JPWO2011111787A1 - 間葉系幹細胞を含む細胞製剤及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、無血清条件下において免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤の製造方法を提供する。本発明に係る細胞製剤の製造方法は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる増殖工程と、上記増殖工程後の間葉系幹細胞から、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程とを包含している。
本発明に係る製造方法の増殖工程においては、間葉系幹細胞を、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Aにおいて培養し、間葉系幹細胞を増殖させる。
(i)細胞層をPBS(−)5mLを用いて洗浄する。
(ii)ACCUTASEを2mL添加する。
(iii)室温にて2分程度静置し、細胞の剥離を確認のうえ遠心管に細胞浮遊液を移す。
(iv)培養容器にPBS(―)を7mL添加し、フラスコ底面をリンスする。
(v)上記(iii)の遠心管に上記(iv)の溶液を移し、1500rpm(200×g)で5分間遠心する。
(vi)上清を除き、5,000個/cm2の播種濃度にて、無血清培地Aを用いて播種する。
本発明に係る製造方法のスクリーニング工程(「第1スクリーニング工程」ともいう。)においては、上記増殖工程後の間葉系幹細胞から、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞をスクリーニングする。上述した無血清培地Aにおいて増殖した増殖工程後の間葉系幹細胞は、免疫抑制能が少なくとも維持されており、さらに免疫抑制能がこう進している。したがって、このような間葉系幹細胞を、免疫抑制能を基準としてスクリーニングすることによって、免疫抑制能を維持または向上した間葉系幹細胞を選別することができる。そして、選別した間葉系幹細胞を細胞製剤として使用することによって、免疫抑制剤を併用することなく、免疫学的拒絶反応を抑制した間葉系幹細胞の移植治療が実現する。
本発明に係る製造方法は、上記増殖工程後の間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングする第2スクリーニング工程をさらに包含していてもよい。
本発明に係る製造方法は、さらに、増殖工程後の間葉系幹細胞を、スクリーニング工程の前に、血清含有培地において培養する血清培養工程を包含していてもよい。血清培養工程においては、増殖工程において無血清培養した間葉系幹細胞を、血清含有培地において培養する。血清培養工程を行う場合、血清培養工程後の間葉系幹細胞をスクリーニング工程に供する。
本発明に係る製造方法は、上記増殖工程の前に、FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地Bにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる前増殖工程をさらにしていてもよい。
本発明に係る製造方法は、上記増殖工程の前(または上記前増殖工程の前)に、間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器を選択する培養容器選択工程をさらに包含していてもよい。間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、上記「増殖工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
本発明は、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための無血清の培地用添加剤を提供する。本発明に係る培地用添加剤は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している。本発明に係る培地用添加剤は、従来公知の基礎培地に添加して、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための無血清培地(無血清培地A)として使用することができる。
本発明は、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための無血清の培地用添加剤を提供する。本発明に係る培地用添加剤(培地用添加剤A)は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している。また、本発明に係る培地用添加剤は、細胞接着分子をさらに含有していてもよい。
本発明は、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための無血清の培養培地を提供する。本発明に係る培養培地は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している。本発明に係る培養培地は、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための無血清培地(無血清培地A)として使用することができる。
