JP2024036484A

JP2024036484A - グラフェン量子ドットを有効成分として含む化粧料組成物

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Publication number: JP2024036484A
Application number: JP2024014946A
Authority: JP
Inventors: ス・ギョン・ジョン; ビョン・ヒ・ホン; ソ・ヨン・キュン; ヨン・ソク・チェ; ジュ・ヒ・キム; ソク・キュン・ユン; ヒョン・ジュ・ヨ; スン・ヒュン・カン; ミョン・サム・パク
Original assignee: Seoul National University R&DB Foundation
Current assignee: SNU R&DB Foundation
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2024-02-02
Publication date: 2024-03-15
Also published as: CN114423400A; EP3998057A4; KR102239987B1; US20220273576A1; CN114423400B; JP2022540460A; KR20210006765A; EP3998057A1; WO2021006490A1

Abstract

【課題】本発明が解決しようとする課題は、皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化化粧料組成物を提供することである。【解決手段】本発明は、グラフェン量子ドットを有効成分として含む化粧料組成物、医薬部外品組成物、薬学組成物に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化化粧料組成物に関し、具体的には、グラフェン量子ドットを有効成分として含む皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用化粧料組成物に関する。

本発明はまた、グラフェン量子ドットを有効成分として含む皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用医薬部外品組成物、薬学組成物に関する。

身体の中で皮膚は、外部環境と直接接しながら多様な有害因子から体を保護する機能を担当している。老化は加齢とともに自然に進む現象で、複雑な人体メカニズムによる結果として本来持っている正常な機能が生理学的に徐々に衰えることを称する。老化は多様な刺激によって促進または減少しうるが、現代社会に入るにつれ、紫外線、環境汚染、ストレスなどの内外的要因によって加速化されている。

皮膚は、外部から順に、表皮（Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、真皮（Ｄｅｒｍｉｓ）、皮下脂肪（Ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ）組織の３つの層に大きく区分され、物理的、化学的な外部環境の刺激から人体を保護する機能をする。このうち、表皮はさらに、角質層、顆粒層、有棘層、基底層に分けられるが、角質層は約１０～２０％の水分を含有し、人体の最外郭に存在することにより、体外への水分蒸発を抑制する一方、外部からの物質の過剰浸透を遮断する役割を果たす。角質層の表面は、皮脂腺から出た皮脂と汗腺から出た汗で作られた薄い天然保護膜に取り囲まれていて水分の蒸発を予防する。一方、真皮層は、皮膚の支持台の役割をするコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）と弾力を形成するフィブリリン（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）などのタンパク質などを合成して、皮膚の弾力を維持し構造を支持する役割を果たす。

皮膚の老化は、角質層の水分不足や真皮層の細胞外基質タンパク質の異常によって発生し、老化が進むほど、皮膚を構成する物質であるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸および糖タンパク質などの含有量および配列が変化または減少する症状が現れる。表皮の角質層を構成している細胞には、水溶性成分である高濃度の天然保湿因子（ＮａｔｕｒａｌＭｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇＦａｃｔｏｒ；ＮＭＦ）が存在して角質層の水分維持に中心的な役割を果たす。アミノ酸、糖類のような天然保湿因子は、皮膚が柔軟性を示すように作用することはもちろん、適切な水分を維持できるように補助する。特に、アミノ酸のような物質は、それ自体で水溶性である上に、効果的に水分と結合して皮膚で水分が乾燥することを抑制する。このような角質層の水分が減少すると、皮膚が乾燥し表面が荒れ、皮膚が潤いを失ってくすんで見えるなどの現象が発生するため、皮膚保湿剤の必要性が増加している。

