CN105745321B - 用于产生工程化心肌(ehm)的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在化学充分限定的完全符合GMP规定的条件和化合物下产生工程化心肌(EHM)的新方法。得到的人心肌生成力，并显示出心肌的典型特性。

Description

用于产生工程化心肌(EHM)的方法
技术领域
本发明提供了用于在化学充分限定的完全符合GMP规定的条件下产生工程化心肌(EHM)的新方法。得到的人心肌生成力，并显示出心肌的典型特性。
背景技术
心脏病是工业化国家的头号致死原因，尽管有完善的药物及介入治疗，其患病率预计仍上升。因此，不可避免地需要新的药物和非药物治疗模式。组织工程化心肌，一方面可以用于鉴定用于治疗心脏病的新药或新药物靶点(物质筛选/靶点确认)，另一方面可以直接应用于心脏修复(再生/修复医学)(Eschenhagen和Zimmermann,Circ Res,97:1220-1231(2005)；Zimmermann等,Cardiovasc Res,71:419-429(2006))。功能性工程化心肌的主要先决条件是，如原生心肌那样具有产生力的能力。
过去十年间，已建立了若干心肌组织工程化模式。但是，仅利用水凝胶-细胞捕获(Eschenhagen等,Faseb J 11:683-694(1997)；Kofidis等,J Thorac Cardiovasc Surg124:63-69(2002)；Morritt等,Circulation 115:353-360(2007)；Zimmermann等,Biotechnol Bioeng 68:106-114(2000)；Tulloch等,Circ Res 109:47-59(2011))或细胞层技术(Shimizu等,Circ Res 90:e40(2002))证实了可靠的力生成。发明人和其它研究人员已经提供证据，即在胶原蛋白-水凝胶中的心肌细胞捕获提供了三维生长环境，该环境一方面可以促进多细胞、各向异性的心肌细胞的组装，另一方面支持未成熟心肌细胞的高度成熟(Tiburc等,Circ Res 109:1105-1114(2011))。得到的工程化心肌(EHM)制剂(以前被描述为工程化心脏组织：EHT)最终有利于形成具有出生后心肌特性的有收缩能力的心肌构建体(Radisic等,Proc Natl Acad Sci USA 101:18129-18134(2004)；Tiburcy等,CircRes,109:1105-1114(2011)；Zimmermann等,Circ Res 90:223-230(2002))。原理验证的动物研究已经表明，在植入到患病心脏上之后，EHM不仅电整合而且改善心脏功能(Zimmermann等,Nat.Med 12:452-458(2006))。
原理上，发明人已经证明，组织工程化心肌可以是一种新的心脏病治疗模式。然而，迄今所有公开报道的心脏组织工程化方法都依赖使用非限定的动物性组分，主要是动物基质(如大鼠胶原蛋白、牛纤维蛋白、小鼠肿瘤来源的细胞外基质)，和动物血清(Tulloch等,Circ Res 109:47-59(2011)；Zimmermann等,Circ Res 90:223-230(2002)；Zimmermann等,Nat.Med 12:452-458(2006)；Schaaf等,PloS One 6:e26397(2011)；Soong等,Curr Prot Cell Biol 23.8.1-23.8.21(2012)；WO 01/55297，WO 2007/054286和WO 2008/058917)。在大鼠EHM模型中，本发明人已进行用无血清培养基替换动物血清的最初研究。虽然本发明人能够在得到的组织中获得相当的力产生，但是本发明人无法在最初七天的组织形成初始阶段除去动物性组分(Naito等,Circulation,114:I72-78(2006)；Zimmermann，Hamburg Eppendorf,Habilitation(2006)；Schneiderbanger,汉堡大学,论文(2006))。
最近，若干用于更有效心脏分化的无血清的、细胞因子导向的操作方案已有所描述(Burridge等,Cell Stem Cell 10:16-28(2012))，产生了含有高达98％心肌细胞的培养物(Lian等,Proc Natl Academic Sci USA(2012))。重要的是，因为使用无动物性产品的限定物质，这些无血清分化操作方案提供了潜在的临床适用性。虽然在GMP条件下扩大人心脏细胞的规模似乎是一个可以解决的问题，但是生成力的人心肌的制造仍是一个挑战。在无血清限定培养条件下支持ESC来源的心肌细胞的器官型构建和高度成熟依然是一个关键问题。
发明内容
在此，发明人报告了一个使用完全限定组分来工程化人心肌(人工程化心肌：hEHM)的操作方案。这些组分包括水凝胶基质、人细胞和完全符合GMP规定的无血清培养基条件。得到的人心肌能生成力，并显示了典型的心肌特性。
更具体地，提供了一种用于产生工程化心肌(EHM)的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)在一个或多个模具中提供无血清重构混合物，所述重构混合物包含(a)无血清最少必需培养基；(b)无血清补充剂，得到0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml盐酸左旋肉碱、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)和0.2-2mg/ml胶原蛋白的终浓度；和(c)人心肌细胞和人非肌细胞的混合物，其中总细胞混合物的20％到80％是心肌细胞；其中重构混合物的pH为7.2到7.6；
ii)在所述一个或多个模具中培养无血清重构混合物，由此使无血清重构混合物凝结至少15分钟；
iii)在所述一个或多个模具中，在无血清EHM培养基中培养步骤(ii)中获得的混合物，直至所述混合物凝结到至少50％的其初始厚度，其中所述EHM培养基包含(a)含有0.5-3mmol/L Ca2+的基础培养基；(b)如(i)(b)中定义的无血清补充剂；(c)0.5-10mmol/LL-谷氨酰胺；(d)0.01-1.0mmol/L抗坏血酸；(e)1-100ng/ml IGF-1；及(f)1-10ng/ml TGFβ1；
iv)在如步骤(iii)(a)-(f)中定义的无血清EHM培养基中，在机械拉伸下培养步骤(iii)中获得的混合物，由此形成生成力的EHM。
具体实施方式
更具体地，本发明提供了一种用于产生工程化心肌(EHM)的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)在一个或多个模具中提供无血清重构混合物，所述重构混合物包括(a)无血清最少必需培养基；(b)无血清补充剂，得到下述的终浓度为
0.5-50mg/ml白蛋白(优选1-40mg/ml，更优选2-30mg/ml，还更优选3-20mg/ml，最优选4-10mg/ml，甚至最优选4.5-7.5mg/ml，诸如约5mg/ml)，
1-100μg/ml转铁蛋白(优选2-90μg/ml，更优选3-80μg/ml，甚至更优选4-70μg/ml，还更优选5-60μg/ml，更优选6-50μg/ml，更优选7-40μg/ml，更优选8-30μg/ml，更优选9-20μg/ml，诸如约10μg/ml)，
0.1-10μg/ml乙醇胺(优选0.2-9μg/ml，更优选0.3-8μg/ml，甚至更优选0.4-7μg/ml，还更优选0.5-6μg/ml，更优选0.6-5μg/ml，更优选0.7-4μg/ml，更优选0.8-3μg/ml，更优选1-2.5μg/ml，诸如约2μg/ml)，
0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠(优选0.005-0.2μg/ml，更优选0.01-0.1μg/ml，甚至更优选0.02-0.05μg/ml，最优选约0.03μg/ml，诸如约0.032μg/ml)，
0.4-40μg/ml盐酸左旋肉碱(优选0.5-30μg/ml，更优选1-20μg/ml，甚至更优选2-10μg/ml，最优选3-5μg/ml，甚至最优选约4μg/ml)，
