JP6662777B2

JP6662777B2 - 人工心筋（ｅｈｍ）を産生するための方法

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Publication number: JP6662777B2
Application number: JP2016535491A
Authority: JP
Inventors: ツィンマーマン，ウルフラム−ウベルトゥス; ティブルシー，マルテ; ハドソン，ジェームズ
Original assignee: Repairon GmbH
Current assignee: Repairon GmbH
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2014-08-22
Publication date: 2020-03-11
Anticipated expiration: 2034-08-22
Also published as: JP2016528898A; US11492594B2; CN105745321B; AU2014310526B2; US20200231934A1; ES2615396T3; US10626374B2; CA2921882C; CN105745321A; AU2014310526A1; DK2840132T3; WO2015025030A1; EP2840132B1; EP2840132A1; US20160201034A1; SG11201601269RA; CA2921882A1

Description

本発明は、ＧＭＰ規制に全て適合する、化学的に十分に明確な条件で、人工心筋（ＥＨＭ）を産生するための新規な方法を提供する。結果として生じたヒト心筋は、力を発生し、典型的な心筋の性質を示す。

発明の背景
心疾患は、先進工業国における死亡の１番の原因であって、洗練された薬理学的及び介入処置にかかわらずその有病率は増加すると予想される。その結果、新規な薬理学的及び非薬理学的処置様式が必然的に求められる。組織工学による心筋は、一方で心疾患の処置のための新薬又は薬物標的を同定（物質スクリーニング／標的検証）するために使用することができ、他方で心修復（再生／修復医療）に直接適用され得る（Eschenhagen & Zimmermann Circ Res 97: 1220-1231 (2005); Zimmermann et al. Cardiovasc Res 71: 419-429 (2006)）。天然の心筋と同様に、機能性人工心筋の主な必要条件は、力を発生できることである。

過去１０年にわたりいくつかの心筋組織工学様式が確立されている。しかし、信頼できる力発生は、ヒドロゲル細胞封入（Eschenhagen et al. Faseb J 11: 683-694 (1997); Kofidis et al. J Thorac Cardiovasc Surg 124: 63-69 (2002); Morritt et al. Circulation 115: 353-360 (2007); Zimmermann et al. Biotechnol Bioeng 68: 106-114 (2000); Tulloch et al. Circ Res 109: 47-59 (2011)）又は細胞シート技術（Shimizu et al. Circ Res 90: e40 (2002)）を用いて実証されているのみである。本発明者ら及びその他は、コラーゲンヒドロゲル中の筋細胞封入が、一方で多細胞性異方性心筋の集合を促進することができ、他方で未熟心筋細胞の成熟進行を支援することができる三次元成長環境を与えるという証拠を提供した（Tiburcy et al. Circ Res 109: 1105-1114 (2011)）。結果として生じた人工心筋（ＥＨＭ）調製物（以前は人工心臓組織：ＥＨＴと記載された）は、出生後心筋の性質を備える収縮性心筋構築物の形成を最終的に促進する（Radisic et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 18129-18134 (2004); Tiburcy et al. Circ Res 109: 1105-1114 (2011); Zimmermann et al. Circ Res 90: 223-230 (2002)）。原理証明動物研究によって、ＥＨＭは、罹患心臓上への移植後に電気的に統合されるだけでなく、心機能も改善することが示された（Zimmermann et al. Nat Med 12: 452-458 (2006)）。

原則として、本発明者らは、組織工学による心筋が、罹患心臓のための新規な処置様式であり得ることを示した。しかし、今までに公表された全ての心臓組織工学によるアプローチは、明確でない動物成分、主として動物マトリックス（例えば、ラットコラーゲン、ウシフィブリン、マウス腫瘍由来細胞外マトリックス［Matrigel（登録商標）］）、及び動物血清（Tulloch et al. Circ Res 109: 47-59 (2011), Zimmermann et al. Circ Res 90: 223-230 (2002), Zimmermann et al. Nat Med 12: 452-458 (2006), Schaaf et al. PLoS One 6: e26397 (2011); Soong et al. Curr Prot Cell Biol 23.8.1-23.8.21 (2012); 国際公開第０１／５５２９７号、国際公開第２００７／０５４２８６号、及び国際公開第２００８／０５８９１７号）の使用に依存している。ラットＥＨＭモデルにおいて、本発明者らは、動物血清を無血清培地に置換するための最初の研究を行った。本発明者らは、結果として生じた組織において匹敵する力産生を達成することができたものの、最初の７日間における組織形成の間に動物成分を取り除くことができなかった（Naito et al. Circulation 114: I72-78 (2006); Zimmermann, Universitaetsklinikum Hamburg Eppendorf, Habilitation (2006); Schneiderbanger, Universitaet Hamburg, Dissertation (2006)）。

近年、より効率的な心臓分化のための、サイトカインを標的とするいくつかの無血清プロトコールが記載されており（Burridge et al. Cell Stem Cell 10: 16-28 (2012)）、心筋細胞を最大９８％含有する培養物を産生している（Lian et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2012))。重要なことには、これらの無血清分化プロトコールは、明確な物質が動物産物なしに利用されるので、潜在的な臨床適用性を提供する。ＧＭＰ条件でのヒト心臓細胞の倍率変更は、解決できる注意事項に見えるものの、力発生性ヒト心筋を発生させることは、依然として難題のままである。明確な無血清培養条件でＥＳＣ由来筋細胞の器官型組織化及び成熟進行を支援することは、中心的な問題のままである。

発明の概要
本明細書において本発明者らは、全て明確な成分を使用してヒト心筋（ヒト人工心筋：ｈＥＨＭ）を加工するためのプロトコールを報告する。これらの成分は、ＧＭＰ規制に全て適合するヒドロゲルマトリックス、ヒト細胞及び無血清培地条件を含む。結果として生じたヒト心筋は、力を発生し、典型的な心筋の性質を示す。

より具体的には、人工心筋（ＥＨＭ）を産生するための方法であって：
ｉ）（ａ）無血清最小必須培地；（ｂ）０．５〜５０mg/ml アルブミン、１〜１００μg/ml トランスフェリン、０．１〜１０μg/ml エタノールアミン、０．００３〜０．３μg/ml 亜セレン酸ナトリウム、０．４〜４０μg/ml Ｌ−カルニチンＨＣｌ、０．１〜１０μg/ml ヒドロコルチゾン、０．０５〜５μl/ml 脂肪酸サプリメント、０．０００１〜０．１μg/ml トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）及び０．２〜２mg/ml コラーゲンの終濃度を生じる無血清サプリメント；並びに（ｃ）ヒト心筋細胞とヒト非筋細胞との混合物であって、総細胞混合物の２０〜８０％が心筋細胞である混合物、を含む無血清再構成混合物を１つ以上の型の中に提供する段階であって、再構成混合物がｐＨ７．２〜７．６を有する、段階；
ｉｉ）該１つ以上の型の中で無血清再構成混合物を培養する段階であって、無血清再構成混合物を少なくとも１５分間凝縮させる段階；
ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得られた混合物がその本来の厚さの少なくとも５０％に凝縮するまで、該１つ以上の型の中で無血清ＥＨＭ培地中において該混合物を培養する段階であって、該ＥＨＭ培地が、（ａ）０．５〜３mmol/L Ｃａ^２＋を含む基本培地；（ｂ）（ｉ）（ｂ）と同義の無血清サプリメント；（ｃ）０．５〜１０mmol/L Ｌ−グルタミン；（ｄ）０．０１〜１．０mmol/L アスコルビン酸；（ｅ）１〜１００ng/ml ＩＧＦ−１；及び（ｆ）１〜１０ng/ml ＴＧＦβ１を含む段階；
ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で得られた混合物を、段階（ｉｉｉ）（ａ）〜（ｆ）と同義の無血清ＥＨＭ培地中において機械的伸張下で培養する段階であって、力発生性ＥＨＭが形成される段階
を含む方法が提供される。