アクアポリン（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ）は、水分子のみを選択的に通過させ、すべての細胞膜に存在する膜貫通タンパク質（ＭａｊｏｒＩｎｔｒｉｎｓｉｃＰｒｏｔｅｉｎＦａｍｉｌｙ）で、皮膚の水分吸収を増加させる。哺乳動物から発見されるアクアポリンは、１３個の同種タンパク質（ＡＱＰ－１～ＡＱＰ－１３）であり、これらのうちアクアポリン－３（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－３、ＡＱＰ－３）はヒトの表皮に豊富に存在する。アクアポリン－３は皮膚の角質形成細胞で発現し、アクアポリン－３を通した水およびグリセロールの吸収と移動は、細胞の水分損失を防止して皮膚の保湿および弾力を増加させる。

また、老化した皮膚から現れるシワと皮膚の弾力減少、皮膚のたるみおよび乾燥現象などは、大部分真皮に存在する基質タンパク質の変化のためである。真皮は皮膚内で皮膚の強度と形態を支持する役割をしているため、老化が進む時、真皮に形態的な変化が起こると、シワ生成および皮膚のたるみに決定的な働きをする。このような基質タンパク質を分解する酵素として代表的なものがマトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）である。紫外線照射時、皮膚内のＭＭＰｓの活性が増加し、皮膚内のコラーゲンおよびその他の基質タンパク質を著しく分解させて皮膚の老化を促進するのに主な要因として作用する。そのうち、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）として知られたＭＭＰ－１は、皮膚コラーゲンの衰えに最も影響を及ぼす酵素の一つである。したがって、ＭＭＰ－１を抑制する活性成分は、皮膚の老化防止に良い効果を有する。

そこで、本発明者らはバイオ分野に適用可能なグラフェンに注目して、本発明を完成するに至った。グラフェンは、炭素原子がｓｐ^２混成結合により六角形の格子構造をなして作られた原子１層の２次元物質である。グラフェンが最初に発見されて以来、グラフェンの特異な物理的、化学的、電気的、そして機械的特性を利用した多様な研究が進められてきており、最近は、グラフェン由来ナノ物質のバイオ分野への応用の可能性に注目しながらバイオ素材に適用させる研究が活発に報告されている。従来のグラフェンを含有した化粧料として、グラフェン量子ドットを含有して紫外線吸収機能を増進させた化粧料組成物（ＫＲ１０－１７１０９０７Ｂ）が開示された。

KR 10-2016-0146213 KR 10-2015-0054186 KR 10-2013-0134580

本発明は、グラフェン量子ドットを有効成分として含む組成物により皮膚再生、シワ改善、保湿、抗酸化効果を提供することを目的とする。

本発明は、上記の目的を達成するために、グラフェン量子ドットを有効成分として含む化粧料組成物を提供する。

本発明はまた、全体化粧料組成物の総重量対比、グラフェン量子ドットを１．０×１０^－７～３０重量％含む化粧料組成物を提供する。

本発明のグラフェン量子ドットは、ｉ）活性酸素消去、ｉｉ）コラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）の発現抑制、ｉｉｉ）タイプ１プロコラーゲン（ｔｙｐｅ１ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）の合成促進、ｉｖ）フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）の発現増加、ｖ）ヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ－３）の発現増加、またはｖｉ）アクアポリン－３（ＡＱＰ－３）の発現増加からなる群より選択される１つ以上の効果を提供することを特徴とする化粧料組成物を提供する。

本発明はまた、粉体（ｐｏｗｄｅｒ）、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、香料、親水性または親油性活性剤からなる群より選択される１種以上をさらに含むことを特徴とする化粧料組成物を提供する。

本発明は、トナー剤、ローション剤、およびクリーム剤からなる群より選択される１つ以上の剤形であることを特徴とする化粧料組成物を提供する。

本発明の他の実施形態として、グラフェン量子ドットを有効成分として含む、皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用医薬部外品組成物を提供する。

本発明のさらに他の実施形態として、グラフェン量子ドットを有効成分として含む、皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用薬学組成物を提供する。

