CN112955542A

CN112955542A - 非免疫原性工程化组织及其生产方法和用途

Info

Publication number: CN112955542A
Application number: CN201980059824.7A
Authority: CN
Inventors: L·杰罗姆罗
Original assignee: L Jieluomuluo
Current assignee: L Jieluomuluo
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2021-06-11
Also published as: WO2020012033A1; CA3105897A1; SG11202100319XA; JP2021534813A; US20210284965A1; EP3820993A1; AU2019301894A1

Abstract

本发明提供了一种从多能干细胞或多能干细胞衍生物生产非免疫原性(生物)工程化组织的方法，所述各种细胞缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中该方法包括在也允许形成工程化组织的条件下诱导多能干细胞分化为对于工程化组织的功能所必需的细胞类型，由此使工程化组织对工程化组织的受体是非免疫原性的。本发明还涉及工程化组织，包含所述工程化组织的药物组合物，使用所述工程化组织的医学治疗和所述工程化组织的用途。

Description

非免疫原性工程化组织及其生产方法和用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年7月13日提交的欧洲专利申请No.18183294.0的优先权权益，其内容在此全文引入作为参考用于所有目的。

技术领域

本发明提供了一种从多能干细胞生产非免疫原性工程化组织的方法，所述多能干细胞缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中所述方法包括在对于工程化组织的功能所必需的至少一种细胞类型的存在下，在允许形成所述工程化组织的条件下，形成所述工程化组织，其中所述至少一种细胞类型已通过在也允许形成所述工程化组织的条件下诱导多能干细胞分化为所述对于工程化组织的功能所必需的至少一种细胞类型而获得，由此使所述工程化组织对该工程化组织的受体是非免疫原性的。本发明还涉及一种工程化组织，一种包含所述工程化组织的药物组合物，使用所述工程化组织的治疗方法和所述工程化组织的用途。

背景技术

缺少合适的器官或组织来代换失能的器官或组织仍是现代医学中的主要问题，特别是考虑到器官捐献的供应不足以满足医疗需要而且无法适当地计划。

一种解决的方法是使多能干细胞、特别是功能组织中的人多能干细胞(hPSC)工程化。最近，该领域已经呈现出了多种非常有希望的结果。例如，国际专利申请WO2015/025030描述了用于生产工程化心肌的方法，而国际专利申请WO2015/040142描述了对心脏组织的改进的分化方案。Rao等人通过Pax7在从hPSCs分化的轴旁中胚层细胞中的瞬时过表达，得到诱导的肌原祖细胞(iMPC)(Rao等人,“Engineering human pluripotent stem cellsinto functional skeletal muscle tissue”，Nature Communications,(2018)9:126)。Rao等人报道，在2D培养中，iMPCs容易分化为自发收缩的多核肌管和内源性表达Pax7的卫星样细胞池(pool)。Lancaster和Knobilich的综述特别描述了来源于肠、肾、脑和视网膜组织的人PSCs的类器官(干细胞衍生的三维培养物)(Lancaster和Knobilich,“Organogenesis in a dish:Modeling development and disease using organoidtechnologies”,Science 345,1247125(2014))。类似地，Llonch等人的综述讨论了PSC衍生的视网膜类器官作为体外产生视网膜组织的重要工具，该视网膜组织被广泛用于产生大量可能进一步被发展为潜在的基于细胞的疗法的感光细胞(Llonch等人,“Organoidtechnology for retinal repair”,Development Biology 433(2018)132-134)。最后，Pagliuca等报道了一种可放大的分化方案，该方案可以在体外从hPSC产生数亿葡萄糖响应性b细胞(Pagliuca等人,“Generation of Functional Human Pancreatic b Cells inVitro”,Cell 159,428-439(1994))。

然而，上述方法虽然产生例如功能性心脏组织或功能性骨骼组织，但如果所用的多能干细胞源自同种异体供体和/或非组织相容的，则仍然面临移植排异的问题。

因此，不仅需要一般性的应用于治疗的功能性组织或类器官，类似于例如功能性心脏组织，而且也需要改进的功能性组织或类器官，类似于例如改进的心脏组织，该组织尽管源自同种异体供体，但在受体中不被排斥。本发明的目的正是解决这个问题。

发明内容

如权利要求中所限定的主题解决了该问题。本发明提供了一种从多能细胞生产非免疫原性工程化组织的方法，一种工程化组织，一种包含所述工程化组织的药物组合物，使用所述工程化组织的治疗方法和所述工程化组织的用途。

因此，本发明涉及一种从多能干细胞生产非免疫原性工程化组织的方法，所述多能干细胞缺乏被呈递于所述多能干细胞的细胞表面的内源性MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中所述方法包括在对于所述工程化组织的功能所必需的至少一种细胞类型的存在下，在允许形成所述工程化组织的条件下，形成所述工程化组织，其中所述至少一种细胞类型已通过多能干细胞分化为所述至少一种细胞类型而获得，由此使所述工程化组织对该工程化组织的受体是非免疫原性的。

本发明还涉及一种从多能干细胞生产非免疫原性工程化组织的方法，所述多能干细胞缺乏被呈递于所述多能干细胞的细胞表面的内源性MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中所述方法包括在也允许形成所述工程化组织的条件下诱导所述多能干细胞分化为对于所述工程化组织的功能所必需的至少一种细胞类型，由此使所述工程化组织对该工程化组织的受体是非免疫原性的。

在本发明的实施方案中，所述工程化组织(a)不被受体的效应T细胞识别为是同种异体的，和/或，(b)对NK介导的裂解具有抗性。优选地，所述工程化组织不结合抗HLA抗体，优选地所述组织不结合抗HLA-A或抗HLA-B抗体。

所述免疫调节蛋白可以是单链融合HLA I类蛋白，其中更优选地所述单链融合HLAI类蛋白包含至少一部分B2M，所述至少一部分B2M与至少一部分HLA I类α链共价连接，所述HLA I类α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。最优选地，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-A，或者所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-A0201，或者所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-E，或者所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-G，或者所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-B，或者所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-C，或者所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-F。

在本发明的实施方案中，所述多能干细胞进一步表达由在该多能细胞表面的所述单链融合HLA I类蛋白呈递的靶肽抗原，其中更优选地，所述靶肽抗原与所述单链融合HLAI类蛋白共价连接，其中所述靶肽抗原可以包含序列VMAPRTLFL(SEQ ID NO：1)。

在本发明的实施方案中，在所述多能干细胞中，β-微球蛋白2基因的所有拷贝基本上都被破坏。

在本发明的实施方案中，所述方法包括在形成所述组织的一部分的至少一种第二细胞类型的存在下形成所述工程化组织。所述形成所述工程化组织的一部分的第二细胞类型取决于待被工程化的组织的类型(例如，如果要形成工程化的心肌组织或肝脏组织)，举例来说，可以是成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞或间充质干细胞。

所述工程化组织可选自心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、脑组织、胰腺组织、肺组织、骨骼肌组织、胃肠组织、神经元组织、皮肤组织、骨组织、骨髓、脂肪组织、结缔组织、视网膜组织和血管组织。

优选地，在本发明所述方法的一个实施方案中，所述工程化组织为心脏组织，其中所述方法还包括：(i)在基础培养基中培养所述多能干细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)BMP4、激活素A、FGF2、GSK3-抑制剂，和(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱盐酸盐、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂和0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)的无血清补充剂，由此诱导多能干细胞的中胚层分化；(ii)在基础培养基中培养步骤(i)中获得的细胞，所述基础培养基包含有效量的Wnt-信号传导通路抑制剂和如步骤(i)中所述的无血清补充剂，由此诱导所述细胞的心肌分化；和(iii)在机械刺激下，在包含有效量的如步骤(i)中所述的无血清补充剂的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，由此促进心肌成熟。

在本发明方法的一个实施方案中，所述组织的形成在水凝胶，优选细胞外基质蛋白，最优选胶原水凝胶的存在下进行。

在本发明方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括：(iv)在一个或多个模具中提供无血清重构混合物，所述重构混合物包含(a)无血清最低必需培养基；(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱盐酸盐、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)和0.2-2mg/ml胶原的无血清补充剂；和(c)步骤(iii)中获得的细胞和形成工程化组织的一部分的细胞类型，优选人非肌细胞，其中任选地，所述形成工程化组织的一部分的细胞衍生自所述多能干细胞，其中总细胞混合物的20-80％是步骤(iii)中获得的细胞；其中所述重构混合物的pH值为7.2-7.6；(v)在所述一个或多个模具中培养所述无血清重构混合物，由此使无血清重构混合物凝结至少15分钟；(vi)在所述一个或多个模具中，在无血清EHM培养基中培养步骤(v)中获得的所述混合物，直到该混合物凝结到其原始厚度的至少50％，其中所述EHM培养基包含(a)含有0.5-3mmol/LCa²⁺的基础培养基；(b)如步骤(i)(b)中所定义的无血清补充剂；(c)0.5-10mmol/L的L-谷氨酰胺；(d)0.01-1.0mmol/L抗坏血酸；(e)1-100ng/ml IGF-1；和(f)1-10ng/ml TGFβ1；(vii)在步骤(iii)(a)-(f)中所定义的无血清EHM培养基中，在机械拉伸下培养步骤(iii)中获得的混合物，由此形成产生力(force-generating)的工程化心脏组织。

优选地，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和孤雌生殖干细胞。

优选地，所述多能干细胞是灵长类动物来源的多能干细胞，优选人多能干细胞。优选地，所述多能干细胞。优选地，所述多能干细胞是NINDS人类细胞和数据库中的ND50039。

优选地，本发明的方法还进一步包括诱导所述多能干细胞分化为形成所述工程化组织的一部分的至少一种细胞类型，其中，使对于所述工程化组织的功能所必需的细胞和所述形成工程化组织的一部分的细胞在分化后相接触以形成工程化组织。仅举几个说明性例子，所述可以形成工程化组织的一部分的(第二)细胞类型可以是，但不限于成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞或间充质干细胞。

优选地，所述B2M的破坏和/或免疫调节蛋白的插入由工程化核酸酶介导。更优选地，所述工程化核酸酶选自巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应子基核酸酶(TALEN)和成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR/Cas9)。最优选地，所述工程化核酸酶是CRISPR/Cas9，所述crRNA选自ACTCACGCTGGATAGCCTCC(SEQ ID NO：2)、GAGTAGCGCGAGCACAGCTA(SEQ ID NO：3)、GGCCGAGATGTCTCGCTCCG(SEQ ID NO：4)、ACTCACGCTGGATAGCCTCCAGG(SEQ ID NO：5)、GAGTAGCGCGAGCACAGCTAAGG(SEQ ID NO：6)和GGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGG(SEQ ID NO：7)。

在一个实施方案中，在工程化组织形成的同时，所述多能干细胞分化为所述至少一种细胞类型。

本发明还涉及工程化组织，包含多能干细胞，所述多能干细胞缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中所述多能干细胞在也允许形成工程化组织的条件下分化为对于所述工程化组织的功能所必需的细胞类型，由此使工程化组织对该工程化组织的受体是非免疫原性的。

本发明还涉及通过本发明的方法可能获得的工程化组织。本发明还涉及通过本发明的方法获得的工程化组织。

优选地，所述工程化组织还包含细胞外基质生物材料。更优选地，所述细胞外基质生物材料是海藻酸盐、水凝胶、胶原水凝胶、纤维蛋白水凝胶或合成基质如聚乳酸、聚乙醇酸、和聚癸二酸甘油酯(生物橡胶)、和聚八亚甲基马来酸(酸酐)柠檬酸酯，最优选地，所述细胞外基质生物材料是I型胶原。

优选地，所述工程化组织(a)不被受体的效应T细胞识别为是同种异体的，(b)不结合抗HLA抗体，和/或(c)对NK介导的裂解具有抗性。

本发明还涉及包含本发明工程化组织的药物组合物。

本发明还涉及在治疗病症的方法中使用的本发明的工程化组织或本发明的药物组合物。

本发明还涉及治疗病症的方法，包括给予有此需要的受试者有效量的本发明的工程化组织或本发明的药物组合物。

用于本发明用途或本发明的治疗方法的工程化组织或药物组合物，其中所述病症选自糖尿病、自身免疫性疾病、癌症、感染、心肌梗塞、心力衰竭、骨骼或关节病症、成骨不全、烧伤、肝衰竭、肾衰竭、脑损伤或软组织损伤。

本发明还涉及本发明任一工程化组织在(a)药物毒性筛选的体外模型中的用途；和/或(b)作为研究工具的用途。

本发明还涉及包含SEQ ID NOs：2-7中的至少一个的核酸。

本发明还涉及所述核酸在破坏B2M基因(表达)中的用途。

当结合附图、非限制性实施例和所附权利要求书考虑时，参照详细说明，本发明将更好地被理解。

附图说明

图1示出了围绕B2M基因序列的外显子1(灰色，201-327位)的片段。图1所示的550个碱基对对应于例如NCBI GenBank登录号NG_012920(2018年6月3日的NG_012920.2版本)的序列4811-5360位，该序列显示了完整的基因。下划线是在该基因序列下方所示的三个crRNA的结合位点。SEQ ID NO：6(B2M_CR1)结合互补链的287-299位，SEQ ID NO：5(B2M_CR2)结合互补链的311-333位，SEQ ID NO：7(B2M_CR3)结合254-276位。相关PAM用粗斜体表示。另外突出显示的是翻译开始信号ATG(双下划线)。

