KR20190109045A

KR20190109045A - 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 줄기세포 배양액의 제조방법

Info

Publication number: KR20190109045A
Application number: KR1020180030906A
Authority: KR
Inventors: 강민석; 김상헌; 이성훈; 이명준; 이홍기; 정재언; 문남은; 윤진상; 신백수
Original assignee: 주식회사 이에이치엘바이오
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2019-09-25
Also published as: KR102029358B1

Abstract

본 발명은 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 줄기세포 배양액의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 줄기세포를 저산소 조건 하에 3차원 배양하여 얻어진 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 줄기세포 배양액의 제조방법{Cosmetic composition comprising a stem-cell culture fluid, and method for preparing the stem-cell cultee fluid}

본 발명은 줄기세포 배양액을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 줄기세포 배양액의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 줄기세포를 저산소와 고이산화탄소 조건 하에 3차원 배양하여 얻어진 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 줄기세포의 기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한

지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다. 이에 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포에 대한 관심이 고조되어, 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되고 있으며, 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다.

이러한 성체 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기 세포의 소스이지만, 다능성 줄기세포는 지방, 제대, 피부, 혈관, 근육 및 뇌 등으로부터도 획득할 수 있다(J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al, Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30:896, 2002). 성체줄기세포를 이해하는데 있어서 중요한 점은 성체줄기세포는 각각의 조직에 소량으로 존재한다는 것이다. 조직이 병에 걸리거나 손상을 받아서 성체줄기세포가 활성화 될 때 까지는 수년간 분열 혹은 증식하지 않고 잠잠하게 지낸다. 학자들은 성체줄기세포를 세포배양을 통해서 증식 시키고, 특정세포로 분화를 유도하여 우리 몸이 상처를 받거나 질병에 걸리면 사용하는 방법을 연구하고 있다.

이러한 성체줄기세포를 획득하는데 어려운 점은 성체줄기세포가 성체 조직 내에 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린되어 있는 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다는 것이다. 그렇지만 이러한 성체줄기세포 중 지방줄기세포는 간단한 지방흡입술 등으로 쉽게 얻을 수 있으며, 대표적인 성체줄기세포인 골수유래 줄기세포에 비해 세포 수득률도 500배 이상으로 높으며, 풍부한 성장인자 및 사이토카인을 포함하고 있다는 면에서 가장 이용가치가 높은 성체줄기세포로 생각된다(Rubio D, 65: 3035-3039, 2005). 줄기세포가 지니는 잠재적 이점에도 불구하고, 줄기세포의 임상 적용에는 몇 가지 제한점이 있다. 첫째, 이식된 줄기세포의 비교적 짧은 수명을 지닌다. 즉, 이식된 세포의 대부분은 이식 후 몇 일 이내에 손실된다고 알려져 있다 (Greene AK, 16:99-102, 2003; Rubio D, 3: e1398-, 2008). 무엇보다도 줄기세포의 임상적용을 방해하는 요인은 줄기세포의 악성 전환(malignant transformation)이 가능하다는 사실이다(Orlic D, 98: 10344-10349, 2001; Trento C, 140 : w13121-, 2010). 이러한 줄기세포 치료의 한계를 극복할 수 있는 방법 중의 하나는 줄기세포를 대신하여 줄기세포 분비물인 줄기세포 배양물(secretome)을 사용하는 것이다. 줄기세포 배양물은 줄기세포에서 분비되는 단백질의 총 집합으로 사이토카인, 호르몬, 및 성장인자 등을 포함한다. 최근 연구에서 줄기세포 배양물은 줄기세포의 치료 성분으로 주목을 받고 있는데, 이는 줄기세포가 손상이 발생한 미세환경(microenviroment)에 반응하여 분비하는 다양한 단백질 성분이 손상 받은 장기를 회복시키는 능력을 지닌다는 사실이 밝혀졌기 때문이다(Baglio SR, 3: 359-, 2012; Zhang W, 12: 9-18, 2002).

