JP2021534813A - 非免疫原性の操作された組織ならびにそれを製造および使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年7月13日に出願された欧州出願特許第18183294.0号の優先権の恩典を主張し、この内容は全ての目的について参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明は、多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、ここで、方法が、操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が、操作された組織の形成も可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導することによって得られたものである、工程を含む、方法を提供する。本発明はさらに、操作された組織、操作された組織を含む薬学的組成物、操作された組織を使用する医学的処置、および操作された組織の使用に関する。
からなる群より選択される。
本発明は、機能性β2-ミクログロブリン(B2M)の発現を欠き、それによってMHCクラスI分子を欠損しているが、HLA-E、即ち、免疫調節タンパク質を発現する、多能性幹細胞が、操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性である操作された組織の製造のために使用することができるという驚くべき知見に基づく。MHCクラスI分子を欠損しておりかつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含む多能性幹細胞の使用は、それが、レシピエントの免疫系によって同種異系とはしかしもはや認識されない同種異系操作された組織を提供するという利点を有する。従って、重要なことには、組織の機能に必須である細胞へ分化されている幹細胞によって得られる、そのように得られた同種異系操作された組織(レシピエントの免疫系に対して「ロボチック組織」または「ステルス組織」とも本明細書において呼ばれる)は、組織拒絶または移植片対宿主病のような合併症のリスクを完全に回避するかまたは少なくとも減少させるために、組織のレシピエント(患者)が免疫抑制へ供されることを必要としない。これは、本発明のロボチック組織を、例えば器官または組織置換移植における、操作された心臓組織、肝臓組織、網膜組織または腎組織のような機能性組織の治療適用のための理想的な候補とする。この文脈において、MHCクラスI分子の表面発現を排除してMHCクラスI(HLAクラスI)を欠損している細胞を提供するためのβ2-ミクログロブリン(B2M)遺伝子の破壊は、1992年に国際特許出願WO 92/09688(国際特許出願WO 2012/145384も参照されたい)によって既に記載されており、しかし、このアプローチは、Gornalusse et al “HLA-E-expressing pluripotent stem cells escape allogeneic responses and lysis by NK cells” (2017), Nature Biotechnology, 35(8):765-772によって報告されたように、細胞をナチュラルキラー(NK)細胞による溶解に脆弱にしておくことが注意される。この「自己喪失」応答に取り組むために、Gornalusseらは、最小限に多形性のHLA-E分子の強制発現を使用する。このアプローチによって、Gornalusseらは、同種異系反応およびNK細胞による溶解を免れることができたCD45+造血細胞へ分化させることができる多能性幹細胞を作製する。
からなる群より選択され得る。化膿性連鎖球菌のCas9エンドヌクレアーゼは、この指定されるDNA配列への結合を可能にするために認識配列に対して3’のcrRNA中にプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とする。このPAMはコンセンサス配列XGGを有し、ここでXは任意の核酸であり得る。従って、SEQ ID NO: 2〜4は3’プライム末端で配列XGGをさらに有し得、ここでXは任意の核酸であり得る。従って、crRNAはまた
であり得る。
β2-ミクログロブリン(B2M)のノックアウト
多能性幹細胞株50039をNINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリから得た。この細胞株はまたLonzaから入手可能であり、Baghbaderani et al. (2015), Stem Cell Reports, 5:647-6659において特徴付けられた。Baghbaderaniらはまたこの細胞株を維持するための標準条件を開示している。これとは異なり、多能性細胞をStemMACS(商標)iPS-Brew培地中に維持した。細胞外マトリックスの提供について、CTGラミニン-521 (Biolamina)またはGeltrex (Thermo Scientific)を使用した。
図1Aは、エクソン1を囲むB2M遺伝子および異なるcrRNA(下線)の結合部位の概要を示す。全ての3つのcrRNAを、B2M遺伝子のB2M翻訳産物のN末端を形成する領域の近くに結合するように設計した。これらのcrRNAのうちの1つ、Alt-R Cas9ヌクレアーゼおよびAlt-R Cas9エレクトロポレーションエンハンサーを使用して、リボ核タンパク質複合体を形成し、これをPSC中へエレクトロポレーションした。異なるcrRNAの各々について、crRNA:tracRNA:Cas9 RNP複合体を製造業者の説明書に従って調製した。crRNA:tracRNA:Cas9 RNP複合体を、プログラムCB-150を使用するLonza 4Dヌクレオフェクターシステム(X-ユニット)およびP3溶液キット(Lonza, V4XP-3012)を使用してPSC中へトランスフェクトした。トランスフェクション後、PSCをプレーティングし、コロニーが現われるまで培養した。個々のコロニーを手動で取り、標準プロトコルを使用して継代した。ゲノム編集をシーケンシングによって確認した。60個の配列決定されたコロニーから、15個がB2Mのエクソン1内の突然変異を示した。
