JPWO2005078070A1 - 胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地およびフィーダー細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願2004−36845号からの優先権を請求する。
1.血清アルブミン、インスリンおよび基本培地を含み、当該血清アルブミンの量が2g/L〜50g/L、当該インスリンの量が1mg/L〜100mg/Lであり、当該基本培地がMEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201およびMCDB202から選択される少なくとも1種からなる、胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地。
2.さらに細胞接着因子が含有されている、前項1に記載の培地。
3.細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチンおよびポリエチレンイミンから選択される少なくとも1種類である、前項2に記載の培地。
4.さらに細胞増殖因子が含有されている、前項1、2または3に記載の培地。
5.細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子および上皮細胞増殖因子から選択される少なくとも1種類である、前項4に記載の培地。
6.胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、胎児肺線維芽細胞、胎児上皮細胞、胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺線維芽細胞、成体上皮細胞および成体内皮細胞から選択される少なくとも1種の細胞種を含む細胞集団を前項1〜5のいずれか一項に記載の胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地中で培養増殖させる工程と、当該培養増殖された細胞集団をマイトマイシンCまたは放射線照射により増殖停止させる工程とを含む、胚性幹細胞用フィーダー細胞の製造方法。
7.前記培養増殖工程を細胞接着因子をコートした培養容器中で行う、前項6に記載の製造方法。
8.細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチンおよびポリエチレンイミンから選択される少なくとも1種類である、前項7に記載の製造方法。
9.前記培養増殖工程において培養細胞を平均して20回以上細胞分裂させる、前項6、7または8に記載の製造方法。
10.前項6〜9のいずれか一項に記載の製造方法で得られた胚性幹細胞用フィーダー細胞。
なお、本発明に利用される基本培地の詳細な組成は、表1に記載された出典に基づく。
細胞接着因子としては、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチンおよびポリエチレンイミンから選択される少なくとも1種類であることが好ましく、特に、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチンなどが好ましい。細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子(FGF)および上皮細胞増殖因子(EGF)から選択される少なくとも1種類であることが好ましい。
FBSを10v/v%添加したMEM培地で、41.77PDL(population doubling Level:通算細胞集団倍加値(日本組織培養学会編「組織培養の技術第三版(基礎編)1996年 p42))まで培養した、細胞バンクより分譲されたヒト正常2倍体肺線維芽細胞株(MRC−5)を、以下のフィーダー細胞作成培地(A)を用いて細胞数が2.4×106cellsとなるように懸濁し、ゼラチンコートしたシャーレ上で1回の継代培養を挟んで42.99PDLまで培養した。
ウシ血清アルブミン(BSA) 5g/L, EGF 10μg/L, インスリン 1mg/L, ハイドロコルチゾン 1mg/Lが添加されたRITC80-7培地
実施例1と同様の細胞バンクより分譲されたMRC−5を、以下のフィーダー細胞作成培地(B)を用いて細胞数が2.1×105cellsとなるように懸濁し、ゼラチンコートした培養シャーレ上で、4回の継代培養を行い53.47PDLまで培養した。
ついで、前記培養したMRC−5を最終濃度10μg/mlのMMCを含むフィーダー細胞作成培地(B)を用いて2〜3時間培養し、細胞分裂を不活性化させた。その後、MMCを含むフィーダー細胞作成培地(B)を除き、PBSで細胞を3回洗浄しフィーダー細胞を作成した。このフィーダー細胞を、ゼラチンコートした直径60mmのシャーレに1枚あたりに生細胞数として約4×105個播き静着させた。
アルブミン83g/Lおよびインスリン100mg/Lを含む血清代替物(Knock out Serum Replacement:インビトロジェン社(特許文献1))20v/v%, MEM非必須アミノ酸溶液(インビトロジェン社)1v/v%、ピルビン酸Na 1mmol/L、L-グルタミン 2mmol/L、2-メルカプトエタノール 0.1 mmol/L、EGF 10μg/L、FGF 1μg/Lが添加されたDMEM:Ham F=1:1の混合培地
アルブミン83g/Lおよびインスリン100mg/Lを含む血清代替物(特許文献1)20v/v%, MEM非必須アミノ酸溶液(インビトロジェン社)1v/v%、ピルビン酸Na 1mmol/L、L-グルタミン 2mmol/L、2-メルカプトエタノール 0.1 mmol/Lが添加されたDMEM:Ham F=1:1の混合培地
このことから、本発明による方法で作成されたMRC−5からのフィーダー細胞により、胚性幹細胞の培養が可能であることが示唆された。
実施例1と同様の細胞バンクより分譲されたMRC−5を、フィーダー細胞作成培地(B)を用いて細胞数が2.4×106cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャーレ上で4回の継代培養を行い53.68PDLまで培養した。ついで、前記培養したMRC−5を、最終濃度10μg/mlのMMCを含むフィーダー細胞作成培地(B)で2〜3時間培養し、細胞分裂を不活性化した。その後、MMCを含むフィーダー細胞作成培地(B)を除き、PBSで細胞を3回洗浄し、フィーダー細胞を作成した。
