KR102303948B1

KR102303948B1 - 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102303948B1
Application number: KR1020210030919A
Authority: KR
Inventors: 황성환; 강정화
Original assignee: 주식회사 스마트셀랩; 주식회사 이뮤니스바이오
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2021-09-24

Abstract

본 발명에 따른 조성물은 인체 유래 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하여, 중간엽 줄기세포 단독 배양액 또는 면역세포 단독 배양액보다 우수한 피부 재생 효과를 갖는 조성물을 제공할 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물 {A COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN REGENERATION COMPRISING CO-CULTURE MEDIUM OF MESENCHYMAL STEM CELL AND IMMUNE CELL}

본 발명은 우수한 피부 재생 효과를 제공하는 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 화장품 국내 화장품 산업은 한류 열풍에 힘입어 중국, 일본, 동남아를 중심으로 빠르게 성장하고 있는 수출주력 산업으로 2020년 화장품 연간 수출 실적이 2019년의 65억4천200만 달러(한화 약 7조1천28억원)보다 15.7% 증가하였다. 특히 기능성 화장품 국내 연 평균 23.8%씩 성장하여 2023년에는 22조 9429억원의 규모를 형성할 것으로 전망되고 있다. 특히 기능성 화장품 시장 중 코스메슈티컬(Cosmeceutical) 산업이 가장 큰 폭으로 성장세를 형성하고 있다.

코스메슈티컬 산업은 의료 관광을 통해 신력을 인증 받은 피부과 기반 화장품 업체의 신뢰 및 기술력을 바탕으로, 차별화되고 진보된 기능성 화장품을 개발하기 위해서는 여러 가지 관련 기술의 확보가 중요하며, 새로운 물질 중에서 효능이 우수하더라도 안전성, 용해성 등이 부합하지 않으면 제제화 및 상품화가 어렵기 때문에 유효성분의 안정성, 흡수성을 향상시킬 수 있는 제형화 기술의 확보가 필요하다.

한편, 중간엽 줄기세포는 다능성(multipotent) 미분화 성체줄기세포로서 다양한 신체 조직에서 발견되며, 골모세포(osteoblast), 연골모세포(chondroblast), 지방세포(adipocyte), 심근세포, 골격세포, 신경세포 등을 포함하는 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있어 줄기세포를 이용한 다양한 연구와 여러 질환의 치료에 가장 많이 사용되고 있다.

아울러, 면역세포는 신체 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 바이러스 등에 대응하는 세포로서 NK 세포, T 세포, NKT 세포, B 세포, 수지상세포 등이 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 배경에서, 본 발명자는 중간엽 줄기세포 단독 배양액 또는 면역세포 단독 배양액을 유효성분으로 포함할 때보다 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함할 때 우수한 피부 재생 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1: KR 10-2013-0029290 2: KR 10-1451989

상기한 바와 같이 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은, 중간엽 줄기세포 단독 배양액 또는 면역세포 단독 배양액을 유효성분으로 포함할 때보다 피부 재생 효과가 더욱 우수함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 화상 및 창상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 포함하여 중간엽 줄기세포 단독 배양액 또는 면역세포 단독 배양액보다 더욱 우수한 피부 재생 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은 피부 재생용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 그 사용 목적에 따라, 화장료 조성물, 약학적 조성물 등으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 “피부 재생”은 임의로 스크래치된 피부섬유아세포 및 피부각질세포에 본 발명의 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 처리하였을 때 시간이 경과함에 따라 스크래치된 피부섬유아세포 및 피부각질세포가 치유되는 경우를 포함하는 의미이다.

본 발명의 조성물은 유효성분인 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 포함한다.

