WO2005078070A1 - 胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地およびフィーダー細胞 - Google Patents

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Norio Nakatsuji
Hirofumi Suemori
Isao Asaka
Harumi Sugai
Reiko Okamoto
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Reprocell, Inc.
Asahi Techno Glass Corporation
Tanabe Seiyaku Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a medium for producing a feeder cell used for culturing embryonic stem cells including human embryonic stem cells, a method for producing a feeder cell using the medium, and a method for producing the same. And a feeder cell for embryonic stem cells obtained by the method.
  • Embryonic stem cells are undivided cells derived from the inner cell mass of a blastocyst, have a variety that allows differentiation into all tissues, and include cell culture, tissue transplantation, and drug discovery. It is expected to find applications in research and gene therapy. Furthermore, it is also known that cloned embryonic stem cells obtained by transplanting adult somatic cell nuclei are induced. In recent years, techniques for inducing embryonic stem cells into various tissues including neural tissues have been reported. Tissues derived from embryonic stem cells are genetically equivalent tissues without immune exclusion. It is expected to be used for transplantation medicine and gene therapy.
  • embryonic stem cells have been extended to primates including small experimental animals, humans, and it has been reported that the isolation of rhesus monkey embryonic stem cells and the separation of embryonic stem cells from human in vitro fertilized eggs have been reported. You.
  • Suemori et al. Succeeded in producing new embryonic stem cells from microinjected fertilized eggs of power quizal, which are useful for preclinical studies and widely used in medical research, and have obtained pluripotent cells. It demonstrated that sex was maintained for a long time, and further demonstrated that dominant nerves could be induced from this force-quiz monkey embryonic stem cells.
  • Embryonic stem cells including human embryonic stem cells as described above have been conventionally co-cultured with feeder cells to promote their growth.
  • embryonic stem cells of primates including humans cannot be maintained in an undifferentiated state when cultured using serum! Therefore, culture in a serum-free medium has been studied (see Patent Document 1).
  • embryonic stem cells cannot be maintained only by culturing in a serum-free medium, and the effect of serum cannot be maintained.
  • Co-culture with feeder cells has been essential to replace some of them.
  • human feeder cells derived from human embryonic stem cells and mouse-derived feeder cells were used as the feeder cells because, for example, fibroblasts prepared from mouse embryos were used to stop proliferation by mitomycin C or irradiation.
  • Co-culture with zirconium could cause zoonotic diseases. Since tissues derived from human embryonic stem cells are expected to be used as materials for transplantation medicine and gene therapy, it is desirable to eliminate as much as possible the risk of zoonotic infections.
  • Non-Patent Document 1 human embryonic fibroblasts, adult oviduct epithelial cells (Non-Patent Document 1), human neonatal foreskin-derived fibroblasts (Non-Patent Documents 2, 3), adult epidermal lines A method using fibroblasts (Non-patent document 4) and human bone marrow cells (Non-patent document 5) as a single feeder cell has been reported.
  • Serum such as fetal calf serum (FBS) is used as a medium for producing these human-derived feeder cells, and unknown pathogens such as unknown infectious diseases and prions are transmitted from this serum. There is a risk of being done.
  • FBS fetal calf serum
  • Patent Document 1 International Publication No. 98Z30679 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Nat.Biotechnol. 20: 933-936 (2002)
  • Non-Patent Document 2 Biol. Reprod. 68: 2150-2156 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Hum. Reprod. 18: 1404-1409 (2003)
  • Non-Patent Document 4 Stem Cells. 21: 546-556 (2003)
  • Non-Patent Document 5 Stem Cells. 21: 131-142 (2003)
  • An object of the present invention is to efficiently establish feeder cells used for culturing embryonic stem cells including human embryonic stem cells from materials derived from a limited number of donors, and to reduce the risk of infection.
  • An object of the present invention is to provide a feeder-one cell preparation medium for embryonic stem cells (hereinafter referred to as a "feeder-one cell preparation medium") that can be cultured in a state. Further, a method for producing a feeder cell which is relatively safe even when co-cultured with embryonic stem cells, and a method for producing a feeder cell obtained thereby. To provide.
  • a fetus that can be a feeder cell of embryonic stem cells by using a feeder cell preparation medium containing at least serum albumin and insulin in a basal medium.
  • a feeder cell preparation medium containing at least serum albumin and insulin in a basal medium.
  • the present inventors have found that a cell population containing one cell type can be stably expanded, and have completed the present invention.
  • the present invention consists of the following.
  • a feeder-one-cell preparation medium for embryonic stem cells comprising at least one selected from Ham F12, Mediuml99, RPMI1640, RITC 80-7, MCDB104, MCDB105, MCDB153, MCDB201 and MCDB202.
  • cell adhesion factor is at least one selected from collagen, gelatin, fibronectin, vitronectin, laminin, polylysine, polyortin and polyethyleneiminka.
  • the medium according to the above item 4 wherein the cell growth factor is at least one selected from fibroblast growth factor and epithelial cell growth factor.
  • the cell adhesion factor is at least one selected from collagen, gelatin, fibronectin, vitronectin, laminin, polylysine, polyortin and polyethyleneiminka.
  • a feeder for embryonic stem cells obtained by the production method according to any one of items 6 to 9 of the preceding item.
  • the feeder single cell preparation medium of the present invention can establish relatively safe feeder cells even when co-cultured with embryonic stem cells including human embryonic stem cells, and enables long-term culture.
  • Materials for feeder cells include, for example, fetal epidermal fibroblasts, fetal myofibroblasts, fetal lung fibroblasts, fetal epithelial cells, fetal endothelial cells, adult epidermal fibroblasts, adult lung fibroblasts, adult epithelial cells, It is useful to be able to perform long-term culture because it is derived from limited donors such as adult endothelial cells.
  • the present invention can provide an embryonic stem cell having a low risk of diseases and the like.
  • FIG. 1 is a view showing a 10-day colony ( ⁇ 40) of force-quiz monkey embryonic stem cells cultured with the feeder cell prepared in Example 2.