图2示出了图1所示的B2M基因片段的序列201-350位处经CRISPR/Cas9核酸酶基因编辑后得到的4个不同PSC克隆的序列。对于每个克隆，显示了两个等位基因所产生的序列。下划线是三个crRNA的结合位点。SEQ ID NO：6(B2M_CR1)结合互补链的287-299位，SEQ IDNO：5(B2M_CR2)结合互补链的311-333位，SEQ ID NO：7(B2M_CR3)结合254-276位。另外突出显示的是起始密码子(双下划线)、PAM(粗斜体)和突变(波浪线)。缺失用“-”表示。

图3示出了与野生型PSC和未染色对照相比，经CRIPSR/Cas9核酸酶基因编辑后，4个不同PSC克隆的流式细胞术分析结果。分析了在未刺激的PSC(左)和用干扰素γ刺激24小时的PSC(右)中B2M(APC，x轴)和HLA(PE，y轴)的细胞表面表达。

图4示出了允许免疫调节蛋白在多能干细胞表面过表达并且可以掺入合适的载体中的示例性DNA序列。通常，免疫调节蛋白可包含与HLA基因融合的功能性B2M。在图4所示的示例性实施方案中，人B2M与人HLA-E基因融合。灰色标记的“二聚体”的开放阅读框翻译成SEQ ID NO：18所示的蛋白质。该二聚体包含由(G₄S)₄融合的B2M和HLA-E。灰色标记的“三聚体”的开放阅读框翻译成SEQ ID NO：20所示的蛋白质。该蛋白除了B2M和HLA-E外，还包含具有序列MAPRTLFLGGGGSGGGGSGGGGSIQRTPK(SEQ ID NO：21)的靶肽抗原。采用这样的示例性靶肽抗原融合到单链B2M-HLA-E二聚体上可以增加复合物的稳定性。因此，SEQ ID NOs：18和20是免疫调节蛋白的示例性实施方案。开放阅读框前后未被灰色标记的序列是介导整合入B2M基因的同源臂。

图5示出了HLA-E KI TC1133 hIPSC系的产生。图5(A)显示Crispr/Cas9靶向诱导的HDR介导的HLA-E二聚体和三聚体敲入B2M KO hIPSCs中的示意图。图5(B)显示未转染的hIPSCs(对照)和用含有HLA-E二聚体和三聚体供体序列的质粒转染的hIPSCs在转染后48小时的明场图像。图5(C)显示用pmaxGFP质粒转染后hIPSC表达GFP(左)和GFP+细胞的流式细胞术分析(右)。

图6示出了HLA-E上游敲入B2M基因座。图6(A)显示B2M基因座和用于PCR扩增的包含5′-同源臂和供体序列的引物的示意图。琼脂糖凝胶电泳显示Crispr/Cas9诱导的HDR介导的基因整合到被HLA-E二聚体和三聚体供体质粒转染的hIPSCs中。图6(B)显示HLA-E二聚体的克隆的基因分型，图6(C)显示HLA-E三聚体插入的基因分型。WT：野生型，PD：质粒DNA，HLA-E：被HLA-E供体质粒转染的hIPSC池。

图7示出了HLA-E全序列敲入B2M基因座中。图7(A)是B2M基因座、用于PCR扩增的包含5′-和3′-同源臂和供体序列的引物的示意图。图7(B)显示HLA-E二聚体的克隆的基因分型，图7(C)显示HLA-E三聚体插入的基因分型。

图8示出了HLA-E KI hIPSCs的多能性。流式细胞术分析野生型、B2M KO、HLA-E二聚体克隆#5和78、HLA-E三聚体克隆#66和100的多能性标记物的表达；分别在APC-A和PE-A通道检测到OCT4A和Nanog。

图9示出了HLA-E KI hIPSCs中HLA的表达。流式细胞术分析野生型、B2M KO、HLA-E二聚体克隆#5和78、HLA-E三聚体克隆#66和100表达分别在APC-A和太平洋蓝-A通道被检测到的B2M和HLA-E。黑色线条表示无染色追踪结果。

图10示出了HLA-E KI CMs中HLA的表达。图10(A)显示hIPSCs及其随后分化为表达α-辅肌动蛋白、cTnT和Nuclei的CMs的明场图像。通过流式细胞术检测到>90％α-辅肌动蛋白+CMs高纯度(右侧)。显示的未填充区域为同型对照追踪。图10(B)显示流式细胞术分析衍生自野生型、B2M KO、HLA-E二聚体克隆#5和#78、HLA-E三聚体克隆#66和#100的hIPSC系的CMs分别在APC-A、PE-A和太平洋蓝-A通道上被检测到的B2M、HLA-B、C和HLA-E的表达。刻度单位：50μm。

图11示出了本发明的低免疫原性工程化人心肌(EHM)。图11A显示EHM制造过程的示意图；将从原生

GMP hiPSC系ND50039(也称为TC1133，可从Lonza获得)和从如本文所述遗传修饰的iPSC系TC1133的hiPSC衍生的心肌细胞(CMs)，按照Tiburcy等人(2017)的报道在I型胶原中与人皮肤成纤维细胞混合，以形成环状EHM。图11B显示在铸模中经3天的固定期的EHM，在机械载荷下在柔性拉伸器上至多4周的功能成熟，以及在恒温器官浴中在等距条件下测量收缩力(FOC)。图11C显示在电刺激下记录的遗传原生(野生型)EHM和包含B2M KO、HLAE二聚体和三聚体KI iPSC衍生的心肌细胞的EHM的收缩力(FOC)。在升高钙浓度的条件下记录FOC反应(n＝4/组)。

图12示出了可通过本发明的方法生产的示例性工程化组织。在本文中，心肌细胞和成纤维细胞形成心脏组织，也称作“EHM补片”。

具体实施方式

本发明基于这种令人惊奇的发现，即缺乏功能性β2-微球蛋白(B2M)表达(由此缺乏MHC I类分子)但表达HLA-E(即免疫调节蛋白)的多能干细胞，可用于生产对工程化组织的受体为非免疫原性的工程化组织。这种缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白的多能干细胞的应用具有以下优点：它提供了一种同种异体工程化组织，但是该组织不再被受体的免疫系统识别为是同种异体的。因此，并且重要的是，如此借助干细胞(所述干细胞分化为对于组织的功能所必需的细胞)获得的同种异体工程化组织(在本文中，相对于受体的免疫系统也称作“机器组织”或“隐形组织”)，不需要该组织的受体(患者)经受免疫抑制治疗以便完全避免或至少降低组织排异或并发症如移植物抗宿主病的风险。这使得本发明的机器组织成为诸如工程化心脏组织、肝脏组织、视网膜组织或肾脏组织等功能性组织的医疗应用(例如在器官或组织置换移植中)的理想候选者。在本文中，应当看到破坏β2-微球蛋白(B2M)基因来消除MHC I类分子的表面表达以提供缺乏MHC I类(HLA I类)的细胞已经在1992年由国际专利申请WO 92/09688披露(也可参见国际专利申请WO2012/145384)，然而，如Gornalusse等人报道的(Gornalusse等人,“HLA-E-expressing pluripotent stemcells escape allogeneic responses and lysis by NK cells”(2017),NatureBiotechnology,35(8):765-772)，该方法使细胞易于被自然杀伤(NK)细胞裂解。为了解决这一“迷失自我”反应，Gornalusse等人采用强制表达最小多态性HLA-E分子的方法。通过这种方法，Gornalusse等人构建出能够被分化为CD45+造血细胞的多能干细胞，所述CD45+造血细胞能够逃脱同种异体应答以及被NK细胞裂解。

在本发明的方法中，多能干细胞被分化为对于目标工程化组织的功能所必需的至少一种细胞类型。这种分化可以在工程化组织形成之前发生(例如参见本文中的实施例3和图10A)，或者可以在形成工程化组织的同时进行多能干细胞的分化。换言之，多能干细胞可以在工程化组织的实际生产开始之前分化，或者多能干细胞的分化可以与工程化组织的生产在同一时刻(同时)进行。这样的工程化组织可以仅包含一种细胞类型，例如，仅产生胰岛素的胰腺β细胞，或者例如像Rao等人所报道的(上文引用的Rao等人,NatureCommunications,2018)从hPSCs分化的诱导的肌原祖细胞(iMPCs)，其中所述iMPCs可容易地分化为自发收缩的多核肌管，在3D培养条件下，所述多核肌管可重复地形成包含排列起来的多核肌管的功能性骨骼肌组织(iSKM束)，所述多核肌管显示出正向力-频率关系和响应于电或乙酰胆碱刺激的稳健的钙瞬变。根据上述内容，工程化组织还可以包含两种或更多种对于目标工程化组织的功能所必需的细胞类型。这种组织的一个说明性例子是胰腺组织，更具体地说，胰岛，所述胰岛包含产生胰高血糖素的α细胞(占胰岛细胞总数的20％)，产生胰岛素和胰淀素的β细胞(≈70％)，产生生长抑素的δ细胞(<10％)，产生胰多肽的PP细胞(γ细胞或F细胞)(<5％)和产生生长激素释放肽的ε细胞(<1％)。或者，所述工程化组织可以包含两种或更多种细胞类型，例如，一种是对于工程化组织的功能所必需的细胞类型和一种也形成(工程化)组织的一部分的支持性(第二)细胞类型。包含这样至少两种不同细胞类型的工程化组织的示例性例子是心脏组织，其主要包含心肌细胞(作为第一种或至少一种细胞类型)，发挥心脏组织作为肌肉的功能，以及成纤维细胞，该细胞(作为第二细胞类型)提供结缔组织(例如参见WO2015/025030)。在根据WO2015/025030形成的这种心脏组织的说明性例子中，本发明的工程化心脏组织可以从人心肌细胞和人非肌细胞的混合的混合物形成，其中总细胞混合物的20-80％是心肌细胞(已经从本发明的多能干细胞分化而来)，剩余的细胞是非心肌细胞，例如成纤维细胞(即形成本发明所述组织的一部分的第二细胞类型的细胞)。

因此，本发明涉及一种从多能干细胞生产非免疫原性工程化组织的方法，所述多能干细胞缺乏呈递于所述多能干细胞的细胞表面的内源性MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中所述方法包括在对于工程化组织的功能所必需的至少一种细胞类型的存在下，在允许形成所述工程化组织的条件下，形成所述工程化组织，其中所述至少一种细胞类型已通过多能干细胞分化为所述至少一种细胞类型而获得，由此使所述工程化组织对该工程化组织的受体是非免疫原性的。

本发明还涉及从多能干细胞生产非免疫原性工程化组织的方法，所述多能干细胞缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中所述方法包括在也允许形成所述工程化组织的条件下，诱导多能干细胞分化为对于所述工程化组织的功能所必需的至少一种或者例如两种、三种、四种或五种细胞类型，由此使所述工程化组织对该工程化组织的受体是非免疫原性的。

本文所用术语“多能干细胞”(PSC)是指能够分化为身体的每一种细胞类型的细胞。因此，多能干细胞提供了分化成基本上任何组织或器官的独特机会。目前，最常用的多能细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)。人ESC-系首先由Thomson和合作者建立(Thomson等人(1998),Science 282:1145-1147)。最近，人ESC研究使得能够开发一种将身体细胞重编程为ES样细胞的新技术。该技术在2006年由Yamanaka和合作者首创(Takahashi和Yamanaka(2006),Cell,126:663-676)。产生的诱导的多能细胞(iPSC)展现出与ESC非常相似的行为，并且重要的是，也能够分化为身体的每一种细胞。此外，据报道在小鼠模型中孤雌生殖干细胞也适用于EHM生产(Didié等人.(2003),J Clin Invest.,123:1285-1298)；根据WO 2015/025030，采用人孤雌生殖干细胞可能生产出人EHM。因此，本文所用的多能干细胞例如可选自胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和孤雌生殖干细胞。然而，在本发明的上下文中，这些多能干细胞优选不是使用涉及改变人类种系遗传特性或涉及将人胚胎用于工业或商业目的方法生产的。优选地，多能干细胞是灵长类动物、更优选人来源的。合适的PSCs，包括诱导的PSCs，例如可以从NIH人类胚胎干细胞登记处、欧洲诱导多能干细胞库(EBiSC)、德国心血管研究中心(DZHK)的干细胞库或ATCC获得，这些仅是例举的几个来源。多能干细胞也可以从商业途径获得，例如可以从NINDS人类序列和细胞库(https://stemcells.nindsgenetics.org)获得，该库由美国国立神经疾病和卒中研究所(NINDS)运营并将人类细胞资源广泛提供给科研人员和企业研究人员。可用于本发明的合适细胞系的一个说明性例子是细胞系ND50039，它是从脐带血干细胞衍生的诱导(未编辑)的多能干细胞。可用于本发明的其它示例性iPSC细胞系包括但不限于Gibco^TM人Episomal iPSC系(订单号A18945，Thermo Fisher Scientific)，或可从ATCC获得的iPSC细胞系ATCC ACS-1004、ATCC ACS-1021、ATCC ACS-1025、ATCC ACS-1027或ATCC ACS-1030。或者，通过已知的方法，例如Okita等人(Okita等人,“A more efficient method to generate integration-freehuman iPS cells”,Nature Methods,Vol.8No.5,5月2011,409-411页)或Lu等人(Lu等人,“A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation,expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specificinduced pluripotent stem cells”,Biomaterials 35(2014)2816e2826)报道的方法，重编程领域的任何技术人员都可以容易地生产合适的iPSC系。