0.1-10μg/ml氢化可的松(优选0.2-9μg/ml，更优选0.3-8μg/ml，甚至更优选0.4-7μg/ml，还更优选0.5-6μg/ml，更优选0.6-5μg/ml，更优选0.7-4μg/ml，更优选0.8-3μg/ml，更优选0.9-2μg/ml，诸如约1μg/ml)，
0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂(优选0.1-4μl/ml，更优选0.2-3μl/ml，甚至更优选0.3-3μl/ml，最优选0.4-2μl/ml，甚至最优选0.45-1μl/ml，诸如约0.5μl/ml)，
0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)(优选0.001-0.01μg/ml，更优选0.002-0.0075μg/ml，甚至更优选0.003-0.005μg/ml，最优选约0.004μg/ml)，和
0.2-2mg/ml胶原蛋白(优选0.3-1.9mg/ml，更优选0.4-1.8mg/ml，甚至更优选0.4-1.7mg/ml，还更优选0.5-165mg/ml，更优选0.6-1.5mg/ml，更优选0.7-1.4mg/ml，更优选0.8-1.3mg/ml，更优选0.9-1.2mg/ml，诸如约1mg/ml)；
和(c)人心肌细胞和人非肌细胞的混合物，其中20％到80％的总细胞混合物是心肌细胞；
其中重构混合物的pH为7.0到7.8，优选为7.1到7.7，更优选为7.2到7.6，甚至更优选为7.3到7.5，最优选为约7.4；
(ii)在所述一个或多个模具中培养无血清重构混合物，由此使无血清重构混合物凝结至少15分钟，优选0.25-3小时，更优选0.5-1.5小时；
(iii)在所述一个或多个模具中，在无血清EHM培养基中培养步骤(ii)中获得的混合物，直至混合物凝结到至少50％(优选至少55％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，最优选至少75％)的其原始厚度，
其中所述EHM培养基包含
(a)包含0.5-3mmol/L(优选1-2.5mmol/L，更优选约2mmol/L)Ca2+的基础培养基；
(b)如(i)(b)中定义的无血清补剂；
(c)0.5-10mmol/L(优选1-7mmol/L，更优选2-6mmol/L，甚至更优选3-5mmol/L，还更优选约2mmol/L)L-谷氨酰胺；
(d)0.01-1.0mmol/L(优选0.05-1.0mmol/L，更优选0.1-0.5mmol/L，甚至更优选0.2-0.4mmol/L，还更优选约0.3mmol/L)抗坏血酸；
(e)1-100ng/ml(优选2-90ng/ml，更优选3-80ng/ml，甚至更优选4-70ng/ml，还更优选5-60ng/ml，更优选6-50ng/ml，更优选7-40ng/ml，更优选8-30ng/ml，更优选9-20ng/ml，诸如约10ng/ml)IGF-1；及
(f)1-10ng/ml(优选1-9ng/ml，更优选2-8ng/ml，甚至更优选3-7ng/ml，最优选4-6ng/ml，甚至最优选约5ng/ml)TGFβ1；
(iv)在如步骤(iii)(a)-(f)中定义的无血清EHM培养基中，在机械拉伸下培养步骤(iii)中获得的混合物，由此形成生成力的EHM。
步骤(i)中的最少必需培养基可以选自Iscove’s培养基、αMEM、DMEM和RPMI。在一个优选的实施方案中，该基础培养基是Iscove’s培养基或αMEM。在一个更优选的实施方案中，该基础培养基是Iscove’s培养基。但是任何适宜的最少培养基都可以用于本方法。适宜的最少必需培养基配方由本文提供或者是可公开获得的，例如从ATCC目录。
优选地，步骤(i)的无血清补充剂还包含选自维生素A、D-半乳糖、亚油酸、亚麻酸、黄体酮和腐胺中的一个或多个组分。这些组分都有助于细胞的存活。各个组分的适宜浓度是技术人员已知的，或可以容易地使用常规手段确定。
对于步骤(i)的组分(b)中的所述无血清补充剂，可以采用市售的补充剂或减胰岛素补充剂。可替代地，也可以采用如表2所示的定制补充剂。在一个优选的实施方案中，补充剂或减胰岛素补充剂作为上述方法的步骤(i)的组分(b)，用量为2-6％(v/v)。更优选地，补充剂或减胰岛素补充剂作为上述方法的步骤(i)的组分(b)，用量为4％(v/v)。
此外，步骤(i)的所述重构混合物包含0.3-0.5mg胶原蛋白/1.5×106个心肌细胞和非肌细胞混合物。更优选地，步骤(i)的所述重构混合物包含约0.4mg胶原蛋白/1.5×106个心肌细胞和非肌细胞混合物。
步骤(i)的重构混合物的组分(c)中的所述胶原蛋白优选为医用级且选自Ⅰ型胶原蛋白、III型胶原蛋白，V型胶原蛋白及其混合物。在一个更优选的实施方案中，步骤(i)的重构混合物的组分(c)含有至少90％的所述胶原蛋白是I型胶原蛋白。但是，所述胶原蛋白还可以进一步包含选自弹力蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白(entactin)、巢蛋白(nidogen)、蛋白多糖和纤连蛋白的一个或多个细胞外基质组分。通常，胶原蛋白的确切组成取决于来源，即它来自哪里。胶原蛋白优选是人源的，但牛源或海洋生物源如藻源或鱼源也在考虑范围内。
开发功能性(即产生力的)、限定的、无血清人组织工程化心肌用于潜在的再生心脏治疗，需要克服很多困难。最重要的是人心脏细胞的可靠来源。迄今为止，人多能干细胞已经成为人心脏细胞的主要来源。多能干细胞能够分化为身体的每一类细胞。因此，人多能干细胞为获得真正的人心脏细胞提供了独一无二的机会。目前，最常用的多能干细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。人ESC系由Thomson和同事首先建立(Thomson等,Science 282:1145-1147(1998)；通过引用全文并入本文)。最近，人ESC研究实现了将体细胞再编程成为类ES细胞的新技术。该技术由Yamanaka和同事在2006年率先创立(Takahashi和Yamanaka Cell 126:663-676(2006)；通过引用全文并入本文)。产生的诱导多能细胞(iPSC)表现出和ESC非常相似的行为，并且重要的是，其也可以分化成身体的任何细胞。ESC和iPSC的心肌分化发生在胚状体(Schroeder等,Biotechnol Bioeng 92:920-933(2005)；通过引用全文并入本文)培养物中，作为或多或少随机事件，产生含有5-20％真正心肌细胞的细胞群(Kehat等,J Clin Invest 108:407-414(2001)；Mummery等,Circulation 107:2733-2740(2003)；Xu等,Cir Res 91:501-508(2002)；所有文献都通过引用并入本文)。此外，据报道，单性生殖干细胞可能也适合EHM产生(Didié等,J Clin Invest.doi:10.1172/JCI66584；通过引用全文并入本文)。因此，在一个优选的实施方案中，心肌细胞是人心肌细胞。优选地，所述心肌细胞来源于胚胎干细胞，其中细胞不是使用涉及修改人类生殖系遗传特性或者涉及为工业或商业目的使用人胚胎的过程产生的。在可替代的实施方案中，心肌细胞来源于如上面所描述的诱导多能细胞、单性生殖干细胞或成体干细胞。
最近，若干用于更有效心脏分化的无血清的、细胞因子导向的操作方案已有所描述(Burridge等,Cell Stem Cell 10:16-28(2012)；通过引用全文并入本文)，产生了含有高达98％心肌细胞的培养物(Lian等,Proc Natl Academic Sci USA(2012)；通过引用全文并入本文)。因此，在另一个优选的实施方案中，心肌细胞可以通过无血清分化获得。另一方面，心肌细胞也可来源于非人的灵长类动物干细胞、胚胎或新生儿心肌细胞。