  • FIG. 2 is a view showing colonies (100-fold) on day 4 after subculture of force-quigus monkey embryonic stem cells cultured with a feeder cell prepared in Example 2.
  • FIG. 3 is a view showing the proliferation of force-quigus monkey embryonic stem cells cultured by the feeder cell prepared in Example 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing an immunostained image (100 ⁇ ) of SSEA-4 of a colony on day 4 after subculture of a force-quiz monkey embryonic stem cell cultured by a feeder cell prepared in Example 2 is there
  • FIG. 5 is a view showing a 10-day colony (40-fold) of force-quiz monkey embryonic stem cells cultured by a feeder cell prepared in Example 3.
  • FIG. 6 is a diagram showing colonies (100-fold) on day 4 after subculture of force-quigus monkey embryonic stem cells cultured with a feeder cell prepared in Example 3.
  • FIG. 7 is a view showing the proliferation of force-quiz monkey embryonic stem cells cultured by the feeder cell prepared in Example 3.
  • FIG. 8 is a diagram showing the proliferation of MRC-5 when cultured in combination with a gelatin coat and a feeder-one-cell preparation medium (B) in Example 4. The PDL at the start of the culture and the PDL at the end of the culture, for which the ability to measure the number of cells at the time of subsequent subculturing was also calculated, are shown.
  • FIG. 9 is a diagram showing the proliferation of MRC-5 when cultured in combination with a collagen coat and a feeder-one-cell preparation medium (B) in Example 5. The PDL at the start of the culture and the PDL at the end of the culture calculated from the cell number measurement during the subsequent subculture are described.
  • a 1: 1 mixed medium of DMEM and Ham F12, which can be used for serum-free culture of embryonic stem cells, can improve the nutrient value of the medium and the survival rate in co-culture with embryonic stem cells after the preparation of feeder cells More suitable.
  • composition of the basal medium used in the present invention is based on the sources described in Table 1.
  • the feeder-cell preparation medium used in the present invention contains serum albumin and insulin as essential components. This medium may further contain other components. However, other components that contain unknown components such as fetal bovine serum (FBS) or contaminants and that have a high risk of infectious diseases are inappropriate.
  • FBS fetal bovine serum
  • Other components include those that are not contained in the basal medium or those that are contained in the basal medium but whose amounts are not sufficient. Specific examples include cell adhesion factors, cell growth factors, metal-containing proteins such as transferrin, other polypeptide-proteins, amino acids, and vitamins. These components are mixed with a basic medium to produce a feeder-cell preparation medium.
  • a medium called a feeder-cell preparation medium can also be produced by blending a commercially available serum substitute or the like with the above-mentioned basic medium. This serum replacement usually contains serum albumin and insulin, and also contains other components as described above. Therefore, a serum substitute can be blended with the basal medium in an amount such that serum albumin and insulin become the desired amounts. Examples of the serum substitute include a serum substitute described in Patent Document 1 described above.
  • the feeder-cell preparation medium of the present invention contains a cell adhesion factor as the above-mentioned other components. Further, it is preferable that a cell growth factor is contained. Further, it is preferable that a metal-containing protein such as transferrin is contained.
  • the cell adhesion factor is preferably at least one selected from collagen, gelatin, fibronectin, vitronectin, laminin, polylysine, polyortin and polyethyleneimine.Particularly, collagen, gelatin, fibronectin, Vitronek Chin and the like are preferred.
  • the cell growth factor is preferably at least one selected from fibroblast growth factor (FGF) and epidermal growth factor (EGF).
  • the feeder-cell preparation medium in the present invention is essential to contain serum albumin at a ratio of 2gZL-50gZL and insulin at a ratio of lmgZL-100mgZL.
  • a more preferred amount of serum albumin is 4gZL-25gZL, and the amount of insulin is 5mgZL-30mgZL.
  • the cell adhesion factor is contained in an amount of about 0.3mgZL-50mgZL.
  • the cell growth factor is preferably contained in the feeder-cell preparation medium at a ratio of 0.01 ⁇ gZL—100 gZL.
  • fibroblast growth factor is contained at 0.1 g / z gZL—10 gZL.
  • the preferred epidermal growth factor is 0.
  • metal-containing proteins such as transferrin are contained at a ratio of lmgZL-50mgZL.
  • Cells that can be used to establish a feeder cell for embryonic stem cells of the present invention include, for example, fetal epidermal fibroblasts, fetal myofibroblasts, fetal lung fibroblasts, fetal epithelial cells, fetal endothelium Cells, adult epidermal fibroblasts, adult lung fibroblasts, adult epithelial cells, adult skin cells At least one cell type can be selected.
  • the cell population containing the selected cell type is placed in a culture vessel containing the feeder-cell preparation medium of the present invention under a condition of 3% to 10% CO, 35 ° C to 40 ° C for 1 day.
  • the production method including the steps of cell growth and cell growth arrest, safe feeder cells for embryonic stem cells that are grown under serum-free culture and have almost no animal-derived infection are produced. be able to.
  • the cell culture container can be coated in advance with a cell adhesion factor.
  • a feeder cell can be produced in large quantities by dividing the cultured cells 20 times or more on average.
  • Feeder-one cell preparation medium (A) Composition:
  • RI RITC80-7 medium supplemented with 5 g / L of serum albumin (BSA), 10 ⁇ g / L of EGF, lmg / L of insulin, and lmg / L of cortisol in the mouth
  • the cultured MRC-5 was cultured for 2-3 hours using a feeder-one cell preparation medium (A) containing mitomycin C (MMC) at a final concentration of 10 ⁇ g / ml, Cell division was inactivated. Thereafter, the feeder-cell preparation medium (A) containing MMC was removed, and the cells were washed three times with a phosphate buffer solution (PBS). The washed cells were peeled off from the culture dish by trypsin treatment (0.25 w / v% trypsin, 1 mM EDTA), and the number of cells was counted. As a result, about 5.5 X 10 6 feeder cells could be obtained.