本発明によるグラフェン量子ドットを有効成分として含む化粧料組成物、医薬部外品組成物または薬学組成物は、皮膚再生、シワ改善、保湿、抗酸化効果を示す。

線維芽細胞にグラフェン量子ドット（ＧｒａｐｈｅｎｅＱｕａｎｔｕｍＤｏｔｓ、ＧＱＤ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１×１０^４ｎｇ／ｍＬ、１×１０^５ｎｇ／ｍＬ処理時、細胞活性阻害に影響を及ぼさないことを示すグラフである。線維芽細胞にグラフェン量子ドットをそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ処理時、Ｈ_２Ｏ_２で誘発された細胞内活性酸素除去能を示すグラフである。線維芽細胞にグラフェン量子ドットを１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ処理時、Ｈ_２Ｏ_２で誘発された活性酸素中のＯＨラジカル消去能を示す蛍光イメージである。グラフェン量子ドットを１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ処理時、濃度の増加による線維芽細胞の再生促進効果を示すイメージである。グラフェン量子ドットを１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ処理時、濃度の増加による線維芽細胞の再生促進効果を示すイメージである。グラフェン量子ドットのＵＶ照射によって増加したＭＭＰ－１の発現抑制効果を測定したグラフである。グラフェン量子ドット処理時、コラーゲン合成酵素ＣＯＬ１Ａ１の発現促進効果を示すグラフである。グラフェン量子ドット処理時、フィブリリン（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）の発現促進効果を示すグラフである。グラフェン量子ドット処理時、ヒアルロン酸合成酵素であるＨＡＳ－３の発現促進効果を示すグラフである。グラフェン量子ドット処理時、アクアポリン－３（ＡＱＰ－３）の発現促進効果を示すグラフである。

本発明者らは、グラフェン量子ドット（ＧｒａｐｈｅｎｅＱｕａｎｔｕｍＤｏｔｓ、ＧＱＤ）が皮膚細胞に毒性がないことを確認し、皮膚線維芽細胞の再生を促進させる効能を確認した。また、皮膚細胞内に生成された活性酸素除去能を示し、コラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）の発現を抑制し、ＣＯＬ１Ａ１およびフィブリリン（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）の発現を促進することにより、抗酸化およびシワ改善効果があることを確認した。また、皮膚保湿因子であるヒアルロン酸合成遺伝子ＨＡＳ－３（ＨｙａｌｕｒｏｎａｎＳｙｎｔｈａｓｅ－３）とアクアポリン－３（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－３、ＡＱＰ－３）の発現増加により、グラフェン量子ドットの保湿効果を確認した。結果として、本発明は、再生、抗酸化および保湿により抗老化効果を有するグラフェン量子ドットを有効成分として含む化粧料組成物を提供する。

本明細書内において、「老化」は、加齢に伴う老化（ｃｈｒｏｎｏａｇｉｎｇ）、または太陽への露出による老化（光老化）、極限の気候条件、タバコの煙、微細埃、化学的汚染物質などによる環境要因への露出により皮膚が経験するすべての変化を意味する。老化による皮膚の変化は、触感などによる外的な、可視的なおよび／または認識可能なすべての変化、または皮膚組織の組織学的変化を含む。老化は多様な要因によって発生しうるもので、本発明の化粧料組成物は、皮膚再生、シワ改善、保湿、および抗酸化により多様な機序で皮膚の抗老化に役立つことができる。

本明細書内の「皮膚光老化（Ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ）」は、日光露出（紫外線）によって皮膚が老化する現象を意味するものであって、長期間太陽（紫外線）に露出すると、顔、首の深シワを増加させ、また、皮膚の乾燥および皮膚表面が荒れたり、まだら、そばかすなどの色素沈着をもたらす。

本明細書内において、「細胞」は、皮膚細胞を意味し、例として、表皮に存在する角質形成細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）およびメラニン細胞（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、真皮に存在してコラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）およびエラスチン（Ｅｌａｓｔｉｎ）の生合成を担当する線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）が挙げられる。前記皮膚細胞は、好ましくは、線維芽細胞であってもよい。