已经证明，将心肌细胞以与选自非肌细胞的一类或多类细胞的细胞的混合物提供是有优势的，所述非肌细胞诸如成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和间充质干细胞。因此优选地，心肌细胞混合物包含20-80％心肌细胞，更优选30-70％心肌细胞，甚至更优选40-60％心肌细胞，最优选约50％心肌细胞，其中非肌细胞是成纤维细胞或内皮细胞。事实上，一个特别优选的实施方案是非肌细胞为成纤维细胞。适宜的非肌细胞可以通过表面标志物例如CD90的表达来鉴定。适宜的细胞可以通过例如使用诸如免疫染色或荧光激活细胞分选(FACS)的技术来识别。从上述混合物得到的EHM通常生成更强的力。
优选地，步骤(i)中提供的心肌细胞的细胞浓度为至少2.7-20×106个/ml。而在一个更优选的实施方案中，步骤(i)中提供的心肌细胞的细胞浓度为至少2.9-10×106个/ml，甚至更优选的细胞浓度为至少3.1-5×106个/ml，在一个最优选的实施方案中，细胞浓度为至少3.3-3.4×106个/ml。
所述方法中提及的模具可以具有允许EHM掺入有此需要的宿主中的任何合适的形式。然而，在一个优选的实施方案中，所述模具是环状、多角状、盘状或袋状的。
细胞培养采用本领域一般已知的常用程序和设备进行。通常，培养条件包括在30-40℃、优选为36-38℃、最优选为约37℃的范围中的温度，采用加湿细胞培养孵育箱在5-10％CO2存在下。
对于步骤(iii)的组分(b)中提及的无血清补充剂，可以使用市售的补充剂或减胰岛素补充剂。另外，也可以采用如下表2所示的定制补充剂。在一个优选的实施方案中，补充剂或减胰岛素补充剂作为上述方法的步骤(iii)的组分(b)，用量为2-6％(v/v)。更优选地，补充剂或减胰岛素补充剂作为上述方法的步骤(i)的组分(b)，用量为4％(v/v)。
另外，步骤(iii)的无血清补充剂还包含选自维生素A、D-半乳糖、左旋肉碱、亚油酸、亚麻酸、黄体酮和腐胺的一个或多个组分。如前所述，这些组分都有助于细胞的存活。各个组分的适宜浓度对技术人员是已知的，或可以容易地使用常规手段确定。
步骤(iii)中所述EHM培养基中包含的基础培养基可以选自Iscove’s培养基、αMEM、DMEM和RPMI。因为RPMI通常具有较低浓度的钙，因此可能有必要相应地向RPMI基础培养基补充钙。如果有必要，可以向基础培养基补充非必需氨基酸。如果αMEM作为基础培养基使用，则EHM培养基无需另行补充非必需氨基酸。非必需氨基酸可以作为组合补充剂商购获得。所述补充剂例如包含750mg/L甘氨酸、890mg/L L-丙氨酸、1320mg/L L-天冬酰胺、1330mg/L L-天冬氨酸、1470mg/L L-谷氨酸、1150mg/L L-脯氨酸和1050mg/L L-丝氨酸。
在一个优选的实施方案中，步骤(iii)中所述EHM培养基中包含的基础培养基是Iscove’s培养基或αMEM。在一个更优选的实施方案中，步骤(iii)中所述EHM培养基中包含的基础培养基是Iscove’s培养基。然而，任何基础培养基都可用于本方法。适宜的最少必需培养基配方由本文提供或者是可公开获得的，例如从ATCC目录。
下面的实施例证明，更有利的是，无血清EHM培养基还包含VEGF、FGF或VEGF和FGF两者。添加VEGF和/或FGF已被证明得到展现出更高的力的EHM。
通常情况下，以约5-20ng/ml VEGF、优选6-18ng/ml、更优选7-16ng/ml、甚至更优选8-14ng/ml、最优选9-12ng/ml的浓度，甚至最优选以约10ng/ml的浓度添加VEGF。
以约5-20ng/ml FGF、优选6-18ng/ml、更优选7-16ng/ml、甚至更优选8-14ng/ml、最优选9-12ng/ml的浓度，甚至最优选以约10ng/ml的浓度添加FGF。
原则上，可以使用任何类型的VEGF、FGF、IGF1和TGFβ1，只要这些生长因子能够经由它们在EHM的心肌细胞表面上的相应受体传导信号即可。然而，在一个优选的实施方案中，VEGF是人VEGF。在另一个优选的实施方案中，FGF是人FGF。在另一个优选的实施方案中，IGF1是人IGF1。还在另一个实施方案中，TGFβ1是人TGFβ1。在最优选的实施方案中，所有VEGF、FGF、IGF1和TGFβ1都是人的。
通常，步骤(iii)中的培养进行至少3天，优选进行约3到约7天。
原则上，步骤(iv)中的进一步培养可以进行任何合适的时间段。然而，通常情况下，步骤(iv)中的进一步培养进行至少3-60天、优选4-30天、更优选5-20天的时间段。在最优选的实施方案中，进一步培养进行7天，因为这个时间段是优选的短培养时间和足够得到生成力的EHM的时间段的最佳平衡。
通常，如本领域公知的，上述方法的步骤(iv)在拉伸装置上进行。优选地，拉伸装置对EHM施加静态、位相性或动态拉伸。更具体地，机械拉伸可以是对抗弹性载荷的(i)静态的，(ii)动态的，或(iii)柔性的。
正如下文将进一步证明地，如使用在Zimmermann等,Circ.Res.90,223-230(2002)中描述的方法测定地，通过上述方法产生的EHM在用3mM钙诱导后生成大于0.01mN的力，如使用在Zimmermann等,Circ.Res.90,223-230(2002)中描述的方法测定地，优选大于0.1mN、更优选大于0.2mN的力、最优选大于0.3mN的力。
另一个现有技术中适合作为本文公开的改进方法的基础的操作方案由Soong等,Curr Prot Cell Biol,55:23.8.1-23.8.21(2012)描述，在此通过引用全文并入本文，特别是引用“基本方案2”和“支持方案2”。
表1：用于人EHM产生的操作方案的比较
表2：替代B27的定制补充剂
用符合细胞培养要求的水配制25×
表3：无谷氨酰胺的Iscove’s基础培养基配方(Biochrom)
表4：RPMI基础培养基(Invitrogen)
表5：αMEM基础培养基配方(Invitrogen)
表6：用于EHM生成的无血清限定培养基
表7：另一种用于EHM生成的无血清限定培养基
通过如下实施方案对本发明作进一步描述：
1.一种用于产生工程化心肌(EHM)的方法，该方法包括下述步骤：
(i)在一个或多个模具中提供无血清重构混合物，所述重构混合物包含(a)无血清最少必需培养基；(b)无血清补充剂，得到0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml盐酸左旋肉碱、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)和0.2-2mg/ml胶原蛋白的终浓度；和(c)人心肌细胞和人非肌细胞的混合物，其中总细胞混合物的20％到80％是心肌细胞；其中重构混合物的pH为7.2到7.6；
(ii)在所述一个或多个模具中培养无血清重构混合物，由此使无血清重构混合物凝结至少15分钟；
(iii)在所述一个或多个模具中，在无血清EHM培养基中培养步骤(ii)中获得的混合物，直至所述混合物凝结到至少50％的其初始厚度，其中所述EHM培养基包含(a)含有0.5-3mmol/L Ca2+的基础培养基；(b)如(i)(b)中定义的无血清补充剂；(c)0.5-10mmol/LL-谷氨酰胺；(d)0.01-1.0mmol/L抗坏血酸；(e)1-100ng/ml IGF-1；及(f)1-10ng/ml TGFβ1；
(iv)在如步骤(iii)(a)-(f)中定义的无血清EHM培养基中，在机械拉伸下培养步骤(iii)中获得的混合物，由此形成生成力的EHM。
2.实施方案1所述的方法，其中步骤(i)中的所述最少必需培养基选自Iscove’s培养基、αMEM、DMEM和RPMI。
3.实施方案2所述的方法，其中所述基础培养基是Iscove’s培养基或αMEM。
4.实施方案2所述的方法，其中所述基础培养基是Iscove’s培养基。
5.实施方案1-4中任一个所述的方法，其中步骤(i)的无血清补充剂还包含选自维生素A、D-半乳糖、亚油酸、亚麻酸、黄体酮和腐胺的一个或多个组分。
6.实施方案1-5中任一个所述的方法，其中步骤(i)的组分(b)中的所述无血清补充剂是补充剂或减胰岛素补充剂。
7.实施方案6所述的方法，其中步骤(i)的组分(b)中的所述无血清补充剂是2-6％(v/v)补充剂或减胰岛素补充剂。