  • A feeder-one cell preparation medium
  • MMC mitomycin C
  • PBS phosphate buffer solution
  • MRC-5 which was obtained from the same cell bank as in Example 1, was suspended in the following feeder-cell formation medium (B) to a cell count of 3 ⁇ 4.l ⁇ 10 5 cells, and gelatin-coated. The cells were subcultured four times on the culture dish, and cultured to 53.47 PDL. Then, the cultured MRC-5 was cultured for 2-3 hours using a feeder-cell formation medium (B) containing MMC at a final concentration of 10 / zg / ml to inactivate cell division. Thereafter, the feeder-cell preparation medium containing MMC was removed, and the cells were washed three times with PBS to prepare feeder-cells. The feeder cells were seeded on a gelatin-coated 60 mm diameter petri dish at a rate of about 4 ⁇ 10 5 viable cells per cell and allowed to settle.
  • B feeder-cell formation medium
  • Feeder-one cell preparation medium (B) Composition:
  • the cultured force-quiz monkey embryonic stem cell colonies were dissociated from the petri dish by trypsin treatment (0.25 w / v% trypsin).
  • the cells in a part of the petri dish were reseeded into a petri dish containing a new feeder cell, and then cultured under the same conditions for 4 days.
  • the cells in the remaining petri dish were detached from the petri dish, and the number of cells was counted.
  • the morphology of the viable monkey embryonic stem cell colony was the same as that cultivated in a single feeder cell derived from mouse fetal fibroblasts at the time of V and at the end of the passage and at the end of the culture. Yes (Figs. 1 and 2), and the force-Cuis monkey embryonic stem cells proliferated (Fig. 3).
  • the immunostaining at the end of the culture showed fluorescence by SSEA-4, one of the primate embryonic stem cell markers (Fig. 4), confirming that the colony was a primate embryonic stem cell colony. It was revealed.
  • embryonic stem cells can be cultured using a feeder cell from MRC-5 prepared by the method of the present invention.
  • MRC-5 supplied from the same cell bank as in Example 1 was suspended in a feeder-cell preparation medium (B) so that the cell viability was 3 ⁇ 40.4 ⁇ 10 6 cells, and a collagen-coated culture chamber was suspended. The cells were subcultured four times and cultured to 53.68 PDL. Next, the cultured MRC5 was cultured for 2-3 hours in a feeder-one-cell preparation medium (B) containing MMC at a final concentration of 10 ⁇ g Zml to inactivate cell division. Then, the feeder-cell preparation medium containing MMC was removed, and the cells were washed three times with PBS to prepare feeder-cells.
  • B feeder-cell preparation medium
  • MRC-5 which was obtained from the same cell bank as in Example 1, was suspended in a feeder-cell preparation medium (B) so as to be 2.1 ⁇ 10 5 cells, and grown on a gelatin-coated culture dish. Subculture was repeated until it became worse, and the growth limit by serum-free culture was examined. As a result, it was confirmed that fibroblasts that could be a feeder cell with the medium of the present invention could grow from 41.77 PDL up to 4 passages and could divide to about 53 PDL (FIG. 8). This suggests that it is possible to produce a single feeder cell in an amount equivalent to the power of one cell line.
  • MRC-5 donated from the same cell bank as in Example 1 was suspended in a feeder-one cell preparation medium (B) so as to be 2.1 ⁇ 10 5 cells, and the growth was poor on a collagen-coated culture dish. Subculture was repeated to the extent possible, and the growth limit due to serum-free culture was examined. As a result, fibroblasts, which can become feeder cells with the medium of the present invention, can grow up to 7 passages even with 41.77 PDL power, and the fibroblasts reach the limit of finite dividing cells V, up to about 60 PDL. It was confirmed that the cells could be split (Fig. 9).
  • a human normal diploid lung fibroblast cell line obtained from a cell bank cultured to 28.76 PDL in MEM medium supplemented with 10% v / v FBS was added to a feeder-one cell preparation medium (B). The cells were suspended at 1.8 ⁇ 10 5 cells and cultured on a collagen-coated culture dish to 35.51 PDL with two subcultures interposed therebetween.
  • TIG-3 was cultured for 2-3 hours in a feeder-cell preparation medium (B) containing MMC at a final concentration of 10 ⁇ g Zml to inactivate cell division. Then remove the medium containing MMC The cells were washed three times with PBS. The cells after washing were removed from the culture dish by trypsin treatment (0.25 w / v% trypsin, 1 mM EDTA), and the number of cells was counted. As a result, about 2.1 X 10 7 cells per feeder were obtained.
  • MRC-5 supplied from the same cell bank as in Example 1 was added to a medium for human primary fibroblasts (hereinafter referred to as “FGM”) modified with MCDB202 and supplemented with 1 ⁇ g of FGF / 5 mg / L of insulin and not containing serum albumin.
  • FGM human primary fibroblasts
  • the cells were suspended at 2.2 ⁇ 10 5 cells using Cambrex, and cultured on a gelatin-coated culture dish with one subculture. However, after the passage, cell growth stopped, and MMC treatment was not possible, and it was difficult to produce feeder cells.
  • MRC-5 obtained from the same cell bank as in Example 1 was suspended using FGM to 2.2 x 10 5 cells, and cultured on a collagen-coated culture dish with one subculture. did. As in Comparative Example 1, the growth of the cells was stopped after the passage, and the cells could not be treated with MMC, and it was difficult to prepare one feeder cell.
  • one feeder cell used for culturing embryonic stem cells including human embryonic stem cells can be produced in a serum-free medium with a low risk of animal-derived infection.
  • long-term cultivation is possible by combining with cell adhesion factors such as gelatin and collagen, so that materials from a limited number of donors can be used to the utmost and feeder cell
  • the risk of source contamination from changing donors is also very low.
  • the present invention since the present invention was confirmed to be applicable to a plurality of cell lines by Examples, the present invention can also be used for producing individual feeder cells suitable for embryonic stem cells derived from various types of animals. .