本明細書内の「皮膚のシワ改善」は、皮膚のシワおよび弾力に関連する能力を維持または強化させることを意味する。皮膚真皮層の膠原線維であるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）と弾力繊維であるエラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）がそのような役割を果たす主要タンパク質として皮膚弾力を主管するが、コラーゲンの生合成は、皮膚の内外的な影響を受けるようになる。具体的には、皮膚細胞は自然老化によって細胞活性が減少すると、コラーゲン繊維の減少が起こったり、または外的要因として紫外線が過剰照射されたり、ストレスなどによって生成された活性酸素がタンパク質のチオール基（ｔｈｉｏｌ：－ＳＨ）と反応して酵素活性を阻害したり、コラーゲン、エラスチンなどの分解酵素の発現を増加させて皮膚のシワを増加させ、弾力を減少させて、皮膚の老化が進む。

本明細書において、「再生」は、損傷した部位の機能が回復することを意味する。一例として、前記再生は、細胞の直接的な供給で損傷した器官の組織が正常な機能を行うようにする細胞治療方法と細胞外生理活性物質の供給により機能回復を補助する方法を含む。

本明細書内において、「抗酸化」は、人体内の酸化的損傷を起こす活性酸素種（ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）を消去することを意味する。活性酸素種は、紫外線照射時に多量発生して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細胞膜および細胞構造に損傷をきたすので、老化の主因の一つと考えられる。

本明細書の「保湿」は、皮膚角質細胞などの水分含有量を適切に維持するようにして、弾力減少および皮膚乾燥化を阻止し、表面が荒れるのを防止することを意味する。

本明細書において、「グラフェン量子ドット（ＧｒａｐｈｅｎｅＱｕａｎｔｕｍＤｏｔｓ、ＧＱＤ）」は、導体物質であるグラフェンを半導体形態に作るために１０ｎｍ以下の大きさにした物質を意味する。本明細書内において、略語ＧＱＤと使われたりもする。グラフェン量子ドットは、その小さな大きさによって、様々な面で優れた効果を示すことができる。グラフェン由来ナノ物質は大量合成が容易であり、合成後の処理により物質の大きさ、表面電荷などを変形させることができる。また、広い表面積を有しており、必要に応じて、他の物質を付着させるのにも容易であるため、バイオ素材への多くの潜在力を持っている。

以下、前記化粧料組成物についてより詳細に説明する。

本発明の化粧料組成物は、グラフェン量子ドットを有効成分として含む皮膚再生、保湿または抗酸化用化粧料組成物である。

本発明の化粧料組成物は、グラフェン量子ドットを組成物の総重量に対して１．０×１０^－７～３０重量％含む化粧料組成物を提供する。有効成分であるグラフェン量子ドットの含有量が１．０×１０^－７重量％未満であれば、皮膚再生、保湿または抗酸化効果がわずかであり、３０重量％を超えると、含有量の増加による明らかな効果の増加が現れないからである。

グラフェン量子ドットを有効成分として含む本発明の化粧料組成物は、細胞毒性がなく、皮膚細胞に処理した結果、皮膚再生、シワ改善、保湿、抗酸化効果を示す化粧料組成物として提供可能である。本発明の化粧料組成物の有効成分であるグラフェン量子ドットは、線維芽細胞の活性酸素、なかでも特に、ＯＨラジカルを効果的に消去することにより皮膚抗酸化効果を提供し、線維芽細胞の再生を促進し、皮膚コラーゲン分解酵素であるコラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）の発現を抑制し、タイプ１プロコラーゲンおよびフィブリリン合成を促進することによりシワ改善効果を示す。また、ＨＡＳ－３および／またはＡＱＰ－３の発現を促進することにより保湿効果を示す。したがって、皮膚の老化を防止する化粧料組成物として有用に使用可能である。