HLA-E融合タンパク質のノックインは、上記に記載されるクローン18、20および34のいずれかから出発して国際特許出願WO 2012/145384と同様に行われ得る。組込みフォーミーウイルスベクターを使用して、一本鎖B2M/HLA-E融合タンパク質をヒトPSC中において発現させ得る。フォーミーウイルスベクターは、B2M/HLA-E一本鎖融合構築物(「二量体」)を駆動するプロモーターを有する発現カセットを含み得る。B2M/HLA-E一本鎖融合タンパク質(「二量体」)は、SEQ ID NO: 18に表されるようなアミノ酸配列を有し得る。二量体の組込みのためのベクターはSEQ ID NO: 17を含み得る。三量体一本鎖融合構築物は、共有結合されたHLA-Gペプチド
をさらに含み得る(「三量体」)。三量体の組込みのためのベクターはSEQ ID NO: 19を含み得る。B2M/HLA-E融合タンパク質を過剰発現するクローンは、融合タンパク質に結合する抗体を用いてフローサイトメトリーを使用することによって単離され得る。
HLA-E二量体および三量体プラスミドでトランスフェクトされたhIPSCを、コロニー形成のために96-ウェルプレート中へ単一細胞で播種した。加えて、トランスフェクトされたhIPSCプールからのゲノムDNAを同時に単離した。次に、PCRを、示されるように5’-ホモロジーアームおよびドナー配列内のプライマーを用いて行った(図6A)。予想されたように、親B2M KO株中において産物は検出されなかったが、トランスフェクトされたプール中において対応する領域が特異的に増幅され、これは、B2M遺伝子座中における首尾よい遺伝子組込みを示している(図6A)。予備データを考慮して、100個までのクローンをスクリーニングし、それらのうちのおよそ50個がHLA-E二量体(図6B)および三量体組込み(図6C)の両方の上流について陽性であると分かった。
次に、HLA-E二量体クローン#5および78ならびにHLA-E三量体クローン#66および100を培養し、先ず、多能性マーカー(OCT4AおよびNanog)の発現についてそれらを解析した。WTおよびB2M KO株を含む全てのクローンが、フローサイトメトリー解析によって実証されたように、OCT4AおよびNanogの両方の発現について90%を超えて二重陽性であることがわかった(図8)。
操作心筋は、WO 2015/040142およびTiburcy et al. (2017), Circulation, 135:1832-1847 ならびにWO 2015/025030に記載されるプロトコルを使用してPSCから出発して作製することができる。実施例1の、多能性幹細胞、特にクローン18、20および34がこの実施例において使用され得る。このプロトコルは、WO 2015/040142に記載されるような中胚葉分化、心臓分化および心臓成熟を誘導する工程、続いてのWO 2015/025030に記載されるようなI型コラーゲンヒドロゲル中における指向された組織の形成を含む。
DMEMはダルベッコ変法イーグル培地を示す;EHM、操作ヒト心筋層;FGF-2、線維芽細胞増殖因子-2;IGF-1、インスリン様増殖因子1;RPMI、ロズウェルパーク記念研究所培地;TGF-β1、トランスホーミング増殖因子-β1;およびVEGF165、血管内皮増殖因子165。
*あるいは≧1.2mmol/Lカルシウムを含む他の基本培地。
本明細書において得られたhIPSC(実施例1を参照されたい)を、上記実施例2において記載されたプロトコルに基づいて心筋細胞(CM)へ分化させた(Tiburcy et al. 2017ならびにWO 2015/025030)。HLA-E KI hIPSC由来CMは、>90%のアクチニン+細胞の高純度を伴って、筋節タンパク質;アルファ-アクチニンおよび心筋トロポニンT(cTnT)の発現を示した(図10A)。
ヒト脳組織の作製についての例がLancaster et al. 2013, Nature, 501:373-379に開示されている。ここで、脳オルガノイドが作製される。実施例1の多能性幹細胞がこの実施例において使用され得る。
骨格筋組織へのPSCの分化を誘導するための例示的な方法はRao et al. (2018), Nature Communications, 9(126):1-12に開示されている。実施例1の多能性幹細胞がこの実施例において使用され得る。分化プロトコルはいくつかの工程に分割される:
PSCはE8培地(Stemcell Technologies)中においてフィーダーフリー条件で維持され得る。PSCコロニーは、Accutase (Stemcell Technologies)で単一細胞へ解離され、1 × 103/cm2の細胞密度でマトリゲル(Corning)コート6-ウェルプレート上へ播種され得る。PSCは、増大のためにE8中に維持され、次いでAccutaseで単一細胞へ解離され、3.3 × 104細胞/cm2で、Y27632 (5μM, Tocris)が補われたE8中のマトリゲルコート6-ウェルプレート上へ播種され得る。翌日、E8培地はE6培地と交換され得、細胞は、CHIR99021 (10μM, Selleck Chemical)が補われて2日間培養され得、この後、CHIR99021は除去され得、人工筋原性前駆細胞(iMPC)が下記に記載されるようにFACSによって選別され得るまで、18日間、1μg/mL Dox (Sigma)がE6培地に補われ得る。