本発明は、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための培養方法を提供する。本発明に係る培養方法は、FGF、PDGF、TGF−β、HGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地(無血清培地A)中において間葉系幹細胞を培養する工程(培養工程A)を包含している。本発明に係る培養方法は、間葉系幹細胞を培養する際に、上述した無血清の培養培地を用いればよいといえる。
上述したように、本発明によれば、無血清又は低血清培地であっても血清含有培地において培養した場合と同等又はそれ以上の速度で、間葉系幹細胞を増殖させることが可能である上に、増殖させた間葉系幹細胞の免疫抑制能が維持又は向上している。さらに、本発明において増殖させた間葉系幹細胞は、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞が選択的に増加している。さらに、本発明において増殖させた間葉系幹細胞は、分化能が維持又は向上している(特許文献1参照のこと)。したがって、このような間葉系幹細胞を含む細胞製剤を患者に投与した場合、間葉系幹細胞による優れた移植治療が実現できるのみならず、移植治療の大きな問題の1つである免疫拒絶反応を効果的に抑制し、患者の負担を軽減すると共に、安定した治療を実現し得る。また、血清を用いて製造した従来の細胞製剤と比較して、血清のロット差を考慮する必要がなく、移植治療において安定した治癒率を実現できる。
以下の実験を行った。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(骨髄由来hMSC)は、Lonza Walkersville, Inc.(以下、Lonza社)より購入し、Mesenchymal Stem Cell Basal Medium(MSCBM)(Lonza社)にMesenchymal Cell Growth Supplement(MCGS)(Lonza社)を加えた血清含有培地(MSCGM培地)、又は表1に示す無血清の培地1で培養した。
<2−1:マイトジェンによる刺激>
96ウエルプレートの各ウエルに、マウス脾臓細胞(1×105)を播種し、2.5ng/ml Phorbol 12−myristate 13−acetate(以下、PMAと称する)、125ng/ml ionomycinで刺激した。
96ウエルプレートの各ウエルにマウス脾臓細胞(1×105)を播種し、2.5μg/ml anti−CD3、0.5μg/ml anti−CD28で刺激した。
骨髄由来hMSCの前処理として、96ウエルプレートの各ウエルに、骨髄由来hMSC1×104を播種し、張り付いたのを確認してから(数時間から一晩培養)、ガンマセル40イグザクターを用いてガンマ線照射を行い、細胞分裂を阻害した。その上に、上述したように活性化したマウス脾臓細胞を播種し、骨髄由来hMSCと共培養した。
共培養開始から3日目及び4日目に、各ウエルに[3H]−Thymidineを加え、さらに8時間培養した。培養細胞をガラスフィルターに吸着させた後、液体シンチレーションカウンターでThymidineの取り込みを測定し、細胞増殖を測定した。
骨髄由来hMSCとマウス由来活性化T細胞との共培養を、10%FBS含有のMSCGM培地又は無血清培地Aである培地1(STK2(登録商標))で培養した結果を、図1〜4に示す。図1〜4おいて、値は平均±標準偏差で示している。同様の結果が、3回以上の独立した実験結果から得られた。#4及び#5は、それぞれ独立した骨髄由来hMSCの結果を示している。
マウスリンパ球混合反応(MLR)によるT細胞増殖に対する骨髄由来hMSCの免疫抑制効果を調べた。実験方法、並びに使用した細胞及び培地は、実施例1と同様である。骨髄由来hMSCの前処理として、96ウエルプレートの各ウエルに2×104の骨髄由来hMSCを播種し、実施例1と同様に行った。また、マウス脾臓細胞の活性化を、96ウエルプレートの各ウエルにおいて、マウス脾臓細胞(2×105)とマウス骨髄由来樹状細胞(BMDC)(3.3×104)とを共培養することによって行った(MLR刺激)。
以下の実験を行った。
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(脂肪組織由来hMSC)は、以下の(i)〜(vii)の手順にて分離し、培養した。
(i)ヒトから脂肪組織を採取し、無血清DMEM培地を用いて脂肪組織を2〜3回洗浄した。
(ii)洗浄後の脂肪組織を、ハサミを用いて細かく切断した(1mm3)。
(iii)0.1〜0.2%コラゲナーゼ(GIBCO 17100-017)溶液を用いて、スターラーバーで攪拌しながら脂肪組織を処理した(37℃、30〜60分)。
(iv)100mmのフィルターを用いてコラゲナーゼ処理後の脂肪組織を濾過した後、100×g、10分間遠心分離を行い、脂肪組織由来hMSCを分離した。
(v)Red lysis buffer(sigma R7757)を用いて、スターラーバーで攪拌しながら遠心分離後の細胞を処理した(5〜10分)。
(vi)Red lysis buffer処理後の細胞を、無血清DMEM培地を用いて2〜3回洗浄した。
(vii)洗浄後の細胞を培養用プレート(BECTON, DICKINSON (Falcon)353047)に播種し、表1に示した無血清の培地1、又は10%FBSを含有するMEM培地(sigma D6046)(「10%FBS−MEM」と称する。)を用いて培養した。
培養開始から8日目に、細胞の増殖状態を光学顕微鏡を用いて目視で観察した。