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Abstract

　ヒト胚性幹細胞を含めた胚性幹細胞の培養に用いられるフィーダー細胞を、限られたドナー由来の材料から効率的に樹立し、感染のおそれの少ない状態で培養しうる胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地を提供することである。さらに、ヒト胚性幹細胞を含めた胚性幹細胞と共培養しても比較的安全なフィーダー細胞の製造方法、および、それによって得られるフィーダー細胞を提供することである。基本培地に少なくとも血清アルブミンおよびインスリンを含む胚性幹細胞用フィーダー細胞作成培地により、胚性幹細胞のフィーダー細胞と成り得る胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、胎児肺線維芽細胞、胎児上皮細胞、胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺線維芽細胞、成体上皮細胞、成体内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞種を含む細胞集団を安定に増殖できる。

Description

明 細 書
胚性幹細胞用フィーダ一細胞作成培地およびフィーダ一細胞
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト胚性幹細胞を含めた胚性幹細胞の培養に利用されるフィーダ一細 胞を作成するための培地、その培地を利用したフィーダ一細胞の製造方法、および 、それによつて得られる胚性幹細胞用フィーダ一細胞に関するものである。
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願 2004— 36845 号からの優先権を請求する。
背景技術
[0002] 胚性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する未分ィ匕細胞であり、全組織への 分化が可能な多様性を有しており、細胞培養、組織移植、創薬研究、および遺伝子 治療の分野での応用を期待されている。さらに、成体の体細胞核を移植して得られる クローン胚カゝら胚性幹細胞が誘導されることも知られている。近年、胚性幹細胞を神 経組織をはじめとする様々な組織へ誘導する技術が報告されており、胚性幹細胞か ら誘導される組織は免疫排除がない遺伝的に同等な組織であることより、移植医療 や遺伝子治療への利用が期待されるようになった。また、胚性幹細胞の作成の対象 は実験小動物力 ヒトを含めた霊長類に拡げられており、ァカゲザル胚性幹細胞の 単離、ヒト体外受精卵からの胚性幹細胞の分離などが報告されて 、る。
[0003] また、末盛らは、前臨床試験に有用な、医学研究に広く用いられている力二クイザ ルの顕微受精卵から、新たに胚性幹細胞を作成することに成功し、その多能性が長 期にわたって維持されることを証明し、さらに、この力-クイザル胚性幹細胞からはド 一ノ ミン神経が誘導可能であることも証明した。
[0004] 上記のようなヒト胚性幹細胞を含む胚性幹細胞は、その成長を促進するため、従来 フィーダ一細胞と共培養されて 、た。特にヒトを含む霊長類の胚性幹細胞は血清を 使用して培養すると未分化状態を維持できな!ヽことより、無血清培地による培養が検 討されて!ヽる (特許文献 1参照)。
[0005] しかし、無血清培地による培養だけでは胚性幹細胞を維持できず、血清の効果の 一部を代替するために、フィーダ一細胞との共培養が必須となっていた。このフィー ダー細胞としては、たとえば、マウスの胎児より調製された線維芽細胞をマイトマイシ ン Cや放射線照射によって増殖停止させた細胞が使用されていたため、ヒト胚性幹 細胞とマウス由来のフィーダ一細胞との共培養は人獣共通感染症等のおそれがあつ た。このヒト胚性幹細胞カゝら誘導される組織は移植医療や遺伝子治療の材料として 期待されるため、人獣共通感染症等のおそれは可能な限り排除するのが望ましい。
[0006] そこで、マウスの胎児の代わりにヒト胎児の線維芽細胞、成人輸卵管上皮細胞 (非 特許文献 1)や、ヒト新生児の包皮由来線維芽細胞 (非特許文献 2、 3)、成人表皮線 維芽細胞 (非特許文献 4)、ヒト骨髄細胞 (非特許文献 5)をフィーダ一細胞として利用 する方法が報告されている。
[0007] しかし、これらのほとんどは初代細胞を利用するものであり、ヒト胚性幹細胞を大量 に得るためには複数のドナー由来の材料が必要となるため、ドナー毎に感染源のチ エックが必要となり手間がかかる。また、これらのヒト由来のフィーダ一細胞を作成する ための培地はゥシ胎児血清 (FBS)等の血清が使用されており、この血清からも未知 の感染症やプリオン等による未知の病原体が伝播される危険性がある。
特許文献 1：国際公開第 98Z30679号パンフレット
非特許文献 1 : Nat.Biotechnol. 20:933-936(2002)
非特許文献 2： Biol.Reprod. 68:2150-2156(2003)
非特許文献 3： Hum.Reprod. 18: 1404-1409(2003)
非特許文献 4 : Stem Cells. 21:546-556(2003)
非特許文献 5 : Stem Cells. 21:131-142(2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の課題は、ヒト胚性幹細胞を含めた胚性幹細胞の培養に用いられるフィー ダー細胞を、限られたドナー由来の材料から効率的に榭立し、感染のおそれの少な い状態で培養しうる、胚性幹細胞用フィーダ一細胞作成培地（以下、「フィーダ一細 胞作成培地」という）を提供することである。さら〖こ、胚性幹細胞と共培養しても比較的 安全なフィーダ一細胞の製造方法、および、それによつて得られるフィーダ一細胞を 提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、前述の課題を解決すべく研究を進めた結果、基本培地に少なくとも 血清アルブミンおよびインスリンを含むフィーダ一細胞作成培地により、胚性幹細胞 のフィーダ一細胞と成り得る胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、胎児肺線維 芽細胞、胎児上皮細胞、胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺線維芽細胞 、成体上皮細胞、成体内皮細胞から選択される少なくとも 1種の細胞種を含む細胞 集団を安定に増殖できることを見出し、本発明を完成した。
[0010] すなわち本発明は、以下よりなる。
1.血清アルブミン、インスリンおよび基本培地を含み、当該血清アルブミンの量が 2g ZL— 50gZL、当該インスリンの量が lmgZL— lOOmgZLであり、当該基本培地 力MEM、 a -MEM, DMEM、 IMDM、 Ham F10、 Ham F12、 Mediuml99、 RPMI1640, RITC 80-7、 MCDB104, MCDB105、 MCDB153、 MCDB201および MCDB202から選 択される少なくとも 1種力もなる、胚性幹細胞用フィーダ一細胞作成培地。
2.さらに細胞接着因子が含有されている、前項 1に記載の培地。
3.細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミ ニン、ポリリジン、ポリオル-チンおよびポリエチレンイミンカも選択される少なくとも 1 種類である、前項 2に記載の培地。
4.さらに細胞増殖因子が含有されている、前項 2または 3に記載の培地。
5.細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子および上皮細胞増殖因子から選択される 少なくとも 1種類である、前項 4に記載の培地。