한편, 어떤 조건으로 줄기세포를 배양하느냐에 따라 줄기세포의 치료 효과에 큰 차이를 보인다. 이는 줄기세포의 배양조건에 따라 줄기세포 배양물의 분비량과 구성 성분에 차이를 보일 수 있음을 시사한다. 줄기세포를 이용한 통상적인 실험은 항상 정상 산소분압(산소 21%)하에서 이루어진다. 하지만, in vivo 환경 즉, 줄기세포가 실제 신체 내에서 작용할 때는 산소분합이 매우 낮은 것으로 알려져 있다(Marcos A, 69 : 1375-1379, 2000). Liu 등(Kiuchi T, 67: 321-327, 1999)과 Rosova 등(Banas A, 26: 2705-2712, 2008)은 in vivo 환경과 같이 저산소 환경을 제공하여 줄기세포를 배양했을 때 세포의 성장과 분화 및 신생혈관생성을 유도되었고, 줄기세포의 치료 효과도 상승되었다고 보고하였다. 또한 중간엽줄기세포의 경우 부착하여 생존하는 특성 때문에 평평한 바닥이 있는 플라스크에서 2차원으로 부착식 배양 (adhesion culture)을 한다. 종래의 방법에서는 줄기세포를 단순히 2차원 배양하거나, VEGF 등의 함량을 높이기 위해 저산소 조건에서 2차원 배양을 실시하고 있을 뿐으로, 무혈청 배지에서는 줄기세포가 안정적으로 유지되기 어렵다는 점을 고려할 때 줄기세포 배양액의 생리적 활성도가 저하되는 문제점이 있었다. 즉, 2차원 배양에서는 저산소 조건을 주더라도 배양액 중 함유되는 VEGF 등의 함량을 높이는 데 한계가 있다.

이에 본 발명자들은 고함량의 사이토카인 및 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액을 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 줄기세포를 저산소 조건 하에서 3차원 배양하는 경우 줄기세포 증식률이 증가하고 줄기세포 배양액 내 사이토카인 및 세포성장인자의 함량이 증가함을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 줄기세포를 저산소 조건뿐만 아니라 고이산화탄소 조건 하에 3차원 배양하는 경우 줄기세포 증식률이 현저히 증가하고 줄기세포 배양액 내 사이토카인 및 세포성장인자의 함량이 현저히 증가함을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 줄기세포를 저산소 조건 하에 3차원 배양하여 얻어진 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 줄기세포를 저산소 조건 하에 3차원 배양하여 얻어진 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 및 치료용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 줄기세포를 저산소 조건 하에 3차원 배양하여 얻어진 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 및 치료용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “줄기세포”는 증식하는 줄기세포를 의미한다. 상기 줄기세포는 골수 줄기세포, 제대 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있으며, 인체 유래 또는 동물이나 식물 유래 줄기세포일 수 있고, 예를 들면 인체 지방유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells; MSCs)"는 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화된 성체줄기세포를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "저산소(hypoxia)"는 통상적인 정상산소 조건인 산소 분압 21%에 비해 낮은 산소 분압 상태를 의미할 수 있다. 상기 저산소 조건은 5 내지 15%, 8 내지 12%, 예를 들면, 10%일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "스페로이드(spheroid)"는 3차원 세포집합체(3D cell mass, 3DCM)라고 알려진 세포괴로서, 하나의 개체가 분열하여 생긴 다수의 딸개체가 모여 형성된 구형 군체를 의미한다

제1구현예에 따르면, 본 발명은

a) 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및

b) 상기 줄기세포를 저산소 조건 하에서 3차원 스페로이드 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 파부섬유아세포(HDF), 인간 피부각질세포(HEK) 또는 인간 모낭세포(HDP)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 비타민 또는 그 유사체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 무혈청 배지에 포함되는 비타민 또는 그 유사체는 비타민 A, B, C, D 및 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 비타민A(2uM), 비타민C(100μg/ml) 및 비타민D(50nM)이 사용되었다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 FBS(fetal bovine serum), bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-β 1(transforming growth factor β-l), PDGF(platelet-derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 또는 IFG- 1. (insulin-like growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 저산소 조건은 1% 내지 15%의 산소분압인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 단계 b)는 5% 내지 15%의 이산화탄소의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약제학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