如上所述，用于本发明的(诱导的)多能干细胞可以衍生自任何合适的细胞类型(例如，来自干细胞如间充质干细胞或上皮干细胞，或来自分化的细胞如成纤维细胞)和来自任何合适来源(体液或组织)。仅举几个说明性例子，这些来源(体液或组织)的例子包括脐带血、皮肤、牙龈、尿液、血液、骨髓、脐带的任何组成部分(例如脐带羊膜或华通式胶)、脐带-胎盘连接处、胎盘或脂肪组织。一个说明性例子是从脐带血中分离CD34阳性细胞，如Chou等描述的，例如通过使用特异性针对CD34的抗体进行磁性细胞分选然后进行重编程(Chou等人,(2011),Cell Research,21:518-529)。Baghbaderanti等人的研究表明iPSC产生过程能够在符合良好生产规范(GMP)的规定下产生细胞系ND50039(Baghbaderanti等人,(2015),Stem Cell Reports,5(4):647-659)。因此，多能干细胞优选满足良好生产规范的规定。

一种细胞或多能干细胞，所述细胞或多能干细胞是“缺乏被呈递于细胞表面的内源性MHC I类分子”，则在其表面(即细胞或多能干细胞的表面)不呈递功能性MHC I类分子，在其细胞膜中也不包含功能性MHC I类分子。在本文中，术语“内源性”涉及任何MHC I类蛋白，其天然地包含在细胞或多能干细胞中而不是人工引入的。然而，这增加了受体免疫系统的排斥反应风险，因为在细胞表面缺乏MHC I类分子可能被免疫系统解读为“迷失自我”信号。因此，细胞或多能干细胞在其表面缺乏MHC I类分子的缺陷不适用于任意免疫调节蛋白，所述缺陷可以被引入多能干细胞中和/或重组免疫调节蛋白。在一个实施方案中，通过破坏多能干细胞中β2-微球蛋白基因的所有拷贝，可以实现细胞表面MHC I类分子的缺乏。MHC复合物是α-微球蛋白和β2-微球蛋白的异源二聚体。因此，如果β2-微球蛋白缺失，则不能组装功能性MHC I类复合物，因而，没有MHC I类分子呈递在细胞膜和/或细胞表面。

本领域技术人员已知许多可能的方式来修饰多能干细胞的基因组，使得它们缺乏MHC I类分子并包含免疫调节蛋白。但应注意，本发明的缺乏MHC I类分子的多能干细胞可以表达免疫调节蛋白，即使它是MHC I类分子，如本文所述的HLA-E。因此，术语“缺乏MHC I类分子”可以涉及内源性MHC I类分子，并且不排除(重组)免疫调节蛋白的存在。

在本发明的多能干细胞中，B2M基因可能被破坏，使得没有功能性内源性B2M蛋白从被破坏的遗传基因座产生。在某些实施方案中，所述破坏导致非功能性B2M蛋白的表达，包括但不限于截短、缺失、点突变和插入。在其它实施方案中，所述破坏导致无来自B2M基因的蛋白表达。

缺乏B2M表达的多能干细胞不能在细胞表面表达HLA I类蛋白。HLAI类缺乏带来了更多益处；例如，没有HLA I类表达的细胞不能呈递自身抗原，所述自身抗原本应阻止对自身免疫性疾病例如糖尿病和类风湿性关节炎有效的细胞疗法。类似地，由创新的细胞疗法引入的治疗性基因产品(例如肌营养不良蛋白)(所述基因产品在患有某些遗传性疾病(例如肌肉营养不良)的患者中缺失)，将不会在替代疗法中被免疫系统当作新抗原呈递和识别。

用于破坏B2M基因的一个、两个或所有拷贝的任何适宜的技术都可以被采用；示例性技术在本申请的上下文中被公开，并且基于本文给出的和本领域已知的教导，该技术在本领域技术人员的认知水平之内。示例性的其它技术可参见，例如，2008年9月11日公开的公开号US2008/0219956的美国专利申请。这些技术可任选地包括在B2M基因破坏后从细胞中除去非人DNA序列的步骤。

该方法的示例性实施方案是使用腺相关病毒(AAV)基因靶向载体，任选地包括通过诸如下文所述的那些的技术去除用于靶向的转基因，或通过Cre介导的loxP重组或其它合适的重组技术去除用于靶向的转基因。参见Khan等人的报道(Khan等人,(2011),Protocol,6:482-501)。基于本文和本领域已知的教导，利用多种技术构建本发明的B2M-/-多能干细胞(即缺乏MHC I类分子的干细胞)，优选人细胞，在本领域技术人员的认知水平之内。

B2M的破坏和/或编码免疫调节蛋白的基因的插入也可以通过使用工程化核酸酶来实现。这些核酸酶能够在DNA中引入单链和/或双链断裂。工程化核酸酶可以选自巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子基核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR/Cas9)。

CRISPR是指细菌中的一个DNA序列家族。该序列包含来自攻击了该细菌的病毒的DNA片段。这些片段被细菌用于在随后的攻击中检测和破坏来自相似病毒的DNA。这些序列在细菌防御系统中起关键作用，并形成称作CRISPR/Cas9的技术的基础，所述技术有效且特异性地改变生物体内的基因。CRISPR/Cas系统最初是一种原核免疫系统，其赋予对外来的诸如那些存在于质粒和噬菌体中的遗传元件的抗性，从而提供一种获得性免疫。携带间隔序列的RNA有助于Cas(CRISPR关联的)蛋白识别和切割外源DNA。其它RNA导向的Cas蛋白切割外来RNA。CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas系统的一个简单版本，已经被改造来编辑基因组。通过将与合成的导向RNA(gRNA)复合的Cas9核酸酶递送到细胞中，可以在所需位置切割细胞的基因组，允许去除现有基因和/或添加新基因。

来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR系统也依赖于蛋白Cas9。CaS9核酸内切酶是一种四组分体系，该体系包括两个被称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的小RNA分子。来自嗜热链球菌(S.thermophilus)的CRISPR系统的Cas9可以通过改变其crRNA的序列被重新编程以靶向它们所选择的位点。因此，本发明还涉及本发明的方法，其中B2M的破坏和/或免疫调节蛋白的插入由工程化核酸酶介导，并且其中工程化核酸酶是CRISPR/Cas9。在该方法中，crRNA可以选自ACTCACGCTGGATAGCCTCC(SEQ ID NO：2)、GAGTAGCGCGAGCACAGCTA(SEQ ID NO：3)和GGCCGAGATGTCTCGCTCCG(SEQ IDNO：4)。化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸内切酶需要相对识别序列3′的crRNA中原间隔区毗邻基序(PAM)，从而能与该特定DNA序列结合。该PAM具有共有序列XGG，其中X可以是任意核酸。因此，SEQ ID NOs：2-4可以另外在3′原端具有序列XGG，其中X可以是任意核酸。因此，crRNA也可以是ACTCACGCTGGATAGCCTCCAGG(SEQ ID NO：5)、GAGTAGCGCGAGCACAGCTAAGG(SEQ ID NO：6)和GGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGG(SEQ ID NO：7)。

判断多能干细胞是否缺乏MHC I类分子在本领域技术人员的能力范围之内。该分析可以在基因组、转录和/或翻译水平上进行。例如，当MHC I类分子缺乏是通过采用核酸酶(如CRIPSR)来破坏对于形成MHC I类分子所必需的基因(如B2M基因)而实现的时候，通过对相应核苷酸序列进行测序，可以分析B2M基因内阻止功能性B2M蛋白表达的突变。测序技术的例子包括Sanger法测序和二代测序法如单分子实时测序法(Pacific Biosciences)、离子半导体法(Ion Torrent测序法)、焦磷酸测序法、合成测序法(Illumina)、连接测序法(SOLiD测序法)和纳米孔测序法。或者，可以进行引物结合在待突变的区域的PCR或Southern Blot分析。编码MHC I类分子的至少一部分的基因的转录可以例如通过使用跨越待突变的区域的引物对的定量PCR来分析。最后，可以进行蛋白质表达或翻译的分析。因此，分析多能干细胞是否缺乏MHC I类分子的示例性方法可以包括免疫分析法(例如WesternBlot)、流式细胞术、表面等离子体共振等。

本发明还涉及包含SEQ ID NOs：2-7的序列中的至少一个的核酸。在一个实施方案中，所述核酸可以可操作地与允许该核酸在宿主细胞中过表达的表达控制序列连接。示例性的表达控制序列包括启动子，例如U6启动子或CMV启动子。本发明的核酸也可以被包含在载体中。所述载体可进一步编码反式激活的crRNA(tracrNA)和/或Cas9核酸酶。本发明还涉及本发明的核酸或载体用于破坏B2M的用途。

本文所用的术语“非免疫原性”是指基本上不引起免疫应答的组织，即不被受体排斥的组织。非免疫原性工程化组织的其它特征可以包括该组织不被效应T细胞识别为是同种异体的，和/或不结合抗HLA抗体和/或抗NK(自然杀伤细胞)介导的裂解。检测这些特征的分析手段对于本领域技术人员来说是熟知的，并且可以参见Gornalusse等人.(2017),Nature Biotechnology,35(8):765-772和WO 2012/145384。

组织被效应T细胞识别为是同种异体的和对NK介导的裂解的抗性，例如可以通过用NK细胞进行铬释放试验来分析。这样的试验是基于将待分析的组织或细胞暴露于⁵¹Cr，随后使该组织或细胞与CD8⁺T细胞或NK细胞接触，最后通过液闪计数测量上清液中的放射性活性(再次参见例如Gornalusse等人.(2017),Nature Biotechnology,35(8):765-772和WO2012/145384)。

本文所用的术语“效应T细胞”涉及对刺激(例如共刺激)立即作出主动反应的各种T细胞类型。这包括辅助T细胞和杀伤T细胞。T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中辅助其它白血细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。这些细胞也称作CD4⁺T细胞，因为它们在其表面表达CD4糖蛋白。当通过MHC II类分子呈递给肽抗原时，辅助T细胞被激活，所述MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面表达。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌被称作细胞因子的小蛋白，所述小蛋白调节或辅助活性免疫应答。细胞毒性T细胞(TC细胞、CTL、T-杀伤细胞、杀手T细胞)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并还与移植排斥有关。这些细胞也称作CD8⁺T细胞，因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类分子相关的抗原来识别它们的靶标，所述MHC I类分子存在于所有有核细胞表面。通过IL-10、腺苷和其它由调节性T细胞分泌的分子，CD8⁺细胞可被灭活至无能状态，从而预防自身免疫性疾病。

抗HLA抗体，优选抗HLA-A或抗HLA-B抗体与本发明所述组织的结合涉及补体依赖性细胞毒性(CDC)。表达HLA-A或HLA-B分子的细胞易于被抗HLA-A或抗HLA-B检测到。在包括补体系统的所有组件和抗HLA-A和/或抗HLA-B抗体的环境中，如果其HLA与受体HLA不相容，则在其表面表达HLA-A和/或HLA-B的组织被补体系统杀伤。这样的组织很可能在受体中被排斥。在Gornalusse等人.(2017),Nature Biotechnology,35(8):765-772中也报道了这样的试验的例子。

如本文所述的“免疫调节蛋白”，是指能够阻止靶向所述工程化组织的免疫反应的任意蛋白质。在细胞表面缺少功能性B2M的情况下，工程化组织的细胞在其表面不呈递任何MHC I类分子，这是一种“迷失自我”信号从而导致其被受体的免疫系统破坏(主要由于自然杀伤细胞的作用)。适宜的免疫调节基因包括但不限于编码抑制抗原呈递的病毒蛋白的基因，优选编码本文所述的单链(SC)融合人白细胞抗原(HLA)I类蛋白的基因。本发明的免疫调节蛋白可以是重组的和/或不是天然存在于多能干细胞中的。因此，所述多能干细胞可以表达重组免疫调节蛋白。

用于本发明的SC-HLA I类融合蛋白的融合蛋白可以由所述多能干细胞和/或形成工程化组织的细胞表达。所述融合蛋白的优势是功能性HLA I类蛋白可被呈递于工程化组织的细胞的细胞表面而无需表达B2M，所述B2M也会与其它HLA单体关联，然后会再次诱导排斥反应。虽然用于本发明的细胞缺乏功能性B2M的表达，但是根据Gornalusse等人的报道(Gornalusse等.(2017),Nature Biotechnology,35(8):765-772)(例如，参见文中的图1)，这种SC-HLA I类融合蛋白可以包含与HLA I类α链的至少一部分共价连接的B2M的一部分，所述HLA I类α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。在一个实施方案中，所述单链融合HLA I类蛋白包含(至少)一部分B2M和至少一部分HLA-A。在一个实施方案中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-A0201(在这方面也参见WO2012/145384)。在一个实施方案中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-E。在一个实施方案中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-G。在一个实施方案中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-B。在一个实施方案中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-C。在一个实施方案中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-F。在一个实施方案中，所述免疫调节蛋白是B2M和HLA-E的融合蛋白和/或包含SEQ IDNO：18。用于表达B2M和HLA-E的融合蛋白的载体可以包含SEQ ID NO：17。