本発明の化粧料組成物は、粉体（Ｐｏｗｄｅｒ）、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（Ｆｏａｍｉｎｇａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、香料、親水性または親油性活性剤からなる群より選択される１種以上、または化粧品に通常使用される任意の他の成分のような化粧品または皮膚科学分野にて通常使用される補助剤を追加的に含有することができる。前記補助剤は、化粧品または皮膚科学分野にて一般的に使用される量で導入される。さらに、本発明の組成物は、皮膚改善効果を増加させるために皮膚吸収促進物質を含有することができる。

本発明の化粧料組成物はまた、トナー剤、ローション剤およびクリーム剤からなる群より選択される１つ以上の形態に剤形化されてもよいし、その剤形が特に限定されるものではない。

他の態様として、本発明は、グラフェン量子ドットを有効成分として含む皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用医薬部外品組成物を提供する。本発明において、用語、「医薬部外品」は、人間や動物の疾病を治療、軽減、処置または予防する目的で使用される繊維、ゴム製品またはこれに類似のもの、人体への作用が弱いか人体に直接作用せず、器具または機械ではないものとこれに類似のもの、感染病の予防のために殺菌、殺虫およびこれに類似の用途に使用される製剤の一つに相当する物品であって、人間や動物の疾病を診断、治療、軽減、処置または予防する目的で使用する物品のうち器具、機械または装置ではないもの、および人間や動物の構造と機能に薬理学的影響を与える目的で使用する物品のうち器具、機械または装置ではないものを意味する。

本発明の組成物を医薬部外品添加物として使用する場合、前記組成物をそのまま添加するか他の医薬部外品または医薬部外品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適宜使用可能である。有効成分の混合量は、使用目的によって好適に決定可能である。

本発明の医薬部外品組成物はこれに制限されないが、好ましくは、ボディクレンザー、消毒清潔剤、洗浄剤、キッチン用洗浄剤、掃除用洗浄剤、歯磨き、うがい剤、ウェットティッシュ、洗剤、石鹸、ハンドウォッシュ、ヘア洗浄剤、ヘア柔軟剤、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤およびフィルタ充填剤からなる群より選択される１種以上の剤形であってもよい。本発明の医薬部外品組成物には、剤形による差異を除けば、前記化粧料組成物について説明したものと同一の内容が適用可能である。

さらに他の態様として、本発明は、グラフェン量子ドットを有効成分として含む皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用薬学組成物を提供する。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。また、本発明の薬学組成物は、経口または非経口投与可能であり、投与量は、投与対象の年齢、性別、体重、状態、疾病の程度、薬物の形態、投与経路および期間によって適宜選択可能である。

一方、本発明の一実施例による皮膚分化細胞を製造する方法は、胚幹細胞に由来する胚様体を継代培養して分化細胞を形成するステップと、前記分化細胞の成長を抑制させながら前記分化細胞を培養するステップと、前記分化細胞の培養ステップから溶液成分を回収するステップとを含む。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるため、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されない。

＜実施例１＞
製造例１：グラフェン量子ドットの製造
本実験に使用されたグラフェン量子ドット（ＧｒａｐｈｅｎｅＱｕａｎｔｕｍＤｏｔｓ、ＧＱＤ）は、２０１８年、ＮａｔｕｒｅＮａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに発表された論文［Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈ．３，８１２－８１８（２０１８）］を参照して製造した。硫酸と窒酸とが３：１の体積比率で混合された溶液にカーボンファイバー（Ｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒ）を入れた後、８０℃で２４時間撹拌しながら加熱する。以後、酸除去と真空濾過により精製し、水分を除去して、パウダー状のグラフェン量子ドットを得る。このように製造したグラフェン量子ドットは２０ナノメートル以下の多様な大きさを有することができ、本実験に使用されたグラフェン量子ドットは約３ナノメートル水準である。

このように得たグラフェン量子ドット粉末は、下記の実験例１～７における細胞効能評価のために、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）に濃度別に分散させて使用した。