6.胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、胎児肺線維芽細胞、胎児上皮細胞、 胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺線維芽細胞、成体上皮細胞および成 体内皮細胞力 選択される少なくとも 1種の細胞種を含む細胞集団を前項 1一 5のい ずれか一項に記載の胚性幹細胞用フィーダ一細胞作成培地中で培養増殖させるェ 程と、当該培養増殖された細胞集団をマイトマイシン Cまたは放射線照射により増殖 停止させる工程とを含む、胚性幹細胞用フィーダ一細胞の製造方法。
7.前記培養増殖工程を細胞接着因子をコートした培養容器中で行う、前項 6に記載 の製造方法。
8.細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミ ニン、ポリリジン、ポリオル-チンおよびポリエチレンイミンカも選択される少なくとも 1 種類である、前項 7に記載の製造方法。
9.前記培養増殖工程において培養細胞を平均して 20回以上細胞分裂させる、前 項 6、 7または 8に記載の製造方法。
10.前項 6— 9の 、ずれか一項に記載の製造方法で得られた胚性幹細胞用フィーダ 一細胞。
発明の効果
[0011] 本発明のフィーダ一細胞作成培地により、ヒト胚性幹細胞を含めた胚性幹細胞と共 培養しても比較的安全なフィーダ一細胞を榭立することができ、長期の培養が可能と なる。フィーダ一細胞の材料は、例えば胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、 胎児肺線維芽細胞、胎児上皮細胞、胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺 線維芽細胞、成体上皮細胞、成体内皮細胞等の限られたドナー由来であるため、長 期の培養が可能となることは有用である。これにより、ヒト胚性幹細胞を含めた胚性幹 細胞と胚性幹細胞用フィーダ一細胞を共培養することができ、移植や遺伝子治療等 の材料として胚性幹細胞を使用する際に、人畜共通感染症等のおそれが少な 、胚 性幹細胞を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]実施例 2で作成されたフィーダ一細胞によって培養された力-クイザル胚性幹 細胞の 10日目のコロニー (40倍)を示す図である。
[図 2]実施例 2で作成されたフィーダ一細胞によって培養された力-クイザル胚性幹 細胞の継代後 4日目のコロニー (100倍)を示す図である。
[図 3]実施例 2で作成されたフィーダ一細胞によって培養された力-クイザル胚性幹 細胞の増殖を示す図である。
[図 4]実施例 2で作成されたフィーダ一細胞によって培養された力-クイザル胚性幹 細胞の継代後 4日目のコロニーの SSEA-4による免疫染色像 (100倍)を示す図である [図 5]実施例 3で作成されたフィーダ一細胞によって培養された力-クイザル胚性幹 細胞の 10日目のコロニー (40倍)を示す図である。
[図 6]実施例 3で作成されたフィーダ一細胞によって培養された力-クイザル胚性幹 細胞の継代後 4日目のコロニー (100倍)を示す図である。
[図 7]実施例 3で作成されたフィーダ一細胞によって培養された力-クイザル胚性幹 細胞の増殖を示す図である。
[図 8]実施例 4においてゼラチンコートとフィーダ一細胞作成培地 (B)を組み合わせて 培養したときの MRC— 5の増殖を示す図である。培養開始時の PDLとその後の継代 培養時の細胞数測定力も算定された培養終了時の PDLを記載した。
[図 9]実施例 5においてコラーゲンコートとフィーダ一細胞作成培地 (B)を組み合わせ て培養したときの MRC— 5の増殖を示す図である。培養開始時の PDLとその後の継 代培養時の細胞数測定から算定された培養終了時の PDLを記載した。
発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる基本培地としては MEM、 a - MEM、 DMEM、 IMDM、 Ham F10、 Ham F12、 Mediuml99、 RPMI1640, RITC 80—7、 MCDB104, MCDB105、 MCDB153、 MCDB201、 MCDB202の何れか単独および Zまたは、複数の組み合わせが可能で あるが、線維芽細胞の無血清培地に利用されうる DMEM、 IMDM、 Ham F10、 Ham F12、 RITC 80-7、 MCDB104, MCDB105、 MCDB201, MCDB202が好ましぐ霊長類 胚性幹細胞の無血清培養にも利用され得る DMEMと Ham F12の 1:1の混合培地が培 地の栄養価や、フィーダ一細胞作成後の胚性幹細胞との共培養での生存率の面か らより好適である。
なお、本発明に利用される基本培地の詳細な組成は、表 1に記載された出典に基 づく。
[表 1] 表 1 基本培地の出典
Figure imgf000007_0001
[0014] 本発明で用いられるフィーダ一細胞作成培地は、血清アルブミンおよびインスリン を必須成分として含有する。この培地にはさらに他の成分を含んでいてもよい。ただ し、他の成分としてゥシ胎児血清 (FBS)などの未知の成分や夾雑物を含み、感染症 等のおそれが高いものは不適当である。
[0015] 他の成分としては、前記基本培地に含まれていないものまたは前記基本培地には 含まれているがその量が十分でない成分などがある。具体的には、例えば、細胞接 着因子、細胞増殖因子、トランスフェリンなどの金属含有タンパク質、その他のポリべ プチドゃタンパク質、アミノ酸類、ビタミン類などがある。これら成分を基本培地に配合 してフィーダ一細胞作成培地が製造される。また、市販されている血清代替物と称さ れて 、るものなどを前記基本培地に配合して、フィーダ一細胞作成培地を製造する こともできる。この血清代替物は、通常血清アルブミンやインスリンを含有し、さらに上 記のような他の成分を含有する。したがって、基本培地に血清代替物を血清アルブミ ンおよびインスリンが目的の量となる量を配合して使用することができる。血清代替物 としては、例えば、前記特許文献 1に記載の血清代替物がある。
[0016] 本発明におけるフィーダ一細胞作成培地には、上記その他の成分として細胞接着 因子が含有されていることが好ましい。また、細胞増殖因子が含有されていることが 好ましい。さらに、トランスフェリンなどの金属含有タンパク質が含有されていることが 好ましい。
細胞接着因子としては、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラ ミニン、ポリリジン、ポリオル-チンおよびポリエチレンィミン力 選択される少なくとも 1 種類であることが好ましぐ特に、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネク チンなどが好ましい。細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子 (FGF)および上 皮細胞増殖因子 (EGF)から選択される少なくとも 1種類であることが好ま 、。
[0017] 本発明におけるフィーダ一細胞作成培地は、血清アルブミンを 2gZL— 50gZLお よびインスリンを lmgZL— lOOmgZLの割合で含有することを必須とする。より好ま しい血清アルブミンの量は 4gZL— 25gZLであり、インスリンの量は 5mgZL— 30 mgZLである。
[0018] さらに、細胞接着因子は 0. 3mgZL— 50mgZL程度含有されていることが好まし い。ただし後述のように細胞接着因子を培養容器内面にコートして使用する場合は、 フィーダ一細胞作成培地中には細胞接着因子を配合する必要はな 、。細胞増殖因 子はフィーダ一細胞作成培地中に 0. 01 μ gZL— 100 gZLの割合で含有されて いることが好ましぐ特に線維芽細胞増殖因子は 0. Ι /z gZL— 10 gZL含有され ていることが好ましぐ上皮細胞増殖因子は 0.