所述多能干细胞可进一步表达由在细胞表面上的所述单链融合HLA I类蛋白呈递的靶肽抗原。这样的靶肽抗原可以稳定HLA I类蛋白，也可以增强“自我”信号。在某些特定实施方案中，所述靶肽抗原与所述单链融合HLA I类蛋白共价连接。HLA-E单链二聚体可以由通过柔性(G₄S)₄接头与B2M共价融合的HLA-E重链组成，从而使得它能够结合用于抗原呈递的普通肽库(参见，例如，Gornalusse等人.(2017),Nature Biotechnology,35(8):765-772的图1C)。SEQ ID NO：18是这样的HLA-E二聚体的一个示例。“HLA-E二聚体”可以结合不同的或“普通的”用于抗原呈递的肽。然而，附加地或可选地，肽可以融合到所述HAL-E二聚体上。作为说明性示例，HLA-E单链三聚体可以含有额外的(G₄S)₃接头，该接头融合到包含衍生自HLA-G(另一种HLA I类分子)的信号序列的序列VMAPRTLFL(SEQ ID NO：1)的肽上，该肽是一种非多态性肽，通常由HLA-E呈递，HLA-E通过其与CD94/NGK2A的结合抑制NK细胞依赖性裂解。在一个实施方案中，所述免疫调节蛋白是靶肽抗原VMAPRTLFL(SEQ ID NO：1)通过(G₄S)₃接头与B2M和HLA-E的融合蛋白融合的融合蛋白，并且/或包含SEQ ID NO：20。

对于CRISPR介导的基因序列的敲入，可以利用宿主细胞的同源重组DNA修复系统。在本发明中，包含待插入序列的两端连接有“同源臂”的核酸，可与CRISPR/Cas9核酸酶和crRNA同时被引入宿主细胞。然后核酸酶可诱导双链断裂，该断裂可由宿主细胞DNA修复系统修复。在同源重组的情况下，DNA修复系统使用同源序列，通常是第二等位基因。通过引入包含同源臂的核酸，宿主细胞的DNA修复系统使用引入的核酸作为模板，而不是第二基因组等位基因，由此整合待插入的序列。本文所用的“同源臂”涉及的核酸序列，其DNA序列与靶基因组序列相同。典型地，待插入的基因序列在3′和5′端各有一个同源臂。“左侧”同源臂，即待插入序列3′端同源臂可以具有如SEQ ID NO：22或23所示的序列。“右侧”同源臂，即待插入序列5′端同源臂可以具有如SEQ ID NO：24所示的序列。这些示例性的同源臂介导进入人B2M基因的整合(也参见图5A)。

待插入基因序列可以包括可有助于表达和/或功能的其它元件，所述待插入基因序列在3′和5′端可各有一个同源臂，并且编码HLA-E二聚体或HLA-E三聚体。这些附加元件包括但不限于例如，例如如SEQ ID NO：25所示的T2A自切割肽，例如如SEQ ID NO：26所示的B2M靶向信号或pBHGA元件(SEQ ID NO：27)。

用于整合HLA-E二聚体的示例性载体可以包含SEQ ID NO：17(包含B2M和HLA-E的融合蛋白)，用于整合HLA-E三聚体(包含靶肽抗原、(G₄S)₃接头、B2M和HLA-E的融合蛋白)可以包含SEQ ID NO：19。SEQ ID NO：17和19都包含同源臂，所述同源臂被指向到B2M基因中的整合，该B2M基因如本文所述被敲除。用于整合的所有示例性载体包含本文所述的所有附加元件。

可以用本发明的方法生产各种组织。实例包括但不限于心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、脑组织、胰腺组织、肺组织、肌肉组织、胃肠组织、神经元组织、皮肤组织、骨组织、骨髓、脂肪组织、结缔组织或血管组织。在任选地也允许形成工程化组织的条件下，使多能干细胞分化为对于所述工程化组织的功能所必需的细胞类型的示例性方法可在下面的实施例部分中找到。多能干细胞的分化和工程化组织的形成可以同时发生，或者所述分化可以在所述形成开始之前进行。

生产工程化组织的不同方法是本领域技术人员已知的。例如，以下技术可用于本发明：1)组织工程化：在水凝胶环境中以确定的比例混合从多能干细胞分化的细胞，参见例如Tiburcy等人.(2017),Circulation,135：1832-1847；2)类器官技术：起始材料通常是未分化的多能干细胞(HES、iPSC或PaSC)，其或者聚集成所谓的微组织(参见Ewart等人.(2018),Annu Rev Pharmacol Toxicol,58:65-82)，该微组织原则上可进一步融合成大组织，或者嵌入水凝胶/基质环境中(参见Lancaster等人.2013,Nature,501:373-379和WO2015/040142)；3)3D打印：组织的3D打印，实质上类似于铸模技术(也参见Sudo(2014),Organogenesis,10(2)：216-224；Tiburcy等人.(2017),Circulation,135:1832-1847)；4)脱细胞器官的再细胞化：概念是使用猪器官(心脏)来再细胞化以供人使用(也参见Ott等人.(2008),Nature Medicine,14(2):213-221)，但该概念也被尝试用于许多其它器官；5)细胞片技术：基本上，几个细胞单层被堆叠并形成器官(参见例如Shimizu等人.(2002),Circ Res 90:e40-e48；Sawa等人.(1995),Circ J 79:991-999)。

回到作为第一个说明性例子的功能性心脏组织的生产，国际专利申请WO2015/040142(本文称作“生物工程化心肌”)公开了一种从多能干细胞生产工程化心脏组织的方法。对于功能性心脏组织的形成，在WO 2015/040142中描述的条件是获得已经分化为对于工程化组织的功能所必需的所述至少一种细胞类型的多能干细胞的条件。对于功能性心脏组织的形成，在WO2015/040142中描述的这些条件也可以被认为是多能干细胞分化为对于工程化组织的功能所必需的细胞类型的条件，所述条件也允许该工程化组织的形成。因此，为了形成工程化心脏组织，本发明的方法可以包括以下步骤：(i)在基础培养基中培养所述多能干细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)BMP4、激活素A、FGF2、GSK3-抑制剂，和(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱盐酸盐、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂和0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)的无血清补充剂，由此诱导多能干细胞的中胚层分化；(ii)在基础培养基中培养步骤(i)中获得的细胞，所述基础培养基包含有效量的Wnt-信号传导通路抑制剂和如步骤(i)中所述的无血清补充剂，由此诱导所述细胞的心肌分化；和(iii)在机械刺激下，在包含有效量的如步骤(i)中所述的无血清补充剂的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，由此促进心肌成熟。在本文中，还参见本申请实施例部分的实施例2。涉及心脏组织产生并提供多能干细胞分化为对于所述工程化组织的功能所必需的细胞类型的条件并任选地该条件还允许工程化(心脏)组织形成的其它文献包括，但不限于Ogle等人.(2006),Sci Trans Med,8(342),1-7；Tiburcy等人.(2017),Circulation,135:1832-1847；Ye等人.(2013),Cir Res,113:922-932；Zimmermann(2009),Antioxidant&Redox Signaling,11(8):2011-2023；Ott等人.(2008),Nature Medicine,14(2):213-221；或Shimizu等人.(2002),90:e40-e48。多能干细胞的分化和工程化组织的形成可以同时发生，或者所述分化可以在所述形成开始之前进行。通过WO 2015/040142的方法获得的心肌细胞可以随后用生产工程化心脏组织(也称作工程化心肌(EHM))的方法进行加工，在国际专利申请WO 2015/025030中描述了该方法。因此，本发明的方法可进一步包括(iv)在一个或多个模具中提供无血清重构混合物，所述重构混合物包含(a)无血清最低必需培养基；(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱盐酸盐、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)和0.2-2mg/ml胶原的无血清补充剂；和(c)步骤(iii)中获得的细胞和形成工程化组织的的一部分的细胞类型，优选人非肌细胞，任选地，所述形成工程化组织的一部分的细胞类型衍生自多能干细胞，其中总细胞混合物的20-80％是步骤(iii)中获得的细胞；其中所述重构混合物的pH值为7.2-7.6；(v)在所述一个或多个模具中培养所述无血清重构混合物，由此使无血清重构混合物凝结至少15分钟；(vi)在所述一个或多个模具中，在无血清EHM培养基中培养步骤(v)中获得的所述混合物，直到该混合物凝结到其原始厚度的至少50％，其中所述EHM培养基包含(a)含有0.5-3mmol/L Ca²⁺的基础培养基；(b)如步骤(i)(b)中所定义的无血清补充剂；(c)0.5-10mmol/L的L-谷氨酰胺；(d)0.01-1.0mmol/L抗坏血酸；(e)1-100ng/ml IGF-1；和(f)1-10ng/ml TGFβ1；(vii)在步骤(iii)(a)-(f)中所定义的无血清EHM培养基中，在机械拉伸下培养步骤(iii)中获得的混合物，由此形成产生力的工程化脏组织。该工程化心脏组织也被称作工程化心肌(EHM)。或者，WO 2015/040142的方法可以用本发明的多能干细胞完成，其中所述多能干细胞之前已经定殖于诸如I型胶原的水凝胶。该方法得到了所谓的生物工程化心肌(BHM)，该生物工程化心肌可以被描述为类器官。

本领域技术人员也知晓在使多能干细胞分化为对于工程化组织的功能所必需的细胞类型的条件下(任选地该条件还允许所述工程化组织的形成)，生产其它工程化组织，例如肝脏组织、肾脏组织、脑组织、胰腺组织、肺组织、肌肉组织、胃肠组织、神经元组织、皮肤组织、骨组织、骨髓、脂肪组织、结缔组织或血管组织。多能干细胞的分化和工程化组织的形成可以同时进行，或者所述分化可以在所述形成开始之前进行。在WO 2013/047639或Sudo(2014),Organogenesis,10(2):216-224中披露了用于产生肝脏组织的这种条件的示例。在Morizane等人的文章中公开了产生肾脏组织的适宜条件的例子(Morizane等人.(2017),Stem Cells,35:2209-2217)。Yang等人或Lancaster等人公开了用于产生脑组织或神经元组织的合适条件的例子(Yang等人.(2011),Cell Stem Cell 9:517-525；Lancaster等人.(2003),Nature,501:373-379。)(也参见本申请的实施例4)。在Pagliuca等人的报道中公开了用于产生胰腺组织的合适条件的例子(Pagliuca等人.(2014),Cell,159:428-439)(也参见本申请的实施例6)。Rao等人公开了用于产生功能性骨骼肌组织的例子(Rao等人.(2018),Nature Communication,9(126):1-12)(也参见本申请的实施例5)。用于产生血管组织的合适条件的例子，例如在Song等人的文章中公开(Song等人.(2018),Cell StemCell,22:340-354)。最后，用于产生视网膜组织的合适条件的例子，例如在Llonch等人的文章中描述(Llonch等人.Developmental Biology 433(2018)132-143)。

许多生物组织不光仅包含一种细胞类型。例如，心肌包含心肌细胞和在细胞丰度中更大量的主要包含成纤维细胞和内皮细胞的非肌细胞组分。虽然心肌细胞是对于组织的功能(即心脏搏动)所必需的细胞类型，但是成纤维细胞提供使组织稳定的细胞外基质，即可以被看作是形成该组织的一部分的细胞。内皮细胞和平滑肌细胞参与心脏血管系统。因此，本发明的方法可以进一步包括诱导多能干细胞分化为至少一种第二细胞类型，其中所述第二细胞类型形成该工程化组织的一部分。对于组织的功能所必需的细胞和形成该组织的一部分的细胞可以在分化后被组合在一起以形成工程化组织。这样的方法例如在WO2015/025030中披露。本文中，人心肌细胞和人非肌细胞，如成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞或间充质干细胞是形成组织的一部分的细胞的示例，心肌细胞是对于组织的功能所必需的细胞。通过采用相同的多能干细胞作为对于组织的功能所必需的细胞和形成组的织一部分的(第二种)细胞的来源，所述细胞具有相同的遗传修饰，即缺乏B2M并在细胞表面表达免疫调节蛋白，使得所述组合的工程化组织是非免疫原性的。

本发明不仅涉及生产非免疫原性工程化组织的方法，而且涉及非免疫原性工程化组织本身。因此，本发明涉及一种工程化组织，包含对于所述工程化组织的功能所必需的细胞类型，其中所述细胞类型已通过在适合于多能干细胞分化为所述类型的条件下使多能干细胞分化为所述细胞类型而获得，其中所述多能干细胞缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，由此使该工程化组织对工程化组织的受体是非免疫原性的。本发明还涉及通过本发明的方法可获得的工程化组织。在一个这样的实施方案中，本发明涉及一种工程化组织，包含多能干细胞，所述多能干细胞缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，其中在也允许形成所述工程化组织的条件下，所述多能干细胞分化为对于工程化组织的功能所必需的细胞类型，由此使该工程化组织对工程化组织的受体是非免疫原性的。