본 명세서에서 “중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)”는 다능성(multipotent) 미분화 성체줄기세포로서 상기 중간엽 줄기세포 배양액은 미세소포체, 성장인자, 미네랄, 비타민 등의 성분이 포함되어 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 인체 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 명세서에서 “면역세포(immune cells)”는 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 세포를 의미할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 유효성분으로서 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액은 조성물 총 중량에 대하여 2%(w/v) 내지 100%(w/v)로 포함될 수 있고, 바람직하게는 2%(w/v) 내지 100%(w/v)로 포함될 수 있다. 상기 공동배양액의 함량이 상기 2%(w/v) 미만으로 포함되는 경우, 피부 재생에 대한 효과를 얻을 수 없고, 100%(w/v)를 초과하여 포함하는 경우 함량 증가에 따른 효과의 증가가 미미하다.

본 발명의 일 실시예에서, 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액의 피부 재생 효과를 실험한 결과, 상기 공동배양액의 농도가 증가함에 따라 피부 재생 효능도 증가함을 확인하였다(실시예 3 및 4).

본 발명의 다른 일 실시예에서, 본 발명의 공동배양액(MSC+Immune cell CM)이 중간엽 줄기세포 단독 배양액(MSC CM) 또는 면역세포 단독 배양액(Immune cell CM)보다 성장인자(growth factor)의 분비가 촉진되는 것을 확인하였다(도 3).

구체적으로, 상기 성장인자는 M-CSF(macrophage colony stimulating factor), MCSF R(macrophage colony stimulating factor R), HGF(hepatocyte growth factor), IGFBP-4(insulin-like growth factor-binding protein-4) 및 IGFBP-6(insulin-like growth factor-binding protein-6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명은 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 "조성물"은 화장료 조성물, 약학적 조성물 등을 포함하는 의미?. 상기 각 조성물은 사용 목적, 유효 성분의 함량 등에 따라 카테고리를 달리하여 사용할 수 있다.

일 양태로서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있고, 이러한 측면에서 본 발명은 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 "화장료 조성물"은 화장품의 제조를 목적으로 구성된 조성물을 의미하며, 넓게는 외용제를 위한 외용제 조성물을 포함하는 의미로 해석될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 스프레이 타입의 화장수, 훼이셜 로션, 바디 로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 스틱, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워시 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적인 사용 방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리 할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상의 화장품에 사용가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 보습제, 자외선 차단제, 중화제, 점증제, 향료, 방부제, 산화방지제 또는 색소를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 스프레이 타입의 화장수, 훼이셜 로션, 바디 로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 스틱, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

다른 양태로서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있고, 이러한 측면에서 본 발명은 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 "약학적 조성물"은 의약품의 제조를 목적으로 구성된 조성물로서, 인간을 포함한 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방을 목적으로 사용하는 조성물을 의미한다. 넓게는 상기한 목적으로 사용되는 조성물 중, 의사의 허가없이 구매 가능하나, 화장품 또는 일반 외용제와 구분되는 의약외품을 위한 의약외품 조성물을 포함하는 의미로 해석될 수 있다.

본 발명의 조성물이 안정하면서도 우수한 피부 재생 효과를 갖는 피부 재생용 조성물을 제공할 수 있는바, 본 발명은 화상 및 창상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 "화상(burn injuries)"이란 불 또는 열에 의한 피부세포가 손상되는 것을 의미하는 한다.

본 명세서에서 “창상(wound)”이란 외부의 압력에 의하여　피부 조직이 손상되는 것을 의미하며, 구체적으로는 찰과상, 타박상, 열상, 칼날에 의한 절창,　자창,　할창, 총창,　폭창, 교창 등을 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 투여하여 목적하는 증상을 투여 전부다 증세가 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 "예방"이란 본 발명의 조성물을 투여하여 목적하는 증상 또는 질병이 발생하지 않도록 하거나, 이의 발생 또는 발현을 늦추는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 "치료"란 본 발명의 조성물을 투여하여 목적하는 증상 또는 질병을 호전시키거나 사라지게 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액은 약학적으로 유효한 함량(유효량)으로 포함될 수 있다. 상기 용어 '유효량'은 피부섬유아세포와 피부각질세포의 재생을 촉진하여 화상 및 창상 등을 치료할 수 있는 효과를 나타내는 양을 의미한다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 점막, 피부, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 상기 피부 투여는 피부 외부에 조성물을 처리하는 것을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로 하는 상기 조성물을 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 더 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

상기 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여경로 또는 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다.