제2구현예에 따르면, 본 발명은

a) 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및

b) 상기 줄기세포를 저산소 조건 하에서 3차원 스페로이드 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료용 식품 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 파부섬유아세포(HDF), 인간 피부각질세포(HEK) 또는 인간 모낭세포(HDP)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 비타민 또는 그 유사체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 무혈청 배지에 포함되는 비타민 또는 그 유사체는 비타민 A, B, C, D 및 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 비타민A(2uM), 비타민C(100μg/ml) 및 비타민D(50nM)이 사용되었다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 FBS(fetal bovine serum), bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-β 1(transforming growth factor β-l), PDGF(platelet-derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 또는 IFG- 1. (insulin-like growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 저산소 조건은 1% 내지 15%의 산소분압인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 단계 b)는 5% 내지 15%의 이산화탄소의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다. 그 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

제3구현예에 따르면, 본 발명은

a) 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및

b) 상기 줄기세포를 저산소 조건 하에서 3차원 스페로이드 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 파부섬유아세포(HDF), 인간 피부각질세포(HEK) 또는 인간 모낭세포(HDP)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 비타민 또는 그 유사체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 무혈청 배지에 포함되는 비타민 또는 그 유사체는 비타민 A, B, C, D 및 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 비타민A(2uM), 비타민C(100μg/ml) 및 비타민D(50nM)이 사용되었다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 FBS(fetal bovine serum), bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-β 1(transforming growth factor β-l), PDGF(platelet-derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 또는 IFG- 1. (insulin-like growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 저산소 조건은 1% 내지 15%의 산소분압인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 단계 b)는 5% 내지 15%의 이산화탄소의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 상처 부위로 세포 이동을 촉진하여 우수한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 활성을 갖는다. 피부 투과도가 우수하면서, 흡수 시 피부 보습, 피부 미백, 주름 개선 및 노화 방지 등의 피부 개선 효과가 우수할 뿐만 아니라, 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다. 또한, 본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 발모 및 육모 효과가 우수하여 탈모의 방지 및 치료 효과가 뛰어나며, 이를 섭취하거나 피부에 도포하여도 부작용이 없이 안전하다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 줄기세포 배양액 선별시험 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 3에 따른 저산소 및 3차원 배양 조건 하에서 세포 증식 시험 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 4에 따른 상처 회복능 시험 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 5에 따른 배양액 유효성분 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 6에 따른 창상동물모델에서 배양액 유효 시험 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 6에 따른 창상동물모델에서 배양액 유효 시험 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1. 줄기세포 배양액 선별시험

다양한 배양액 구성성분에 따른 최적의 배지 구성성분을 선별하기 위하여 인간 파부섬유아세포(HDF), 인간 피부각질세포(HEK), 인간 지방 줄기세포(ADSC)를 96-well plate(SPL)에 각각 200개씩 10% FBS(Gibco)가 포함된 DMEM(Gibco) 배지 100μl로 접종하여, 37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 상등액을 제거한 뒤 PBS(Gibco)를 200μl씩 첨가하여 3회 세척하였다. PBS를 제거하고 하기의 표 1에 따라 6종의 배양액을 100μl씩 첨가하여 72시간동안 37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 배양하였다.

	기본배지	조성
Media 1	DMEM	10% FBS(우태아혈청)
Media 2	α-MEM	5% FBS
Media 3	α-MEM	5% FBS, 비타민A(2uM), 비타민C(100μg/ml), 비타민D(50nM)
Media 4	α-MEM	1% 인간 알부민, 비타민C(100μg/ml), 비타민D(50nM)
Media 5	α-MEM	1% 인간 알부민, 인슐린(1mg/mL), 트렌스페린(0.55mg/mL), Lipid concentrate(0.1%), 비타민A (2uM)
Media 6	α-MEM	1% 인간 알부민, 인슐린(1mg/mL), 트렌스페린(0.55mg/mL), Lipid concentrate(0.1%), 비타민A (2uM), 비타민C(100μg/ml), 비타민D(50nM)

72시간 배양한 다음, CCK-8(Cell counting kit-8, Sigma) 시약을 10μl씩 well에 첨가하여 2시간동안 추가배양한 후, 마이크로 플레이트 판독기(Eon, BioTek)로 450nm에서의 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 1에 나타내었다.