Figure imgf000008_0001
ことが好まし 、。トランスフェリンなどの金属含有タンパク質は lmgZL— 50mgZLの 割合で含有されて 、ることが好ま 、。
[0019] 本発明の胚性幹細胞用フィーダ一細胞榭立のために使用可能な細胞として、例え ば胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、胎児肺線維芽細胞、胎児上皮細胞、 胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺線維芽細胞、成体上皮細胞、成体内 皮細胞力 少なくとも 1種の細胞種を選択することができる。選択された細胞種を含 む細胞集団を、本発明のフィーダ一細胞作成培地を含む培養容器内において、 3% 一 10%の CO、温度 35°C— 40°Cの条件下で 1日
2 一 30日培養し、増殖させることが できる。上記細胞集団を増殖させた後、細胞の増殖をマイトマイシン Cまたは放射線 照射により停止させることで、フィーダ一細胞を大量に得ることができる。
[0020] 以上のように、細胞増殖させる工程と、増殖停止させる工程を含む製造方法により 、無血清培養下で育成され、動物由来感染が殆どない安全な胚性幹細胞用フィー ダー細胞を製造することができる。前記細胞増殖工程では、細胞の培養容器に、予 め細胞接着因子をコートしておくことができる。当該細胞増殖工程において、培養細 胞を平均して 20回以上細胞分裂させることで、フィーダ一細胞を大量に製造すること ができる。 実施例
[0021] 以下に、本発明の実施例と比較例について説明するが、本実施例は本発明の再 現を補助する目的でその一実施態様を示すものであって、本実施例から本発明の限 界ゃ制限事項は示唆されない。なお、以下の実施例等においては、フィーダ一細胞 として、ゥシ胎児血清 (FBS)を含む培地で増殖された株化ヒト細胞を使用した。これ は、人体力も直接得たヒト細胞は実験材料としての入手が困難であることより、既に研 究用に提供されて 、る株化ヒト細胞を入手して実験に使用せざるを得な 、状況にあ ることによる。
[0022] (実施例 1)
FBSを 10v/v%添カ卩した MEM培地で、 41.77PDL (population doubling Level:通算細 胞集団倍加値 (日本組織培養学会編「組織培養の技術第三版 (基礎編) 1996年 p42) )まで培養した、細胞バンクより分譲されたヒト正常 2倍体肺線維芽細胞株 (MRC-5) を、以下のフィーダ一細胞作成培地 (A)を用いて細胞数力 X 106cellsとなるように 懸濁し、ゼラチンコートしたシャーレ上で 1回の継代培養を挟んで 42.99PDLまで培養 した。
[0023] フィーダ一細胞作成培地 (A)組成：
ゥシ血清アルブミン (BSA) 5g/L, EGF 10 μ g/L,インスリン lmg/L,ハイド口コルチゾ ン lmg/Lが添カ卩された RITC80-7培地
[0024] つ!、で、前記培養した該 MRC— 5を、最終濃度 10 μ g/mlのマイトマイシン C (MMC )を含むフィーダ一細胞作成培地 (A)を用いて 2— 3時間培養し、細胞分裂を不活性 化させた。その後、 MMCを含むフィーダ一細胞作成培地 (A)を除き、細胞をリン酸 緩衝溶液 (PBS)で 3回洗浄した。洗浄後の細胞を、トリプシン処理 (0.25w/v%トリプシ ン、 1 mM EDTA)により培養シャーレカゝら剥がし、細胞数をカウントした。その結果、 約 5.5 X 106cellsのフィーダ一細胞を得ることができた。
[0025] (実施例 2)
実施例 1と同様の細胞バンクより分譲された MRC— 5を、以下のフィーダ一細胞作 成培地（B)を用いて細胞数力 ¾.l X 105cellsとなるように懸濁し、ゼラチンコートした培 養シャーレ上で、 4回の継代培養を行!、53.47PDLまで培養した。 ついで、前記培養した MRC— 5を最終濃度 10 /z g/mlの MMCを含むフィーダ一細 胞作成培地 (B)を用いて 2— 3時間培養し、細胞分裂を不活性化させた。その後、 M MCを含むフィーダ一細胞作成培地 (B)を除き、 PBSで細胞を 3回洗浄しフィーダ一 細胞を作成した。このフィーダ一細胞を、ゼラチンコートした直径 60mmのシャーレに 1枚あたりに生細胞数として約 4 X 105個播き静着させた。
[0026] フィーダ一細胞作成培地 (B)組成：
アルブミン 83g/Lおよびインスリン 100mg/Lを含む血清代替物（Knock out Serum Replacement:インビトロジヱン社（特許文献 1) ) 20v/v%, MEM非必須アミノ酸溶液 (ィ ンビトロジェン社） lv/v%、ピルビン酸 Na lmmol/L、 L-グルタミン 2mmol/L、 2-メルカ プトエタノール 0.1 mmol/L、 EGF 10 μ g/Lゝ FGF 1 μ g/Lが添カ卩された DMEM:Ham F=l:lの混合培地
[0027] 凍結保存した力-クイザル胚性幹細胞を解凍後、以下の力-クイザル胚性幹細胞 用培地 (A)に生細胞数として約 2 X 105cells/mlの濃度となるように懸濁したものを、前 記フィーダ一細胞が静着したシャーレに播き込んだ。 5%CO
2、 37°Cのインキュベー ター内で、力-クイザル胚性幹細胞のコロニーが成長し継代培養が可能となるまで（ 10日間）、毎日力-クイザル胚性幹細胞用培地 (A)の交換を行 、ながら培養した。