상기 성분들은 상기 유효성분에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

상기 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 상기 제형의 예로 연고, 크림, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 수용액, 비수성용제, 현탁제 및 유제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 일 수 있다.

상기 제형을 위하여 부형제, 일 예로 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등을 더욱 포함할 수 있다.

일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

또한, 경구 투여를 위한 액상제제에는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

피부 투여를 위해 언급할 수 있는 예로는 더스팅 파우더, 에멀젼, 현탁액, 오일, 스프레이, 연고, 그리지 연고, 크림 페이스트, 겔, 폼, 또는 용액을 생성시키는데 적합하고, 경피 약물 전달체(TTS: Transdermal therapeuticsystem)에 적합한 담체 및/또는 부형제가 있다. 본 발명의 국소용 약학제제는 반고체상 제형일 수 있으며 특히 연고(용액 연고, 현탁액 연고), 크림, 겔 또는 페이스트가 있다. 유상에 주로 사용되는 것은 지방 알콜, 예를 들면 라우릴 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 지방산, 예를 들면 팔미트산 또는 스테아르산, 액상 또는 고체상 파라핀 또는 오조케라이트, 액상 내지 고체상 왁스, 예를 들면 이소프로필 미리스테이트, 천연 지방 또는 일부 합성 지방, 예를 들면 코코넛 지방산 트리글리세라이드, 경화유, 예를 들면 수소화된 피넛 또는 캐스터 오일, 또는 글리세롤의 지방산 부분 에스테르, 예를 들면 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 디스테아레이트가 있다. 적합한 유화제로는 계면활성제, 예를 들어 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리알코올 또는 이것의 산화에틸렌 부가물의 지방산 에스테르, 예컨대 폴리글리세롤 지방산 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 소르비탄 올레에이트 또는 소르비탄 이소스테아레이트 등, 이소스테아레이트, 스테롤, 또는 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르 또는 지방산 에스테르, 예를 들어 음이온성 계면활성제, 예를 들면 지방 알코올 설포네이트의 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 세틸 설페이트 또는 나트륨 스테아릴 설페이트가 있으며 이들은 상기 지방 알코올, 예를 들면 세틸 알코올 또는 스테아릴 알코올의 존재 하에서 일반적으로 사용된다. 이 중에서도 특히 크림 건조를 방지하는 제제, 예를 들면 폴리알코올, 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 수상에 첨가하거나 또는 보존제, 향료 등을 수상에 첨가하는 것이 가능하다.

본 발명의 약학제제는 무수상태의 연고일 수 있고, 국소용도에 적합하고 체온상태에서 액체인 파라핀, 특히 저점도 파라핀을 함유하거나, 또는 상기 천연지방 또는 부분합성 지방, 예를 들면, 코코넛 지방산 트리글리세라이드, 경화유, 예를 들면 수소화된 피넛 도는 캐스터 오일, 글리세롤의 지방산 부분 에스테르, 예를 들면 글리세롤 모노스테아레이트 및 디스테아레이트, 실리콘, 예를 들면 폴리메틸실록산, 예컨대 헥사메틸디실록산 또는 옥타메틸트리실록산을 함유할 수 있으며, 예를 들어 수성크림과 관련되어 있고 수분 흡수 용량을 증가시키는 지방알코올, 그리고 스테롤, 울 왁스, 다른 유화제 및/또는 기타 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물을 의약품으로 제형화할 경우 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

상기 약학적 조성물은 의약외품 조성물 일 수 있다.

본 명세서에서 "의약외품"은 질병에 대한 치료, 경감, 처치 또는 예방의 효과를 나타내나 의약품 보다 인체에 미치는 작용이 경미한 물품을 의미한다. 약사법에 따른 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외하며, 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 물품을 포함한다. 구체적으로 피부 외용제 또는 개인위생용품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물을 피부 재생 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 마스크 또는 연고제가 있다.