8.实施方案6所述的方法，其中步骤(i)的组分(b)中的所述无血清补充剂是4％(v/v)补充剂或减胰岛素补充剂。
9.实施方案1-8中任一个所述的方法，其中步骤(i)的所述重构混合物包含0.3-0.5mg胶原蛋白/1.5×106个心肌细胞和非肌细胞混合物。
10.实施方案9所述的方法，其中步骤(i)的所述重构混合物包含约0.4mg胶原蛋白/1.5×106个心肌细胞和非肌细胞混合物。
11.实施方案1-10中任一个所述的方法，其中在步骤(i)的重构混合物的组分(c)中，所述胶原蛋白选自I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白及其混合物。
12.实施方案1-11中任一个所述的方法，其中在步骤(i)的重构混合物的组分(c)中，至少90％的所述胶原蛋白是I型胶原蛋白。
13.实施方案1-12中任一个所述的方法，其中在步骤(i)的重构混合物的组分(c)中，所述胶原蛋白是医用级的。
14.实施方案1-13中任一个所述的方法，其中在步骤(i)的重构混合物的组分(c)中，所述胶原蛋白是人源的、牛源的或海洋生物源的。
15.实施方案1-14中任一个所述的方法，其中在步骤(i)的重构混合物的组分(c)中，所述胶原蛋白还包含选自弹力蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白(entactin)、巢蛋白(nidogen)、蛋白多糖和纤连蛋白的一个或多个细胞外基质组分。
16.实施方案1-15中任一个所述的方法，其中步骤(i)的重构混合物的pH为7到7.8。
17.实施方案13所述的方法，其中步骤(i)的重构混合物的pH为约7.4。
18.实施方案1-17中任一个所述的方法，其中所述心肌细胞为人心肌细胞。
19.实施方案1-18中任一个所述的方法，其中所述心肌细胞来源于胚胎干细胞，其中细胞不是使用涉及修改人类生殖系遗传特性或者为工业或商业目的使用人胚胎的过程产生的。
20.实施方案1-19中任一个所述的方法，其中所述心肌细胞来源于诱导多能细胞、单性生殖干细胞或成体干细胞。
21.实施方案1-20中任一个所述的方法，其中所述心肌细胞通过无血清分化获得。
22.实施方案1-21中任一个所述的方法，其中所述心肌细胞是非人的灵长类动物干细胞来源的、胚胎或新生儿心肌细胞。
23.实施方案1-22中任一个所述的方法，其中所述心肌细胞以与选自非肌细胞的一类或多类细胞的细胞的混合物提供，所述非肌细胞诸如成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和间充质干细胞。
24.实施方案23所述的方法，其中心肌细胞混合物包含20-80％心肌细胞。
25.实施方案23所述的方法，其中所述心肌细胞混合物包含30-70％心肌细胞。
26.实施方案23所述的方法，其中所述心肌细胞混合物包含40-60％心肌细胞。
27.实施方案23所述的方法，其中所述心肌细胞混合物包含50％心肌细胞。
28.实施方案1-27中任一个所述的方法，其中所述非肌细胞是成纤维细胞或内皮细胞。
29.实施方案1-28中任一个所述的方法，其中所述非肌细胞是成纤维细胞。
30.实施方案1-29中任一个所述的方法，其中所述非肌细胞表达CD90。
31.实施方案1-30中任一个所述的方法，其中步骤(i)中提供的心肌细胞的细胞浓度为至少2.7-20×106个/ml。
32.实施方案31所述的方法，其中步骤(i)中提供的心肌细胞的细胞浓度为至少2.9-10×106个/ml。
33.实施方案31所述的方法，其中步骤(i)中提供的心肌细胞的细胞浓度为至少3.1-5×106个/ml。
34.实施方案31所述的方法，其中步骤(i)中提供的心肌细胞的细胞浓度为至少3.3-3.4×106个/ml。
35.实施方案1-34中任一个所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述模具是环状、多角状、盘状或袋状。
36.实施方案1-35中任一个所述的方法，其中步骤(ii)中的培养进行0.25-3小时。
37.实施方案36所述的方法，其中步骤(ii)中的培养进行0.5-1.5小时。
38.实施方案1-37中任一个所述的方法，其中培养在30-40℃的温度范围下进行。
39.实施方案38所述的方法，其中培养在36-38℃的温度范围下进行。
40.实施方案39所述的方法，其中培养在约37℃下进行。
41.实施方案1-40中任一个所述的方法，其中培养在加湿细胞培养孵育箱中在5-10％CO2存在下进行。
42.实施方案1-41中任一个所述的方法，其中步骤(iii)的组分(b)中的无血清补充剂是补充剂或减胰岛素补充剂。
43.实施方案42所述的方法，其中步骤(iii)的组分(b)中的无血清补充剂是2-6％(v/v)补充剂或减胰岛素补充剂。
44.实施方案43所述的方法，其中步骤(iii)的组分(b)中的无血清补充剂是4％(v/v)补充剂或减胰岛素补充剂。
45.实施方案1-44中任一个所述的方法，其中步骤(iii)的所述无血清补充剂还包含选自维生素A、D-半乳糖、左旋肉碱、亚油酸、亚麻酸、黄体酮和腐胺的一个或多个组分。
46.实施方案1-45中任一个所述的方法，其中步骤(iii)中所述EHM培养基中包含的基础培养基选自Iscove’s培养基、αMEM、DMEM和RPMI。
47.实施方案46所述的方法，其中所述基础培养基是Iscove’s培养基或αMEM。
48.实施方案47所述的方法，其中所述基础培养基是Iscove’s培养基。
49.实施方案1-48中任一个所述的方法，其中所述无血清EHM培养基包含约20ng/ml IGF1。
50.实施方案1-49中任一个所述的方法，其中所述IGF1是人IGF1。
51.实施方案1-50中任一个所述的方法，其中所述无血清EHM培养基包含约5ng/mlTGFβ1。
52.实施方案1-51中任一个所述的方法，其中所述TGFβ1是人TGFβ1。
53.实施方案1-52中任一个所述的方法，其中所述无血清EHM培养基还包含VEGF、FGF或VEGF和FGF两者。
54.实施方案1-53中任一个所述的方法，其中所述VEGF是人VEGF。
55.实施方案1-54中任一个所述的方法，其中所述FGF是人FGF。
56.实施方案53所述的方法，其中所述无血清EHM培养基包含约5-20ng/ml VEGF。
57.实施方案56所述的方法，其中所述无血清EHM培养基包含约10ng/ml VEGF。
58.实施方案53所述的方法，其中所述无血清EHM培养基包含约5-20ng/ml FGF。
59.实施方案58所述的方法，其中所述无血清EHM培养基包含约10ng/ml FGF。
60.实施方案1-59中任一个所述的方法，其中步骤(iii)中的所述无血清EHM培养基另外还包含750mg/L甘氨酸、890mg/L L-丙氨酸、1320mg/L L-天冬酰胺、1330mg/L天冬氨酸、1470mg/L L-谷氨酸、1150mg/L L-脯氨酸和1050mg/L L-丝氨酸。
61.实施方案1-60中任一个所述的方法，其中步骤(iii)中的培养进行至少3天。
62.实施方案61所述的方法，其中步骤(iii)中的培养进行约3到约7天。
63.实施方案1-62中任一个所述的方法，其中步骤(iv)中的培养进行至少3-60天的时间段。
64.实施方案63所述的方法，其中所述进一步培养进行4-30天。
65.实施方案63所述的方法，其中所述进一步培养进行5-20天。
66.实施方案63所述的方法，其中所述进一步培养进行6-10天。
67.实施方案63所述的方法，其中所述进一步培养进行7天。
68.实施方案1-67中任一个所述的方法，其中步骤(iv)在拉伸装置上进行。
69.实施方案68所述的方法，其中所述拉伸装置施加静态、位相性或动态拉伸。
70.实施方案1-69中任一个所述的方法，其中如使用在Zimmermann等,Circ.Res.90,223-230(2002)中描述的方法测定地，所述EHM在用3mM钙诱导后生成大于0.01mN的力。
71.实施方案70所述的方法，其中如使用在Zimmermann等,Circ.Res.90,223-230(2002)中描述的方法测定地，所述EHM在用3mM钙诱导后生成大于0.1mN的力。