그 결과, Media 3으로 배양한 경우 피부세포뿐만 아니라 지방줄기세포에서도 높은 증식률을 나타냈으며(도 1a) 인간 지방 줄기세포의 경우에도 Media 3 배양액에서 가장 높은 세포 증식률을 나타내었다(도 1 b). 본 실험 결과를 바탕으로 Media 3 배양액으로 줄기세포를 배양했을 때, 3차원 스페로이드 형성시 배양기간을 단축할 수 있고, 최종적으로 피부재생에 최적화된 배양물을 생산할 수 있다고 판단하였다.

실시예 2. 저산소 및 3차원 배양

2-1. 스페로이드 제조

배양된 줄기세포에 효소(TrypLE EXPRESS, Gibco) 처리하여 회수한 뒤, 6X10⁸개의 세포를 계수하여 3X10⁸개씩 50ml 튜브(SPL) 2개에 분주하였다. 분주된 세포 펠렛에 생리식염수(0.9%)를 첨가하여 세척한 뒤, 1500rpm에서 5분간 원심 분리하고 상등액을 제거하였다. 세척 과정은 2회 반복하였다. 각 튜브의 세포 펠렛에 30ml의 스페로이드 제조 배지(표 1 Media 3)를 첨가하여 5X10⁷/5ml의 농도가 되도록 세포를 부유시키고, 5ml씩 50ml 튜브 12개에 분주하였다. 5ml의 세포 부유액 (5X10⁷/5ml)에 30% F-127 하이드로젤 용액을 25ml 첨가하여 총 30ml이 되도록 세포와 혼합하였다. 세포와 혼합된 용액 30ml을 초저부착 플라스크(ULA T75 flask, Corning)에 천천히 분주하여 하기의 표 2에 따라 스페로이드 형성 조건별로 1시간 동안 배양 하였다.

실험군	세포	스페로이드 형성 조건	스페로이드 배양액 생산 조건
ADS 1	지방유래 줄기세포	Normoxia	37°C, 20% O₂, 5%CO₂
ADS 2	지방유래 줄기세포	Hypoxia 2%	37°C, 1% O₂, 5%CO₂
ADS 3	지방유래 줄기세포	Hypoxia 2%	37°C, 2% O₂, 10%CO₂
UCS 1	제대 줄기세포	Normoxia	37°C, 20% O2, 5% CO2
UCS 2	제대 줄기세포	Hypoxia 2%	37°C, 1% O₂, 5%CO₂
UCS 3	제대 줄기세포	Hypoxia 2%	37°C, 2% O₂, 10%CO₂

1시간 경과 후 용액이 젤화 되면 37℃의 스페로이드 제조 배지를 5ml 첨가한 뒤, 37℃ 가습 배양 조건에서 5일 동안 배양하여 스페로이드를 제조하였다.

2-2. 스페로이드 회수

각 실험군별 스페로이드가 포함된 F-127 젤을 상온에서 10분간 인큐베이션 하여 액상화 시킨 후, 여기에 생리식염수를 동일 용량으로 첨가하여 각각 50 ml 튜브에 나누어 회수하였다. 800rpm에서 5분간 원심 분리하여 상등액을 제거한 뒤, 생리식염수를 50ml 첨가하여 스페로이드를 세척한다. 세척 과정은 2회 반복하였다.