好ましい実施態様の詳細な説明
より具体的には、本発明は、人工心筋（ＥＨＭ）を産生するための方法であって：
（ｉ）（ａ）無血清最小必須培地；（ｂ）０．５〜５０mg/ml アルブミン（好ましくは１〜４０mg/ml、より好ましくは２〜３０mg/ml、さらにより好ましくは３〜２０mg/ml、最も好ましくは４〜１０mg/ml、いっそう最も好ましくは４．５〜７．５mg/ml、例えば約５mg/ml)、
１〜１００μg/ml トランスフェリン（好ましくは２〜９０μg/ml、より好ましくは３〜８０μg/ml、いっそうより好ましくは４〜７０μg/ml、さらにより好ましくは５〜６０μg/ml、より好ましくは６〜５０μg/ml、より好ましくは７〜４０μg/ml、より好ましくは８〜３０μg/ml、より好ましくは９〜２０μg/ml、例えば約１０μg/ml)、
０．１〜１０μg/ml エタノールアミン（好ましくは０．２〜９μg/ml、より好ましくは０．３〜８μg/ml、いっそうより好ましくは０．４〜７μg/ml、さらにより好ましくは０．５〜６μg/ml、より好ましくは０．６〜５μg/ml、より好ましくは０．７〜４μg/ml、より好ましくは０．８〜３μg/ml、より好ましくは１〜２．５μg/ml、例えば約２μg/ml)、
０．００３〜０．３μg/ml 亜セレン酸ナトリウム（好ましくは０．００５〜０．２μg/ml、より好ましくは０．０１〜０．１μg/ml、いっそうより好ましくは０．０２〜０．０５μg/ml、最も好ましくは約０．０３μg/ml、例えば約０．０３２μg/ml）、
０．４〜４０μg/ml Ｌ−カルニチンＨＣｌ（好ましくは０．５〜３０μg/ml、より好ましくは１〜２０μg/ml、いっそうより好ましくは２〜１０μg/ml、最も好ましくは３〜５μg/ml、いっそう最も好ましくは約４μg/ml）、
０．１〜１０μg/ml ヒドロコルチゾン（好ましくは０．２〜９μg/ml、より好ましくは０．３〜８μg/ml、いっそうより好ましくは０．４〜７μg/ml、さらにより好ましくは０．５〜６μg/ml、より好ましくは０．６〜５μg/ml、より好ましくは０．７〜４μg/ml、より好ましくは０．８〜３μg/ml、より好ましくは０．９〜２μg/ml、例えば約１μg/ml）、
０．０５〜５μl/ml 脂肪酸サプリメント（好ましくは０．１〜４μl/ml、より好ましくは０．２〜３μl/ml、いっそうより好ましくは０．３〜３μl/ml、最も好ましくは０．４〜２μl/ml、いっそう最も好ましくは０．４５〜１μl/ml、例えば約０．５μl/ml）、
０．０００１〜０．１μg/ml トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）（好ましくは０．００１〜０．０１μg/ml、より好ましくは０．００２〜０．００７５μg/ml、いっそうより好ましくは０．００３〜０．００５μg/ml、最も好ましくは約０．００４μg/ml）、及び
０．２〜２mg/ml コラーゲン（好ましくは０．３〜１．９mg/ml、より好ましくは０．４〜１．８mg/ml、いっそうより好ましくは０．４〜１．７mg/ml、さらにより好ましくは０．５〜１．６mg/ml、より好ましくは０．６〜１．５mg/ml、より好ましくは０．７〜１．４mg/ml、より好ましくは０．８〜１．３mg/ml、より好ましくは０．９〜１．２mg/ml、例えば約１mg/ml）
の終濃度を生じる無血清サプリメント；並びに
（ｃ）ヒト心筋細胞とヒト非筋細胞との混合物であって、総細胞混合物の２０〜８０％が心筋細胞である混合物、
を含む無血清再構成混合物を１つ以上の型の中に提供する段階であって；
再構成混合物がｐＨ７．０〜７．８、好ましくは７．１〜７．７、より好ましくは７．２〜７．６、いっそうより好ましくは７．３〜７．５、最も好ましくは約７．４を有する、段階；
（ｉｉ）該１つ以上の型の中で無血清再構成混合物を培養する段階であって、無血清再構成混合物を少なくとも１５分間、好ましくは０．２５〜３時間、より好ましくは０．５〜１．５時間凝縮させる段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得られた混合物がその本来の厚さの少なくとも５０％（好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、いっそうより好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％）に凝縮するまで、該１つ以上の型の中で無血清ＥＨＭ培地中において該混合物を培養する段階であって、
該ＥＨＭ培地が、
（ａ）０．５〜３mmol/L Ｃａ^２＋（好ましくは１〜２．５mmol/L、より好ましくは約２mmol/L）を含む基本培地；
（ｂ）（ｉ）（ｂ）と同義の無血清サプリメント；
（ｃ）０．５〜１０mmol/L Ｌ−グルタミン（好ましくは１〜７mmol/L、より好ましくは２〜６mmol/L、いっそうより好ましくは３〜５mmmol/L、さらにより好ましくは約２mmol/L）；
（ｄ）０．０１〜１．０mmol/L アスコルビン酸（好ましくは０．０５〜１．０mmol/L、より好ましくは０．１〜０．５mmol/L、いっそうより好ましくは０．２〜０．４mmol/L、さらにより好ましくは約０．３mmol/L）；
（ｅ）１〜１００ng/ml ＩＧＦ−１（好ましくは２〜９０ng/ml、より好ましくは３〜８０ng/ml、いっそうより好ましくは４〜７０ng/ml、さらにより好ましくは５〜６０ng/ml、より好ましくは６〜５０ng/ml、より好ましくは７〜４０ng/ml、より好ましくは８〜３０ng/ml、より好ましくは９〜２０ng/ml、例えば約１０ng/ml）；及び
（ｆ）１〜１０ng/ml ＴＧＦβ１（好ましくは１〜９ng/ml、より好ましくは２〜８ng/ml、いっそうより好ましくは３〜７ng/ml、最も好ましくは４〜６ng/ml、いっそう最も好ましくは約５ng/ml）、
を含む段階；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で得られた混合物を、段階（ｉｉｉ）（ａ）〜（ｆ）と同義の無血清ＥＨＭ培地中において機械的伸張下で培養する段階であって、力発生性ＥＨＭが形成される段階
を含む、方法を提供する。

段階（ｉ）における最小必須培地は、Iscove培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩより選択され得る。好ましい一実施態様では、基本培地は、Iscove培地又はαＭＥＭである。より好ましい一実施態様では、基本培地はIscove培地である。しかし、任意の適切な最少培地を本方法に使用してもよい。適切な最小必須培地の処方が本明細書において提供されており、又は例えばＡＴＣＣの目録から公的に入手可能である。

好ましくは、段階（ｉ）の無血清サプリメントは、さらに、ビタミンＡ、Ｄ−ガラクトース、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、及びプトレッシンからなる群より選択される１つ以上の成分を含む。これらの成分は、細胞生存能の助けとなる。それぞれの成分の適切な濃度は、当業者に公知であり、又は日常的な措置を用いて容易に決定することができる。

段階（ｉ）の成分（ｂ）において言及された無血清サプリメントのために、市販されているＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントを使用することができる。あるいは、下記の表２に示される特別注文のサプリメントを使用することができる。好ましい一実施態様では、上記方法の段階（ｉ）の成分（ｂ）として使用されるＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントは、２〜６％(v/v)の量で適用される。より好ましくは、上記方法の段階（ｉ）の成分（ｂ）として使用されるＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントは、４％(v/v)の量で適用される。

さらに、段階（ｉ）の該再構成混合物は、好ましくは心筋細胞と非筋細胞との混合物１．５×１０^６個あたりコラーゲン０．３〜０．５mgを含む。より好ましくは、段階（ｉ）の該再構成混合物は、心筋細胞と非筋細胞との混合物１．５×１０^６個あたりコラーゲン約０．４mgを含む。

段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）中のコラーゲンは、好ましくは医療用であって、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択される。より好ましい一実施態様では、段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）は、コラーゲンを含み、該コラーゲンの少なくとも９０％はＩ型コラーゲンである。しかし、該コラーゲンは、さらに、エラスチン、ラミニン、エンタクチン、ナイドジェン、プロテオグリカン、及びフィブロネクチンからなる群より選択される１つ以上の細胞外マトリックス成分も含み得る。通常は、コラーゲンの正確な組成は、それが由来する起源に依存する。コラーゲンは、好ましくはヒト起源であるが、ウシ起源、又は藻類若しくは魚類起源などの海洋起源も考えられる。

潜在的な再生心臓治療のための、機能性（すなわち力発生性）で明確な、無血清のヒト組織工学による心筋の開発は、克服すべきいくつかの障害を要求する。最も重要であるのは、ヒト心臓細胞の信頼できる供給源である。現在までのところ、ヒト多能性幹細胞が、ヒト心臓細胞の主要な供給源として出現している。多能性幹細胞は、身体のあらゆる細胞型に分化することができる。そのように、ヒト多能性幹細胞は、真のヒト心臓細胞を得る優れた機会を提供する。現在最も利用されている多能性細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ヒトＥＳＣ株は、最初にThomson及び共同研究者らによって確立された（Thomson et al.. Science 282: 1145-1147 (1998)；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ヒトＥＳＣ研究は、近年、体細胞をＥＳ様細胞に再プログラムする新しい技術の開発を可能にした。この技術は、２００６年にYamanaka及び共同研究者らによって開拓された（Takahashi & Yamanaka Cell 126: 663-676 (2006)；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。結果として生じた人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）は、ＥＳＣと非常に類似した挙動を示し、重要なことには、あらゆる体細胞に分化することもできる。ＥＳＣ及びｉＰＳＣの心臓分化は、ある程度確率論的な事象として胚様体（Schroeder et al. Biotechnol Bioeng 92: 920-933 (2005)；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）の培養物で起こり、真の心筋細胞を５〜２０％含有する細胞集団を産生する（Kehat et al. J Clin Invest 108: 407-414 (2001); Mummery et al. Circulation 107: 2733-2740 (2003); Xu et al. Circ Res 91: 501-508 (2002)；全てが参照により本明細書に組み入れられる）。そのうえ、単為発生幹細胞も、ＥＨＭ産生に適している見込みがあると報告された（Didie et al. J Clin Invest. doi:10.1172/JCI66584；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。したがって、好ましい一実施態様では、心筋細胞はヒト心筋細胞である。好ましくは、該心筋細胞は、胚性幹細胞に由来し、該細胞は、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変することを伴う又は工業若しくは商業目的のためのヒト胚の使用を伴う工程を用いて産生されない。代替的な一実施態様では、心筋細胞は、上記の人工多能性細胞、単為発生（parthogenetic）幹細胞、又は成体幹細胞に由来する。

近年、より効率的な心臓分化のための、サイトカインを標的とするいくつかの無血清プロトコールが記載されており（Burridge et al. Cell Stem Cell 10: 16-28 (2012)；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、心筋細胞を最大９８％含有する培養物を産生している（Lian et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2012)；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。したがって、別の好ましい実施態様では、心筋細胞は、無血清分化によって得ることができる。他方で、心筋細胞は、非ヒト霊長類幹細胞、胎児又は新生児心筋細胞に由来し得る。

心筋細胞を、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、及び間葉系幹細胞などの非筋細胞の群より選択される細胞の１つ以上のクラスの細胞と混合して提供することが有利であることが実証されている。したがって、好ましくは、心筋細胞の混合物は、心筋細胞を２０〜８０％、より好ましくは心筋細胞を３０〜７０％、いっそうより好ましくは心筋細胞を４０〜６０％、最も好ましくは心筋細胞を約５０％含有し、ここで、非筋細胞は線維芽細胞又は内皮細胞である。実際に、非筋細胞が線維芽細胞であることが、特に好ましい一実施態様である。適切な非筋細胞は、例えばＣＤ９０表面マーカーの発現によって同定され得る。適切な細胞は、例えば免疫染色又は蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）などの技術を用いて同定することができる。そのような混合物の結果として生じたＥＨＭは、通常はより高い力を発生する。