細胞は、0.25%トリプシン-EDTAで解離され、カウントされ、PBSで洗浄され得、次いで、2 × 106〜1 × 107細胞/mlの濃度でフローバッファー中に再懸濁され得る。Tra-1-81またはCD56を発現する細胞をカウントするために、抗-Tra-1-81 (Stemgent, 09-0011)または抗-CD56 (PE, R&D, FAB2408P)抗体およびアイソタイプ一致対照が、製造業者の説明書に従って適用され得、細胞は、FACSCanto(商標)IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して解析され得る。関心対象の細胞集団は、先ず、細胞サイズおよび粒状性について、次いでTra-1-81またはCD56の発現レベルについて、ゲーティングされ得る。
分化20日目に、細胞を0.25%トリプシン-EDTA (Thermo)で解離し、中和培地中で洗浄し得る。分離された細胞を300 gで5分間遠心分離し得、次いで選別溶液中に再懸濁させ、クラスターおよび砕片を除去するために30μMフィルター(SYSMEX)で濾過し得る。単一細胞懸濁液は選別まで氷上に維持され得、未分化hPSCが陰性対照として使用される。細胞を、MoFlo(登録商標)Astrios(商標)セルソーター(Beckman Coulter)を使用してGFPについて選別し得る。
選別後、iMPCは収集溶液中の氷上に維持され、300 gで5分間遠心沈殿され、Y27632、Dox、およびbFGFが補われた新鮮なE6培地中に再懸濁され得、次いでマトリゲルコートフラスコ中に4 × 104/cm2で播種され得る。選別後の24〜48時間後、細胞を、DoxおよびbFGFが補われた、増大培地(EM)中においてインキュベートし得、80%コンフルエンスに達した後3〜4日毎に1:3〜1:6比で継代し得る。
iMPCを、マトリゲルコート皿上に1 × 105/cm2の密度で播種し得、100%コンフルエンスに達した後、EMをPBSで洗い落とし、分化培地(DM)へ切り替え得、これを一日おきに交換し得る。
三次元操作骨格筋(iSKM束)は、3D機械加工テフロンマスターからキャストされた、2つの半円筒形ウェル(長さ7 mm、直径2 mm)を含有するポリジメチルシロキサン(PDMS)型内で形成され得る。PDMS型は、ヒドロゲル接着を防ぐために、室温で1時間、0.2% (w/v)プルロニック(Invitrogen)でコーティングされ得る。2つのウェル周りに配置されたLaser-cut Cerex(登録商標)フレーム(9 × 9 mm2、1 mm幅の縁)は、束末端を固定しそして取り扱いおよび移植を容易にするために役立つ。細胞/ヒドロゲル混合物をPDMSウェル中へ注入し、37℃で30分間重合してもよい。形成されたiSKM束を、4日間、1μg/mL Doxおよび1.5 mg/mL 6-アミノカプロン酸(ACA, Sigma)が補われたEM中のロッキングプラットフォーム上において維持してもよい。培地は、次いで、2 mg/mL ACAおよび50μg/mLアスコルビン酸(Sigma)が補われたDMへ切り替えられ得、培地は毎日交換される。
膵臓組織、またはより具体的には、インスリン分泌β細胞を作るための例示的な方法は、Pagliuca et al. (2014), Cell, 159:428-439に開示されている。ここで、多能性幹細胞はインスリン産生膵β細胞(SC-β)へ分化される:
[本発明1001]
多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、該多能性幹細胞が、該多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
該方法が、
操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が、該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されない、かつ/または
(b)NK媒介性溶解に耐性である、
本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記操作された組織が抗HLA抗体に結合しない、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記免疫調節タンパク質が一本鎖融合HLAクラスIタンパク質である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-Gからなる群より選択されるHLAクラスIα鎖の少なくとも一部分へ共有結合されたB2Mの少なくとも一部分を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Aの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1007]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-A0201の少なくとも一部分を含む、本発明1004〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Eの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1009]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Gの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1010]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Bの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1011]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Cの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1012]
前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Fの少なくとも一部分を含む、本発明1004または1005の方法。
[本発明1013]