実験例１：細胞毒性評価
実施例１のグラフェン量子ドットの細胞毒性評価のために、ヒトの線維芽細胞細胞株（Ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、Ｈｓ６８）における細胞数の変化を測定した。Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）を処理した細胞を陽性対照群として使用した。

まず、Ｈｓ６８線維芽細胞を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２×１０^４の数だけ分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器で２４時間培養した。以後、グラフェン量子ドット（ＧＱＤ）を含まない培地（Ｎｏｎｅ）とグラフェン量子ドットをそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１×１０^４ｎｇ／ｍＬ、１×１０^５ｎｇ／ｍＬ含む培地に切り替えた後、２４時間追加的に培養した。２４時間後、各ｗｅｌｌの培地を除去し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ）を用いたｗａｓｈｉｎｇ過程を１回経た後、各ｗｅｌｌあたり１０μｌのＣＣＫ－８（Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ、日本）試薬を含む培地に切り替えて、３７℃で４時間反応させた。以後、ＵＶ－Ｖｉｓｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞生存率（Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＧＱＤを含まない培地を処理した場合を対照群として、その平均吸光度値に対する百分率で示した。

その結果、図１に示すように、ＧＱＤを処理した場合、細胞増殖を阻害させておらず、細胞増殖促進効果があることを確認した。これにより、皮膚細胞に１×１０^５ｎｇ／ｍＬ以上で処理時にも細胞毒性がないことを確認した。

実験例２：抗酸化効能評価
細胞内で発生する活性酸素種（ＲＯＳ）と反応して蛍光を呈するＤＣＦ－ＤＡを用いて、ＲＯＳの生成量を確認することにより抗酸化力を測定した。線維芽細胞株Ｈｓ６８を６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに３．５×１０^５の数だけ分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器で２４時間培養した。以後、培地を除去し、ＤＰＢＳを入れた後、Ｃｏｎｔｒｏｌを除いた残りの細胞群にＨ_２Ｏ_２を添加した後、２４時間追加培養した。以後、光を遮断した状態でＤＣＦ－ＤＡ（１０μＭ）を入れて、３７℃で１時間染色した。その後、培地を除去した後にＤＰＢＳで２回ｗａｓｈｉｎｇした後、ｗｅｌｌごとに１ｍｌのＤＰＢＳを入れて、ｃｅｌｌｓｃｒａｐｐｅｒで掻いてＥＰｔｕｂｅに入れた。このように集めたｃｅｌｌ溶液を２００ｕｌずつ９６ｗｅｌｌｂｌａｃｋｐｌａｔｅに３回繰り返し入れた後、Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５３５ｎｍとしてＶｉｃｔｏｒ３でｐｌａｔｅｒｅａｄｉｎｇした。下記数式１のように無処理群（Ｎｏｎｅ）に対する％を計算して、細胞内ＲＯＳ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲＯＳ）を測定した結果を図２に示した。
［数１］
細胞内ＲＯＳ（％）＝
｛（ＵＶおよび試料処理群ＯＤ－ＵＶ無処理群ＯＤ）／ＵＶ無処理群ＯＤ｝×１００
（ここで、ＯＤ（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ）は吸光度単位を意味する。）