好ましくは、心筋細胞は、段階（ｉ）において少なくとも２．７〜２０×１０^６個/mlの細胞濃度で提供される。しかし、より好ましい一実施態様では、心筋細胞は、段階（ｉ）において少なくとも２．９〜１０×１０^６個/mlの細胞濃度で、いっそうより好ましくは少なくとも３．１〜５×１０^６個/mlの細胞濃度で、最も好ましい一実施態様では、少なくとも３．３〜３．４×１０^６個/mlの細胞濃度で提供される。

本方法において言及される型は、ＥＨＭの組み入れを必要とする宿主においてそれを可能にする任意の適切な形状を有し得る。しかし、好ましい一実施態様では、型は、輪状、多角形状、円板状又は袋状である。

細胞培養は、当技術分野において一般的に公知の通例の手順及び装置を用いて実施される。通常、培養条件は、５〜１０％ＣＯ_２の存在下で加湿細胞培養器を用いて３０〜４０℃、好ましくは３６〜３８℃の範囲の、最も好ましくは約３７℃の温度を含む。

段階（ｉｉｉ）の成分（ｂ）において言及される無血清サプリメントのために、市販されているＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントを使用することができる。あるいは、下記の表２に示される特別注文のサプリメントを使用することができる。好ましい一実施態様では、上記方法の段階（ｉｉｉ）の成分（ｂ）として使用されるＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントは、２〜６％(v/v)の量で適用される。より好ましくは、上記方法の段階（ｉ）の成分（ｂ）として使用されるＢ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントは、４％(v/v)の量で適用される。

加えて、段階（ｉｉｉ）の無血清サプリメントは、さらに、ビタミンＡ、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、及びプトレッシンからなる群より選択される１つ以上の成分を含み得る。上述のように、これらの成分は、細胞生存能の助けとなる。それぞれの成分の適切な濃度は、当業者に公知であり、又は日常的な措置を用いて容易に決定することができる。

段階（ｉｉｉ）の該ＥＨＭ培地に含まれる基本培地は、Iscove培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩより選択され得る。ＲＰＭＩは、通常、より低い濃度のカルシウムを有するので、結果的にＲＰＭＩ基本培地に補充することが必要であり得る。適切と見なされるならば、基本培地に可欠アミノ酸を補充してもよい。αＭＥＭが基本培地として使用されるならば、ＥＨＭ培地に追加的に可欠アミノ酸を補充する必要はない。可欠アミノ酸は、複合サプリメントとして市販されている。そのようなサプリメントは、例えば、７５０mg/L グリシン、８９０mg/L Ｌ−アラニン、１３２０mg/L Ｌ−アスパラギン、１３３０mg/L Ｌ−アスパラギン酸、１４７０mg/L Ｌ−グルタミン酸、１１５０mg/L Ｌ−プロリン、及び１０５０mg/L Ｌ−セリンを含む。

好ましい一実施態様では、段階（ｉｉｉ）の該ＥＨＭ培地中に含まれる基本培地は、Iscove培地又はαＭＥＭである。より好ましい一実施態様では、段階（ｉｉｉ）の該ＥＨＭ培地中に含まれる基本培地は、Iscove培地である。しかし、任意の基本培地を本方法に使用してもよい。適切な最小必須培地の処方が本明細書において提供されており、又は例えばＡＴＣＣの目録から公的に入手可能である。

下記実施例において実証されるように、無血清ＥＨＭ培地は、有利にはさらにＶＥＧＦ、ＦＧＦ、又はＶＥＧＦ及びＦＧＦの両方を含む。ＶＥＧＦ及び／又はＦＧＦの添加は、より高い力を示すＥＨＭを生じることが示されている。

典型的には、ＶＥＧＦは、約５〜２０ng/ml、好ましくは６〜１８ng/ml、より好ましくは７〜１６ng/ml、いっそうより好ましくは８〜１４ng/ml、最も好ましくは９〜１２ng/ml ＶＥＧＦの濃度で、いっそう最も好ましくは約１０ng/mlの濃度で添加される。

ＦＧＦは、約５〜２０ng/ml、好ましくは６〜１８ng/ml、より好ましくは７〜１６ng/ml、いっそうより好ましくは８〜１４ng/ml、最も好ましくは９〜１２ng/ml ＦＧＦの濃度で、いっそう最も好ましくは約１０ng/mlの濃度で添加される。

原則として、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ１及びＴＧＦβ１がＥＨＭの心筋細胞の細胞表面上でそれらに対応する受容体を介してシグナル伝達できる限り、これらの成長因子の任意の種類を使用することができる。しかし、好ましい一実施態様では、ＶＥＧＦはヒトＶＥＧＦである。別の好ましい実施態様では、ＦＧＦはヒトＦＧＦである。さらに別の好ましい実施態様では、ＩＧＦ１はヒトＩＧＦ１である。さらに別の実施態様では、ＴＧＦβ１はヒトＴＧＦβ１である。最も好ましい一実施態様では、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ１、及びＴＧＦβ１の全てがヒトである。

通常、段階（ｉｉｉ）における培養は、少なくとも３日間、好ましくは約３〜約７日間実施される。

原則として、段階（ｉｖ）におけるさらなる培養は、任意の適切な期間実施され得る。しかし、通常、段階（ｉｖ）におけるさらなる培養は、少なくとも３〜６０日、好ましくは４〜３０日、より好ましくは５〜２０日の期間実施される。最も好ましい一実施態様では、さらなる培養は、７日間実施されるが、それは、この期間が、なるべくなら短い培養時間と、力発生性ＥＨＭを生じるために十分な期間との最適なバランスに相当するからである。

通常、上記方法の段階（ｉｖ）は、当技術分野において一般的に公知の伸張装置上で実施される。好ましくは、伸張装置は、ＥＨＭに静的、相動性的又は動的伸張を適用する。より具体的には、機械的伸張は、弾性負荷に対して（ｉ）静的、（ｉｉ）動的、又は（ｉｉｉ）フレキシブルである可能性がある。

下記にさらに実証されるように、上記方法によって産生されるＥＨＭは、３mM カルシウムを用いた誘導に対して、Zimmermann et al. Circ. Res. 90, 223-230 (2002)に記載の方法を用いて決定された、０．０１mNを超える力を、好ましくは３mM カルシウムを用いた誘導に対して、Zimmermann et al. Circ. Res. 90, 223-230 (2002)に記載の方法を用いて決定された、０．１mNを超える力、より好ましくは０．２mNを超える力、最も好ましくは０．３mNを超える力を発生する。

本明細書に開示の改良法のための基礎として役立つために適する、別の詳細な先行技術のプロトコールは、Soong et al. Curr Prot Cell Biol. 55: 23.8.1-23.8.21 (2012)に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられ、「基本プロトコール２」及び「補助プロトコール２」が特に参照される。