このことから実施例2と同様、コラーゲンコートしたシャーレを用いると、MRC−5から作成されたフィーダー細胞により、胚性幹細胞の培養が可能であることが示唆された。
実施例1と同様の細胞バンクより分譲されたMRC−5を、フィーダー細胞作成培地(B)を用いて2.1×105cellsとなるように懸濁し、ゼラチンコートした培養シャーレ上で増殖が悪くなるまで継代培養を繰り返し、無血清培養による増殖限界を調べた。その結果、本発明の培地によりフィーダー細胞となりうる線維芽細胞は41.77PDLからでも4回の継代まで増殖が可能であり、約53PDLまで分裂できることが確認された(図8)。
このことから、1種の細胞株から相当量のフィーダー細胞を作成することが可能あることが示唆された。
実施例1と同様の細胞バンクより分譲されたMRC−5を、フィーダー細胞作成培地(B)を用いて2.1×105cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャーレ上で増殖が悪くなるまで継代培養を繰り返し、無血清培養による増殖限界を調べた。
その結果、本発明の培地によりフィーダー細胞と成り得る線維芽細胞は41.77PDLからでも7回の継代まで増殖が可能であり、線維芽細胞を有限分裂細胞の限界に近い約60PDLまで分裂できることが確認された(図9)。
このことから、本発明の培地はコラーゲンコートと組み合わせることにより、より多くのフィーダー細胞を作成することが可能であることが示唆された。
FBSを10v/v%添加したMEM培地で28.76PDLまで培養した細胞バンクより分譲されたヒト正常2倍体肺線維芽細胞株(TIG−3)を、フィーダー細胞作成培地(B)を用いて1.8×105cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャーレ上で2回の継代培養を挟んで35.51PDLまで培養した。
ついで、最終濃度10μg/mlのMMCを含むフィーダー細胞作成培地(B)でTIG−3を2〜3時間培養し、細胞分裂を不活性化した。その後、MMCを含む培地を除き、細胞をPBSで3回洗浄した。トリプシン処理(0.25w/v%トリプシン、1 mM EDTA)により、洗浄後の細胞を培養シャーレから剥がし、細胞数をカウントした。その結果約2.1×107cellsのフィーダー細胞を得ることができた。
このことから、MRC−5以外の線維芽細胞株でも本発明の培地により大量のフィーダー細胞の作成が可能であることが示唆された。
実施例1と同様の細胞バンクより分譲されたMRC−5を、FGF1μg/L、インスリン5mg/Lが添加され、血清アルブミンを含まないMCDB202を改変したヒト初代線維芽細胞用培地(以下「FGM」という:Cambrex社)を用いて2.2×105cellsとなるように懸濁し、ゼラチンコートした培養シャーレ上で1回の継代培養を挟んで培養した。しかし継代後に細胞の増殖は停止し、MMC処理することはできず、フィーダー細胞の作成は困難であった。
実施例1と同様の細胞バンクより分譲されたMRC−5を、FGMを用いて2.2×105cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャーレ上で1回の継代培養を挟んで培養した。しかし比較例1と同様、継代後細胞の増殖は停止し、MMC処理することはできずフィーダー細胞の作成は困難であった。
Claims (10)
- 血清アルブミン、インスリンおよび基本培地を含み、当該血清アルブミンの量が2g/L〜50g/L、当該インスリンの量が1mg/L〜100mg/Lであり、当該基本培地がMEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201およびMCDB202から選択される少なくとも1種からなる、胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地。
- さらに細胞接着因子が含有されている、請求の範囲第1項に記載の培地。
- 細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチンおよびポリエチレンイミンから選択される少なくとも1種類である、請求の範囲第2項に記載の培地。
- さらに細胞増殖因子が含有されている、請求の範囲第1、2または3項に記載の培地。
- 細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子および上皮細胞増殖因子から選択される少なくとも1種類である、請求の範囲第4項に記載の培地。
- 胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、胎児肺線維芽細胞、胎児上皮細胞、胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺線維芽細胞、成体上皮細胞および成体内皮細胞から選択される少なくとも1種の細胞種を含む細胞集団を請求の範囲第1〜5項のいずれか一項に記載の胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地中で培養増殖させる工程と、当該培養増殖された細胞集団をマイトマイシンCまたは放射線照射により増殖停止させる工程とを含む、胚性幹細胞用フィーダー細胞の製造方法。
- 前記培養増殖工程を細胞接着因子をコートした培養容器中で行う、請求の範囲第6項に記載の製造方法。
- 細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチンおよびポリエチレンイミンから選択される少なくとも1種類である、請求の範囲第7項に記載の製造方法。
- 前記培養増殖工程において培養細胞を平均して20回以上細胞分裂させる、請求の範囲第6、7または8項に記載の製造方法。
- 請求の範囲第6〜9項のいずれか一項に記載の製造方法で得られた胚性幹細胞用フィーダー細胞。
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