이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

도 1은 중간엽 줄기세포 단독 배양액, 면역세포 단독 배양액 및 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액 각각의 성상을 보여준다.
도 2는 중간엽 줄기세포 단독 배양액, 면역세포 단독 배양액 및 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액 각각의 사이토카인 분석(cytokine array) 결과를 보여준다.
도 3은 중간엽 줄기세포 단독 배양액, 면역세포 단독 배양액 및 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액 각각의 성장인자 분석(growth factor array) 결과를 보여준다.
도 4는 중간엽 줄기세포 단독 배양액, 면역세포 단독 배양액 및 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액의 피부 섬유아세포 회복 효과를 보여준다.
도 5는 중간엽 줄기세포 단독 배양액, 면역세포 단독 배양액 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액 각각의 피부 각질세포 회복 효과를 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실험예 및 제조예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실험예 및 제조예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

실시예 1. 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액 제조

줄기세포(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)를 1 내지 10% FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 a-MEM에 80% 이상 부착시켜 배양한다. 이후 면역세포를 0.001 내지 0.05% Albumin이 함유된 RPMI(Rosewell Park Menorial Institute) 배지 또는 DMEM에 부유하여 첨가하였다.

이후 3 내지 4일간 배양하여 얻은 배양액을 고속원심분리기를 이용하여 세포와 배양액을 분리 후 0.22um 필터로 여과, 순수 배양액만을 수확하였다.

실시예 2. 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액의 사이토카인 분석

사이토카인 분석은 R&D사의 Human Cytokine Array(Cat.No. ARY005B)를 사용하였다.

준비된 멤브레인에 차단 완충액(Blocking buffer)를 상온에서 한 시간 동안 rocking platform shaker에서 반응시키고 그동안 실시예 1에서 제조된 공동배양액, 줄기세포 단독배양액, 면역세포 단독배양액을 각각 1mL에 완충액을 첨가하여 총 1.5mL로 만든 후 검출 항체(Detection antibody)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시켰다.

멤브레인에 넣은 차단 완충액을 제거하고 배양액과 항체가 함유된 시액을 넣고 냉장온도에서 16 내지 24시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 시액을 제거하고 세척 완충액(wash buffer)를 이용하여 3회 이상 수세하였다.

이후 HRP가 부착된 완충액을 2mL 사용하여 상온에서 30분동안 반응시키고 반응이 완료된 시액을 제거, 세척 완충액을 이용하여 3회 이상 수세하였다.

HRP까지 부착된 멤브레인에 Chemi Reagent Mix를 넣고 1분간 반응시킨 다음, 다빈치-K기기를 사용하여 검출하였다.

이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. 면역세포 단독 배양액 또는 줄기세포 단독 배양액인 경우보다 면역세포와 줄기세포를 공동배양한 공동배양액에서 보다 다양한 사이토카인이 분비된 것을 확인하였다.

실시예 3. 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액의 성장 인자 분석

성장인자 분석은 RayBiotech사의 Human Growth Factor Antibody Array(Cat.No. aah-GF-1-4)를 사용하였다.

준비된 멤브레인에 차단 완충액을 상온에서 30분동안 반응시킨 후 완충액을 제거하였다. 그 후 실시예 1에서 제조된 공동배양액, 줄기세포 단독배양액, 면역세포 단독배양액을 각각 1mL을 첨가하여 상온에서 1.5 내지 5시간 반응하거나 냉장온도에서 밤새(overnight) 반응시켰다.

멤브레인에 넣은 배양액을 제거하고 세척 완충액을 이용하여 3회 이상 수세한 다음, Biotinylated Antibody Cocktail을 1mL 첨가하여 상온에서 1.5 내지 2시간 또는 냉장온도에서 밤새 반응하였다.

이후 멤브레인을 3회 이상 수세한 다음 HRP가 부착된 완충액을 2mL 사용하여 상온에서 2시간 또는 냉장온도에서 밤새 반응시키고 반응이 완료된 시액을 제거, 세척 완충액을 이용하여 3회 이상 수세하였다.