72.实施方案70所述的方法，其中如使用在Zimmermann等,Circ.Res.90,223-230(2002)中描述的方法测定地，所述EHM在用3mM钙诱导后生成大于0.2mN的力。
73.实施方案70所述的方法，其中如使用在Zimmermann等,Circ.Res.90,223-230(2002)中描述的方法测定地，所述EHM在用3mM钙诱导后生成大于0.3mN的力。
附图说明
图1.hEHM形成。培养10天后的hEHM(在铸塑模具中培养3天，接着在定制垫片上培养7天；培养时间：3+7天)；比例尺：1mm(。
图2.hEHM收缩功能的表征。(A)用提高cAMP的化合物刺激后的变时性反应(Iso：β-肾上腺素能刺激；IBMX：磷酸二酯酶抑制，n＝6/组)。(B)hEHM对浓度渐增的细胞外钙的变力反应，比较hES2(n＝12)、hES3(n＝12)和iPS I2(n＝3)。(C)hEHM(hES2)对异丙肾上腺素(三角形)和氨甲酰胆碱(方块)刺激的变力反应。插图：低钙(最下方的曲线)、用异丙肾上腺素刺激(最上方的曲线)和氨甲酰胆碱刺激(中间的曲线)下的标准化收缩(twitch)。(D)在异丙肾上腺素(三角形)和氨甲酰胆碱(方块)刺激下hEHM的弛豫。插图：标准化收缩*P＜0.05相对于基线值(A：配对双尾Student’s t检验；C、D：ANOVA之后进行Dunnet’s post hoc校验)。
图3.非肌细胞对于EHM形成的重要性。(A)标准化力与由hES2系(圆：单层心肌分化操作方案(Hudson等,Stem Cell Dev 21:1513-1523(2012))，方块：EB心肌分化操作方案(Yang等,Nature 453:524-528(2008)))和iPS BJ系(三角形)生成的EHM的心肌细胞百分比(辅肌动蛋白+细胞)的比较。(B)用100％心肌细胞(CM 100％)和70％心肌细胞与30％心肌成纤维细胞的混合物(CM/CF 70/30％)生成的hEHM的收缩力，n＝1。
图4.符合GMP要求的水凝胶基质。(A)在2mmol/L的细胞外钙浓度下，用大鼠胶原蛋白(0.4mg/EHM，n＝12)或牛胶原蛋白(0.4mg/EHM，n＝14)制备的hEHM的收缩力。(B)在2mmol/L细胞外钙下，用“初始操作方案“(大鼠胶原蛋白，n＝12)和“基质操作方案”(牛胶原蛋白，无n＝9)制备的hEHM的收缩力。请参见表1。(C)在2mmol/L细胞外钙下，仅用牛胶原蛋白(bov.)、牛胶原蛋白加Matrigel(10％v/v)、牛胶原蛋白加纤连蛋白(5μg/EHM)和牛胶原蛋白加纤连蛋白(5μg/EHM)加层粘连蛋白(5μg/EHM)制备的hEHM的收缩力，n＝4/组。
图5.相对于含20％血清的Iscove，基础培养基和无血清生长补充剂筛选。(A)F.l.t.r.：与含血清EHM培养基(还参见表1)相比较，基于Iscove’s、RPMI和αMEM基础培养基(还参见表2-4)的无血清培养基的细胞死亡、心肌细胞百分比(CM百分比)、心肌细胞平均辅肌动蛋白荧光(CM成熟)、基于侧向散射面积的心肌细胞尺寸(CM尺寸)和基于侧向散射面积的非肌细胞尺寸(NM尺寸)的变化。
(B)F.l.t.r.：与含血清EHM培养基(还参见表1)相比较，具有2％和4％的加胰岛素B27(B27+)和减胰岛素B27(B27-)的无血清培养基的细胞死亡、心肌细胞百分比(CM百分比)、心肌细胞平均辅肌动蛋白荧光(CM成熟)、基于侧向散射面积的心肌细胞尺寸(CM尺寸)和基于侧向散射面积的非肌细胞尺寸(NM尺寸)的变化。
图6.肽生长因子和脂肪酸补充剂的筛选。(A)为无血清、限定EHM培养基考虑的因子。F.l.t.r.：与不具有因子的无血清培养基相比较，通过所示生长因子和脂肪酸补充剂的细胞死亡、心肌细胞百分比(CM百分比)、心肌细胞平均辅肌动蛋白荧光(CM成熟)、基于侧向散射面积的心肌细胞尺寸(CM尺寸)和基于侧向散射面积的非肌细胞尺寸(NM尺寸)的变化。(b)不为无血清、限定EHM培养基考虑的因子。F.l.t.r.：与不具有因子的无血清培养基相比较，通过所示生长因子和脂肪酸补充剂的细胞死亡、心肌细胞百分比(CM百分比)、心肌细胞平均辅肌动蛋白荧光(CM成熟)、基于侧向散射面积的心肌细胞尺寸(CM尺寸)和基于侧向散射面积的非肌细胞尺寸(NM尺寸)的变化。
图7.从hESC细胞的无血清、限定EHM生成。(A)在浓度渐增的细胞外钙情况下的hEHM(hES2)的收缩力，比较含血清培养基(Serum)、基于Iscove’s的无血清培养基(SF-IMDM，还参见表5)、基于aMEM的无血清培养基(SF-aMEM，还参见表6)和基于RPMI的无血清培养基(SF-RPMI)。对于钙的相应EC50，对于Serum、SF-IMDM、SF-aMEM、SF-RPMI，n＝15/5/6/7，n.d.为未测定。(B)无血清hEHM的免疫染色，表现出典型的心肌特性(肌束)。用抗α肌节辅肌动蛋白的抗体进行免疫染色，用DAPI进行细胞核染色。(C)含血清EHM(Serum)、基于Iscove’s的无血清EHM(SF-IMDM)和基于aMEM的无血清EHM(SF-aMEM)的、在用1μM异丙肾上腺素的肾上腺素能刺激后力的变化百分比，n＝15/5/6，*p＜0.05。(D)含血清EHM(Serum)、基于Iscove’s的无血清EHM(SF-IMDM)和基于aMEM的无血清EHM(SF-aMEM)的、在用10μM氨甲酰胆碱的毒蕈碱刺激后力的变化百分比，n＝15/5/6。比例尺：20μm
图8.钙对无血清人工程化心肌收缩力的影响。A)在浓度渐增的细胞外钙情况下的hEHM(hES2)的收缩力，比较RPMI培养基(～0.4mM钙，n＝2)与加入0.8mM CaCl的RPMI培养基(最终游离钙浓度～1.2mM钙，n＝2)，B)在RPMI培养基或RPMI+钙培养基中培养的无血清hEHM对1μM异丙肾上腺素的反应。
图9.TGFb1对hEHM力的影响。(A)在浓度渐增的细胞外钙情况下hEHM(iPS BJ)的收缩力，比较无血清培养基(SF)和含5ng/ml TGFβ1的无血清培养基，hEHM来自培养第0-3天(n＝4/组，*p＜0.05)。(B)比较在含TGFb1处理的无血清培养基中来自培养0-3(SF+TGHb1第0-3天)和培养第0-10天(SF+TGHb1第0-10天，n＝5/组)的人EHM(hES2)的收缩力。
图10.FGF和VEGF对hEHM力的影响。在浓度渐增的细胞外钙情况下hEHM(hES2)的收缩力，比较无血清培养基(SF，n＝3)、含10ng/ml FGF-2的无血清培养基(SF+FGF，n＝3)和含10ng/ml VEGF的无血清培养基(SF+VEGF，n＝3)，*p＜0.05，SF+FGF相对于SF。
图11.B27补充剂浓度对hEHM力的影响。在浓度渐增的细胞外钙情况下hEHM(hES2)的收缩力，比较含血清培养基(Serum)、含2％B27的无血清培养基(SF-2％B27)和含4％B27的无血清培养基(SF-4％B27)，n＝17/9/11，*p＜0.05，相对于2％B27。
图12.B27组成对hEHM力的影响。在浓度渐增的细胞外钙情况下hEHM(hES2)的收缩力，比较含血清培养基(n＝9)、含完全B27的无血清培养基(n＝5)、含减抗氧化剂B27的无血清培养基(n＝5)和含减胰岛素B27的无血清培养基(n＝5)。
图13.在来自hES和iPS细胞的hEHM，用定制补充剂替代B27。(A)在浓度渐增的细胞外钙情况下hEHM(hES2)的收缩力，比较含血清培养基(n＝3)、含减胰岛素B27的无血清培养基(B27-胰岛素，n＝5)和含定制补充剂的无血清培养基(CMS；n＝3)。(B)在浓度渐增的细胞外钙情况下来自iPS细胞(BJ)的hEHM的收缩力，比较含血清培养基(n＝8)、含减胰岛素B27的无血清培养基(n＝8)和含定制补充剂的无血清培养基(CMS；n＝4)。
图14.在延长培养时间情况下无血清hEHM的成熟。(A)在无血清条件下(n＝4-6/条件)培养的2周(下方的曲线)、4周(中间的曲线)和8周(上方的曲线)时间点，hEHM(hiPS-G1)的收缩力。(B)来自8周龄的无血清EHM的个别心肌细胞的明场像。比例尺：20μM。