以下の実施態様によって本発明をさらに説明する：
１人工心筋（ＥＨＭ）を産生するための方法であって：
（ｉ）（ａ）無血清最小必須培地；（ｂ）０．５〜５０mg/ml アルブミン、１〜１００μg/ml トランスフェリン、０．１〜１０μg/ml エタノールアミン、０．００３〜０．３μg/ml 亜セレン酸ナトリウム、０．４〜４０μg/ml Ｌ−カルニチンＨＣｌ、０．１〜１０μg/ml ヒドロコルチゾン、０．０５〜５μl/ml 脂肪酸サプリメント、０．０００１〜０．１μg/ml トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）及び０．２〜２mg/ml コラーゲンの終濃度を生じる無血清サプリメント；並びに（ｃ）ヒト心筋細胞とヒト非筋細胞との混合物であって、総細胞混合物の２０〜８０％が心筋細胞である混合物、を含む無血清再構成混合物を１つ以上の型の中に提供する段階であって；再構成混合物がｐＨ７．２〜７．６を有する、段階；
（ｉｉ）該１つ以上の型の中で無血清再構成混合物を培養する段階であって、無血清再構成混合物を少なくとも１５分間凝縮させる段階；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得られた混合物がその本来の厚さの少なくとも５０％に凝縮するまで、該１つ以上の型の中で無血清ＥＨＭ培地中において該混合物を培養する段階であって、該ＥＨＭ培地が、（ａ）０．５〜３mmol/L Ｃａ^２＋を含む基本培地；（ｂ）（ｉ）（ｂ）と同義の無血清サプリメント；（ｃ）０．５〜１０mmol/L Ｌ−グルタミン；（ｄ）０．０１〜１．０mmol/L アスコルビン酸；（ｅ）１〜１００ng/ml ＩＧＦ−１；及び（ｆ）１〜１０ng/ml ＴＧＦβ１を含む段階；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で得られた混合物を、段階（ｉｉｉ）（ａ）〜（ｆ）と同義の無血清ＥＨＭ培地中において機械的伸張下で培養する段階であって、力発生性ＥＨＭが形成される段階
を含む、方法。
２段階（ｉ）における最小必須培地が、Iscove培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩより選択される、実施態様１記載の方法。
３基本培地が、Iscove培地又はαＭＥＭである、実施態様２記載の方法。
４基本培地がIscove培地である、実施態様２記載の方法。
５段階（ｉ）の無血清サプリメントが、さらに、ビタミンＡ、Ｄ−ガラクトース、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、及びプトレッシンからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、実施態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６段階（ｉ）の成分（ｂ）における無血清サプリメントが、Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントである、実施態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７段階（ｉ）の成分（ｂ）における無血清サプリメントが、２〜６％(v/v) Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントである、実施態様６記載の方法。
８段階（ｉ）の成分（ｂ）における無血清サプリメントが、４％(v/v) Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントである、実施態様６記載の方法。
９段階（ｉ）の該再構成混合物が、心筋細胞と非筋細胞との混合物１．５×１０^６個あたりコラーゲン０．３〜０．５mgを含む、実施態様１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０段階（ｉ）の該再構成混合物が、心筋細胞と非筋細胞との混合物１．５×１０^６個あたりコラーゲン約０．４mgを含む、実施態様９記載の方法。
１１段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択される、実施態様１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンの少なくとも９０％がＩ型コラーゲンである、実施態様１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンが医療用である、実施態様１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンが、ヒト起源、ウシ起源、又は海洋起源である、実施態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンが、さらに、エラスチン、ラミニン、エンタクチン、ナイドジェン、プロテオグリカン、及びフィブロネクチンからなる群より選択される１つ以上の細胞外マトリックス成分を含む、実施態様１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６段階（ｉ）の再構成混合物がｐＨ７〜７．８を有する、実施態様１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７段階（ｉ）の再構成混合物が、ｐＨ約７．４を有する、実施態様１３記載の方法。
１８心筋細胞がヒト心筋細胞である、実施態様１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９心筋細胞が、胚性幹細胞に由来し、該細胞が、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変することを伴う又は工業若しくは商業目的のためのヒト胚の使用を伴う工程を用いて産生されない、実施態様１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０心筋細胞が、人工多能性細胞、単為発生幹細胞、又は成体幹細胞に由来する、実施態様１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１心筋細胞が、無血清分化によって得られる、実施態様１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２心筋細胞が、非ヒト霊長類幹細胞由来心筋細胞、胎児心筋細胞又は新生児心筋細胞である、実施態様１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３心筋細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、及び間葉系幹細胞などの非筋細胞の群より選択される細胞の１つ以上のクラスの細胞と混合して提供される、実施態様１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４心筋細胞混合物が、心筋細胞を２０〜８０％含有する、実施態様２３記載の方法。
２５心筋細胞混合物が、心筋細胞を３０〜７０％含有する、実施態様２３記載の方法。
２６心筋細胞混合物が、心筋細胞を４０〜６０％含有する、実施態様２３記載の方法。
２７心筋細胞混合物が、心筋細胞を５０％含有する、実施態様２３記載の方法。
２８非筋細胞が、線維芽細胞又は内皮細胞である、実施態様１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９非筋細胞が、線維芽細胞である、実施態様１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０非筋細胞が、ＣＤ９０を発現する、実施態様１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１心筋細胞が、段階（ｉ）において少なくとも２．７〜２０×１０^６個/mlの細胞濃度で提供される、実施態様１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２心筋細胞が、段階（ｉ）において少なくとも２．９〜１０×１０^６個/mlの細胞濃度で提供される、実施態様３１記載の方法。
３３心筋細胞が、段階（ｉ）において少なくとも３．１〜５×１０^６個/mlの細胞濃度で提供される、実施態様３１記載の方法。
３４心筋細胞が、段階（ｉ）において少なくとも３．３〜３．４×１０^６個/mlの細胞濃度で提供される、実施態様３１記載の方法。
３５段階（ｉｉ）において、型が輪状、多角形状、円板状又は袋状である、実施態様１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６段階（ｉｉ）における培養が、０．２５〜３時間実施される、実施態様１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７段階（ｉｉ）における培養が、０．５〜１．５時間実施される、実施態様３６記載の方法。
３８培養が、３０〜４０℃の温度範囲で実施される、実施態様１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９培養が、３６〜３８℃の温度範囲で実施される、実施態様３８記載の方法。
４０培養が、約３７℃で実施される、実施態様３９記載の方法。
４１培養が、５〜１０％ＣＯ_２の存在下の加湿細胞培養器中で実施される、実施態様１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２段階（ｉｉｉ）の成分（ｂ）における無血清サプリメントが、Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントである、実施態様１〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３段階（ｉｉｉ）の成分（ｂ）における無血清サプリメントが、２〜６％(v/v) Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントである、実施態様４２記載の方法。
４４段階（ｉｉｉ）の成分（ｂ）における無血清サプリメントが、４％(v/v) Ｂ２７（登録商標）サプリメント又はインスリン不含Ｂ２７（登録商標）サプリメントである、実施態様４３記載の方法。
４５段階（ｉｉｉ）の該無血清サプリメントが、さらに、ビタミンＡ、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、及びプトレッシンからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、実施態様１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６段階（ｉｉｉ）における該ＥＨＭ培地中に含まれる基本培地が、Iscove培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩより選択される、実施態様１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
４７基本培地が、Iscove培地又はαＭＥＭである、実施態様４６記載の方法。
４８基本培地が、Iscove培地である、実施態様４７記載の方法。
４９無血清ＥＨＭ培地が、約２０ng/ml ＩＧＦ１を含む、実施態様１〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０ＩＧＦ１が、ヒトＩＧＦ１である、実施態様１〜４９のいずれか１つに記載の方法。
５１無血清ＥＨＭ培地が、約５ng/ml ＴＧＦβ１を含む、実施態様１〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２ＴＧＦβ１が、ヒトＴＧＦβ１である、実施態様１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３無血清ＥＨＭ培地が、さらに、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、又はＶＥＧＦ及びＦＧＦの両方を含む、実施態様１〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４ＶＥＧＦが、ヒトＶＥＧＦである、実施態様１〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５ＦＧＦが、ヒトＦＧＦである、実施態様１〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６無血清ＥＨＭ培地が、約５〜２０ng/ml ＶＥＧＦを含む、実施態様５３記載の方法。
５７無血清ＥＨＭ培地が、約１０ng/ml ＶＥＧＦを含む、実施態様５６記載の方法。
５８無血清ＥＨＭ培地が、約５〜２０ng/ml ＦＧＦを含む、実施態様５３記載の方法。
５９無血清ＥＨＭ培地が、約１０ng/ml ＦＧＦを含む、実施態様５８記載の方法。
６０段階（ｉｉｉ）における無血清ＥＨＭ培地が、追加的に、７５０mg/L グリシン、８９０mg/L Ｌ−アラニン、１３２０mg/L Ｌ−アスパラギン、１３３０mg/L Ｌ−アスパラギン酸、１４７０mg/L Ｌ−グルタミン酸、１１５０mg/L Ｌ−プロリン、及び１０５０mg/L Ｌ−セリンを含む、実施態様１〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１段階（ｉｉｉ）における培養が、少なくとも３日間実施される、実施態様１〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２段階（ｉｉｉ）における培養が、約３〜約７日間実施される、実施態様６１記載の方法。
６３段階（ｉｖ）における培養が、少なくとも３〜６０日間実施される、実施態様１〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６４さらなる培養が、４〜３０日間実施される、実施態様６３記載の方法。
６５さらなる培養が、５〜２０日間実施される、実施態様６３記載の方法。
６６さらなる培養が、６〜１０日間実施される、実施態様６３記載の方法。
６７さらなる培養が、７日間実施される、実施態様６３記載の方法。
６８段階（ｉｖ）が。伸張装置上で実施される、実施態様１〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９伸張装置が、静的、相動性的又は動的伸張を適用する、実施態様６８記載の方法。
７０該ＥＨＭが、３mM カルシウムを用いた誘導に対して、Zimmermann et al. Circ. Res. 90, 223-230 (2002)に記載の方法を用いて決定された、０．０１mNを超える力を発生する、実施態様１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
７１該ＥＨＭが、３mM カルシウムを用いた誘導に対して、Zimmermann et al. Circ. Res. 90, 223-230 (2002)に記載の方法を用いて決定された、０．１mNを超える力を発生する、実施態様７０記載の方法。
７２該ＥＨＭが、３mM カルシウムを用いた誘導に対して、Zimmermann et al. Circ. Res. 90, 223-230 (2002)に記載の方法を用いて決定された、０．２mNを超える力を発生する、実施態様７０記載の方法。
７３該ＥＨＭが、３mM カルシウムを用いた誘導に対して、Zimmermann et al. Circ. Res. 90, 223-230 (2002)に記載の方法を用いて決定された、０．３mNを超える力を発生する、実施態様７０記載の方法。