前記多能性幹細胞が、該多能性細胞表面上の一本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する、本発明1004〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記標的ペプチド抗原が、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質へ共有結合されている、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記標的ペプチド抗原が配列VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)を含む、本発明1013または1014の方法。
[本発明1016]
β-ミクログロブリン2遺伝子の本質的に全てのコピーが多能性幹細胞において破壊されている、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型の存在下で、操作された組織を形成する工程を含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記操作された組織が、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、骨格筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織、網膜組織および血管組織からなる群より選択される、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記操作された組織が心臓組織であり、前記方法が、
(i)多能性幹細胞を、有効量の、
(a) BMP4、アクチビンA、FGF2、GSK3阻害剤、および
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)の最終濃度を生じる無血清サプリメント
を含む基本培地中で培養し、それによって、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
(ii)工程(i)において得られた細胞を、有効量のWntシグナル伝達経路の阻害剤および(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、細胞の心臓分化を誘導する工程;ならびに
(iii)工程(ii)において得られた細胞を、機械的刺激下で、有効量の(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、心臓成熟を促進する工程
を含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記組織の形成が、ヒドロゲル、好ましくは細胞外マトリックスタンパク質含有ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル、最も好ましくはコラーゲンヒドロゲルの存在下で行われる、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
(iv)1つまたは複数の型の中に無血清再構成混合物を提供する工程であって、該再構成混合物が、
(a)無血清最小必須培地;
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)および0.2〜2 mg/mlコラーゲンの最終濃度を生じる無血清サプリメント;ならびに
(c)工程(iii)において得られた細胞、および操作された組織の部分を形成する細胞型、好ましくはヒト非筋細胞
を含み、任意で該操作された組織の部分を形成する細胞が多能性幹細胞に由来するものであり、総細胞混合物の20〜80%が工程(iii)において得られた細胞であり;
該再構成混合物が7.2〜7.6のpHを有する、工程;
(v)該1つまたは複数の型の中で無血清再構成混合物を培養し、それによって、無血清再構成混合物を少なくとも15分間圧縮させる工程;
(vi)該1つまたは複数の型の中の工程(v)において得られた混合物がその元の厚さの少なくとも50%へ圧縮するまで、無血清EHM培養培地中で該混合物を培養する工程であって、ここで、該EHM培養培地が、(a)0.5〜3 mmol/L Ca 2+ を含む基本培地;(b)(i)(b)に定義されるような無血清サプリメント;(c) 0.5〜10 mmol/L L-グルタミン;(d) 0.01〜1.0 mmol/Lアスコルビン酸;(e) 1〜100 ng/ml IGF-1;および(f) 1〜10 ng/ml TGFβ1を含む、工程;
(vii)工程(iii)において得られた混合物を、工程(iii) (a)〜(f)に定義されるような無血清EHM培養培地中で、機械的伸張下で培養し、それによって、力を発生する(force-generating)操作された心臓組織を形成する工程
をさらに含む、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および単為発生幹細胞からなる群より選択される、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記多能性幹細胞が、霊長類起源の多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞である、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記多能性幹細胞が、臍帯血から単離されたCD34陽性細胞から作製される、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記多能性幹細胞が、NINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリ(NINDS Human Cell and Data Repository)のND-50039である、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