2-3. 스페로이드 배양액 생산

각 회수된 스페로이드를 실험군별로 3L 폴리카보네이트 에를렌마이어 플라스크(3L polycarbonate Erlenmeyer flask, Corning)에 분주하고, 각 실험군별 배양액 생산 조건(표 2)으로 배양하였다. 이 때 사용한 스페로이드 배양액 생산배지는 상기 표 1의 Media 6로 하고 배지용량은 2L로 하였다. 스페로이드 배양액 생산은 37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 25rpm 속도로 10일간 진탕 배양하였다. 스페로이드 배양액은 2일마다 2L 전량 회수하며, 새로운 스페로이드 배양액 생산 배지로 교체하였다. 10일간 총 5회 회수한 배양액은 10L bottle에서 균질화를 하여 냉장 보관하였다.

실시예 3. 세포 증식 시험

최적의 저산소 및 3차원 배양조건을 선별하기 위하여 인간 파부섬유아세포(HDF), 인간 피부각질세포(HEK), 인간 모낭세포(HDP)를 96-well plate(SPL)에 각각 200개씩 10% FBS(Gibco)가 포함된 DMEM(Gibco) 배지 100μl로 접종하여, 37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 상등액을 제거한 뒤 PBS(Gibco)를 200μl씩 첨가하여 3회 세척하였다. PBS를 제거하고 상기 표 2의 조건으로 생산된 6종의 배양액을 100μl씩 첨가하여 72시간동안 37℃, 5% CO₂의 가습 배양 조건에서 배양하였다. 72시간 배양 후 CCK-8(Cell counting kit-8, Sigma) 시약을 10μl씩 well에 첨가하여 2시간동안 추가배양한 후, 마이크로 플레이트 판독기(Eon, BioTek)로 450nm에서의 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 정상산소분압 조건 보다 저산소 배양으로 생산된 배양액이 HDF 증식을 34%(지방줄기세포), 23%(제대줄기세포) 증가시켰으며, HEK는 21%(지방줄기세포), 23%(제대줄기세포) 및 HDP는 59%(지방줄기세포), 12%(제대줄기세포) 더 증식되는 것으로 확인되었다. 또한, 5% 이산화탄소 배양 조건(ADS2, UCS2)에서 더욱 높은 피부세포 증식률을 나타냄에 따라, 피부세포 증식률에 있어서 산소분압 뿐만 아니라 이산화탄소 분압도 관여하는 것으로 확인되었다.

실시예 4. in vitro 상처 회복능 시험

인간 피부 및 모낭세포를 24-well plate(SPL)에 상처회복능 시험용 인서트(scrach assay kit, Ibidi)를 삽입하고, 5X10³개의 세포를 100μl의 10% FBS(Gibco)가 포함된 DMEM(Gibco) 배지로 접종하여, 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 가습 배양 조건에서 배양하였다. 24시간 배양 후 핀셋을 사용하여 인서트를 제거하여 well plate 중앙에 상처(scratch)를 만든 뒤, 상등액을 제거하고 PBS(Gibco)를 1ml씩 첨가하여 3회 세척하였다. PBS를 제거하고 각 조건(<표2.>)의 배지를 1ml씩 첨가하여, 24시간동안 37℃, 5% CO2의 가습 배양 조건에서 배양하며 6시간 간격으로 현미경 관찰을 통해 세포 재생률을 확인하고 사진을 촬영하고 이를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 정상산소분압 조건(ADS1, USC1) 보다 저산소 배양으로 생산된 배양액(ADS2, ADS3, UCS2, UCS3)이 HDF, HEK 및 HDP의 상처회복능을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, 10% 이산화탄소 배양 조건이 5% 이산화탄소 배양조건 보다 상처회복능이 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 5. 배양액 유효성분 분석