ｈＥＨＭの形成。１０日培養後のｈＥＨＭ（鋳型中で３日、続いて特別注文のスペーサー上で７日；培養日数３＋７）。バー：１mm（。ｈＥＨＭの収縮機能の特徴付け。（Ａ）ｃＡＭＰ上昇化合物で刺激後の変時反応（Ｉｓｏ：β−アドレナリン刺激；ＩＢＭＸ：ホスホジエステラーゼ阻害、ｎ＝６／群）。（Ｂ）増加する濃度の細胞外カルシウムに対するｈＥＨＭの変力反応、ｈＥＳ２（ｎ＝１２）、ｈＥＳ３（ｎ＝１２）及びｉＰＳＩ２（ｎ＝３）の比較。（Ｃ）イソプレナリン（三角）及びカルバコール（四角）刺激に対するｈＥＨＭ（ｈＥＳ２）の変力反応。挿入図：規準化単収縮。低カルシウム下（一番下のグラフ）、イソプレナリンを用いた刺激（一番上のグラフ）及びカルバコールを用いた刺激（中央のグラフ）。（Ｄ）イソプレナリン（三角）及びカルバコール（四角）刺激を用いたｈＥＨＭの弛緩。挿入図：ベースライン値に比べた^＊Ｐ＜０．０５での規準化単収縮、（Ａ：対応のある両側スチューデントｔ検定；Ｃ、Ｄ：ＡＮＯＶＡに続くダネット事後検定）。ＥＨＭ形成に対する非筋細胞の重要性。（Ａ）規準化された力を、ｈＥＳ２株から発生したＥＨＭ中の心筋細胞（アクチニン＋細胞）の率と比較（丸：単層心臓分化プロトコール（Hudson, et al. Stem Cells Dev 21: 1513-1523 (2012)）、四角：ＥＢ心臓分化プロトコール（Yang et al. Nature 453: 524-528 (2008))）及びｉＰＳＢＪ株（三角）。（Ｂ）心筋細胞１００％（ＣＭ１００％）及び心筋細胞７０％と心臓線維芽細胞３０％との混合物（ＣＭ／ＣＦ７０／３０％）で発生したｈＥＨＭの収縮力、ｎ＝１。ＧＭＰ適合性のヒドロゲルマトリックス。（Ａ）ラットコラーゲン（０．４mg/ＥＨＭ、ｎ＝１２）又はウシコラーゲン（０．４mg/ＥＨＭ、ｎ＝１４）を用いて細胞外カルシウム濃度２mmol/Lで作られたｈＥＨＭの収縮力。（Ｂ）「本来のプロトコール」（ラットコラーゲン、Matrigel（登録商標）、ｎ＝１２）及び「マトリックスプロトコール」（ウシコラーゲン、Matrigel（登録商標）なし、ｎ＝９）を用いて作られた、ｈＥＨＭの２mmol/L 細胞外カルシウムでの収縮力。表１も参照されたい。（Ｃ）ウシ（ｂｏｖ．）コラーゲンのみ、ウシコラーゲン＋Matrigel（１０％v/v）、ウシコラーゲン＋フィブロネクチン（５μg/ＥＨＭ）、及びウシコラーゲン＋フィブロネクチン（５μg/ＥＨＭ）＋ラミニン（５μg/ＥＨＭ）、ｎ＝４／群で作られたｈＥＨＭの、２mmol/L 細胞外カルシウムでの収縮力。２０％血清を有するIscoveに比べた基本培地及び無血清成長サプリメントのスクリーニング。（Ａ）左から右：血清含有ＥＨＭ培地（表１も参照されたい）に比べた、Iscove、ＲＰＭＩ及びａＭＥＭ基本培地ベースの無血清培地（表２〜４も参照されたい）の細胞死、心筋細胞の率（ＣＭ率）、心筋細胞の平均アクチニン蛍光（ＣＭ成熟）、側方散乱面積ベースの心筋細胞サイズ（ＣＭサイズ）及び側方散乱面積ベースの非筋細胞サイズ（ＮＭサイズ）における変化。（Ｂ）左から右：血清含有ＥＨＭ培地（表１も参照されたい）に比べた、インスリン含有（Ｂ２７＋）及びインスリン不含（Ｂ２７−）のＢ２７を２％及び４％有する無血清培地の細胞死、心筋細胞の率（ＣＭ率）、心筋細胞の平均アクチニン蛍光（ＣＭ成熟）、側方散乱面積ベースの心筋細胞サイズ（ＣＭサイズ）及び側方散乱面積ベースの非筋細胞サイズ（ＮＭサイズ）における変化。ペプチド成長因子及び脂肪酸サプリメントのスクリーニング。（Ａ）無血清限定ＥＨＭ培地について考慮された因子。左から右：因子不含無血清培地に比べた、表示の成長因子及び脂肪酸サプリメントによる細胞死、心筋細胞の率（ＣＭ率）、心筋細胞の平均アクチニン蛍光（ＣＭ成熟）、側方散乱面積ベースの心筋細胞サイズ（ＣＭサイズ）及び側方散乱面積ベースの非筋細胞サイズ（ＮＭサイズ）における変化。（Ｂ）無血清限定ＥＨＭ培地について考慮されなかった因子。左から右：因子不含無血清培地に比べた、表示の成長因子及び脂肪酸サプリメントによる細胞死、心筋細胞の率（ＣＭ率）、心筋細胞の平均アクチニン蛍光（ＣＭ成熟）、側方散乱面積ベースの心筋細胞サイズ（ＣＭサイズ）及び側方散乱面積ベースの非筋細胞サイズ（ＮＭサイズ）における変化。ｈＥＳＣ細胞からの無血清限定ＥＨＭ発生。（Ａ）増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｈＥＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力、血清含有培地（血清）、及び無血清Iscoveベース培地（ＳＦ−ＩＭＤＭ、表５も参照されたい）、無血清ａＭＥＭベース培地（ＳＦ−ａＭＥＭ、表６も参照されたい）、及び無血清ＲＰＭＩベース培地（ＳＦ−ＲＰＭＩ）の比較。血清／ＳＦＩＭＤＭ、ＳＦ−ａＭＥＭ、ＳＦ−ＲＰＭＩ（ｎ＝１５／５／６／７）についてのカルシウムに対するそれぞれのＥＣ_５０。ｎ．ｄ．：判定せず。（Ｂ）典型的な心筋の性質（筋束）を示す無血清ｈＥＨＭの免疫染色。α−筋節アクチニンに対する抗体及び核染色についてのＤＡＰＩを用いて染色を行った。（Ｃ）血清含有ＥＨＭ（血清）、及び無血清IscoveベースＥＨＭ（ＳＦ−ＩＭＤＭ）、無血清ａＭＥＭベースＥＨＭ（ＳＦ−ａＭＥＭ）（ｎ＝１５／５／６）の１μM イソプレナリンを用いたアドレナリン刺激後の力の変化率、^＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）血清含有ＥＨＭ（血清）、及び無血清IscoveベースＥＨＭ（ＳＦ−ＩＭＤＭ）、無血清ａＭＥＭベースＥＨＭ（ＳＦ−ａＭＥＭ）（ｎ＝１５／５／６）の１０μM カルバコールを用いたムスカリン刺激後の力の変化率。バー：２０μm。無血清ｈＥＨＭの力に及ぼすカルシウムの作用。Ａ）増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｈＥＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力、ＲＰＭＩ培地（〜０．４mM カルシウム、ｎ＝２）、及び０．８mM ＣａＣｌ添加ＲＰＭＩ培地（最終遊離カルシウム濃度〜１．２mMカルシウム、ｎ＝２）の比較。Ｂ）ＲＰＭＩ又はＲＰＭＩ＋カルシウム培地中で培養された無血清ｈＥＨＭの１μM イソプレナリンに対する応答。ｈＥＨＭの力に及ぼすＴＧＦｂ１の作用。（Ａ）増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｈＥＨＭ（ｉＰＳＢＪ）の収縮力、培養０〜３日からの無血清培地（ＳＦ）及び５ng/ml ＴＧＦｂ１を有する無血清培地の比較（ｎ＝４／群、^＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）培養０〜３日（ＳＦ＋ＴＧＦｂ１、０〜３日）及び培養０〜１０日（ＳＦ＋ＴＧＦｂ１、０〜１０日、ｎ＝５／群）からのＴＧＦｂ１処理された無血清培地におけるヒトＥＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力の比較。ｈＥＨＭの力に及ぼすＦＧＦ及びＶＥＧＦの作用。増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｈＥＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力、無血清培地（ＳＦ、ｎ＝３）、１０ng/ml ＦＧＦ−２を有する無血清培地（ＳＦ＋ＦＧＦ、ｎ＝３）、及び１０ng/ml ＶＥＧＦを有する無血清培地（ＳＦ＋ＶＥＧＦ、ｎ＝３）の比較、^＊ｐ＜０．０５ＳＦ＋ＦＧＦ対ＳＦ。ｈＥＨＭの力に及ぼすＢ２７サプリメントの濃度の作用。増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｈＥＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力、血清含有培地（血清）及び２％Ｂ２７を有する無血清培地（ＳＦ−２％Ｂ２７）及び４％Ｂ２７を有する無血清培地（ＳＦ−４％Ｂ２７）の比較、ｎ＝１７／９／１１、^＊ｐ＜０．０５対２％Ｂ２７。ｈＥＨＭの力に及ぼすＢ２７組成物の作用。増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｈＥＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力、血清含有培地（ｎ＝９）、完全なＢ２７を有する無血清培地（ｎ＝５）、抗酸化剤不含Ｂ２７を有する無血清培地（ｎ＝５）、及びインスリン不含Ｂ２７を有する無血清培地（ｎ＝５）の比較。ｈＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞からのｈＥＨＭにおける特別注文のサプリメントによるＢ２７の置換。（Ａ）増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｈＥＨＭ（ｈＥＳ２）の収縮力、血清含有培地（ｎ＝３）、インスリン不含Ｂ２７を有する無血清培地（Ｂ２７−インスリン、ｎ＝５）、及び特別注文のサプリメントを有する無血清培地（ＣＭＳ；ｎ＝３）の比較。（Ｂ）増加する濃度の細胞外カルシウムを用いたｉＰＳ細胞（ＢＪ）からのｈＥＨＭの収縮力、血清含有培地（ｎ＝８）、Ｂ２７−インスリンを有する無血清培地（ｎ＝８）、及び特別注文のサプリメントを有する無血清培地（ＣＭＳ；ｎ＝４）の比較。培養時間の延長に伴う無血清ｈＥＨＭの成熟。（Ａ）無血清条件で培養２週間（下のグラフ）、４週間（中央のグラフ）、及び８週間（上のグラフ）時点でのｈＥＨＭ（ｈｉＰＳ−Ｇ１）の収縮力（１条件につきｎ＝４〜６）。（Ｂ）８週齢無血清ＥＨＭからの個別の心筋細胞の明視野像。バー：２０μm。

以下の実施例は、本発明を限定するわけではなく、さらに例証する意図である。本実施例は、様々な技術的特徴を含み、本発明は、この例示的な節に示された技術的特徴の組合せにも関することが理解されよう。

実施例
材料
本明細書に使用される材料は、市販されている。例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、αＭＥＭ（カタログ番号32561-029）、ストレプトマイシン、ペニシリン、及びＢ２７はInvitrogenから得ることができ；医療用ウシコラーゲンはDevros Medicalから入手可能であり；脂肪酸サプリメントは、Sigmaから注文することができ（カタログ番号F7050）；様々な成長因子は、Peprotechから入手可能である（ＦＧＦ２、ＡＦ−１ββ−１８Ｂ；ＩＧＦ−１、ＡＦ−１００−１１；ＴＧＦβ１、１００−２１）。