所述工程化组织可进一步包含细胞外基质材料。所述细胞外基质(ECM)是支持细胞分泌的细胞外分子的集合，其为周围细胞提供结构和生物化学支持。因为在不同的多细胞谱系中独立进化的多细胞性，多细胞结构之间的ECM组成是不同的；然而，细胞粘附、细胞间通信和分化是ECM的共同功能。细胞外基质包括间质基质和基膜。间质基质存在于各种细胞之间(即，在细胞间的空间内)。多糖和纤维蛋白的凝胶填充所述间质空间，并作为对抗施加在ECM上的应力的压缩缓冲剂。基底膜是ECM的片状沉积，其围绕例如心肌细胞和内皮细胞以在组织内锚定并使得能够与细胞外环境通信。每种类型的组织具有特定类型的ECM：胶原纤维和骨矿物质组成骨组织的ECM；网状纤维和基质组成疏松结缔组织的ECM；血浆是血液的ECM。心脏的主要ECM成分是I型胶原和III型胶原，还有透明质酸以及层粘连蛋白、IV型胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白和内联蛋白，后者是基膜的关键组分。I型胶原是最丰富的ECM材料，因此是组织工程和生物工程中的优选材料。因此，细胞外基质生物材料优选为I型胶原。在一个实施方案中，组织形成在水凝胶存在下进行，所述水凝胶优选含有细胞外基质蛋白的水凝胶，如纤维蛋白水凝胶或胶原水凝胶，最优选胶原水凝胶。

所述ECM材料还可以包含通常不是天然存在的ECM的一部分的材料。这种非天然存在的ECM材料优选是生物相容的，即无毒且不诱导免疫应答。这种非天然存在的ECM材料的例子包括但不限于海藻酸盐、水凝胶或合成基质，例如聚乳酸、聚乙醇酸和聚癸二酸甘油酯(生物橡胶)，和聚八亚甲基马来酸(酸酐)柠檬酸酯。

所述工程化组织也可以具有与本发明方法的产品相同的性质。优选地，所述工程化组织不被CD8⁺T细胞识别为是同种异体的，不结合抗HLA抗体和/或对NK介导的裂解具有抗性。这样的工程化组织可以替换受试者体内至少一部分受损组织。优选地，所述工程化组织不结合抗HLA-A抗体或抗HLA-B抗体。

本发明还涉及含有本发明工程化组织的药物组合物。所述药物组合物还可含有诸如缓冲剂这样的材料以稳定所述工程化组织。

本发明的工程化组织或药物组合物可用于治疗各种疾病。特别优选用于治疗以组织的失能或功能障碍为特征的疾病。然而，本发明还涉及应用于治疗病症的方法中的本发明的工程化组织或药物组合物。本发明还涉及治疗病症的方法，包括给予有此需要的受试者有效量的本发明的工程化组织或药物组合物。

由于多能干细胞具有形成畸胎瘤的风险，所述工程化组织优选不含任何多能干细胞，特别是如果本发明的工程化组织用于治疗用途。

所述病症可以是例如糖尿病、自身免疫性疾病、癌症、感染病、心脏病(如心肌梗塞或心力衰竭)、骨骼或关节病症、肌肉营养不良、成骨不全、烧伤、肝衰竭、肾衰竭、脑损伤或软组织损伤。本文中，仅举几个示例性例子，所述工程化组织可以代替已经因自身免疫反应、创伤、血液供应不足或烧伤而被感染或破坏的组织。

本发明还涉及本发明的工程化组织在用于药物毒性筛选的体外模型中的和/或作为研究工具的用途。在这点上，工程化组织可用作例如人的器官或组织的替代物，以避免使用动物模型。

从以下实施例将对本发明及其优点有更好理解，这些实施例仅是为了说明的目的而提供的。这些实施例不意欲以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白的多能干细胞的产生

β2-微球蛋白(B2M)的敲除

从NINDS人细胞和数据库获得多能干细胞系50039。该细胞系也可从Lonza获得，Baggbaderane等报道了它的特征(Baggbaderane等人.(2015),Stem Cell Reprots,5:647-6659)。Baggbaderane等人还公开了用于维持该细胞系的标准条件。与此不同，所述多能干细胞在StemMACS^TM iPS-Brew培养基中维持。采用CTG层粘连蛋白-521(Biolamina)或Geltrex(Thermo Scientific)来提供细胞外基质。

为了破坏B2M基因的所有拷贝，按照制造商的说明，采用了Integrated DNATechnologies的Alt-

CRISPER/Cas技术。取决于CRISPR-Cas9 crRNA的序列，Alt-R Cas9核酸酶能够特异性地引入双链断裂，其可能导致非同源末端连接，从而最终引入破坏基因功能的突变。采用了三种不同的crRNA：ACTCACGCTGGATAGCCTCC(序列SEQ ID NO：2)、GAGTAGCGCGAGCACAGCTA(SEQ ID NO：3)和GGCCGAGATGTCTCGCTCCG(SEQ ID NO：4)。图1A显示了围绕外显子1的B2M基因和不同crRNA的结合位点(下划线)的概况。所有三种crRNA都设计成与将形成B2M基因的B2M翻译产物的N-末端的区域靠近结合。采用这些crRNA中的一种、所述Alt-R Cas9核酸酶和Alt-R Cas9电穿孔增强子，形成了核糖核蛋白复合物，其电穿孔到PSC中。对于每种不同的crRNA，根据制造商的说明都制备了crRNA:tracRNA:Cas9 RNP复合物。利用Lonza 4D核转染系统(X-单位)和P3溶液试剂盒(Lonza，V4XP-3012)，使用程序CB-150将crRNA:tracRNA:Cas9 RNP复合物转染到PSC中。转染后，铺板并培养PSCs直到出现集落。手工挑取单个集落，并用标准方案传代。通过测序证实了基因组编辑结果。在60个测序的集落中，15个显示B2M的外显子1内突变。

表1示出了结果的概况。只有4个集落确认是克隆的(克隆3、18、20和34)。如图2所示，编辑的基因组导致在一个(克隆3)或两个等位基因(克隆18、20和34)内的框移位。

表1：测序结果总结

(显示成功缺失的克隆3、18、20和34以粗体和下划线突出显示。)

克隆	结果
		B2M-#001	4条序列不具有野生型，无法解析，混合克隆
B2M-#002	1bp缺失，纯合(homo)，低(突变)背景序列
		<u>B2M-#003</u>	<u>1bp插入，杂合(hetero)</u>
B2M-#004	4条序列不具有野生型，无法解析，混合克隆
		B2M-#005	3条序列不具有野生型，无法解析，混合克隆
B2M-#016	3条序列不具有野生型，无法解析，混合克隆
		B2M-#017	3条序列不具有野生型，混合克隆
<u>B2M-#018</u>	<u>13bp缺失，1bp缺失，混合杂合</u>
		B2M-#019	3条序列不具有野生型，无法解析，混合克隆
<u>B2M-#020</u>	<u>1bp缺失，纯合</u>
		B2M-#031	3bp缺失和34bp缺失，混合杂合
B2M-#032	4条序列具有野生型，无法解析，混合克隆
		B2M-#033	背景中的野生型和突变，无法解析，混合克隆
<u>B2M-#034</u>	<u>2bp插入，纯合</u>
		B2M-#035	3条序列不具有野生型，无法解析，混合克隆

对克隆3、18、20和34进行了FACS分析，并与野生型iPSC细胞系50039进行比较(图3)。本实施例分析了B2M(APC标记的抗人B2M，Biolegend)和HLA-A、B、C(PE标记的抗人HLA-、B、C，Biolegend)的表达。如图3所示，未刺激以及干扰素γ刺激24小时之后，野生型和杂合克隆3都在细胞表面显示HLA和B2M。另外三个克隆18、20和34，其在两个等位基因上都包含突变，即使用干扰素γ刺激24小时后，在它们的细胞表面也不显示任何HLA和B2M，由此证实所有克隆都是适合如下所述的HLA融合蛋白敲入的起始细胞。

HLA-E融合蛋白的敲入

HLA-E融合蛋白的敲入可以类似于国际专利申请WO 2012/145384从上述克隆18、20和34中的任何一个开始进行。利用整合的泡沫病毒载体，单链B2M/HLA-E融合蛋白可以在人PSC中表达。所述泡沫病毒载体可以包括具有驱动B2M/HLA-E单链融合构建体(“二聚体”)的启动子的表达盒。所述B2M/HLA-E单链融合蛋白(“二聚体”)可以具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。用于整合所述二聚体的载体可以包含SEQ ID NO：17。三聚体单链融合构建体可以另外包括共价连接的HLA-G肽MAPRTLFLGGGGSGGGGSGGGSIQRTPK(SEQ ID NO：21)(“三聚体”)。用于整合所述三聚体的载体可以包含SEQ ID NO：19。过表达B2M/HLA-E融合蛋白的克隆可以通过结合该融合蛋白的抗体，用流式细胞术来分离。

本实施例采用这样的方法。选择B2M KO TC1133 hiPSC克隆#34作为敲入HLA-E基因的亲本B2M KO系，在该B2M KO TC1133 hiPSC克隆#34中Crispr/Cas9靶向在两个等位基因中都产生2bp(CT)插入，该插入在基因表达中产生了框移。

在已经证明B2M基因也能成功地被B2M Crispr 2/Cas9作为靶标后，接下来本实施例用B2M Crispr 2/Cas9和含有HLA-E-二聚体(SEQ ID NO：17)和HLAE-三聚体(SEQ ID NO：19)序列的供体质粒靶向B2M KO克隆#34中的外显子1区域，所述HLA-E-二聚体和HLAE-三聚体序列具有根据所述KO系的经修饰基因组序列设计的同源臂(图5A)。如预料的那样，与未处理的野生型细胞相比，在电穿孔后观察到相对更多的细胞死亡。然而，hIPCS保持了其正常的形态(图5B)。通过pmaxGFP质粒平行转染的GFP+细胞的流式细胞术分析证明，转染效率超过80％(图5C)。

HLA-E KI hIPSC克隆的表征

HLA-E二聚体和三聚体质粒转染的hIPSCs在96孔板中以单细胞接种以形成集落。另外，从转染的hIPSC池中同时分离基因组DNA。接下来，如所示用引物在5′-同源臂和供体序列内进行PCR(图6A)。如预料的那样，在亲本B2M KO系中没有检测到产物，而相应的区域在转染池中特异性扩增，表明在B2M基因座中基因整合成功(图6A)。考虑到初步数据，筛选了多达100个克隆，发现其中约50个克隆对于HLA-E二聚体(图6B)和三聚体整合(图6C)的上游都是阳性的。

接下来，对HLA-E插入潜在阳性的克隆进行基因分型鉴定。从5′到3′同源臂的PCR扩增被认为证明了完整序列的整合(图7A)。有趣的是，正确的扩增(HLA-E二聚体：2.6kb和HLA-E三聚体：2.8kb)在有限数量的克隆中被检测到，其中HLA-E二聚体克隆#5和78以及HLA-E三聚体克隆#66和100因野生型等位基因在0.9kb处的置换而呈现出一条清晰的带(图7B和C)。

HLA在HLA-E KI hIPSCs中的表达

接着，培养HLA-E二聚体克隆#5和78以及HLA-E三聚体克隆#66和100，并首先分析它们多能性标记(OCT4A和Nanog)的表达。流式细胞术分析证实，所有克隆，包括WT和B2M KO系，都被发现对OCT4A和Nanog二者的表达具有超过90％的双重阳性(图8)。

随后，在用干扰素(IFN)-γ刺激24小时后，检测hIPSCs的B2M和HLA-E蛋白表达。WT细胞表达B2M作为阳性对照，而如预期的那样，B2M KO hIPSC为B2M和HLA-E阴性。另外，>95％的HLA-E二聚体(#5和#78)和三聚体克隆(#66和#100)的B2M和HLA-E表达呈阳性(图9)。

实施例2：用经修饰的PSC产生生物工程化心肌组织

可以采用WO 2015/040142和Tiburcy等人的文章(Tiburcy等人,(2017),Circulation,135:1832-1847)以及WO 2015/025030中所述的方案，从PSC开始产生工程化心肌。实施例1的多能干细胞，特别是克隆18、20和34可用于本实施例中。该方案包括如WO2015/040142中所述的诱导中胚层分化、心脏分化和心脏成熟的步骤，随后如WO 2015/025030所述在I型胶原水凝胶中定向形成组织。

在第一步中，PSC必须分化为心肌细胞。该步可以按照例如Tiburcy等人所报道的(Tiburcy等人,(2017),Circulation,135:1832-1847)且最早在WO 2015/040142公开的方法进行。实施例1的多能干细胞(PSC)可以在1:30的Matrigel上以5×10⁴至1×10⁵个细胞/cm²在磷酸盐缓冲液(PBS)包被的平板上铺板，在与经辐射的人包皮成纤维细胞(HFF)条件培养基(含有10ng/mL成纤维细胞生长因子-2(FGF2)或TeSR-E8(STEMCELL Technologies))按1∶1混合的敲除DMEM、20％敲除血清替代物、2mmol/L谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(都来自Life Technologies)中培养。1天后，用洛斯维帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute(RPMI))培养基冲洗细胞，然后用RPMI、2％B27、200μmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸倍半镁盐水合物(Sigma-Aldrich)、9ng/mL激活素A(R&D Systems)、5ng/mL BMP4(R&D Systems)、1μmol/L CHIR99021(Stemgent)和5ng/mL FGF-2(Miltenyi Biotec)处理3天。在用RPMI培养基进行再次洗涤之后，可在第4-13天用5μmol/LIWP4(Stemgent)培养细胞，接着用RPMI、2％B27、200μmol/L L-抗坏血酸-2-磷酸倍半镁盐水合物培养细胞。需要指出的是，心肌细胞可通过在不含葡萄糖和谷氨酰胺的RPMI(Biological Industries)、2.2mmol/L乳酸钠(Sigma-Aldrich)、100μmol/Lβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素中在第13-17天经葡萄糖剥夺来以代谢方式纯化。