その結果、１００ｎｇ／ｍＬと１０００ｎｇ／ｍＬのＧＱＤ処理濃度においてＤＣＦ－ＤＡａｓｓａｙによるＧＱＤの細胞内ＲＯＳに対する抗酸化効能があることを確認した。

実験例３：細胞内ＯＨラジカル消去能評価
生きている細胞内のＯＨラジカルに選択的に結合して蛍光を呈するＯＨ５８０ｐｒｏｂｅを添加して、グラフェン量子ドット（ＧＱＤ）のＯＨラジカル消去能を評価した。線維芽細胞株ＨＳ６８を９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２×１０^４ずつ分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器で２４時間培養した。以後、ｐｌａｔｅを８００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、培地を除去し、ＯＨ５８０ｓｔａｉｎｗｏｒｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ（ａｂｃａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）をｗｅｌｌごとに１００ｕｌずつ処理した後、ホイルに包んで３７℃、５％ＣＯ_２で１時間反応させる。以後、ＤＰＢＳにＨ_２Ｏ_２（１００ｕＭ）をはじめとするグラフェン量子ドットをそれぞれ１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌに合わせて処理後、２時間３７℃、５％ＣＯ_２で反応させる。以後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎを除去し、ＤＰＢＳで２～３回ｗａｓｈｉｎｇした後、１００ｕＬのＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒを各ｗｅｌｌに入れて、蛍光顕微鏡で５９４ｎｍの波長で観察する。

線維芽細胞の細胞内Ｈ_２Ｏ_２誘導で生成されたＯＨラジカル消去能を蛍光顕微鏡で確認した結果、図３のように、ＧＱＤを１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で処理した場合、対照群と比較して有意な抗酸化活性を有することが確認された。

実験例４：細胞再生促進能評価
グラフェン量子ドット（ＧＱＤ）の細胞再生促進効果を評価するために、実験例１、２と同一の細胞を用いて実験を進行させた。Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ処理細胞を陽性対照群として使用した。

Ｈｓ６８線維芽細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器で２４時間培養して１００％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態にした。以後、ｐｉｐｅｔｔｅｔｉｐを用いてｗｅｌｌの真ん中を横切るように任意に掻いて傷を入れ、ＧＱＤを含まない培地とそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬのＧＱＤを含む培地に切り替えた後、２４時間追加的に培養した。２４時間後、ＧＱＤを含まない場合と含む場合とで細胞に任意に入れた傷がどの程度回復したかを顕微鏡で撮影した。

その結果、図４に示すように、ＧＱＤを処理しない場合に比べて、処理した場合で細胞再生がさらに促進されることを確認した。

実験例５：ＭＭＰ－１阻害能評価
紫外線によって増加するコラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）に対するグラフェン量子ドット（ＧＱＤ）の阻害能を比較するために、ヒト線維芽細胞株Ｈｓ６８を用いてＭＭＰ－１の発現量測定を進行させた。線維芽細胞株Ｈｓ６８を６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに３×１０^５の数だけ分注した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件の培養器で２４時間培養した。以後、培地を除去し、ＤＰＢＳを入れた後、ＵＶＢ非照射群を除いた残りの細胞群に１２ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢを照射した後、ＧＱＤを濃度別に添加して２４時間追加的に培養した。その後、各サンプルを処理した細胞からトリゾール（ＲＮＡｉｓｏ、ＤＡＫＡＲＡ、日本）を用いてＲＮＡを分離した後、ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて２６０ｎｍでＲＮＡを定量した後、それぞれ２μｇのＲＮＡを用いて増幅器でｃＤＮＡを合成した（Ｃ１０００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）。合成されたｃＤＮＡにターゲットタンパク質であるＭＭＰ－１ｐｒｉｍｅｒとシアニン染料であるサイバーグリーン（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｓｕｐｅｒｍｉｓ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を添加した混合物を用いて、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ機械でリアルタイム重合酵素連鎖反応を実施することにより、最終的にＭＭＰ－１遺伝子の発現程度を評価した。Ｐｒｉｍｅｒの配列と反応条件は下記表１の通りであり、遺伝子の発現量はβ－ａｃｔｉｎ遺伝子に対する補正により最終的に分析した。