操作された組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化をさらに誘導する工程であって、操作された組織の機能に必須である細胞型の細胞と操作された組織の部分を形成する第2の細胞型の細胞とを、操作された組織を形成するために分化後に接触させる、工程
をさらに含む、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞または間葉系幹細胞である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
B2Mの破壊および/または免疫調節タンパク質の挿入が、操作されたヌクレアーゼによって媒介される、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR/Cas9)からなる群より選択される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記操作されたヌクレアーゼがCRISPR/Cas9であり、crRNAが、
からなる群より選択される、本発明1029または1030の方法。
[本発明1032]
操作された組織を形成させている間に、前記多能性幹細胞を前記少なくとも1つの細胞型へ分化させる、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
操作された組織の機能に必須である細胞型を含む、操作された組織であって、
該細胞型が、該細胞型への多能性幹細胞の分化に適した条件下で該細胞型へ多能性幹細胞を分化させることによって得られたものであり、該多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、
前記操作された組織。
[本発明1034]
組織の部分を形成する少なくとも第2の細胞型をさらに含む、本発明1033の操作された組織。
[本発明1035]
本発明1001〜1032のいずれかの方法によって得ることができる、操作された組織。
[本発明1036]
本発明1001〜1032のいずれかの方法によって得られた、操作された組織。
[本発明1037]
細胞外マトリックス生体材料をさらに含む、本発明1033〜1036のいずれかの操作された組織。
[本発明1038]
前記細胞外マトリックス生体材料が、アルギネート、ヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、または合成マトリックス、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリグリセロールセバケート(バイオゴム)、およびポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレートであり、好ましくは該細胞外マトリックス生体材料がI型コラーゲンである、本発明1037の操作された組織。
[本発明1039]
前記合成マトリックス材料がポリ乳酸またはポリグリコール酸である、本発明1038の操作された組織。
[本発明1040]
前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、
(b)抗HLA抗体に結合せず、かつ/または
(c)NK媒介性溶解に耐性である、
本発明1033〜1039のいずれかの操作された組織。
[本発明1041]
本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織を含む、薬学的組成物。
[本発明1042]
疾患状態を処置する方法における使用のための、本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織または本発明1041の薬学的組成物。
[本発明1043]
有効量の本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織または本発明1041の薬学的組成物をその必要がある対象へ投与する工程を含む、疾患状態を処置する方法。
[本発明1044]
前記疾患状態が、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の状態、骨形成不全症、熱傷、肝不全、腎不全、脳損傷、または軟部組織損傷からなる群より選択される、本発明1042の使用のための操作された組織もしくは薬学的組成物または本発明1043の処置する方法。
[本発明1045]
(a)薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける、および/または
(b)研究ツールとしての、
本発明1033〜1040のいずれかの操作された組織の使用。
[本発明1046]
SEQ ID NO: 2〜7からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、核酸。
[本発明1047]
B2M遺伝子の発現を破壊するための、本発明1046の核酸の使用。
Claims (47)
- 多能性幹細胞から非免疫原性の操作された組織を製造する方法であって、該多能性幹細胞が、該多能性幹細胞の細胞表面上に提示される内因性MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
該方法が、
操作された組織の形成を可能にする条件下で、操作された組織の機能に必須である少なくとも1つの細胞型の存在下で操作された組織を形成し、それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする工程であって、該少なくとも1つの細胞型が、該少なくとも1つの細胞型への多能性幹細胞の分化によって得られたものである、工程
を含む、前記方法。 - 前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されない、かつ/または
(b)NK媒介性溶解に耐性である、
請求項1記載の方法。 - 前記操作された組織が抗HLA抗体に結合しない、請求項1または2記載の方法。