为了产生如Tiburcy等人所报道的(Tiburcy等人,(2017),Circulation,135:1832-1847)且最早公开于WO 2015/025030中的确定的无血清EHM，细胞可在pH中性的医用级牛胶原(LLC Collagen Solutions,0.4mg/EHM)、浓缩无血清培养基(2×RPMI、8％不含胰岛素的B27、200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)的混合物中重构，然后在含4％不含胰岛素的B27、1％非必需氨基酸、2mmol/l谷氨酰胺、300μmol/l抗坏血酸、100ng/ml IGF1(AF-100-11)、10ng/ml FGF-2(AF-100-18B)、5ng/ml VEGF165(AF-100-20)、5ng/ml TGFβ1(AF-100-21C；培养第0-3天期间是强制性的)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(无血清方案，表2)的Iscove培养基中培养。所有生长因子均可作为“无动物重组人生长因子”购自Peprotech，并转移到圆形模具中(内/外径：2/4mm；高：5mm)。然后，人心肌组织可在铸模内迅速凝结，并在培养第3天可转移到优选柔性的拉伸装置上，以促进增张收缩(Zimmermann等人,(2006),Nat Med，12:452-458；Soong等人,(2012),Curr Protoc Cell Biol,55:23.8.1.-23.8.21；Tiburcy等人,(2014),Methods Mol Biol,1181:167-176；在WO2007/054286中所公开的内容并作为参考引入本文)。每隔一天更换培养基。拉伸下的心肌组织培养至少进行7天。图12显示了该方案的示例性结果。

表2：EHM方案概况

DMEM表示杜尔贝科改良伊格尔培养(Dulbecco modified Eagle medium)；EHM：工程化人心肌；FGF-2：成纤维细胞生长因子-2；IGF-1：胰岛素样生长因子1；RPMI：洛斯维帕克纪念研究所培养基；TGF-β1：转化生长因子-β1；和VEGF₁₆₅：血管内皮生长因子165。

^*可替换地含有钙≥1.2mmol/L的其他基础培养基。

实施例3：采用经修饰的PSC产生生物工程化心肌组织

基于上述实施例2中描述的方案(Tiburcy等人，2017以及WO 2015/025030)，将本文获得的hIPSCs(参见实施例1)分化为心肌细胞(CM)。HLA-E KI hIPSC衍生的CMs显示肌小节蛋白的表达；α-辅肌动蛋白和心肌肌钙蛋白T(cTnT)，连同>90％的辅肌动蛋白+细胞的高纯度(图10A)。

流式细胞术分析显示野生型(WT)CMs表达B2M和HLA I类分子；HLA-B和C，但在基本条件下不表达HLA-E。IFN-γ处理诱导出B2M和HLA-B、C分子更强的表达，而HLA-E表达略低(～60％)。作为阴性对照，如预期的，B2M KO CMs显示无HLA表达。HLA-E KI克隆(二聚体和三聚体)仅在IFN-γ处理后表达B2M和HLA-E，并且没有显示出任何其它HLA I类表达。从HLA-E三聚体hIPSC系分化出来的CMs与从HLA-E二聚体分化出的对应心肌相比在初始分析中表现出HLA-E表达略高(HLA-E阳性，HLA-E二聚体CMs：>85％，而HLA-E三聚体CMs：>95％；图10B)。

由此，在本实施例中，实验性地由缺乏呈递于多能干细胞的细胞表面的内源性MHCI类分子并在其表面包含免疫调节蛋白的多能干细胞产生了心肌细胞(作为对于工程化心脏组织的功能所必需的细胞类型)。

该实施例进一步旨在从本文所述的获得的心肌细胞并利用Tiburcy等人(Tiburcy等人.2017)和WO 2015/025030所报道的方案产生非免疫原性工程化心脏组织(参见实施例2)。图11A示出了所采取的方法的示意图，图11B示出了在生产过程中EHM的图像。图12是示例性EHM的照片。

成纤维细胞用作形成工程化组织的一部分的第二细胞类型。这些细胞提供结缔组织。在本实施例中，采用了未修饰的成纤维细胞，即不修饰免疫原性。为了用于治疗，形成工程化组织的一部分的成纤维细胞也可以从缺乏呈递于多能干细胞的细胞表面的内源性MHCI类分子并在其表面包含免疫调节蛋白的多能干细胞获得。

如本文所述的EHM生产完成后，比较了野生型EHM、B2M敲除EHM、HLA-E二聚体EHM和HLA-E三聚体EHM的收缩力(FOC)(参见图10C)。从结果中可以明显看出，所有分析的EHM都显示出收缩力随着Ca²⁺浓度增加而增大。有趣的是，衍生自经遗传修饰的PSCs的EHM显示出比未经修饰的(WT)EHM更强的收缩力。

总而言之，本实施例表明EHM(作为本发明的非免疫原性工程化组织的示例)可以从心肌细胞产生，所述心肌细胞是通过多能干细胞分化为所述至少一种细胞类型而获得的，其中所述多能干细胞缺乏呈递于所述多能干细胞的细胞表面的内源性MHC I类分子(B2M敲除)并在其表面包含免疫调节蛋白(HLA-E二聚体/三聚体)。

实施例4：采用经修饰的PSC产生工程化脑组织/神经元

Lancaster等人公开了用于产生人脑组织的例子(Lancaster等人,2013,Nature,501:373-379)。本发明产生脑的类器官。实施例1的多能干细胞可用于本实施例中。

PSC可以根据WiCell方案维持在经CF-1-γ辐射的小鼠胚胎干细胞(MEFs)(GlobalStem)上。在类器官培养的第0天，传代少于50代的PSC可以通过解离酶处理从MEFs中解离出来，MEFs可以在PSC胰蛋白酶化以产生单细胞之前通过干细胞集落的重力分离而除去。总共4500个细胞随后可以在人ES培养基(含低浓度碱性成纤维细胞生长因子(4ng/ml)和50mMRho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(Calbiochem))中铺板在超低结合96孔板(Corning)的每个孔中。类胚体可以隔天加料一次，连续6天，然后转移到低粘附24孔板(Corning)的含有杜尔贝科改良伊格尔培养(DMEM)/F12、1:100N2补充剂(Invitrogen)、谷胱甘肽(Glutamax，Invitrogen)、最低必需培养基-非必需氨基酸(MEM-NEAA)和1mg/ml肝素50(Sigma)的神经诱导培养基中。然后，细胞可以开始形成神经上皮组织，隔天加料一次，连续5天。在本方案的第11天，所述组织可以通过移液到一张具有3mm小凹坑的封口膜上的冷Matrigel中而转移到Matrigel(BD Biosciences)的液滴中。这些液滴可在37℃下凝胶化，随后从封口膜上转移，并在含有DMEM/F12和神经基质(Neurobasal)的1:1混合物的分化培养基中生长，所述神经基质含有1:200的N2补充剂(Invitrogen)、1:100不含维生素A的B27补充剂(Invitrogen)、3.5μl/l的2-巯基乙醇、1:4,000胰岛素(Sigma)、1:100谷胱甘肽(Invitrogen)和1:200MEM-NEAA。在稳定生长4天后，组织液滴可以被转移到含有上述分化培养基的旋转生物反应器中，但是该分化培养基可以使用含维生素A的B27补充剂(Invitrogen)。由于视黄酸已经被证明对体内神经元分化很重要，因此它可以被包括在用于分化脑的类器官的最终培养基中。

实施例5：采用经修饰的PSC产生工程化骨骼肌组织

Rao等人公开了诱导PSC分化为骨骼肌组织的示例性方法(Rao等人,(2018),Nature Communications,9(126):1-12)。实施例1的多能干细胞可用于本实施例中。分化方案分为几个步骤：

hPSCs向iMPCs的肌原性分化

PSC可以在无饲养细胞的条件下在E8培养基(Stemcell Technologies)中维持。PSC集落可以用Accutase(Stemcell Technologies)解离成单细胞，并以1×10³个/cm²的细胞密度接种到涂覆有Matrigel(Corning)的6孔板上。PSC可以保持在E8培养基中进行扩增，然后用Accutase解离成单细胞并以3.3×10⁴个细胞/cm²接种到涂覆有Matrigel的6孔板上的补充了Y27632(5μM，Tocris)的E8培养基中。第二天，可以用E6培养基代替E8培养基，并且细胞可以在补充CHIPR99021(10μM，Selleck Chemical)的条件下培养2天，之后可以除去CHIR99021，在补充1μg/ml Dox(Sigma)的E6培养基中培养细胞18天，直到诱导的肌原祖细胞(iIMPCs)可以如下所述通过FACS进行分选。

流式细胞术分析

细胞可以用0.25％胰蛋白酶-EDTA解离，计数并用PBS洗涤，然后以2×10⁶至1×10⁷个细胞/ml的浓度重新悬浮在流动缓冲液中。为了计数表达Tra-1-81或CD56的细胞，可以根据制造商的说明，采用抗Tra-1-81抗体(Stemgent，09-0011)或抗CD56抗体(PE，R&D，FAB2408P)和同型匹配的对照并使用FACSCanto^TM II流式细胞仪(BD Biosciences)来分析细胞。目标细胞群体可以首先针对细胞大小和粒度，然后针对Tra-1-81或CD56的表达水平进行门控。

iMPCs的分选

在分化第20天，细胞可以用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Thermo)解离，并在中和培养基中洗涤。分离的细胞可以按300g 5分钟进行离心，然后可以重新悬浮在分选溶液中，并通过30μm过滤器(SYSMEX)过滤以除去团簇和碎片。单细胞悬浮液可以在冰上保持直到分选，未分化的hPSCs用作阴性对照。可以使用

174Astrios^TM细胞分选器(BeckmanCoulter)以GFP对细胞进行分选。

iMPCs的扩增

分选后，iMPCSs可在收集溶液中在冰上保持，按300g 5分钟旋转沉降，并重新悬浮在补充有Y27632、Dox和bFGF的新鲜E6培养基中，然后可以按4×10⁴/cm²接种在Matrigel涂覆的烧瓶中。分选后24-48小时后，细胞可在补充有Dox和bFGF的扩增培养基(EM)中孵育，并在达到80％汇合后每隔3-4天以1:3-1:6的比例传代。

iMPCs的二维分化

iMPCs可以按1×10⁵/cm²的密度接种到Matrigel涂覆的培养皿上，当达到100％汇合后，可以用PBS洗掉EM，并切换成可隔天更换一次的分化培养基(DM)。

iSKM肌束的构建和分化

三维工程化骨骼肌(iSKM束)可以在聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具中形成，该模具包含两个半圆柱形孔(长7mm，直径2mm)，由3D加工的特氟隆(Teflon)母模铸造而成。PDMS模具可涂覆0.2％(w/v)pluronic(Invitrogen)在室温下保持1小时以防止水凝胶粘连。激光切割的

框架(9×9mm²，边缘宽1mm)位于2个孔周围，用于锚定肌束端部并便于处理和植入。可将细胞/水凝胶混合物注入PDMS孔中，并在37℃下聚合30分钟。形成的iSKM肌束可以在EM(补充有1μg/ml Dox和1.5mg/mL 6-氨基己酸(ACA，Sigma))中在摇摆平台上保持4天。然后可以将培养基切换成补充有2mg/mL ACA和50μg/mL抗坏血酸(Sigma)的DM，每天更换培养基。

实施例6：采用经修饰的PSC产生工程化胰腺组织

在Pagliuca等人的文章中公开了产生胰腺组织，或更具体地是胰岛素分泌的β细胞的示例性方法(Pagliuca等人,(2014),Cell，159:428-439)。本实施例中，多能干细胞分化为产生胰岛素的胰腺β细胞(SC-β)：

为了引发SC-β细胞分化，多能干细胞可以按6×10⁵个细胞/ml接种到补充有10mMY27632的mTeSR1培养基中。所述分化可以通过将培养基切换为日更培养基来开始。培养基的切换如下。第1天：S1+100ng/ml激活素(R&D系System)+3mM Chir99021(Stemgent)。第2天：S1+100ng/ml激活素A。第4、第6天：S2+50ng/ml KGF(Peprotech)。第7、第8天：S3+50ng/ml KGF+0.25mM Sant1(Sigma)+2mM RA(Sigma)+200nM LDN193189(仅第7天)(Sigma)+500nM PdBU(EMD Millipore)。第9、11和13天：S3+50ng/mlKGF+0.25mM Sant1+100nM RA。第14、第16天：S5+0.25mM Sant1+100nM RA+1mM XXI(EMD Millipore)+10mM Alk5i II(Axxora)+1mM T3(EMD Millipore)+20ng/ml Betacellulin(Thermo FisherScientific)。第18、第20天：S5+25nM RA+1mM XXI+10mM Alk5i II+1mM T3+20ng/mlBetacellulin。第21-35天(隔天更换)：S6+10mM Alk5i II+1mM T3。由此诱导多能干细胞分化为SC-β细胞