[0028] 力-クイザル胚性幹細胞用培地 (A)組成：
アルブミン 83g/Lおよびインスリン 100mg/Lを含む血清代替物（特許文献 1) 20v/v%, MEM非必須アミノ酸溶液 (インビトロジヱン社） lv/v%、ピルビン酸 Na lmmol/L、 L-グ ルタミン 2mmol/L、 2-メルカプトエタノール 0.1 mmol/Lが添カ卩された DMEM:Ham F=l:lの混合培地
[0029] 前記培養された力-クイザル胚性幹細胞コロニーを、トリプシン処理 (0.25w/v%トリ プシン）によりシャーレから解離させた。一部のシャーレ中の細胞は新しいフィーダ一 細胞を含むシャーレに再び播き込こまれ、その後同条件で 4日間培養を続け、残りの シャーレ中の細胞をシャーレから剥がし、細胞数をカウントした。
[0030] 継代した胚性幹細胞コロニーを培養終了後、一部のシャーレ中の細胞を上記と同 様にシャーレから剥がし、細胞数をカウントした。残りのシャーレ中の細胞は、 4 w/v% パラホルムアルデヒドで固定した後、 FITCラベルした SSEA— 4抗体（サンタクルズ社 )で免疫染色し、蛍光顕微鏡で BP460-490nm、 BA515nmにより観察した。
[0031] その結果力-クイザル胚性幹細胞コロニーの形態は、継代時および培養終了時の V、ずれにお 、てもマウス胎児線維芽細胞由来のフィーダ一細胞で培養されたものと 同等であり（図 1、図 2)、力-クイザル胚性幹細胞は増殖していた（図 3)。また、培養 終了時の免疫染色において、霊長類胚性幹細胞のマーカーの一つである SSEA— 4 による蛍光が観察されることから（図 4)、霊長類胚性幹細胞のコロニーであることが証 明された。
このことから、本発明による方法で作成された MRC— 5からのフィーダ一細胞により 、胚性幹細胞の培養が可能であることが示唆された。
[0032] (実施例 3)
実施例 1と同様の細胞バンクより分譲された MRC— 5を、フィーダ一細胞作成培地（ B)を用いて細胞数力 ¾.4 X 106cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャ ーレ上で 4回の継代培養を行い 53.68PDLまで培養した。ついで、前記培養した MR C 5を、最終濃度 10 μ gZmlの MMCを含むフィーダ一細胞作成培地（B)で 2— 3 時間培養し、細胞分裂を不活性化した。その後、 MMCを含むフィーダ一細胞作成 培地 (B)を除き、 PBSで細胞を 3回洗浄し、フィーダ一細胞を作成した。
[0033] このフィーダ一細胞を、ゼラチンコートした直径 60mmシャーレ 1枚あたりに生細胞 数として約 4 X 105個播き静着させた。このフィーダ一細胞が静着したシャーレに、凍 結保存した力-クイザル胚性幹細胞を解凍後、力-クイザル胚性幹細胞用培地 (A) に生細胞数として約 2 X 105cells/mlの濃度で懸濁し播き込んだ。 5%CO
2、 37°Cのィ ンキュベータ一内で、胚性幹細胞のコロニーが成長し継代培養が可能となるまで（10 日間）、毎日培地交換を行いながら培養した。トリプシン処理 (0.25w/v%トリプシン）に より、胚性幹細胞コロニーを解離し、一部のシャーレ中の細胞は新しいフィーダ一細 胞を含むシャーレに再び播き込み、その後同条件で 4日間培養を続け、残りのシヤー レ中の細胞をシャーレから剥がし、細胞数をカウントした。
[0034] 継代した胚性幹細胞コロニーの培養終了後、細胞をシャーレ力も剥がし、細胞数を カウントした。その結果力-クイザル胚性幹細胞コロニーの形体は継代時および培養 終了時のいずれにおいてもマウスフィーダ一細胞で培養されたものと同等であり（図 5、図 6)、細胞は増殖していた（図 7)。
このことから実施例 2と同様、コラーゲンコートしたシャーレを用いると、 MRC— 5力ら 作成されたフィーダ一細胞により、胚性幹細胞の培養が可能であることが示唆された
[0035] (実施例 4)
実施例 1と同様の細胞バンクより分譲された MRC— 5を、フィーダ一細胞作成培地（ B)を用いて 2.1 X 105cellsとなるように懸濁し、ゼラチンコートした培養シャーレ上で増 殖が悪くなるまで継代培養を繰り返し、無血清培養による増殖限界を調べた。その結 果、本発明の培地によりフィーダ一細胞となりうる線維芽細胞は 41.77PDLからでも 4 回の継代まで増殖が可能であり、約 53PDLまで分裂できることが確認された（図 8)。 このこと力 、 1種の細胞株力 相当量のフィーダ一細胞を作成することが可能ある ことが示唆された。
[0036] (実施例 5)
実施例 1と同様の細胞バンクより分譲された MRC— 5を、フィーダ一細胞作成培地（ B)を用いて 2.1 X 105cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャーレ上で 増殖が悪くなるまで継代培養を繰り返し、無血清培養による増殖限界を調べた。 その結果、本発明の培地によりフィーダ一細胞と成り得る線維芽細胞は 41.77PDL 力 でも 7回の継代まで増殖が可能であり、線維芽細胞を有限分裂細胞の限界に近 V、約 60PDLまで分裂できることが確認された（図 9)。
このことから、本発明の培地はコラーゲンコートと組み合わせることにより、より多くの フィーダ一細胞を作成することが可能であることが示唆された。
[0037] (実施例 6)