- 前記免疫調節タンパク質が一本鎖融合HLAクラスIタンパク質である、請求項1または2記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-FおよびHLA-Gからなる群より選択されるHLAクラスIα鎖の少なくとも一部分へ共有結合されたB2Mの少なくとも一部分を含む、請求項4記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Aの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-A0201の少なくとも一部分を含む、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Eの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Gの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Bの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Cの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
- 前記一本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、B2Mの少なくとも一部分およびHLA-Fの少なくとも一部分を含む、請求項4または5記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、該多能性細胞表面上の一本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する、請求項4〜12のいずれか一項記載の方法。
- 前記標的ペプチド抗原が、一本鎖融合HLAクラスIタンパク質へ共有結合されている、請求項13記載の方法。
- 前記標的ペプチド抗原が配列VMAPRTLFL (SEQ ID NO: 1)を含む、請求項13または14記載の方法。
- β-ミクログロブリン2遺伝子の本質的に全てのコピーが多能性幹細胞において破壊されている、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型の存在下で、操作された組織を形成する工程を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
- 前記操作された組織が、心臓組織、肝臓組織、腎臓組織、脳組織、膵臓組織、肺組織、骨格筋組織、胃腸組織、神経組織、皮膚組織、骨組織、骨髄、脂肪組織、結合組織、網膜組織および血管組織からなる群より選択される、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
- 前記操作された組織が心臓組織であり、前記方法が、
(i)多能性幹細胞を、有効量の、
(a) BMP4、アクチビンA、FGF2、GSK3阻害剤、および
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)の最終濃度を生じる無血清サプリメント
を含む基本培地中で培養し、それによって、多能性幹細胞の中胚葉分化を誘導する工程;
(ii)工程(i)において得られた細胞を、有効量のWntシグナル伝達経路の阻害剤および(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、細胞の心臓分化を誘導する工程;ならびに
(iii)工程(ii)において得られた細胞を、機械的刺激下で、有効量の(i)に記載されるような無血清サプリメントを含む基本培地中で培養し、それによって、心臓成熟を促進する工程
を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。 - 前記組織の形成が、ヒドロゲル、好ましくは細胞外マトリックスタンパク質含有ヒドロゲル、例えばフィブリンヒドロゲルまたはコラーゲンヒドロゲル、最も好ましくはコラーゲンヒドロゲルの存在下で行われる、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- (iv)1つまたは複数の型の中に無血清再構成混合物を提供する工程であって、該再構成混合物が、
(a)無血清最小必須培地;
(b)0.5〜50 mg/mlアルブミン、1〜100μg/mlトランスフェリン、0.1〜10μg/mlエタノールアミン、0.003〜0.3μg/ml亜セレン酸ナトリウム、0.4〜40μg/ml L-カルニチンHCl、0.1〜10μg/mlヒドロコルチゾン、0.05〜5μl/ml脂肪酸サプリメント、0.0001〜0.1μg/mlトリヨード-L-チロニン(T3)および0.2〜2 mg/mlコラーゲンの最終濃度を生じる無血清サプリメント;ならびに
(c)工程(iii)において得られた細胞、および操作された組織の部分を形成する細胞型、好ましくはヒト非筋細胞
を含み、任意で該操作された組織の部分を形成する細胞が多能性幹細胞に由来するものであり、総細胞混合物の20〜80%が工程(iii)において得られた細胞であり;
該再構成混合物が7.2〜7.6のpHを有する、工程;
(v)該1つまたは複数の型の中で無血清再構成混合物を培養し、それによって、無血清再構成混合物を少なくとも15分間圧縮させる工程;
(vi)該1つまたは複数の型の中の工程(v)において得られた混合物がその元の厚さの少なくとも50%へ圧縮するまで、無血清EHM培養培地中で該混合物を培養する工程であって、ここで、該EHM培養培地が、(a)0.5〜3 mmol/L Ca2+を含む基本培地;(b)(i)(b)に定義されるような無血清サプリメント;(c) 0.5〜10 mmol/L L-グルタミン;(d) 0.01〜1.0 mmol/Lアスコルビン酸;(e) 1〜100 ng/ml IGF-1;および(f) 1〜10 ng/ml TGFβ1を含む、工程;