方法
ヒトＥＳＣ及びｉＰＳ株並びに培養
本発明者らは、本研究にＨ９．２（Technion, Haifa, Israel）、ｈＥＳ３（Embryonic Stem Cell International, Singapore）及びトランスジェニックｈＥＳ３−ＥＮＶＹ（Costa, M., et al. Nat Methods 2: 259-260 (2005)）並びにｈＥＳ２株（McEwen Centre for Regenrative Medicine, Toronto, Canada; Yang et al. Nature 453: 524-528 (2008)）を利用した（Robert-Koch-InstituteによってW.-H.Z.に承認：許可番号１２；参照番号：１７１０−７９−１−４−１６）。分化したＥＢは、ハンブルグ／ゲッチンゲンに室温で輸送され、７２〜９６時間以内に到着した。ｉＰＳ株は、トロント（ｉＰＳＢＪ）及びゲッチンゲン（ｉＰＳＩ２、Streckfuss-Bomeke et al. Eur Heart J (2012) doi: 10.1093/eurheartj/ehs203、及びｉＰＳＳｅｎｄａｉ）由来であった。

他に記載されたように、ＥＢをコラゲナーゼＢ（１mg/ml; Ｈ９．２）、コラゲナーゼＩ（２mg/ml）及び／又はトリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％/１mmol/l；ｈＥＳ３、ｈＥＳ３−ＥＮＶＹ、ｈＥＳ２、ｉＰＳＮＪ、ｉＰＳＩ２）で消化した（Kehat et al. J Clin Invest 108: 407-414 (2001); Mummery et al. Circulation 107: 2733-2740 (2003); Xu et al. Circ Res 91: 501-508 (2002); Yang et al. Nature 453: 524-528 (2008); Passier et al. Stem Cells 23: 772-780 (2005)；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。トロポミオシン又は筋節アクチニンの染色後に、酵素により分散された細胞の代表的な一定分量中の心筋細胞を計数した。

基本的なヒト人工心筋（ｈＥＨＭ）の構築
本発明者らは、改変されたＥＨＭ工学プロトコール（Zimmermann et al. Circ Res 90: 223-230 (2002)、参照により本明細書に組み入れられる）を用いてｈＥＨＭを構築した。簡潔には、新鮮分散されたＥＳＣ由来細胞（derivatives）（２０％ウシ胎児血清、１％可欠アミノ酸、２mmol/l グルタミン、１００μmol/l β−メルカプトエタノール、１００U/ml ペニシリン、及び１００mg/ml ストレプトマイシンを有するIscove培地中に細胞１×１０^４〜１５×１０^６個）、ラット尾由来ｐＨ中和Ｉ型コラーゲン（０．４mg/ＥＨＭ）、Matrigel（商標）（１０％v/v; Becton Dickenson又はtebu）、及び濃縮血清含有培地（２×ＤＭＥＭ、２０％ウマ血清、４％ニワトリ胚抽出物、２００U/ml ペニシリン、及び２００mg/ml ストレプトマイシン）を含有する混合物を円形の型（内径／外径：２／４mm；高さ：５mm）の中にピペットで入れることによってＥＨＭ（再構成体積：４５０μl）を調製した（表１）。ｈＥＨＭは鋳型内で速やかに凝縮し、培養３日目にそれを静的伸張装置（自然長（slack length）の１１０％）上に移動させた（Zimmermann et al. Nat Med 12: 452-458 (2006)、参照により本明細書に組み入れられる）。培地を２日毎に交換した。伸張下でのｈＥＨＭ培養を７日間行った。

本明細書に開示の改良法のための基礎として役立つために適する、別の詳細な先行技術のプロトコールは、Soong et al. Curr Prot Cell Biol. 23.8.1-23.8.21 (2012)に記載されており、これはその全体が本明細書に組み入れられ、「基本プロトコール２」及び「補助プロトコール２」が特に参照される。

異種マトリックス成分の回収及び置換
プレＧＭＰのｈＥＨＭを可能にするために異種成分が減少したプロトコール（マトリックスプロトコール、表１）を確立した。ｐＨ中和ウシコラーゲン（Devros Medical、０．４mg/ＥＨＭ）と濃縮血清含有培地（２×ＤＭＥＭ、４０％ウシ胎児血清、２００U/ml ペニシリン、及び２００mg/ml ストレプトマイシン）との混合物中で細胞を再構成し、２０％ウシ胎児血清、１％可欠アミノ酸、２mmol/l グルタミン、０．３mmol/l アスコルビン酸、１００μmol/l β−メルカプトエタノール、１００U/ml ペニシリン、及び１００μg/ml ストレプトマイシンを有するIscove培地中で培養した。

異種培地成分の回収及び置換
完全に明確な無血清ＥＨＭを発生させるために、ｐＨ中和ウシコラーゲン（Devros Medical、０．４mg/ＥＨＭ）、濃縮無血清培地（２×ＤＭＥＭ、８％Ｂ２７、２００U/ml ペニシリン、及び２００mg/ml ストレプトマイシン）との混合物中で細胞を再構成し、完全４％Ｂ２７、１％可欠アミノ酸、２mmol/l グルタミン、０．３mmol/l アスコルビン酸、２０ng/ml ＩＧＦ−１、１０ng/ml ＦＧＦ２、１０ng/ml ＶＥＧＦ、５ng/ml ＴＧＦｂ１（培養０〜３日のみ）、及び１００U/ml ペニシリン、及び１００μg/ml ストレプトマイシンを有するIscove培地中で培養した（無血清プロトコール、表１）。Ｂ２７サプリメントは、ビタミン（ビオチン、ＤＬアルファトコフェロール、酢酸ＤＬアルファ−トコフェロール、ビタミンＡ）、タンパク質及び酵素（ＢＳＡ、フラクションＶ脂肪酸フリー、カタラーゼ、ヒト組換えインスリン、ヒトトランスフェリン、スーパーオキシドディスムターゼ）、並びに他の細胞支援成分（コルチコステロン、Ｄ−ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン（還元型）、Ｌ−カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム、及びＴ３（トリヨード−Ｉ−チロニン）を含有する。表示した場合、完全Ｂ２７（Invitrogen, A1486701）は、抗酸化剤不含Ｂ２７（Invitrogen, #10889038）及びインスリン不含Ｂ２７（Invitrogen, #0050129SA）と比較された。Ｂ２７サプリメントを、アルブミン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、ヒドロコルチゾン、脂肪酸サプリメント、及びトリヨード−Ｌ−チロニンからなる特別注文のサプリメントと置換した（表２）。

収縮機能の解析
本発明者らは、前記等尺条件での収縮力及び単収縮の動態（収縮時間：５０％収縮から最大収縮までの時間；弛緩時間：最大収縮から５０％弛緩までの時間）を解析した（Zimmermann et al. Circ Res 90: 223-230 (2002)、参照により本明細書に組み入れられる）。収縮周波数は、培養器からＥＨＭを取り出した直後に光学顕微鏡法によって評価した（非刺激自然収縮）。

フローサイトメトリー
異なる培地条件で培養されたＥＢを、上記のように単一細胞懸濁液に調製した。細胞を絶えず混合しながら７０％氷冷エタノール中で固定した。心筋細胞を標識するために、筋節アクチニン（Sigma）について細胞を染色し、核ＤＮＡ含量を分析し細胞ダブレットを排除するためにＤＡＰＩで染色した。細胞をＬＳＲＩＩサイトメーター（ＢＤ）にかけた。少なくとも１０，０００個の生細胞を分析した。次に、以下のパラメーターを解析した、（１）細胞死（ｓｕｂ−Ｇ１期画分の細胞の率）、（２）心筋細胞及び非筋細胞の率（それぞれアクチニン陽性及び陰性細胞）、（３）心筋細胞成熟（平均アクチニン蛍光）、（４）心筋細胞サイズ及び（５）非筋細胞サイズ（側方散乱面積ベース、ＳＳＣ−Ａ）。

形態解析
それぞれ前記の共焦点レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ；Zeiss 510 Meta LSM System又はZeiss 710 LSM）のために、ｈＥＨＭを中性緩衝４％ホルムアルデヒド／１％メタノール（ｐＨ７．４）中で固定した（Zimmermann et al. Circ Res 90: 223-230 (2002)、参照により本明細書に組み入れられる）。ＣＬＳＭについて、本発明者らは、ビブラトーム切片を調製し（１００μm; Leica VT1000 S）、α−筋節アクチニンに対する抗体（Sigma clone EA-53、１：８００；適切な二次抗体を使用）を用いた免疫蛍光標識にこれらの切片を供した。核をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；１μg/ml）で染色した。

統計解析
データを平均±平均の標準誤差として表した。表示のような対応のある及び対応のない両側スチューデントｔ検定又はＡＮＯＶＡに続くダネット事後検定を用いて統計的な差を判定した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意と見なした。

結果
ヒト人工心筋（ｈＥＨＭ）の発生
ハイファ（Ｈ９．２；）、シンガポール（ｈＥＳ３及びｈＥＳ３−ＥＮＶＹ；Costa et al. Nat Methods 2: 259-260 (2005)）、及びトロント（ｈＨＥＳ２；ｉＰＳ）で調製されたＥＢを、培地を充填した気密容器に入れて、室温で速達便によりハンブルグ／ゲッチンゲンに送った。７２〜９６時間以内に確実に配達されるようにした。到着後、ＥＢを新鮮培地中に移植し、２４〜４８時間回復させた。その間に、ＥＢは自然収縮活性を再獲得した。ＥＢを酵素的に分散させ、結果として生じた単一細胞懸濁液をｈＥＨＭ発生又は細胞組織検査に割り当てた。初回実験系列で、ｈＥＨＭ毎に必要な細胞量の数（細胞１×１０^４〜１５〜１０^６個）及びｈＥＨＭ構築のための異なるＥＳＣ株（Ｈ９．２、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ３−ＥＮＶＹ）及びｉＰＳ株（Ｉ２、ＢＪ、Ｓｅｎｄａｉ）（ｎ＝６７）の有用性を調査した。様々なサイズの領域の自然拍動を、ｈＥＨＭ注型の４８時間以内に全ての培養物で観察することができた。しかし、細胞１．２５〜１５×１０^６個/ＥＨＭが利用された場合に限り、力発生性ｈＥＨＭが形成された（図１）。ＥＨＭのサイズに応じて、細胞密度を容易に適応させることができる。

