KR102624390B1 - 스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 시크리톰 생산 방법 - Google Patents
스피룰리나를 이용한 중간엽줄기세포에서의 시크리톰 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 스피룰리나를 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 시크리톰 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 스피룰리나를 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 시크리톰 생산 방법에 관한 것이다.
여러 가지 성체줄기세포 (adult stem cell) 중에 하나인 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)는 복부 지방조직 (abdominal fat tissue), 탯줄 (umbilical cord), 제대혈 (umbilical cord blood), 태반 (placenta), 치아펄프 (teeth pulp) 등 우리 몸의 다양한 조직에 광범위하게 분포되어있으며, 손상 및 마모된 조직을 재생시키고 필요에 따라 여려가지 성장인자, 싸이토카인 등의 유효 단백질을 발현하여 각 조직의 정상적인 작용을 유지하고 나아가 개체의 항상성(homeostasis)을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다.
중간엽줄기세포는 1970년대에 골수에서 콜로니 단일체 (colony forming unit)로 처음 발견되었으며, 다양한 세포로 분화가 가능한 분화능 (differentiation properties)를 가지고 있어 많은 연구가 진행되어왔다. 이런 중간엽줄기세포의 뼈, 연골, 근육 등으로 분화하는 분화능을 이용하여, 귀나 코의 연골, 심근조직, 간, 치아를 포함한 각종 뼈, 방광, 요도, 피부 등의 바이오 장기를 개발하여 손상된 장기를 대체 이식하려는 조직공학적 연구 및 노력을 많이 기울였으나, 환자 치료에 적용하기 까지는 더욱 많은 연구 개발이 필요한 상황이다.
많은 연구가 중간엽줄기세포의 분화능을 이용한 각종 장기 및 신체조직 개발에 집중되어 있었지만, 많은 노력에도 불구하고 뚜렷한 성과를 거두지 못하고 있던 중, 2000년대 이후, 중간엽줄기세포의 기질세포 특성 (stromal property)이 발견되었으며, 이에 대한 연구가 집중되면서부터 중간엽줄기세포의 개발에 대한 관심이 중간엽줄기세포의 분화능 보다는 기질세포 특성을 치료제 개발에 응용하는 방향으로 바뀌게 되었다.
중간엽줄기세포는 인체 내 다양한 조직에 존재하며 여러 가지 유용 단백질을 발현 및 분비하는 기질세포의 특성을 가지고 있다. 중간엽줄기세포는 체내의 다양한 자극이나 환경의 변화에 따라 다양한 성장인자 (growth factors) 및 사이토카인(cytokine)을 발현 분비하고 주위 세포와의 복잡한 상호작용 및 메커니즘(molecular interaction and mechanism)에 의한 개체의 항상성 유지에 가장 중요한 역할을 한다. 이와 같은 중간엽줄기세포의 개체의 항상성을 유지시켜주는 기질세포 특성을 이용하여, 아직 마땅한 치료제가 개발되지 않은 여러 자가면역 질환을 비롯한 난치병의 치료제 개발에 응용되고 있다.
중간엽줄기세포 치료제는 크게 자가세포치료제와 동종세포치료제 두 가지로 나눌 수 있다. 현재까지 자가 골수유래 중간엽줄기세포를 이용한 급성심근경색과 루게릭병 치료제, 자가 지방유래 중간엽줄기세포를 이용한 크론성누공, 동종 제대혈유래 중간엽줄기세포를 이용한 무릎연골결손 치료제, 동종 골수유래 중간엽줄기세포를 이용한 급성이식편대숙주병 등의 몇몇 질병의 치료제가 임상 3상을 마치고 품목허가(Biologics License Application; BLA)를 획득하여 임상치료에 사용되고 있다. 그러나, 줄기세포 치료제의 안정성에 대한 인식의 부족과 너무 높은 치료비의 부담 때문에 시장의 점유율은 미미한 상태이다.
이러한 중간엽줄기세포의 한계점인 안정성에 대한 우려와 고비용의 문제점에 대한 대안으로 줄기세포가 분비하는 여러 성장인자나 사이토카인 등 유용 단백질을 함유한 시크리톰(세포로부터 세포 배양액에 분비된 모든 물질의 총체적 집합)을 무균상태에서 생산된 줄기세포 배양액으로부터 추출 또는 농축하여 다양한 질병 치료 및 미용에 이용하는 방법의 개발이 활발히 진행되고 있다.
그러나 기존의 시크리톰 생산 방법은 세포를 한번 배양하여 배양액을 회수하는 횟수가 한두 번으로 제한적이어서 세포 사용 및 시크리톰 회수율의 효율성이 무척 낮은 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 스피룰리나를 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함함으로써, 세포를 한번 배양하여 14회까지 그 배양액을 회수할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 스피룰리나를 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 시크리톰 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 시크리톰 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법은 기존의 시크리톰 생산 방법에 비해 시크리톰 회수의 효율이 획기적으로 증가되었다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 하기의 단계를 포함하는 시크리톰 생산 방법에 관한 것이다.