(vii)工程(iii)において得られた混合物を、工程(iii) (a)〜(f)に定義されるような無血清EHM培養培地中で、機械的伸張下で培養し、それによって、力を発生する(force-generating)操作された心臓組織を形成する工程
をさらに含む、請求項20または21記載の方法。 - 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および単為発生幹細胞からなる群より選択される、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、霊長類起源の多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞である、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、臍帯血から単離されたCD34陽性細胞から作製される、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、NINDSヒューマンセルアンドデータリポジトリ(NINDS Human Cell and Data Repository)のND-50039である、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
- 操作された組織の部分を形成する少なくとも1つの第2の細胞型への多能性幹細胞の分化をさらに誘導する工程であって、操作された組織の機能に必須である細胞型の細胞と操作された組織の部分を形成する第2の細胞型の細胞とを、操作された組織を形成するために分化後に接触させる、工程
をさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。 - 前記操作された組織の部分を形成する第2の細胞型が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、細網細胞または間葉系幹細胞である、請求項27記載の方法。
- B2Mの破壊および/または免疫調節タンパク質の挿入が、操作されたヌクレアーゼによって媒介される、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(CRISPR/Cas9)からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
- 操作された組織を形成させている間に、前記多能性幹細胞を前記少なくとも1つの細胞型へ分化させる、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
- 操作された組織の機能に必須である細胞型を含む、操作された組織であって、
該細胞型が、該細胞型への多能性幹細胞の分化に適した条件下で該細胞型へ多能性幹細胞を分化させることによって得られたものであり、該多能性幹細胞が、MHCクラスI分子を欠損しており、かつそれらの表面上に免疫調節タンパク質を含み、
それによって、操作された組織を操作された組織のレシピエントに対して非免疫原性にする、
前記操作された組織。 - 組織の部分を形成する少なくとも第2の細胞型をさらに含む、請求項33記載の操作された組織。
- 請求項1〜32のいずれか一項記載の方法によって得ることができる、操作された組織。
- 請求項1〜32のいずれか一項記載の方法によって得られた、操作された組織。
- 細胞外マトリックス生体材料をさらに含む、請求項33〜36のいずれか一項記載の操作された組織。
- 前記細胞外マトリックス生体材料が、アルギネート、ヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、または合成マトリックス、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリグリセロールセバケート(バイオゴム)、およびポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレートであり、好ましくは該細胞外マトリックス生体材料がI型コラーゲンである、請求項37記載の操作された組織。
- 前記合成マトリックス材料がポリ乳酸またはポリグリコール酸である、請求項38記載の操作された組織。
- 前記操作された組織が、
(a)エフェクターT細胞によって同種異系と認識されず、
(b)抗HLA抗体に結合せず、かつ/または
(c)NK媒介性溶解に耐性である、
請求項33〜39のいずれか一項記載の操作された組織。 - 請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織を含む、薬学的組成物。
- 疾患状態を処置する方法における使用のための、請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織または請求項41記載の薬学的組成物。
- 有効量の請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織または請求項41記載の薬学的組成物をその必要がある対象へ投与する工程を含む、疾患状態を処置する方法。
- 前記疾患状態が、糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の状態、骨形成不全症、熱傷、肝不全、腎不全、脳損傷、または軟部組織損傷からなる群より選択される、請求項42記載の使用のための操作された組織もしくは薬学的組成物または請求項43記載の処置する方法。
- (a)薬物毒性スクリーニングのためのインビトロモデルにおける、および/または
(b)研究ツールとしての、
請求項33〜40のいずれか一項記載の操作された組織の使用。 - SEQ ID NO: 2〜7からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、核酸。
- B2M遺伝子の発現を破壊するための、請求項46記載の核酸の使用。
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