FBSを 10v/v%添カ卩した MEM培地で 28.76PDLまで培養した細胞バンクより分譲され たヒト正常 2倍体肺線維芽細胞株 (TIG— 3)を、フィーダ一細胞作成培地 (B)を用い て 1.8 X 105cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャーレ上で 2回の継 代培養を挟んで 35.51 PDLまで培養した。
っ 、で、最終濃度 10 μ gZmlの MMCを含むフィーダ一細胞作成培地（B)で TIG —3を 2— 3時間培養し、細胞分裂を不活性化した。その後、 MMCを含む培地を除き 、細胞を PBSで 3回洗浄した。トリプシン処理（0.25w/v%トリプシン、 1 mM EDTA)に より、洗浄後の細胞を培養シャーレカゝら剥がし、細胞数をカウントした。その結果約 2.1 X 107cellsのフィーダ一細胞を得ることができた。
このことから、 MRC— 5以外の線維芽細胞株でも本発明の培地により大量のフィー ダー細胞の作成が可能であることが示唆された。
[0038] (比較例 1)
実施例 1と同様の細胞バンクより分譲された MRC— 5を、 FGF1 μ g/ インスリン 5mg/Lが添加され、血清アルブミンを含まな 、MCDB202を改変したヒト初代線維 芽細胞用培地（以下「FGM」 t\、う: Cambrex社）を用いて 2.2 X 105cellsとなるように懸 濁し、ゼラチンコートした培養シャーレ上で 1回の継代培養を挟んで培養した。しかし 継代後に細胞の増殖は停止し、 MMC処理することはできず、フィーダ一細胞の作 成は困難であった。
[0039] (比較例 2)
実施例 1と同様の細胞バンクより分譲された MRC— 5を、 FGMを用いて 2.2 X 105 cellsとなるように懸濁し、コラーゲンコートした培養シャーレ上で 1回の継代培養を挟 んで培養した。し力し比較例 1と同様、継代後細胞の増殖は停止し、 MMC処理する ことはできずフィーダ一細胞の作成は困難であった。
産業上の利用可能性
[0040] 本発明によれば、ヒト胚性幹細胞を含めた胚性幹細胞の培養に用いられるフィーダ 一細胞を動物由来の感染のおそれが少ない無血清培地で生産することができる。ま た、ゼラチンやコラーゲン等の細胞接着因子と組み合わせることにより、長時間の培 養が可能となるため、限られたドナー由来の材料を極限まで利用することが可能とな り、フィーダ一細胞のドナー変更による感染源混入の危険も非常に低くなる。また、実 施例によって本発明は複数の株細胞で利用可能であることが確認されたことから、多 種類の動物由来の胚性幹細胞に適したそれぞれのフィーダ一細胞の作成にも利用 されうる。

Claims

請求の範囲
[1] 血清アルブミン、インスリンおよび基本培地を含み、当該血清アルブミンの量が 2g ZL— 50gZL、当該インスリンの量が lmgZL— lOOmgZLであり、当該基本培地 力 MEM、 a -MEM, DMEM、 IMDM、 Ham F10、 Ham F12、 Mediuml99、 RPMI1640, RITC 80-7、 MCDB104, MCDB105、 MCDB153、 MCDB201および MCDB202から選 択される少なくとも 1種力もなる、胚性幹細胞用フィーダ一細胞作成培地。
[2] さらに細胞接着因子が含有されている、請求の範囲第 1項に記載の培地。
[3] 細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニ ン、ポリリジン、ポリオル-チンおよびポリエチレンィミン力 選択される少なくとも 1種 類である、請求の範囲第 2項に記載の培地。
[4] さらに細胞増殖因子が含有されている、請求の範囲第 1、 2または 3項に記載の培 地。
[5] 細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子および上皮細胞増殖因子から選択される 少なくとも 1種類である、請求の範囲第 4項に記載の培地。
[6] 胎児表皮線維芽細胞、胎児筋線維芽細胞、胎児肺線維芽細胞、胎児上皮細胞、 胎児内皮細胞、成体表皮線維芽細胞、成体肺線維芽細胞、成体上皮細胞および成 体内皮細胞力 選択される少なくとも 1種の細胞種を含む細胞集団を請求の範囲第 1一 5項のいずれか一項に記載の胚性幹細胞用フィーダ一細胞作成培地中で培養 増殖させる工程と、当該培養増殖された細胞集団をマイトマイシン Cまたは放射線照 射により増殖停止させる工程とを含む、胚性幹細胞用フィーダ一細胞の製造方法。
[7] 前記培養増殖工程を細胞接着因子をコートした培養容器中で行う、請求の範囲第 6項に記載の製造方法。
[8] 細胞接着因子が、コラーゲン、ゼラチン、ファイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニ ン、ポリリジン、ポリオル-チンおよびポリエチレンィミン力 選択される少なくとも 1種 類である、請求の範囲第 7項に記載の製造方法。
[9] 前記培養増殖工程にぉ ヽて培養細胞を平均して 20回以上細胞分裂させる、請求 の範囲第 6、 7または 8項に記載の製造方法。
[10] 請求の範囲第 6— 9項のいずれか一項に記載の製造方法で得られた胚性幹細胞
Figure imgf000015_0001
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