 또는 4℃ 중 3주간 보관한 후에 배양에 사용함으로써 그 효과를 검토했다. 파종 시에 사용하는 배지에는 Y-27632를 첨가(최종 농도 10μM, 나카라이테스크사 제조: 08945-84)했다. 다음날 이후에는 Y-27632를 첨가하지 않은 피험 배지에서 배양했다. 2 내지 3일마다 배지 교환을 실시하여 1주간 배양 후, 세포 수를 측정했다. 세포 수의 측정은 실시예 1과 동일하게 하여 실시했다. 또한, 컨트롤로서 알부민(1.4㎎/㎖)만 첨가하고, PVA를 첨가하지 않은 배지에서 동일하게 배양을 실시했다.

평가 기준은 이하와 같다.

컨트롤에 비하여

◎: 상당히 높은 세포 증식능

○: 동등한 세포 증식능

△: 상당히 낮은 세포 증식능

결과를 표 5에 기재한다.

실시예 3: 미분화 마커의 측정

(측정 방법)

리얼 타임 PCR법에 의한 mRNA의 발현 해석

각종 피험 배지에서 배양한 세포를 회수하고, 세포 중의 전(前) RNA를 RNeasy 플러스 미니 리트(RNeasy Plus Mini Lit)(퀴아젠(Qiagen)사 제조)를 사용하여 추출했다. 추출한 각 전체 RNA를 주형으로 하는 프라이머스크립트 RT 시약 키트(PrimerScript RT reagent Kit)(타카라 바이오사 제조)를 사용한 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성했다. 이것을 주형에 각종 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머(모두 홋카이도 시스템 사이언스사에 합성을 위탁), 파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Power SYBR Green PCR Master Mix)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사 제조)를 사용한 PCR을 7500 패스트 리얼 타임 PCR 시스템(Fast Real Time PCR system)(어플라이드 바이오시스템즈사 제조)으로 실시했다. mRNA 발현량은 내재 컨트롤인 β-액틴(ActB) 또는 GAPDH(글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제)로 표준화했다.

(결과)

결과를 도 1에 도시한다. 도 1에 도시한 바와 같이 iPS 세포의 대표적 미분화 마커인 Oct3/4 및 Nanog 중 어느 것에 대해서도 그 발현량은 PVA를 첨가하여 알부민 양을 삭감해도 변화하지 않았다.

이상의 결과로부터 PVA가 iPS 세포의 미분화능에 영향을 미치지 않는 것이 확인되었다.

산업상 이용가능성

본 발명의 배지를 사용하면 간세포를 효율적으로 증식시킬 수 있다. 따라서 배양 중의 배지 교환의 빈도를 낮출 수 있고, 간세포의 배양 비용을 삭감하는 것이 가능해진다.

본 출원은 일본에서 출원된 특허출원 2014-070763(출원일 2014년 3월 31일)을 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (17)

1. 수용성 중합체와 알부민을 함유하는 것을 특징으로 하는, iPS 세포의 배양용 배지.
2. 제1항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리비닐알코올인, 배지.
3. 제2항에 있어서, 폴리비닐알코올의 임계 미셀 농도가 0.1 내지 5㎎/㎖인, 배지.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 폴리비닐알코올의 가수분해율이 60 내지 95%인, 배지.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민이, 지방산 담지량이 저감된 알부민인, 배지.
6. 수용성 중합체를 유효 성분으로 하는, 배지 첨가제.
7. 제6항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리비닐알코올인, 제(劑).
8. 제7항에 있어서, 폴리비닐알코올의 임계 미셀 농도가 0.1 내지 5㎎/㎖인, 제.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 폴리비닐알코올의 가수분해율이 60 내지 95%인, 제.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 알부민 함유 배지인, 제.
11. 제10항에 있어서, 알부민이, 지방산 담지량이 저감된 알부민인, 제.
12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 간세포 증식용 배지인, 제.
13. 제12항에 있어서, 간세포가 iPS 세포인, 제.
14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 함유 배지의 열화 방지제인, 제.
15. 수용성 중합체를 첨가하는 것을 포함하는, 알부민 함유 배지의 열화를 방지하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리비닐알코올인, 방법.
17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 배양용 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, iPS 세포의 배양 방법.

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