以下的实施例用于进一步说明，而非限制本发明。这些实施例包括多个技术特征，应当理解本发明也涉及在本举例说明章节中出现的技术特征的组合。
实施例
材料
本文用到的材料都是市售的。例如，DMEM、RPMI、αMEM(目录编号32561-029)、链霉素、青霉素和B27可获自Invitrogen；医用级牛胶原蛋白购自Devros Medical；脂肪酸补充剂可以从Sigma订购(目录编号F7050)；各种生长因子则可购自Peprotech(FGF2，AF-1ββ-18B；IGF-1，AF-100-11；TGFβ1，100-21)。
方法
人ESC和iPS-系及培养
在本研究中(Robert-Koch研究院批准W.-H.Z.：批准号#12；引用编号：1710-79-1-4-16)，本发明人利用了H9.2(Technion，海法，以色列)、hES3(国际胚胎干细胞公司(Embryonic Stem Cell International)，新加坡)和转基因hES3-ENVY(Costa,M.等,NatMethods 2:259-260(2005))以及hES2系(McEwen再生医学中心(McEwen Centre forRegenrative Medicine)，多伦多，加拿大；Yang等,Nature 453：2:5-528:(2008))。分化的EB在室温下运输至汉堡/哥廷根，并在72-96小时内送达。iPS系来自多伦多(iPS BJ)和哥廷根(iPS I2，Streckfuss-Bomeke等,Eur Heart J(2012)doi:10.1093/eurheartj/ehs203和iPS Sendai)。
如在别处(Kehat等,J Clin Invest 108:407-414(2001)；Mummery等,Circulation 107:2733-2740(2003)；Xu等,Circ Res 91:501-508(2002)；Yang等,Nature453:524-528(2008)；Passier等,Stem Cells 23:772-780(2005)；每一篇都通过引用并入本位)描述地，EB用胶原酶B(1mg/ml；H9.2)，胶原酶I(2mg/ml)和/或胰蛋白酶/EDTA(0.25％/1mmol/l；hES3、hES3-ENVY、hES2、iPS NJ、iPS I2)消化。原肌球蛋白和肌节辅肌动蛋白染色后，对酶解分散细胞的代表性等分试样中的心肌细胞进行计数。
基础人工程化心肌(hEHM)的构建
本发明人采用一种改进的EHM-工程化操作方案(Zimmermann等,Circ Res 90:223-230(2002)，通过引用并入本文)来构建hEHM。简要地说，通过将包含新鲜分散的ESC衍生物(1×104-15×106个细胞，在含20％胎牛血清、1％非必需氨基酸、2mmol/l谷氨酰胺、100μmol/lβ-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Iscove-培养基中)、pH中和的源于大鼠尾的I型胶原蛋白(0.4mg/EHM)、MatrigelTM(10％v/v；Becton Dickenson或tebu)和浓缩的含血清培养基(2×DMEM，20％马血清，4％鸡胚提取物，200U/ml青霉素和200mg/ml链霉素)的混合物移取至环形模具(内径/外径：2/4mm；高：5mm)(表1)中来制备EHM(重构体积：450μl)。hEHM在铸塑模具内快速凝结，并在培养第3天转移到静态拉伸装置(110％悬长)上(Zimmermann等,Nat Med 12:452-458(2006)，通过引用并入本文)。每隔一天更换培养基。hEHM培养在拉伸下进行7天。
另一个现有技术中适合作为本文公开的改进方法的基础的操作方案由Soong等,Curr Prot Cell Biol.23.8.1-23.8.21(2012)描述，其通过引用全文并入本文，特别参考“基本操作方案2”和“支持操作方案2”。
异种基质组分的去除和替换
为了符合拟GMP(pre-GMP)条件的hEHM，建立了一种减少了异种组分的操作方案(基质方案，表1)。细胞在pH中和的牛胶原蛋白(Devros Medical，0.4mg/EHM)、浓缩含血清培养基(2×DMEM，40％胎牛血清，200U/ml青霉素和200mg/ml链霉素)的混合物中重构，并在含20％胎牛血清、1％非必需氨基酸、2mmol/l谷氨酰胺、0.3mmol/l抗坏血酸、100μmol/lβ-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/mL链霉素的Iscove-培养基中培养。
异种培养基组分的去除和替换
为了生成完全限定的无血清EHM，细胞在pH中和的牛胶原蛋白(Devros Medcial，0.4mg/EHM)、浓缩无血清培养基(2×DMEM，8％B27，200U/ml青霉素和200mg/ml链霉素)的混合物中重构，并在含4％完全B27、1％非必需氨基酸、2mmol/l谷氨酰胺、0.3mmol/l抗坏血酸、20ng/ml IGF-1、10ng/ml FGF2、10ng/ml VEGF、5ng/ml TGFb1(仅培养的第0-3天)和100U/ml青霉素、和100μg/ml链霉素的Iscove-培养基(无血清操作方案，表1)中培养。B27补充剂含有维生素(生物素，DL α生育酚，醋酸酯DL α-生育酚，维生素A)、蛋白质和酶(BSA，游离脂肪酸组分V，过氧化氢酶，人重组胰岛素，人转铁蛋白，超氧化物歧化酶)以及其他细胞支持组分(皮质酮，D-半乳糖，乙醇胺，谷胱甘肽(还原型)，左旋肉碱，亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、亚硒酸钠和T3(三碘-I-甲状腺原氨酸))。如所示，将完全B27(Invitrogen，A1486701)与无抗氧化剂B27(Invitrogen，#10889038)和无胰岛素B27(Invitrogen，#0050129SA)进行了比较。B27补充剂被由白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠、盐酸左旋肉碱、氢化可的松、脂肪酸补充剂和三碘-L-甲状腺原氨酸组成的定制补充剂替换(表2)。
收缩功能分析
如前所述，本发明人分析了在等长条件下的收缩力和收缩动力学(收缩时间：从50％到最大收缩的时间；弛豫时间：从最大收缩到50％弛豫的时间)(Zimmermann等,CircRes 90:223-230(2002)；通过引入并入本文)。将EHM从孵育箱中移出后立刻通过光学显微术评价收缩频率(未经刺激的自发收缩)。
流式细胞术
如上文描述地，将在不同培养基条件下培养的EB制成单细胞悬液。在持续搅拌下将细胞固定在70％冰冻乙醇中。对细胞进行肌节附肌动蛋白(Sigma)染色以标记心肌细胞，以及DAPI染色以分析细胞核DNA含量和排除细胞双重态。细胞在LSRII流式细胞仪(BD)上运行。分析了至少10,000个活细胞。然后分析了以下参数，(1)细胞死亡(凋亡细胞在sub-G1级分中的百分比)，(2)心肌细胞和非肌细胞百分比(分别为辅肌动蛋白阳性和阴性细胞)，(3)心肌细胞成熟(平均辅肌动蛋白荧光)，(4)心肌细胞尺寸和(5)非肌细胞尺寸(基于侧向散射面积，SSC-A)。
形态分析
如之前描述地(Zimmermann等,Circ Res 90:223-230(2002)，通过引用并入本文)，将hEHM分别固定在中性4％缓冲甲醛/1％甲醇，pH 7.4中，用于共聚焦激光扫描显微术(CLSM；Zeiss 510 Meta LSM系统或Zeiss 710 LSM)。为了进行CLSM，本发明人制备了振动切片(100μm；Leica VT1000 S)并用抗α-肌节辅肌动蛋白的抗体对其进行免疫荧光标记(Sigma克隆EA-53，1:800；用适宜的二次抗体)。细胞核用DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；1μg/ml)染色。
统计分析
数据以平均值±平均值的标准差形式呈现。利用成对和非成对双尾Student’s t检验或ANOVA之后进行Dunnet’s post hoc校验来确定统计学差异。P值＜0.05则被认为是统计显著的。
结果