ｈＥＨＭの器官型機能
ｈＥＨＭは、少なくとも培養３週間は安定的及び律動的に収縮した（３７℃で０．８±０．０５Hz；ｎ＝１４）。本発明者らは、１０日目に詳細な機能的特徴付けを行った。イソプレナリンと一緒のインキュベーションは、自然拍動周波数を１．２±０．１Hzに増加させた（ｎ＝６；Ｐ＜０．０１、図２Ａ）。３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ；１００μmol/l）を用いたホスホジエステラーゼの追加阻害は、１．６±０．１Hzへの自然拍動速度のさらなる増加を引き起こした（ｎ＝６；Ｐ＜０．００１、図２Ａ）。ｈＥＨＭは、２．４mmol/l カルシウム（ＥＣ_５０：０．８±０．０４mmol/l、ｎ＝１７；図２Ｂ）で最大単収縮平均力１３０±１３μNを生じた。ＥＣ_５０より下の細胞外カルシウム（０．４mmol/l）で１μmol/l イソプレナリンを用いたβ−アドレナリン刺激は、収縮力を４７±１２％増加させ（ｎ＝１２；図２Ｃ）、弛緩を１１３±２．３msに短縮した（ｎ＝１２；図２Ｄ）。

ＥＨＭ形成における非筋細胞の重要性
本実施例で利用された全てのＥＳＣ株及びｉＰＳ株は、ｈＥＨＭ発生に適するように見えた。どの心筋細胞含量が力発生性組織にとって最適かを試験するために、本発明者らは、心筋細胞の率に対して、生じた力をプロットした。興味深いことに、心筋細胞の率４０〜８０％で最大の力が生じる釣り鐘型分布が見出された（図３Ａ）。

この観察は、適切な組織形成にとっての非筋細胞の重要な役割を示唆している。これを調査するために、本発明者らは、表面マーカーＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）によって精製されたヒト心筋細胞を用いた実験を行った（Dubois et al. Nat Biotechnol 29: 1011-1018 (2011)）。精製心筋細胞から発生したＥＨＭは、力発生性組織を形成しなかった（図３Ｂ）。しかし、ヒト心臓線維芽細胞を３０％補充することによって、力産生が良好な、より硬い組織が得られた。これらの結果は、非筋細胞が心臓組織形成に極めて重要であること、及びこれらの細胞も無血清条件で支援される必要があることを強調している。

ＧＭＰ適合マトリックスを用いたｈＥＨＭの発生
初めに本発明者らは、本発明者らが新生ラット心臓細胞モデルにおいて開発したプロトコールに基づきｈＥＨＭを構築した（Zimmermann et al. Biotechnol Bioeng 68: 106-114 (2000)）。このプロトコールは、インビボ「治療応用」に不適合ないくつかの非ヒト成分を含む（ラットコラーゲン、Matrigel、ウマ血清、ウシ胎児血清、及びニワトリ胚抽出物を含む）。この注意事項に取り組むために、ｈＥＨＭ−マトリックスの非ヒト成分を減少させることができるかどうかを直接試験する一連の実験を最初に行った。ラットコラーゲンを医療用（ＧＭＰ）ウシコラーゲンに置換したが、性能の損失はなかった（図４Ａ）。また、Matrigel（登録商標）、ウマ血清及びニワトリ胚抽出物は、ｈＥＨＭの形成及び機能にマイナスの影響を与えずに省くことができた（「マトリックスプロトコール」、図４Ｂ、表１）。フィブロネクチン及びMatrigel（登録商標）の主成分の１つであるラミニンなどの他の細胞外マトリックスタンパク質をウシコラーゲンに補充しても、追加的な利益を生じなかった（図４Ｃ）。

ｈＥＨＭ形成を支援するための無血清培地の明確化
ヒトＥＨＭ培養物をさらに明確にし、ＧＭＰ適合性にするために、本発明者らは、全ての明確でない血清成分を、化学的に明確なサプリメントと置換しようと努めた。これらのサプリメントをスクリーニングするために、本発明者らは、３Ｄ−ヒト胚様体（ＥＢ）培養物に基づく簡便スクリーニングアルゴリズムを導入した。このスクリーニング用のＥＳＣを無血清条件で培養した（Yang et al. Nature 453: 524-528 (2008); Kattman et al. Cell Stem Cell 8: 228-240 (2011)）。スクリーニングのための参照は、本発明者らの血清含有ＥＨＭ培地（表１）であった：（１）Iscove、（２）２mmol/L Ｌ−グルタミン、（３）２０％ＦＢＳ、（４）１％可欠アミノ酸、（５）０．３mmol/L アスコルビン酸、（６）１００μmol/l β−メルカプトエタノール、（７）１００U/ml ペニシリン／１００mg/ml ストレプトマイシン。基本培地及びサプリメントの有益な役割又は有害な役割のための読出し情報として、フローサイトメトリーベースのプロトコール（Tiburcy et al. Circ Res 109: 1105-1114 (2011)；参照により本明細書に組み入れられる）を確立して、（１）細胞死（ｓｕｂ−Ｇ１期のＤＮＡ含量に基づく）、（２）心筋細胞含量（アクチニン発現に基づく）、（３）心筋細胞成熟（心筋細胞１個あたりのアクチニン平均蛍光に基づく）、（４）心筋細胞サイズ、及び（５）非筋細胞サイズ（側方散乱面積に基づく）を決定した。

本発明者らは、最初に、Ｂ２７を補充した及び補充していない３つの基本培地処方（Iscove、ＲＰＭＩ、αＭＥＭ：表３〜５）をスクリーニングした。Ｂ２７は、ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣの分化のためにいくつかのグループによって使用されている（Burridge et al. Cell Stem Cell 10: 16-28 (2012)）。このスクリーニングによって、試験された基本培地にかかわらず、Ｂ２７がＥＢ形成に不可欠であることが実証された。Iscove及びＲＰＭＩは、匹敵する結果を示したが、ａＭＥＭは、わずかに高い細胞死を引き起こすように見えた。他方で、αＭＥＭは心筋細胞のアクチニン発現にとって優れていた（図５Ａ）。

本発明者らは、基本ＲＰＭＩの存在下で培養されたＥＨＭの準最適な性能を示す、自身の予備的結果から（図７）、基本培地としてIscove又はａＭＥＭを用いたスクリーニングを継続した。本発明者らは、次に、そのインスリン含有及び不含標準処方におけるＢ２７の有用性を精査した。４％Ｂ２７へのインスリン補充（終濃度１０μg/ml）は、インスリン不含Ｂ２７及びより低いＢ２７（２％）サプリメント濃度に比べて、最低の細胞死及びより大きな非筋細胞支援の可能性を示した（より低い心筋細胞の率は、より多い非筋細胞への移行を示唆する）（図５Ｂ）。本発明者らは、次に、ＥＣ５０を超える濃度で６つのペプチド成長因子及び脂肪酸サプリメントの有用性をスクリーニングした。ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＣＴ−１及びニューレグリン−１は、実質的な細胞死を引き起こし、一方でＩＧＦ−１は、細胞死から保護するように見えた（図６Ａ、Ｂ）。ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦ及び脂肪酸サプリメントは、個別の心筋細胞のアクチニン発現を高めた。ＦＧＦ−２は、非筋細胞の成長を支援し、心筋細胞の細胞サイズを増大させた（図６Ａ）。ＴＧＦβ２は、有益な作用を有さなかった（図６Ｂ）。試験化合物又はそれらの組合せの全ては、心臓の発生及びＥＨＭ発生に意味づけられた（Naito et al. Circulation 114: I72-78 (2006); Shimojo et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293: H474-481 (2007); Vantler et al. J Mol Cell Cardiol 48: 1316-1323 (2010); Odiete et al. Circ Res 111: 1376-1385 (2012); Wollert & Chien J Mol Med (Berl) 75: 492-501 (1997); Price et al. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 272: 424-433 (2003); Molin et al. Dev Dyn 227: 431-444 (2003); Corda et al. Circ Res 81: 679-687 (1997); Lopaschuk & Jaswal J Cardiovasc Pharmacol 56: 130-140；全て参照により本明細書に組み入れられる）。

ＥＨＭの発生は、２つの段階によって特徴付けられる。初め、分離された細胞がマトリックス中に「定着し」、それら自体及びマトリックスを再組織化する「凝縮期」があり、これには実質的な細胞死も伴い得る。この段階は、非筋細胞によって大きな影響を受ける。第２の段階は、機械的負荷下での組織の成熟である。この時期は、心筋細胞の肥大成長及び成熟、整列、力発生の増加、及びマトリックス安定化によって特徴付けられる（Tiburcy et al. Circ Res 109: 1105-1114 (2011)）。

本発明者らは、段階に応じて異なる培地条件が必要とされ得ると考えた。凝縮期中の細胞死を防ぐために、本発明者らは、中立的である又は初回スクリーニングでの細胞死を減らしさえする培地成分の組合せを選択した。これは、Iscove基本培地、４％Ｂ２７、及びＩＧＦ−１である。また、非筋細胞を介したマトリックスの再組織化及び凝縮は、非筋細胞の数及び／又はサイズを増大させる因子によって支援された（第一段階においてＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β１、ＦＧＦ−２）。ＶＥＧＦは、心筋細胞成熟を支援するために添加される（表５）。次に、力発生性ＥＨＭの形成を支援する能力についてこの培地を試験した。無血清ＥＨＭは、自然拍動周波数１１３±１２bpm（ｎ＝７）で首尾一貫して拍動していた。血清含有ＥＨＭは、有意に速く拍動していた（１９９±８bpm、ｎ＝８）。本発明者らは、血清含有対照と比べて、類似の最大力発生及びカルシウム感受性を見出した（図７Ａ）。収縮力において匹敵する結果で、Iscove及びαＭＥＭ基本培地の両方は、ＥＨＭ形成を支援した。ＲＰＭＩは、力発生性組織を支援しなかった（図７Ａ、表５、６）。形態学的に、無血清ＥＨＭは、異方性に整列した心筋細胞を有する、十分に発達した筋束を含んでいた（図７Ｂ）。重要なことに、無血清ＥＨＭは、心筋に関して予想される通り、アドレナリン及びムスカリン刺激に応答した。実際、αＭＥＭＥＨＭは、血清含有対照よりも有意に良好に応答した（図７Ｃ、Ｄ）。