HRP까지 부착된 멤브레인에 검출 완충액(Detection Buffer)을 넣고 2분간 반응 시킨 다음, 다빈치-K기기를 사용하여 검출하였다.

이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. 면역세포 단독 또는 중간엽 줄기세포 단독인 경우보다 면역세포와 줄기세포를 공동배양한 공동배양액에서 보다 많은 양의 성장인자가 분비된 것을 확인하였다.

구체적으로, 중간엽 줄기세포 단독 배양액의 성장인자 발현도, 면역세포 단독 배양액의 성장인자 발현도 및 중간엽 줄기세포 배양액 및 면역세포 공동배양액의 성장인자 발현도를 측정하였을 때, 중간엽 줄기세포 단독 배양액과 면역세포 단독 배양액의 발현도 평균값 대비 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액의 발현도가 HGF의 경우 124% 증가, IGFPB-4의 경우 221% 증가, IGFPB-6의 경우 210% 증가, M-SCF의 경우 144% 증가 및 MCSF R의 경우 134% 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 공동배양액의 피부 재생 효과

사람유래 피부섬유아세포와 피부각질세포를 3.5 X 10⁴cells/well의 농도로 배양 후 스크래치를 만들어 진행하였다.

이후 DPBS로 수세 후 실시예 1에서 제조된 공동배양액, 줄기세포 단독 배양액, 면역세포 단독 배양액을 첨가군/비첨가군을 포함한 배지로 교체하여 0hr, 18hr, 24hr 및/또는 48hr간격으로 현미경으로 스크래치의 간격을 현미경으로 촬영 후 Image J 프로그램으로 분석하였다.

이에 대한 결과를 도 4 및 5에 나타내었다. 도 4b는 본 발명의 공동배양액의 처리를 통해 피부 섬유아세포가 중간엽 줄기세포 단독 배양액 및 면역세포 단독 배양액 대비 약 10% 이상 향상된 피부 섬유아세포의 회복된 영역을 보여주며, 도 4c는 본 발명의 공동배양액 처리를 통해 피부 섬유아세포의 약 30% 이상 향상된 회복 속도를 보여준다.

또한, 도 5b는 본 발명의 공동배양액의 처리를 통해 피부 각질세포가 중간엽 줄기세포 단독 배양액 및 면역세포 단독 배양액 대비 약 10% 이상 향상된 피부 각질세포의 회복된 영역을 보여주며, 도 5c는 본 발명의 공동배양액 처리를 통해 피부 각질세포의 약 40% 이상 향상된 회복 속도를 보여준다.

결과적으로, 섬유아세포가 시간이 지날수록 상처치유가 진행되는 것이 확인되었고, 공동배양액을 고농도로 함유할수록 높은 피부 재생 효과를 나타내었다. 또한, 피부 겉면인 각질세포에서 피부 재생 효과를 확인하였다.

Claims

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 면역세포는 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 공동배양액은 피부 재생용 화장료 조성물 총 중량에 대하여 2 내지 100%(w/v)으로 포함되는 것인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 재생용 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 젤 또는 세정제의 제형인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 공동배양액은 상기 중간엽 줄기세포 단독 배양액 또는 상기 면역세포 단독 배양액 대비 M-CSF, MCSF R, HGF, IGFBP-4 및 IGFBP-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자의 분비가 촉진되는 것인, 피부 재생용 화장료 조성물.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 면역세포 공동배양액을 유효성분으로 포함하는 화상 및 창상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 면역세포는 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 화상 및 창상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 공동배양액은 상기 약학적 조성물 총 중량에 대하여 2 내지 100%(w/v)으로 포함되는 것인, 화상 및 창상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 공동배양액은 상기 중간엽 줄기세포 단독 배양액 또는 상기 면역세포 단독 배양액 대비 M-CSF, MCSF R, HGF, IGFBP-4 및 IGFBP-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성장인자의 분비가 촉진되는 것인, 화상 및 창상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.