本说明书中罗列的或讨论在先已经公开的文件不应当必然地被当作承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。

本说明书中说明性描述的本发明可以在缺少未在这里具体公开的任何一个或多个元件、一个限制条件或多个限制条件的情况下适当地被实施。因此，例如，术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应扩展地且不限制地解读。另外，本文所用的术语和措辞是被用来描述性而不是限制性术语，并且使用这样的术语和措辞并不意味着排除所示和所述的特征或其部分的任何等同替换，而是应该认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种改进。因此，应当理解，尽管本发明由示例性实施例和可选特征而被具体公开，本文所公开的包括在其中的本发明的改进和变化可被本领域技术人员所采用，并且这种修进和变化被认为在本发明的范围之内。

本发明在此被大体上和一般性地描述。属于通用披露内容的较狭义类型和亚属组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括本发明的通用说明，其限制条件或负面限制是从所述属中移除任何标的物，无论所删除的材料是否在本文中特定叙述。

其它实施例均在下述权利要求书的范围内。此外，当根据马库什组描述本发明的特征或方面时，所属领域的技术人员应认识到本发明也由此根据马库什组中成员的任何个别成员或子组描述。

序列表

<110> L·杰罗姆罗

<120> 非免疫原性工程化组织及其生产方法和用途

<130> LC21310001P

<150> EP 18183294.0

<151> 2018-07-13

<160> 30

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 肽抗原

<400> 1

Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu

1 5

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> BM2 crRNA #1

<400> 2

actcacgctg gatagcctcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> B2M crRNA # 2

<400> 3

gagtagcgcg agcacagcta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> B2M crRNA #3

<400> 4

ggccgagatg tctcgctccg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> B2M crRNA # 1 + PAM

<400> 5

actcacgctg gatagcctcc agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> B2M crRNA #2 + PAM

<400> 6

gagtagcgcg agcacagcta agg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> B2M crRNA #3 + PAM

<400> 7

ggccgagatg tctcgctccg tgg 23

<210> 8

<211> 550

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

cgcaccccag atcggagggc gccgatgtac agacagcaaa ctcacccagt ctagtgcatg 60

ccttcttaaa catcacgaga ctctaagaaa aggaaactga aaacgggaaa gtccctctct 120

ctaacctggc actgcgtcgc tggcttggag acaggtgacg gtccctgcgg gccttgtcct 180

gattggctgg gcacgcgttt aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag 240

ctgacagcat tcgggccgag atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct 300

ctctttctgg cctggaggct atccagcgtg agtctctcct accctcccgc tctggtcctt 360

cctctcccgc tctgcaccct ctgtggccct cgctgtgctc tctcgctccg tgacttccct 420

tctccaagtt ctccttggtg gcccgccgtg gggctagtcc agggctggat ctcggggaag 480

cggcggggtg gcctgggagt ggggaagggg gtgcgcaccc gggacgcgcg ctacttgccc 540

ctttcggcgg 550

<210> 9

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆3的第一等位基因

<400> 9

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggacggc 120

tatccagcgt gagtctctcc taccctcccg c 151

<210> 10

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆3的第二等位基因

<400> 10

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 120

atccagcgtg agtctctcct accctcccgc 150

<210> 11

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆18的第一等位基因

<400> 11

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggtgagt 120

ctctcctacc ctcccgc 137

<210> 12

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆18的第二等位基因

<400> 12

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggagcta 120

tccagcgtga gtctctccta ccctcccgc 149

<210> 13

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆20的第一等位基因

<400> 13

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggagcta 120

tccagcgtga gtctctccta ccctcccgc 149

<210> 14

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆20的第二等位基因

<400> 14

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggagcta 120

tccagcgtga gtctctccta ccctcccgc 149

<210> 15

<211> 152

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆34的第一等位基因

<400> 15

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctctgtgc tcgcgctact ctctctttct ggcctggagg 120

ctatccagcg tgagtctctc ctaccctccc gc 152

<210> 16

<211> 152

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 克隆34的第二等位基因

<400> 16

aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60

atgtctcgct ccgtggcctt agctctgtgc tcgcgctact ctctctttct ggcctggagg 120

ctatccagcg tgagtctctc ctaccctccc gc 152

<210> 17

<211> 2338

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HLA-E二聚体序列

<400> 17

acagcaaact cacccagtct agtgcatgcc ttcttaaaca tcacgagact ctaagaaaag 60

gaaactgaaa acgggaaagt ccctctctct aacctggcac tgcgtcgctg gcttggagac 120

aggtgacggt ccctgcgggc cttgtcctga ttggctgggc acgcgtttaa tataagtgga 180

ggcgtcgcgc tggcgggcat tcctgaagct gacagcattc gggccgagat gtctcgctcc 240

gtggccttag ctgtgctcgc gctactctct ctttctggcc tgggaagcgg agagggcaga 300

ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gcccaatgtc acgatctgtt 360

gcgctggccg tgttggctct tctgtccctg agcggcctcg aggctatcca gcgtacgcca 420

aagattcagg tttactcacg tcatccagca gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc 480

tatgtgtctg ggtttcatcc atccgacatt gaagttgact tactgaagaa tggagagaga 540

attgaaaaag tggagcattc agacttgtct ttcagcaagg actggtcttt ctatctcttg 600

tactacactg aattcacccc cactgaaaaa gatgagtatg cctgccgtgt gaaccatgtg 660

actttgtcac agcccaagat agttaagtgg gatcgcgaca tgggtggtgg cggttctggt 720

ggtggcggta gtggcggcgg aggaagcggt ggtggcggtt ccggatctca ctccttgaag 780

tatttccaca cttccgtgtc ccggcccggc cgcggggagc cccgcttcat ctctgtgggc 840

tacgtggacg acacccagtt cgtgcgcttc gacaacgacg ccgcgagtcc gaggatggtg 900

ccgcgggcgc cgtggatgga gcaggagggg tcagagtatt gggaccggga gacacggagc 960

gccagggaca ccgcacagat tttccgagtg aacctgcgga cgctgcgcgg ctactacaat 1020

cagagcgagg ccgggtctca caccctgcag tggatgcatg gctgcgagct ggggcccgac 1080

aggcgcttcc tccgcgggta tgaacagttc gcctacgacg gcaaggatta tctcaccctg 1140

aatgaggacc tgcgctcctg gaccgcggtg gacacggcgg ctcagatctc cgagcaaaag 1200

tcaaatgatg cctctgaggc ggagcaccag agagcctacc tggaagacac atgcgtggag 1260

tggctccaca aatacctgga gaaggggaag gagacgctgc ttcacctgga gcccccaaag 1320

acacacgtga ctcaccaccc catctctgac catgaggcca ccctgaggtg ctgggctctg 1380

ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc tggcagcagg atggggaggg ccatacccag 1440

gacacggagc tcgtggagac caggcctgca ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct 1500

gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggcta 1560

cccgagcccg tcaccctgag atggaagccg gcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc 1620

atcattgctg gcctggttct ccttggatct gtggtctctg gagctgtggt tgctgctgtg 1680

atatggagga agaagagctc aggtggaaaa ggagggagct actataaggc tgagtggagc 1740

gacagtgccc aggggtctga gtctcacagc ttgtaagcct cgactgtgcc ttctagttgc 1800

cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 1860

actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 1920

attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 1980

catgctgggg ataaggctat ccagcgtgag tctctcctac cctcccgctc tggtccttcc 2040

tctcccgctc tgcaccctct gtggccctcg ctgtgctctc tcgctccgtg acttcccttc 2100

tccaagttct ccttggtggc ccgccgtggg gctagtccag ggctggatct cggggaagcg 2160

gcggggtggc ctgggagtgg ggaagggggt gcgcacccgg gacgcgcgct acttgcccct 2220

ttcggcgggg agcaggggag acctttggcc tacggcgacg ggagggtcgg gacaaagttt 2280

agggcgtcga taagcgtcag agcgccgagg ttgggggagg gtttctcttc cgctcttt 2338

<210> 18

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-E二聚体蛋白序列

<400> 18

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

20 25 30

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val

35 40 45

Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro

50 55 60

Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn

65 70 75 80

Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val

85 90 95

Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp

100 105 110

Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu

115 120 125

Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val

130 135 140

Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Gly Ser His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser Arg

180 185 190

Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp

195 200 205

Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Val

210 215 220

Pro Arg Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp Arg

225 230 235 240

Glu Thr Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu

245 250 255

Arg Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr

260 265 270

Leu Gln Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Arg Arg Phe Leu

275 280 285

Arg Gly Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu

290 295 300

Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile

305 310 315 320

Ser Glu Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala

325 330 335

Tyr Leu Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys

340 345 350

Gly Lys Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr

355 360 365

His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu

370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu

385 390 395 400

Gly His Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp

405 410 415

Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu

420 425 430

Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Val

435 440 445

Thr Leu Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly

450 455 460

Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala Val

465 470 475 480

Val Ala Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly

485 490 495

Ser Tyr Tyr Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu Ser

500 505 510

His Ser Leu

515

<210> 19

<211> 2410

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> HLA-E三聚体序列，包括靶抗原肽

<400> 19

acagcaaact cacccagtct agtgcatgcc ttcttaaaca tcacgagact ctaagaaaag 60

gaaactgaaa acgggaaagt ccctctctct aacctggcac tgcgtcgctg gcttggagac 120

aggtgacggt ccctgcgggc cttgtcctga ttggctgggc acgcgtttaa tataagtgga 180

ggcgtcgcgc tggcgggcat tcctgaagct gacagcattc gggccgagat gtctcgctcc 240

gtggccttag ctgtgctcgc gctactctct ctttctggcc tgggaagcgg agagggcaga 300

ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gcccaatgtc acgatctgtt 360

gcgctggccg tgttggctct tctgtccctg agcggcctcg aggctgttat ggctccgcgg 420

actttaattt taggtggtgg cggatccggt ggtggcggtt ctggtggtgg cggctccatc 480

cagcgtacgc caaagattca ggtttactca cgtcatccag cagagaatgg aaagtcaaat 540

ttcctgaatt gctatgtgtc tgggtttcat ccatccgaca ttgaagttga cttactgaag 600

aatggagaga gaattgaaaa agtggagcat tcagacttgt ctttcagcaa ggactggtct 660

ttctatctct tgtactacac tgaattcacc cccactgaaa aagatgagta tgcctgccgt 720

gtgaaccatg tgactttgtc acagcccaag atagttaagt gggatcgcga catgggtggt 780

ggcggttctg gtggtggcgg tagtggcggc ggaggaagcg gtggtggcgg ttccggatct 840

cactccttga agtatttcca cacttccgtg tcccggcccg gccgcgggga gccccgcttc 900

atctctgtgg gctacgtgga cgacacccag ttcgtgcgct tcgacaacga cgccgcgagt 960

ccgaggatgg tgccgcgggc gccgtggatg gagcaggagg ggtcagagta ttgggaccgg 1020

gagacacgga gcgccaggga caccgcacag attttccgag tgaacctgcg gacgctgcgc 1080

ggctactaca atcagagcga ggccgggtct cacaccctgc agtggatgca tggctgcgag 1140

ctggggcccg acaggcgctt cctccgcggg tatgaacagt tcgcctacga cggcaaggat 1200

tatctcaccc tgaatgagga cctgcgctcc tggaccgcgg tggacacggc ggctcagatc 1260

tccgagcaaa agtcaaatga tgcctctgag gcggagcacc agagagccta cctggaagac 1320

acatgcgtgg agtggctcca caaatacctg gagaagggga aggagacgct gcttcacctg 1380

gagcccccaa agacacacgt gactcaccac cccatctctg accatgaggc caccctgagg 1440

tgctgggctc tgggcttcta ccctgcggag atcacactga cctggcagca ggatggggag 1500

ggccataccc aggacacgga gctcgtggag accaggcctg caggggatgg aaccttccag 1560

aagtgggcag ctgtggtggt gccttctgga gaggagcaga gatacacgtg ccatgtgcag 1620

catgaggggc tacccgagcc cgtcaccctg agatggaagc cggcttccca gcccaccatc 1680

cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt ctccttggat ctgtggtctc tggagctgtg 1740

gttgctgctg tgatatggag gaagaagagc tcaggtggaa aaggagggag ctactataag 1800

gctgagtgga gcgacagtgc ccaggggtct gagtctcaca gcttgtaagc ctcgactgtg 1860

ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 1920

ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 1980

aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 2040

gacaatagca ggcatgctgg ggataaggct atccagcgtg agtctctcct accctcccgc 2100

tctggtcctt cctctcccgc tctgcaccct ctgtggccct cgctgtgctc tctcgctccg 2160

tgacttccct tctccaagtt ctccttggtg gcccgccgtg gggctagtcc agggctggat 2220

ctcggggaag cggcggggtg gcctgggagt ggggaagggg gtgcgcaccc gggacgcgcg 2280

ctacttgccc ctttcggcgg ggagcagggg agacctttgg cctacggcga cgggagggtc 2340

gggacaaagt ttagggcgtc gataagcgtc agagcgccga ggttggggga gggtttctct 2400

tccgctcttt 2410

<210> 20

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HLA-E三聚体，包括靶肽抗原

<400> 20

Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val

20 25 30

Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys

35 40 45

Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys

50 55 60

Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser

65 70 75 80

Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr

85 90 95

Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln

100 105 110

Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser

130 135 140

His Ser Leu Lys Tyr Phe His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly

145 150 155 160

Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val

165 170 175

Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Val Pro Arg Ala Pro

180 185 190

Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Ser

195 200 205

Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg Val Asn Leu Arg Thr Leu Arg

210 215 220

Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Trp Met

225 230 235 240

His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Arg Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Glu

245 250 255

Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Thr Leu Asn Glu Asp Leu

260 265 270

Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Glu Gln Lys

275 280 285

Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Asp

290 295 300

Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr Leu Glu Lys Gly Lys Glu Thr

305 310 315 320

Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile

325 330 335

Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro

340 345 350

Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln Asp Gly Glu Gly His Thr Gln

355 360 365

Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln

370 375 380

Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr

385 390 395 400

Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Val Thr Leu Arg Trp

405 410 415

Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly

420 425 430

Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser Gly Ala Val Val Ala Ala Val

435 440 445

Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Tyr Lys

450 455 460

Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Glu Ser His Ser Leu

465 470 475

<210> 21

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 靶肽抗原

<400> 21

Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys

20 25

<210> 22

<211> 283

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于整合到B2M基因中的5'同源臂

<400> 22

acagcaaact cacccagtct agtgcatgcc ttcttaaaca tcacgagact ctaagaaaag 60

gaaactgaaa acgggaaagt ccctctctct aacctggcac tgcgtcgctg gcttggagac 120

aggtgacggt ccctgcgggc cttgtcctga ttggctgggc acgcgtttaa tataagtgga 180

ggcgtcgcgc tggcgggcat tcctgaagct gacagcattc gggccgagat gtctcgctcc 240

gtggccttag ctgtgctcgc gctactctct ctttctggcc tgg 283

<210> 23

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于整合到B2M基因中的5'同源臂

<400> 23

acagcaaact cacccagtct agtgcatgcc ttcttaaaca tcacgagact ctaagaaaag 60

gaaactgaaa acgggaaagt ccctctctct aacctggcac tgcgtcgctg gcttggagac 120

aggtgacggt ccctgcgggc cttgtcctga ttggctgggc acgcgtttaa tataagtgga 180

ggcgtcgcgc tggcgggcat tcctgaagct gacagcattc gggccgagat gtctcgctcc 240

gtggccttag ctctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctgg 285

<210> 24

<211> 343

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于整合到B2M基因中的3'同源臂

<400> 24

gctatccagc gtgagtctct cctaccctcc cgctctggtc cttcctctcc cgctctgcac 60

cctctgtggc cctcgctgtg ctctctcgct ccgtgacttc ccttctccaa gttctccttg 120

gtggcccgcc gtggggctag tccagggctg gatctcgggg aagcggcggg gtggcctggg 180

agtggggaag ggggtgcgca cccgggacgc gcgctacttg cccctttcgg cggggagcag 240

gggagacctt tggcctacgg cgacgggagg gtcgggacaa agtttagggc gtcgataagc 300

gtcagagcgc cgaggttggg ggagggtttc tcttccgctc ttt 343

<210> 25

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> T2A自切割肽

<400> 25

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> B2m靶向信号

<400> 26

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala

20

<210> 27

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> pBHGA元件

<400> 27

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggataa 218

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> B2M外显子的一部分

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(30)

<223> n为a、c、g或t

<400> 28

cctggaggct atccagcgtg agtctctnnn 30

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 5'同源臂

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> n为a、c、g或t

<400> 29

nnnatgtctc gctccgtggc cttagctctg tgctcgcgct actctctctt tctggcctgg 60

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 3'同源臂

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> n为a、c、g或t

<400> 30

gctatccagc gtgagtctct nnn 23

Claims

1.一种从多能干细胞生产非免疫原性工程化组织的方法，所述多能干细胞缺乏被呈递于所述多能干细胞的细胞表面的内源性MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，

其中，所述方法包括在对于所述工程化组织的功能所必需的至少一种细胞类型的存在下，在允许形成所述工程化组织的条件下，形成所述工程化组织，其中所述至少一种细胞类型已通过所述多能干细胞分化为所述至少一种细胞类型而获得，

由此使所述工程化组织对所述工程化组织的受体是非免疫原性的。

2.权利要求1所述的方法，其中，所述工程化组织

(a)不被效应T细胞识别为是同种异体的，和/或

(b)对NK介导的裂解具有抗性。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述工程化组织不结合抗HLA抗体。

4.权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫调节蛋白是单链融合HLA I类蛋白。

5.权利要求4所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M，所述至少一部分B2M与至少一部分HLA I类α链共价连接，所述HLA I类α链选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。

6.权利要求4至5中任一项所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-A。

7.权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-A0201。

8.权利要求4或5所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-E。

9.权利要求4或5所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-G。

10.权利要求4或5所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-B。

11.权利要求4或5所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-C。

12.权利要求4或5所述的方法，其中，所述单链融合HLA I类蛋白包含至少一部分B2M和至少一部分HLA-F。

13.权利要求4至12中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞进一步表达由在所述多能干细胞表面的所述单链融合HLA I类蛋白呈递的靶肽抗原。

14.权利要求13所述的方法，其中，所述靶肽抗原与所述单链融合HLA I类蛋白共价连接。

15.权利要求13或14所述的方法，其中，所述靶肽抗原包含序列VMAPRTLFL(SEQ ID NO：1)。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，在所述多能干细胞中，β-微球蛋白2基因的所有拷贝基本上都被破坏。

17.权利要求1至16中任一项所述的方法，包括在形成所述组织的一部分的至少一种第二细胞类型的存在下形成所述工程化组织。

18.权利要求17所述的方法，其中，形成所述工程化组织的一部分的所述第二细胞类型选自成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞和间充质干细胞。

19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述工程化组织选自心脏组织、肝脏组织、肾脏组织、脑组织、胰腺组织、肺组织、骨骼肌组织、胃肠组织、神经元组织、皮肤组织、骨组织、骨髓、脂肪组织、结缔组织、视网膜组织和血管组织。

20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述工程化组织为心脏组织，所述方法包括：

(i)在基础培养基中培养所述多能干细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)BMP4、激活素A、FGF2、GSK3-抑制剂，和(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱盐酸盐、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)的无血清补充剂，由此诱导所述多能干细胞的中胚层分化；

(ii)在基础培养基中培养步骤(i)中获得的细胞，所述基础培养基包含有效量的Wnt-信号传导通路抑制剂和如步骤(i)中所述的无血清补充剂，由此诱导所述细胞的心肌分化；和

(iii)在机械刺激下，在包含有效量的如步骤(i)中所述的无血清补充剂的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，由此促进心肌成熟。

21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述组织的形成在水凝胶的存在下进行，所述水凝胶优选包含细胞外基质蛋白的水凝胶，如纤维蛋白水凝胶或胶原水凝胶，最优选胶原水凝胶。

22.权利要求20或21所述的方法，进一步包括：

(iv)在一个或多个模具中提供无血清重构混合物，所述重构混合物包含(a)无血清最低必需培养基；(b)得到终浓度为0.5-50mg/ml白蛋白、1-100μg/ml转铁蛋白、0.1-10μg/ml乙醇胺、0.003-0.3μg/ml亚硒酸钠、0.4-40μg/ml L-肉碱盐酸盐、0.1-10μg/ml氢化可的松、0.05-5μl/ml脂肪酸补充剂、0.0001-0.1μg/ml三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)和0.2-2mg/ml胶原的无血清补充剂；和(c)步骤(iii)中获得的细胞和形成所述工程化组织的一部分的细胞类型，优选人非肌细胞，其中任选地，形成所述工程化组织的一部分的所述细胞衍生自所述多能干细胞，其中总细胞混合物的20-80％是步骤(iii)中获得的细胞；

其中所述重构混合物的pH值为7.2-7.6；

(v)在所述一个或多个模具中培养所述无血清重构混合物，由此使所述无血清重构混合物凝结至少15分钟；

(vi)在所述一个或多个模具中，在无血清EHM培养基中培养步骤(v)中获得的混合物，直到所述混合物凝结到其原始厚度的至少50％，其中所述EHM培养基包含(a)含有0.5-3mmol/L Ca²⁺的基础培养基；(b)如步骤(i)(b)中所定义的无血清补充剂；(c)0.5-10mmol/LL-谷氨酰胺；(d)0.01-1.0mmol/L抗坏血酸；(e)1-100ng/ml IGF-1；和(f)1-10ng/ml TGFβ1；

(vii)在步骤(iii)(a)-(f)中所定义的无血清EHM培养基中，在机械拉伸下培养步骤(iii)中获得的混合物，由此形成产生力的工程化心脏组织。

23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞选自胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和孤雌生殖干细胞。

24.权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞是灵长类动物来源的多能干细胞，优选人多能干细胞。

25.权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞从分离自脐带血的CD34阳性细胞产生。

26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞是NINDS人类细胞和数据库中的ND-50039。

27.权利要求1至26中任一项所述的方法，进一步包括

另外诱导所述多能干细胞分化为形成所述工程化组织的一部分的至少一种第二细胞类型，

其中，使对于所述工程化组织的功能所必需的细胞类型的细胞和形成所述工程化组织的一部分的所述第二细胞类型的细胞在分化后相接触以形成工程化组织。

28.权利要求27所述的方法，其中，形成所述工程化组织的一部分的所述第二细胞类型是成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、网状细胞或间充质干细胞。

29.权利要求1至28中任一项所述的方法，其中，所述B2M的破坏和/或所述免疫调节蛋白的插入由工程化核酸酶介导。

30.权利要求29所述的方法，其中，所述工程化核酸酶选自巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应子基核酸酶(TALEN)和成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR/Cas9)。

31.权利要求29或30所述的方法，其中，所述工程化核酸酶是CRISPR/Cas9，所述crRNA选自ACTCACGCTGGATAGCCTCC(SEQ ID NO：2)、GAGTAGCGCGAGCACAGCTA(SEQ ID NO：3)、GGCCGAGATGTCTCGCTCCG(SEQ ID NO：4)、ACTCACGCTGGATAGCCTCCAGG(SEQ ID NO：5)、GAGTAGCGCGAGCACAGCTAAGG(SEQ ID NO：6)和GGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGG(SEQ ID NO：7)。

32.权利要求1至31中任一项所述的方法，其中，在所述工程化组织形成的同时，所述多能干细胞分化为所述至少一种细胞类型。

33.一种工程化组织，包含：

一种对于所述工程化组织的功能所必需的细胞类型，其中，所述细胞类型已通过在适合于多能干细胞分化为所述类型的条件下使多能干细胞分化为所述细胞类型而获得，其中所述多能干细胞缺乏MHC I类分子并在其表面包含免疫调节蛋白，

34.权利要求33所述的工程化组织，进一步包含形成所述组织的一部分的至少第二细胞类型。

35.一种通过权利要求1至32中任一项所述的方法可获得的工程化组织。

36.一种通过权利要求1至32中任一项所述的方法获得的工程化组织。

37.权利要求33至36中任一项所述的工程化组织，进一步包含细胞外基质生物材料。

38.权利要求37所述的工程化组织，其中，所述细胞外基质生物材料是海藻酸盐、水凝胶、胶原水凝胶、纤维蛋白水凝胶或合成基质如聚乳酸、聚乙醇酸、和聚癸二酸甘油酯(生物橡胶)、和聚八亚甲基马来酸(酸酐)柠檬酸酯；其中，优选地，所述细胞外基质生物材料是I型胶原。

39.权利要求38所述的工程化组织，其中，所述合成基质材料是聚乳酸或聚乙醇酸。

40.权利要求33至39中任一项所述的工程化组织，其中，所述工程化组织

(a)不被效应T细胞识别为是同种异体的，

(b)不结合抗HLA抗体，和/或

(c)对NK介导的裂解具有抗性。

41.一种包含权利要求33至40中任一项所述的工程化组织的药物组合物。

42.权利要求33至40中任一项所述的工程化组织或权利要求41所述的药物组合物，其在治疗病症的方法中使用。

43.一种治疗病症的方法，包括给予有此需要的受试者有效量的权利要求33至40中任一项所述的工程化组织或权利要求41所述的药物组合物。

44.权利要求42所述使用的工程化组织或药物组合物或权利要求43所述的治疗方法，其中，所述病症选自糖尿病、自身免疫性疾病、癌症、感染、心肌梗塞、心力衰竭、骨骼或关节病症、成骨不全、烧伤、肝衰竭、肾衰竭、脑损伤或软组织损伤。

45.如权利要求33至40中任一项所定义的工程化组织

(a)在用于药物毒性筛选的体外模型中的用途；和/或

(b)作为研究工具的用途。

46.一种包含选自SEQ ID NOs：2-7的至少一条序列的核酸。

47.权利要求46所述的核酸用于破坏B2M基因表达的用途。