本発明者らは、ＲＰＭＩ培地の性能が不十分であるのは、ＲＰＭＩ培地の遊離カルシウム濃度が生理濃度よりも低いことが原因であると仮定した（０．４２４mmol/L、表４）。これが真実かどうかを試験するために、本発明者らは、ＲＰＭＩ培地を、０．８mM ＣａＣｌが添加されたＲＰＭＩ培地（遊離カルシウム終濃度１．２４２mmol/L）と比較する追加的な実験を行った。ＲＰＭＩを伴うＥＨＭは、ほとんど収縮しなかったが、カルシウムの補充は、最大力が測定可能になること及びイソプレナリンに対する応答がより良好になることにつながる（図８）。実際、補充後のＲＰＭＩを用いたときの最大力産生は、ＩＭＤＭ又はαＭＥＭ培地に匹敵したので（図７Ａ）、約１〜２mmol/Lカルシウムの範囲が適切な組織機能に必要とされることが示唆される。

初回のスクリーニングからの結果を確認するために、本発明者らは、追加的に、機能性ＥＨＭの形成に対する重大な因子の影響を試験した。０〜３日目のＴＧＦβ１添加が不可欠であったが、ＴＧＦβ１処置の延長は追加的な利益を生じなかった（図９Ａ、Ｂ）。ＦＧＦ及びＶＥＧＦの両方が、力発生を高めることができたので、組織形成への重要な貢献が確認される（図１０）。

Ｂ２７サプリメント濃度を４％に増大させることは、２％Ｂ２７よりも優れていた（図１１）。Ｂ２７のどの成分がＥＨＭの機能にとって不可欠であるかを試験するために、最初に本発明者らは、市販されている異なるＢ２７処方を用いて実験を行った。本発明者らは、完全Ｂ２７をインスリン不含Ｂ２７及び抗酸化剤不含Ｂ２７と比較した。抗酸化剤不含Ｂ２７は、完全Ｂ２７に匹敵する性能を示したので、抗酸化剤が必要とされないことが示唆される。驚くことに、インスリン不含Ｂ２７は、完全Ｂ２７よりも性能が良好であったので、インスリンの補充も必要とされないことが暗示される（図１２）。

次にこれらの結果に基づき、本発明者らは、Ｂ２７と置換するための特別注文の血清サプリメントを開発した（表７）。本発明者らが、血清含有培地及びインスリン不含Ｂ２７を有する無血清培地に対してこの特別注文の血清サプリメントを試験したとき、本発明者らは、匹敵する最大力発生を見出したので、無血清ＥＨＭ培養物からＢ２７を省き、特別注文の血清サプリメントによって置換することができることが示唆される（図１３Ａ）。これらの結果は、ｉＰＳＣからのｈＥＨＭで確認されたので、異なる多能性幹細胞の供給源から明確な人工心筋を発生させるための有用性を実証している（図１３Ｂ）。

無血清ｈＥＨＭが心筋細胞の長期培養及び成熟を支援するかどうかを調査するために、本発明者らは、培養２週間、４週間、及び８週間時点でのｈＩＰＳ−Ｇ１からの無血清ｈＥＨＭの力産生を試験した。本発明者らは、力産生における強い増加（図１４Ａ）及び規則的な横紋を有する個別のｈＥＨＭ由来心筋細胞の桿状形態（図１４Ｂ）を観察したので、無血清条件で成熟が十分に進行していることが示唆される。

結論
本研究は、分化した力発生性ヒト心筋を、完全に明確な無血清条件でインビトロ発生できることを最初に実証している。本プロトコールは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞に由来する心筋のために役立つ。

これは、例えば交絡する血清因子なしに成熟及び肥大を調査するための将来的なインビトロ研究、並びに潜在的なインビボ応用及びＧＭＰ規制下での治療アプローチを可能にする大きなブレークスルーである。

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Claims

人工心筋（ＥＨＭ）を産生するための方法であって：
（ｉ）（ａ）無血清最小必須培地；（ｂ）０．５〜５０mg/ml アルブミン、１〜１００μg/ml トランスフェリン、０．１〜１０μg/ml エタノールアミン、０．００３〜０．３μg/ml 亜セレン酸ナトリウム、０．４〜４０μg/ml Ｌ−カルニチンＨＣｌ、０．１〜１０μg/ml ヒドロコルチゾン、０．０５〜５μl/ml 脂肪酸サプリメント、０．０００１〜０．１μg/ml トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ３）及び０．２〜２mg/ml コラーゲンの終濃度を生じる無血清サプリメント；並びに（ｃ）ヒト心筋細胞とヒト非筋細胞との混合物であって、総細胞混合物の２０〜８０％が心筋細胞である混合物、を含む無血清再構成混合物を１つ以上の型の中に提供する段階であって；
心筋細胞が、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を改変することを伴う又は工業若しくは商業目的のためのヒト胚の使用を伴う工程を用いて産生されず；
再構成混合物がｐＨ７．２〜７．６を有する、段階；
（ｉｉ）該１つ以上の型の中で無血清再構成混合物を培養する段階であって、無血清再構成混合物を少なくとも１５分間凝縮させる段階；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で得られた混合物がその本来の厚さの少なくとも５０％に凝縮するまで、該１つ以上の型の中で無血清ＥＨＭ培地中において該混合物を培養する段階であって、該ＥＨＭ培地が、（ａ）０．５〜３mmol/L Ｃａ^２＋を含む基本培地；（ｂ）（ｉ）（ｂ）と同義の無血清サプリメント；（ｃ）０．５〜１０mmol/L Ｌ−グルタミン；（ｄ）０．０１〜１．０mmol/L アスコルビン酸；（ｅ）１〜１００ng/ml ＩＧＦ−１；及び（ｆ）１〜１０ng/ml ＴＧＦβ１を含む段階；
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で得られた混合物を、段階（ｉｉｉ）（ａ）〜（ｆ）と同義の無血清ＥＨＭ培地中において機械的伸張下で培養する段階であって、力発生性ＥＨＭが形成される段階
を含む、方法。
段階（ｉ）及び／又は段階（ｉｉｉ）における最小必須培地が、Iscove培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩより選択され、好ましくは基本培地が、Iscove培地又はαＭＥＭであり、より好ましくは基本培地が、Iscove培地である、請求項１記載の方法。
段階（ｉ）及び／又は段階（ｉｉｉ）の無血清サプリメントが、さらに、ビタミンＡ、Ｄ−ガラクトース、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、及びプトレッシンからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、請求項１又は２記載の方法。
段階（ｉ）の該再構成混合物が、心筋細胞と非筋細胞との混合物１．５×１０^６個あたりコラーゲン０．３〜０．５mgを含み、好ましくは段階（ｉ）の該再構成混合物が、心筋細胞と非筋細胞との混合物１．５×１０^６個あたりコラーゲン約０．４mgを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンが医療用であり、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択され、好ましくは段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンの少なくとも９０％がＩ型コラーゲンであり、好ましくは段階（ｉ）の再構成混合物の成分（ｃ）において、該コラーゲンが、さらにエラスチン、ラミニン、エンタクチン、ナイドジェン、プロテオグリカン、及びフィブロネクチンからなる群より選択される１つ以上の細胞外マトリックス成分を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
段階（ｉ）の再構成混合物がｐＨ７〜７．８を有し、好ましくは段階（ｉ）の再構成混合物がｐＨ約７．４を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
心筋細胞がヒト心筋細胞である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
心筋細胞が、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、及び間葉系幹細胞などの非筋細胞の群より選択される細胞の１つ以上のクラスの細胞と混合して提供され、心筋細胞混合物が、心筋細胞を２０〜８０％含有し、好ましくは心筋細胞が、段階（ｉ）において少なくとも２．７〜２０×１０^６個/mlの細胞濃度で提供される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
段階（ｉｉ）における培養が、０．２５〜３時間、好ましくは０．５時間〜１．５時間実施される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
無血清ＥＨＭ培地が、（ｉ）約２０ng/ml ヒトＩＧＦ１；（ｉｉ）約５ng/ml ヒトＴＧＦβ１；並びに／又は（ｉｉｉ）約５〜２０ng/ml ヒトＶＥＧＦ及び／若しくは約５〜２０ng/ml ヒトＦＧＦを含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
段階（ｉｉｉ）における無血清ＥＨＭ培地が、追加的に、７５０mg/L グリシン、８９０mg/L Ｌ−アラニン、１３２０mg/L Ｌ−アスパラギン、１３３０mg/L Ｌ−アスパラギン酸、１４７０mg/L Ｌ−グルタミン酸、１１５０mg/L Ｌ−プロリン、及び１０５０mg/L Ｌ−セリンを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
段階（ｉｉｉ）における培養が、少なくとも３日間、好ましくは約３〜約７日間実施される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
段階（ｉｖ）における培養が、少なくとも３〜６０日間、好ましくは４〜３０日間、より好ましくは５〜２０日間、いっそうより好ましくは６〜１０日間、最も好ましくは７日間の期間実施され、
段階（ｉｖ）が、伸張装置上で実施され、好ましくは伸張装置が、静的、相動性的又は動的伸張を適用する、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。