ADS1 스페로이드 배양액과 ADS3 스페로이드 배양액의 성분을 확인하기 위하여 Proteome Profiler Human Cytokine Array (R&D systems, ARY005B)로 분석하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과, ASC spheroid를 낮은 O₂농도와 높은 CO₂농도에서 배양하여 배양액을 제조하는 경우에는 MIP-1 (Macrophage inflammatory protein-1), G-CSF, IL-1b, IL-1r의 발현이 증가하였고, SDF-1의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. MIP-1α(CCL3)와 MIP-1β(CCL4)는 감염과 염증에 대한 면역반응에 중요한 cytokine으로 granulocytes (neutrophils, eosinophils and basophils)를 활성화시키며, fibroblast와 macrophage로부터 IL-1. IL-6, TNF-a 분비를 촉진하는 cytokine이다. 또한 G-CSF는 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)의 이동 촉진하고 IL-1은 감염에 대한 염증반응을 유도하는 cytokine이며 IL-1r는 IL-1α와 IL-1β에 대한 antagonist로 염증반응 조절하는 역할을 한다. SDF-1는 lymphocyte와 MSC의 chemotaxis를 유도하는 cytokine으로, 특히 성인의 angiogenesis 과정에서 골수로부터 endothelial progenitor cells (EPCs)을 유도하는 작용을 한다고 알려져 있다.

실시예 6. 창상동물모델에서 배양액 유효성 시험

Hairless 마우스의 등부분 양쪽에 5mm biopsy punch로 피부를 펀칭하여 각 시험 배양액(표 2) 처치군 별로 6마리씩 창상동물모델을 제작한 후, 왼쪽 등에는 바셀린 0.01g(control), 오른쪽 등에는 바셀린 0.01g+ 시험배양액 10ul mixer를 2일 간격으로 도포하였다. 상처부위는 각 시험물질을 처리한 후, 1.2cmX1.2cm 크기의 테가덤(Tegaderm^tm)으로 1차로 부착하고 떨어지는 것을 방지하기 위하여 3cm x 6cm 크기의 테가덤(Tegaderm^tm)으로 추가로 부착하였다. 각 군별 창상부위의 넓이는 2일 간격으로 기록하고, 0, 4, 10, 14일째 각 군별 창상부위의 사진을 촬영하였다(도 5). 각 군별 마우스들을 sacrifice 하기 전, 심장에서 채혈한 뒤 1.5ml tube에서 30분 동안 배양 후 13000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상층액의 혈청만 취하여 cytokine array를 수행하였다(도 6).

그 결과, 1% 산소 10% 이산화탄소 조건에서 생산된 지방줄기세포 스페로이드 배양액으로 처치한 군에서 상처면적이 50%이상 줄어들었으며 나머지 군에서는 유의적인 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다. 또한 각 군별 혈청내 cytokine을 분석한 결과, ADS1과 ADS-3를 처리한 마우스의 혈청에서 IL-5, CCL-17, TNF-a, CXCL-2가 증가하는 것으로 확인되었다. IL-5는 pro-inflammatory cytokine으로 상처 부위로 호산구(eosinophils)의 침투를 유도하여 감염을 제거하는 작용을 증가시키고 [Leitch VD, et al., Immunol Cell Biol. 87 (2009) 131] CCL-17은 fibroblast의 이동을 촉진하여 상처치료를 증진시킨다고 알려져 있다. [Kato T. et al., Exp. Dermatol. 20 (2011) 669] TNF-a는 상처치료의 초기단계에 관여하는 cytokine이고 [Ritsu, M. et al., J Dermatol Dermatol Surgery, 21 (2017) 14] CXCL-2는 상처치료 과정의 angiogenesis에 관여하는 cytokine으로 알려져 있다 [Ding, et al., Adv Wound Care (New Rochelle) 4 (2015) 673].

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

a) 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 줄기세포를 저산소 조건 하에서 3차원 스페로이드 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양액을 유효성분으로 함유하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간 파부섬유아세포(HDF), 인간 피부각질세포(HEK) 또는 인간 모낭세포(HDP)인 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 무혈청 배지에 포함되는 비타민 또는 그 유사체는 비타민 A, B, C, D 및 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 무혈청 배지는 FBS(fetal bovine serum), bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), TGF-β 1(transforming growth factor β-l), PDGF(platelet-derived growth factor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(hepatocyte growth factor) 또는 IFG- 1. (insulin-like growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 저산소 조건은 1% 내지 15%의 산소분압인 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단계 b)는 5% 내지 15%의 이산화탄소의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.