結果を図7に示す。図7は、培養開始から8日目の脂肪組織由来hMSCの増殖状態を示す図である。図7では、脂肪組織由来hMSCを40倍に拡大して観察した。図7に示すように、培地1で培養した脂肪組織由来hMSCは、10%FBS−MEMで培養した脂肪組織由来hMSCと比較して、顕著に(2〜3倍)細胞数が増加していることが示された。
以下の実験を行った。
ヒト滑膜由来間葉系幹細胞(滑膜由来hMSC)は、以下の(i)〜(iii)の手順にて分離した。
(i)ヒトから滑膜を採取した。
(ii)得られた滑膜細胞をPBSで洗浄後、組織を0.4%コラゲナーゼ溶液10ml中に加えて混和し、37℃で1〜4時間反応させた。
(iii)フィルタリング後、遠心分離した。
・10%FBS含有DMEM(10%FBS−DMEM)(sigma D6046、FBS;Hyclone,PS(+))
・培地1
・培地2
培養は、37℃に保った炭酸ガスインキュベータ内(95% air and 5% CO2)で行った。
培養開始から12日目(継代0回目)に、細胞の増殖状態を光学顕微鏡を用いて目視で観察した。また、細胞の数をコールターカウンターによって測定した。
結果を図8に示す。図8は、初期の滑膜由来hMSCに対する培地1および培地2の増殖促進効果を示す図であり、(a)は、培養開始から12日目の滑膜由来hMSCの細胞数を示すグラフであり、(b)は、培養開始から12日目の滑膜由来hMSCの増殖状態を示す図である。図8の(b)では、滑膜由来hMSCを10倍に拡大して観察した。
以下の実験を行った。
ヒト滑膜由来間葉系幹細胞(滑膜由来hMSC)は、実施例4の「1.細胞培養」の項に示した(i)〜(iii)の手順によって分離した。
・10%FBS含有DMEM(10%FBS−DMEM)(sigma D6046、FBS;Hyclone,PS(+))
・培地1
・培地2
培養は、37℃に保った炭酸ガスインキュベータ内(95% air and 5% CO2)で行った。
細胞の数をコールターカウンターによって測定した。
結果を図9に示す。図9は、培養開始0日目から68日目までの滑膜由来hMSCの細胞数の経時的な変化を示すグラフである。
以下の実験を行った。
ヒト滑膜由来間葉系幹細胞(滑膜由来hMSC)は、実施例4の「1.細胞培養」の項に示した(i)〜(iii)の手順によって分離した。
1gの滑膜組織から培地2と培地1を組み合わせて培養することによって、3〜4週間で1000人分(変形性関節症の最大移植細胞数:1.5×109個)の増殖を取得することができた。
以下の実験を行った。
以下のフラスコを用いた。
・フラスコ1:ファルコン製75cm2フラスコ
・フラスコ2:住友ベークライト製75cm2フラスコ
(培養液)
以下の培養液を用いた。
・10%FBS含有DMEM(10%FBS−DMEM)(sigma D6046、FBS;Hyclone,PS(+))
・培地1
・培地1+フィブロネクチン(終濃度5μg/mL)
(細胞)
以下の骨髄由来間葉系幹細胞(骨髄由来hMCS)を用いた。
・細胞1(P2):1×106個、細胞を起して培養12日目に継代したもの。
・細胞2(P3):1×106個、細胞を起して培養30日目に継代したもの。増殖スピードが遅い。
・細胞3(P1):1×106個、細胞を起して培養12日目に継代したもの。
5,000個/cm2の播種密度で、以下の条件にてそれぞれの骨髄由来hMCS(細胞1〜細胞3)を培養した。なお、培養液3を用いる場合は、播種時のみフィブロネクチンを添加した。
・条件A:フラスコ1+10%FBS−DMEM(ポジティブコントロール)
・条件B:フラスコ1+培地1
・条件C:フラスコ1+培地1+フィブロネクチン
・条件D:フラスコ2+10%FBS−DMEM(ネガティブコントロール)
・条件E:フラスコ2+培地1
・条件F:フラスコ2+培地1+フィブロネクチン
(2.細胞増殖測定)
<細胞1>
継代3回目になった時点でフラスコに細胞を播種し、培養を開始した。培養開始から5日目に、細胞の増殖状態を光学顕微鏡を用いて目視で観察した。
継代4回目になった時点でフラスコに細胞を播種し、培養を開始した。培養開始から5日目に、細胞の増殖状態を光学顕微鏡を用いて目視で観察した。
継代2回目になった時点でフラスコに細胞を播種し、培養を開始した。培養開始から5日目に、細胞の増殖状態を光学顕微鏡を用いて目視で観察した。
<細胞1>
結果を図10に示す。図10は、培養開始から5日目の骨髄由来hMSC(細胞1)の増殖状態を示す図である。図10では、骨髄由来hMSCを40倍に拡大して観察した。
結果を図11に示す。図11は、培養開始から5日目の骨髄由来hMSC(細胞2)の増殖状態を示す図である。図11では、骨髄由来hMSCを40倍に拡大して観察した。
結果を図12に示す。図12は、培養開始から5日目の骨髄由来hMSC(細胞3)の増殖状態を示す図である。図12では、骨髄由来hMSCを40倍に拡大して観察した。
以下の実験を行った。
96ウェルプレートを用いて、各ウェルに軟寒天培地(DMEM−10%FCS−0.6%寒天)を加え、ゲル化した後に細胞を懸濁した軟寒天培地(DMEM−10%FCS−0.4%寒天)を添加した。細胞は、ヒト軟骨肉腫細胞株(OUMS−27、JCRB細胞バンクから購入)、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF、ロンザ社から購入)を用いて、ウェルあたりの細胞播種数は0〜10000個とした。ヒト軟骨肉腫細胞株は、間葉系の細胞がガン化したものである。軟寒天培地上に添加する培養液の血清含有量が10%、20%の群を作製した。なお、本実験において培養液に血清を添加したのは、細胞がより活発に増殖すると考えられる条件とするためである。