人工程化心肌(hEHM)的生成
EB-在海法(H9.2；)，新加坡(hES3和hES3-ENVY；Costa等,Nat Methods 2:259-260(2005))和多伦多(hHES2；iPS)制备，在室温下在充满培养基的密封容器内用快递送到汉堡/哥廷根。确保在72-96小时内送抵。运抵后，EB转移到新鲜培养基中并复苏24-48小时。在这段时间内，EB恢复自发收缩活动。EB是酶解分散的EB，得到的单细胞悬液分配用于hEHM生成或者细胞组织学。最初的一系列实验摸索每块hEHM必需的细胞数量(1×104-15×106细胞)和不同ESC-系(H9.2，hES2，hES3，hES3-ENVY)和iPS系(I2，BJ，Sendai)对于hEHM构建的效用(n＝67)。在hEHM铸塑的48小时内，在全部培养物红均可观察到不同大小的区域的自发性搏动。但是，仅使用1.25-15×106个细胞/EHM时形成生成力的hEHM(图1)。基于EHM的尺寸，可以容易地调节细胞密度。
hEHM的器官型功能
hEHM在培养中稳定且有节率地收缩至少3周(37℃下，0.8±0.05Hz；n＝14)。本发明人在10天内进行了详尽的功能表征。与异丙肾上腺素孵育使自发性搏动频率增加到1.2±0.1Hz(n＝6；P＜0.01，图2A)。加用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX；100μmol/l)抑制磷酸二酯酶，引起自发性搏动率进一步提高到1.6±0.1Hz(n＝6；P＜0.001，图2A)。在2.4mmol/l钙下，hEHM发生最大的平均收缩力为130±13μN(EC50：0.8±0.04mmol/l，n＝17；图2B)。在亚-EC50细胞外钙(0.4mmol/l)下，用1μmol/l异丙肾上腺素的β-肾上腺素能刺激使收缩力增加47±12％(n＝12；图2C)，弛豫缩短至113±2.3ms(n＝12；图2D)。
非肌细胞在EHM形成中的重要性
本实验采用的所有ESC-系和IPS系看起来都适用于hEHM生成。为了测试哪种心肌细胞含量对于生成力的组织是最佳的，本发明人绘制了产生的力相对于心肌细胞百分比的图。有趣的是，得到了钟形分布，其中在心肌细胞百分比为40-80％时产生出最大的力(图3A)。
上述发现提示非肌细胞对于恰当的组织形成起重要作用。为加以研究，本发明人用通过表面标记物CD172a(SIRPα)纯化的人心肌细胞进行了实验(Dubois等,NatBiotechnol 29:1011-1018(2011))。从纯化的心肌细胞生成的EHM没有形成生成力的组织(图3B)。然而，补充30％人心脏成纤维细胞产出了有良好力产生的更刚性的组织。这些结果强调非肌细胞对心肌组织形成至关重要，同时这些细胞也需要在无血清条件下得到支持。
用符合GMP要求的基质生成hEHM
基于本发明人已经在新生大鼠心脏细胞模型上建立起来的操作方案，本发明人初步构建了hEHM(Zimmermann等,Biotechnol Bioeng 68:106-114(2000))。该操作方案包括若干不符合体内“治疗应用”要求的非人组分(包括大鼠胶原蛋白、Matrigel、马血清、胎牛血清和鸡胚提取物)。为了解决这个问题，首先进行了一系列的实验来直接测试是否能减少hEHM-基质的非人组分。大鼠胶原蛋白被医用级(GMP)牛胶原蛋白替代而不损失性能(图4A)。同样，马血清和鸡胚提取物都能剔除而不对hEHM的形成和功能造成负面影响(“基质操作方案”，图4B，表1)。用其他细胞外基质蛋白诸如作为的主要组分之一的纤连蛋白和层粘连蛋白来补充牛胶原蛋白，没有产生额外的益处(图4C)。
支持hEHM形成的无血清培养基的限定
为了进一步限定人EHM培养并使其符合GMP要求，本发明人寻求用化学限定的补充剂替代所有非限定的血清组分。本发明人提出了一种基于三维人拟胚体(EB)培养的简化筛选算法来筛选这些补充剂。在无血清条件下培养了用于该筛选的ESC(Yang等,Nature 453:524-528(2008)；Kattman等,Cell Stem Cell 8:228-240(2011))。筛选的参照是我们的含血清EHM培养基(表1)：(1)Iscove’s，(2)2mmol/L谷氨酰胺，(3)20％FBS，(4)1％非必需氨基酸，(5)0.3mmol/L抗坏血酸，(6)100μmol/lβ-巯基乙醇，(7)100U/ml青霉素/100mg/ml链霉素。作为基础培养基和补充剂的有利或不利作用的读出结果，建立了一个基于流式细胞术的操作方案(Tiburcy等,Circ Res109:1105-1114(2011)；通过引用并入本文)，用于测定(1)细胞死亡(基于亚-G1 DNA含量)，(2)心肌细胞含量(基于脯肌动蛋白的表达)，(3)心肌细胞成熟(基于每个心肌细胞的脯肌动蛋白平均荧光)，(4)心肌细胞尺寸，和(5)非肌细胞尺寸(基于侧向散射面积)。
本发明人首先筛选了三种含和不含B27补充的基础培养基配方(Iscove’s，RPMI，αMEM：表3-5)。B27已经被几个研究小组用于人ESC和iPSC的分化(Burridge等,Cell StemCell 10:16-28(2012))。筛选显示B27对拟胚体(EB)的形成是必不可少的，与受试的基础培养基无关。Iscove’s和RPMI显示出可比较的结果，而aMEM看起来会导致稍高的细胞死亡。另一方面，αMEM对于心肌脯肌动蛋白表达是卓越的(图5A)。
基于在RPMI基础培养基中培养的EHM表现不太理想的初步发现(图7)，本发明人继续用Iscove’s或aMEM作为基础培养基进行筛选。本发明人接下来仔细审视了含和不含胰岛素情况下B27在其标准配方中的效用。与无胰岛素B27和较低B27(2％)补充浓度比较，含胰岛素的4％B27补充(最终浓度10μg/ml)示出了最低的细胞死亡以及可能对非肌细胞更大的支持(心肌细胞百分比降低，提示转向更多非肌细胞)(图5B)。然后，本发明人筛选了6种在EC50浓度以上的肽生长因子和脂肪酸补充剂的效用。PDGF-BB、CT-1和神经调节蛋白-1造成大量的细胞死亡，而IGF-1看起来保护免于细胞死亡(图6A、B)。TGFβ1、VEGF和脂肪酸补充剂增强个别心肌细胞的脯肌动蛋白表达。FGF-2支持非肌细胞生长，并增加心肌细胞尺寸(图6A)。TGFβ2不具有有益效果(图6B)。所有测试的化合物或它们的组合均涉及心脏发育和EHM生成(Naito等,Ciirculation 114:I72-78(2006)；Shimojo等,Am J Physiol Heart CircPhysiol 293:H474-481(2007)；Vantleret等,J Mol Cell Cardiol 48:1316-1323(2010)；Odiete等,Circ Res 111:1376-1385(2012)；Wollert和Chien J Mol Med(Berl)75:492-501(1997)；Price等,Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 272:424-433(2003)；Molin等,Dev Dyn 227:431-444(2003)；Corda等,Circ Res 81:679-687(1997)；Lopaschuk和Jaswal J Cardiovasc Pharmacol 56:130-140；其全部通过引用并入本文)。
EHM的发育以两个阶段为特征。最初出现的是“凝结阶段”，在这阶段，分离的细胞在基质中“定居”，重构自己和基质，也可能伴随大量的细胞死亡。此阶段受非肌细胞的影响很大。第二个阶段是在机械载荷下的组织成熟。这一阶段的特征是肥厚性生长和心肌细胞成熟，定位，力发展渐增，和基质稳定(Tiburcy等,Circ Res 109:1105-1114(2011))。