その結果、図５に示すように、ＵＶＢ照射群でＭＭＰ－１の発現量が急激に増加したのに対し、ＧＱＤ処理群ではその発現量が減少する様子を示した。

実験例６：シワ改善効果
前記図２と図３の結果から示された抗酸化効果がヒト皮膚においてシワに重要な役割を果たすコラーゲンの生成を増加させるかを、次の方法で測定した。ヒト線維芽細胞を６ｗｅｌｌ細胞培養皿に４×１０^５の密度で接種した後、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で２４時間培養した。ＵＶＢを１２ｍＪ／ｃｍ^２照射した後、ＧＱＤを濃度別に処理し、２４時間追加培養した。その後、各サンプルの細胞からトリゾール（ＲＮＡｉｓｏ、ＤＡＫＡＲＡ、日本）を用いてＲＮＡを分離した後、ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて２６０ｎｍでＲＮＡを定量し、それぞれ２μｇのＲＮＡを用いて増幅器でｃＤＮＡを合成した（Ｃ１０００ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）。合成されたｃＤＮＡにターゲットタンパク質であるｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎｐｒｉｍｅｒとシアニン染料であるサイバーグリーンを添加した混合物を用いてｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ機械でリアルタイム重合酵素連鎖反応を実施することにより、最終的にｔｙｐｅ１ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ遺伝子の発現程度を評価した。遺伝子の発現量はβ－ａｃｔｉｎ遺伝子に対する補正により最終的に分析した。

その結果、図６に示すように、皮膚細胞にＧＱＤ処理時、ｔｙｐｅ１ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎの生成が増加したことを確認し、また、図７に示すように、フィブリリンの発現を促進することを確認した。これにより、グラフェン量子ドットが皮膚弾力およびシワ改善効果を示すことができることを確認した。

実験例７：保湿効果
グラフェン量子ドット（ＧＱＤ）の保湿効果を確認するために、ヒト線維芽細胞で発生するヒアルロン酸合成酵素の発現程度をＨｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅ－３（ＨＡＳ－３）とＡｑｕａｐｏｒｉｎ－３（ＡＱＰ－３）遺伝子発現の測定により評価した。

細胞を６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに分注し、培養２４時間後、リン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、各ｗｅｌｌにＦＢＳを入れないＤＭＥＭ培地にＧＱＤを１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した。

その結果、図８および図９に示すように、ＧＱＤ無処理群に比べて、ＧＱＤを処理した各細胞においてＨＡＳ－３（図８）とＡＱＰ－３（図９）の発現増加が促進したことを確認し、これによりＧＱＤの皮膚保湿効果を確認することができた。

＜実施例２＞
製造例２：グラフェン量子ドットを含む化粧料組成物の製造
（１）トナー剤の製造
グラフェン量子ドットを含む化粧料組成物を、下記表２に示した成分および含有量によって、通常の方法によりトナー剤に製造した。

（２）ローション剤の製造
グラフェン量子ドットを含む化粧料組成物を、下記表３に示した成分および含有量によって、通常の方法によりローション剤に製造した。

（３）クリーム剤の製造
グラフェン量子ドットを含む化粧料組成物を、下記表４に示した成分および含有量によって、通常の方法によりクリーム剤に製造した。

Claims

グラフェン量子ドットを有効成分として含む、皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用化粧料組成物。
前記グラフェン量子ドットは、化粧料組成物の総重量対比、１．０×１０^－７～３０重量％含まれることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
前記グラフェン量子ドットは、
ｉ）活性酸素消去、ｉｉ）コラゲナーゼ（ＭＭＰ－１）の発現抑剤、ｉｉｉ）タイプ１プロコラーゲン（ｔｙｐｅ１ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ）の合成促進、ｉｖ）フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）の発現増加、ｖ）ヒアルロン酸合成酵素－３（ＨＡＳ－３）の発現増加、またはｖｉ）アクアポリン－３（ＡＱＰ－３）の発現増加からなる群より選択される１つ以上の効果を提供することを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
前記化粧料組成物は、粉体（ｐｏｗｄｅｒ）、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、香料、親水性または親油性活性剤からなる群より選択される１種以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
前記化粧料組成物は、トナー剤、ローション剤、およびクリーム剤からなる群より選択される１つ以上の剤形であることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
グラフェン量子ドットを有効成分として含む、皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用医薬部外品組成物。
グラフェン量子ドットを有効成分として含む、皮膚再生、シワ改善、保湿または抗酸化用薬学組成物。