以下の培養液を用いた。
・4.5g/Lグルコース含有DMEM(DMEM 4.5g/L glucose)
・培地1(表1を参照)
なお、4.5g/Lグルコース含有DMEMにおいて、グルコースは、コロニー形成・増殖促進を目的として添加している。OUMS−27は、低濃度のグルコース培地(1g/ml)ではコロニー形成が悪いと考え、高濃度グルコース含有培地(市販品)を選んで、培養に使用した。
図13は、正常ヒト皮膚線維芽細胞およびヒト軟骨肉腫細胞株の増殖に対する培地1の効果を示すグラフであり、(a)は、培養開始から14日目の正常ヒト皮膚線維芽細胞のコロニー数を示すグラフであり、(b)は、培養開始から14日目のヒト軟骨肉腫細胞株のコロニー数を示すグラフである。なお、図13では、大きさが25μm以上のコロニーの数を示す。
Claims (18)
- FGF、
PDGF、
TGF−β、
HGF、
EGF、
少なくとも1つのリン脂質、及び
少なくとも1つの脂肪酸を
含有する無血清培地Aにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる増殖工程と、
上記増殖工程後の間葉系幹細胞から、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程と
を包含することを特徴とする間葉系幹細胞を含む細胞製剤の製造方法。 - 上記増殖工程後の間葉系幹細胞を、上記スクリーニング工程の前に、血清を含む培地において培養する血清培養工程をさらに包含することを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 上記増殖工程の前に、
FGF、
PDGF、
EGF、
少なくとも1つのリン脂質、及び
少なくとも1つの脂肪酸を
含有する無血清培地Bにおいて、間葉系幹細胞を増殖させる前増殖工程をさらに包含することを特徴とする請求項1又は2に記載の製造方法。 - 上記増殖工程後の間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングする第2スクリーニング工程をさらに包含することを特徴とする請求項1〜3の何れか1項に記載の製造方法。
- 上記増殖工程では、上記間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器を用いて当該間葉系幹細胞を増殖させることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 上記増殖工程では、上記無血清培地Aに、細胞接着分子をさらに含有させることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 上記増殖工程では、上記間葉系幹細胞を少なくとも1回継代することを特徴とする請求項1〜6の何れか1項に記載の製造方法。
- 上記増殖工程では、継代を行う場合に、哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することを特徴とする請求項7に記載の製造方法。
- 上記増殖工程の前に、間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器を選択する培養容器選択工程をさらに包含していることを特徴とする請求項5に記載の製造方法。
- 上記リン脂質が、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールからなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 上記脂肪酸が、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の製造方法によって製造された間葉系幹細胞を含む細胞製剤。
- FGF、
PDGF、
TGF−β、
HGF、
EGF、
少なくとも1つのリン脂質、及び
少なくとも1つの脂肪酸を
含有することを特徴とする免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための無血清の培地用添加剤。 - 細胞接着分子をさらに含有していることを特徴とする請求項13に記載の培地用添加剤。
- 請求項13又は14に記載の培地用添加剤を含有していることを特徴とする免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための無血清の培養培地。
- 請求項15に記載の培養培地において間葉系幹細胞を培養する工程を包含することを特徴とする免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するための培養方法。
- 請求項13又は14に記載の培地用添加剤Aを少なくとも備えていることを特徴とする免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を含む細胞製剤を製造するためのキット。
- FGF、
PDGF、
EGF、
少なくとも1つのリン脂質、及び
少なくとも1つの脂肪酸を
含有する培地用添加剤Bをさらに備えていることを特徴とする請求項17に記載のキット。
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