本发明人推断，根据阶段，可能要求不同的培养基条件。为了防止细胞在凝结阶段死亡，本发明人选择中性的、甚或减少初始筛选中细胞死亡的培养基组分的组合。即Iscove’s基础培养基、4％B27和IGF-1。同时，通过非肌细胞的基质重构和凝结得到了增加非肌细胞的数目和/或尺寸的因子(IGF-1、TGF-β1、FGF-2，在第一阶段)的支持。添加VEGF以支持心肌细胞的成熟(表5)。然后测试了该培养基支持生成力的EHM形成的能力。无血清的EHM以113±12bpm的自发性博动频率连续搏动，n＝7。含血清的EHM跳动得明显更快(199±8bpm，n＝8)。本发明人发现了与含血清对照组相比较类似的最大力发生和钙敏感度(图7A)。Iscove’s和αMEM基础培养基都支持EHM的形成，两者收缩力结果具有可比性。RPMI不支持生成力的组织(图7A，表5、6)。从形态上看，无血清EHM包含具有各向异性排列的心肌细胞的良好发育的肌肉束(图7B)。重要的是，无血清EHM对肾上腺素能和毒蕈碱刺激产生了如对心肌所预期的反应。事实上，αMEM EHM的反应明显优于含血清对照组。(图7C、D)
发明人推测，RPMI培养基表现不佳是由于RPMI培养基的游离钙浓度(0.424mmol/L，表4)低于生理浓度。为了验证该推测是否正确，本发明人另外进行了一个实验，将RPMI培养基与添加0.8mM CaCl的RPMI培养基(最终游离钙浓度为1.242mmol/L)进行了比较。虽然在RPMI情况下的EHM几乎不收缩，但是补充钙却得到可测量的最大力，及对异丙肾上腺素更好的反应性(图8)。事实上，在经补充的RPMI情况下最大力产生与IMDM或αMEM培养基是可比较的(图7A)，表明～1–2mmol/L钙的范围对恰当组织功能是必需的。
为了验证初始筛选结果，本发明人还测试了关键因子对功能性EHM形成的影响。从第0天至第3天添加TGFβ1是必要的，但延长的TGFβ1处理没有带来额外的益处(图9A、B)。FGF和VEGF都能够增加力生成，确证两者对组织形成有重要贡献(图10)。
B27添加剂浓度提高到4％要优于2％B27(图11)。为了测试B27的哪些组分对EHM功能是至关重要的，本发明人首先对市售的不同B27制剂进行了实验。本发明人将完全B27与减胰岛素B27、和减抗氧化剂B27进行了比较。减抗氧化剂B27与完全B27表现相当，提示抗氧化剂是非必需的。令人惊讶的是，减胰岛素B27的表现优于完全B27，提示补充胰岛素也不是必需的(图12)。
基于这些结果，本发明人开发出了一个替代B27的定制血清补充剂(表7)。当本发明人将该定制血清补充剂针对含血清培养基和含减胰岛素B27的无血清培养基进行测试时，本发明人发现最大力产生具有可比性，提示B27可以从无血清EHM培养中省去，并且都被定制血清补充剂替代(图13A)。这些发现得到了来自iPSC的hEHM的证实，其表明了用于从不同多能干细胞源生成限定工程化心肌的效用。(图13B)。
为了探究无血清hEHM是否支持心肌细胞的长期培养和成熟，本发明人在培养的第2周、第4周和第8周测试了来自hIPS-G1的无血清hEHM的力产生。本发明人观察到力产生的强劲提高(图14A)和个别hEHM来源的心肌细胞的具有规律横纹的棒状形态，这指示在无血清条件下良好高度成熟。
结论
本研究首次表明，分化的、生成力的人心脏肌肉可以在体外在完全限定的、无血清条件下生成。该操作方案适用于胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPS)来源的心脏肌肉。
这是一个重大突破，不仅使未来能够进行体外研究，以诸如探讨成熟和肥大且不再受血清因素的混淆干扰，而且使在GMP要求下的体内应用和治疗方法的潜力成为可能。
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Claims (14)

1.一种用于产生工程化心肌(EHM)的方法，所述方法包括下述步骤：
(i)在一个或多个模具中提供无血清重构混合物，所述重构混合物包含(a)无血清最少必需培养基；(b)无血清补充剂，得到0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml盐酸左旋肉碱、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)和0.2-2mg/ml胶原蛋白的终浓度；和(c)人心肌细胞和人非肌细胞的混合物，其中总细胞混合物的20％到80％是人心肌细胞；
其中所述心肌细胞不是使用涉及修改人类生殖系遗传特性或者涉及为工业或商业目的使用人胚胎的过程产生的；
其中所述重构混合物的pH为7.2到7.6；
(ii)在所述一个或多个模具中培养所述无血清重构混合物，由此使所述无血清重构混合物凝结至少15分钟；
(iii)在所述一个或多个模具中，在无血清EHM培养基中培养步骤(ii)中获得的混合物，直至所述混合物凝结到至少50％的其初始厚度，其中所述EHM培养基包含(a)含有0.5-3mmol/L Ca2+的基础培养基；(b)如步骤(i)(b)中定义的无血清补充剂；(c)0.5-10mmol/LL-谷氨酰胺；(d)0.01-1.0mmol/L抗坏血酸；(e)1-100ng/ml IGF-1；及(f)1-10ng/ml TGFβ1；
(iv)在如步骤(iii)(a)-(f)中定义的无血清EHM培养基中，在机械拉伸下培养步骤(iii)中获得的混合物，由此形成生成力的EHM。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)中的所述最少必需培养基选自Iscove’s培养基、αMEM、DMEM和RPMI。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)和/或步骤(iii)的所述无血清补充剂还包含选自维生素A、D-半乳糖、亚油酸、亚麻酸、黄体酮和腐胺的一个或多个组分。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的组分(b)和/或步骤(iii)的组分(b)中的所述无血清补充剂是补充剂或减胰岛素补充剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述重构混合物包含0.3-0.5mg胶原蛋白/1.5×106个心肌细胞和非肌细胞混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)的所述重构混合物的组分(c)中，所述胶原蛋白是医用级的且选自I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白及其混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(i)的所述重构混合物的pH为7.4。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述心肌细胞为人心肌细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述人非肌细胞为成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞或间充质干细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中的培养进行0.25-3小时。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述无血清EHM培养基包含(i)20ng/ml人IGF1；(ii)5ng/ml人TGFβ1；和/或(iii)5-20ng/ml人VEGF和/或5-20ng/ml人FGF。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)中的所述无血清EHM培养基另外包含750mg/L甘氨酸、890mg/L L-丙氨酸、1320mg/L L-天冬酰胺、1330mg/L天冬氨酸、1470mg/LL-谷氨酸、1150mg/L L-脯氨酸和1050mg/L L-丝氨酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)中的培养进行至少3天。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(iv)中的培养进行至少3-60天的时间段；
其中步骤(iv)在拉伸装置上进行。
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