일반 세포성장 배지(growth medium; GM)에서 중간엽줄기세포를 배양용기 표면의 80 내지 90%까지 배양하는 단계 제1 배양 단계; 및
스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 제2 배양 단계.
상기 제1 배양 단계에서 배양용기 표면의 80 내지 90%까지 배양하지 않으면 세포 수가 너무 적어 시크리톰 생산량이 줄어들고, 이를 초과하면 세포들이 배양용기 표면에 붙어있지 못하고 뜨게 되어 사용할 수 없게 된다.
상기 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 포함되지 않은 DMEM/F-12인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생산 방법은 제1 배양 단계 이 후에 중간엽줄기세포를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 세척은 인산완충용액(PBS)로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제2 배양 단계는 24 내지 48 시간, 24 내지 42 시간, 24 내지 36 시간, 24 내지 30 시간, 예를 들어, 24시간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생산 방법은 제2 배양 단계 이 후에 세포 상층의 배지를 회수하는 회수단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 생산 방법은 제2 배양 단계 및 회수 단계를 반복 수행하는 것일 수 있다.
상기 반복 수행은 1 내지 14회, 2 내지 14회, 3 내지 14회, 4 내지 14회, 5 내지 14회, 6 내지 14회, 7 내지 14회, 8 내지 14회, 9 내지 14회, 10 내지 14회, 11 내지 14회, 12 내지 14회 또는 13 내지 14회, 예를 들어, 14회 반복 수행하는 것일 수 있다.
상기 생산 방법은 제2 배양 단계 및 회수 단계를 8회 이상, 9회 이상, 10회 이상, 11회 이상, 12회 이상, 13회 이상, 예를 들어, 14회 반복 수행하여도 회수된 세포상층액에 포함된 시크리톰 단백질 농도가 50 ug/ml 이상, 45 ug/ml 이상, 40 ug/ml 이상, 35 ug/ml 이상, 30 ug/ml 이상, 25 ug/ml 이상 또는 20 ug/ml 이상, 예를 들어, 18.9 ug/ml 이상인 것일 수 있다.
스피룰리나는 남조류(blue-green algae)의 일종으로, 학명은 사이노박테리아(Cyanobacteria 또는 Spirulina maxima)로 분류되고, 건조된 무게(dry weight)의 약 60%가 단백질이며 많은 비타민과 무기질 등 인체에 필요한 거의 모든 영양소가 고루 들어 있는 완전 식품 중의 하나로 널리 알려져 있는 해조류이다.
또한, 스피룰리나는 혈액순환, 항염증, 항알러지, 미백 등의 생물학적 활성을 나타내는 물질을 함유하고 있는 안정성이 입증된 천연 물질로 건강 보조 식품 및 화장품의 원료로도 많이 활용되고 있다.
스피룰리나 추출물은 하기 방법으로 제조하였다.
건조 분말 스피루리나 원물에 70% 에탄올을 10배수를 넣어 8시간 초음파 처리 후, 65℃ 에서 4시간 추출하고, 추출물을 여과지(Hyundai Micro No.51)를 사용하여 감압여과 하였다. 여과지를 통과한 액상은 45℃ 에서 감압농축 후 동결건조 하여 스피룰리나 추출물을 만들었다. 해당 추출물을 3차증류수에 녹여 1% 용액을 만든 후, 0.22um 필터 유닛을 이용하여 무균상태의 스피룰리나 추출용액을 만들었다.
상기 스피룰리나 추출용액의 농도는 0.01 내지 3.0 mg/ml, 0.01 내지 2.8 mg/ml, 0.01 내지 2.6 mg/ml, 0.01 내지 2.4 mg/ml, 0.01 내지 2.2 mg/ml, 0.01 내지 2.0 mg/ml, 0.01 내지 1.8 mg/ml, 0.01 내지 1.6 mg/ml, 0.1 내지 3.0 mg/ml, 0.1 내지 2.8 mg/ml, 0.1 내지 2.6 mg/ml, 0.1 내지 2.4 mg/ml, 0.1 내지 2.2 mg/ml, 0.1 내지 2.0 mg/ml, 0.1 내지 1.8 mg/ml, 예를 들어, 0.1 내지 1.6 mg/ml인 것일 수 있다.
이 외에도 스피룰리나 추출물 제조 방법에는 물을 이용하여 추출하는 방법, 마이크로플루이다이저(Microfluidizer)를 이용하여 추출하는 방법, 라이소자임(Lisozyme) 및 소화효소를 이용하여 추출하는 방법 등이 있으며 어느 한 방법에 한정하는 것은 아니다.
우리 인체에는 다양한 중간엽줄기세포가 존재하며, 각 중간엽줄기세포는 주어진 환경과 자극에 따라 서로 다른 시크리톰을 분비하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명의 중간엽줄기세포는 제대유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC), 지방유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC), 골수유래 줄기세포, 치아펄프유래 줄기세포 및 태반유래 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 지방유래 중간엽줄기세포 또는 제대유래 중간엽줄기세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 중간엽줄기세포를 배양하여 얻어지는 시크리톰의 생산 정도를 확인하기 위하여 지표물질로 간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)와 인터루킨-8(IL-8)을 사용하였다.
상기 간세포성장인자는 성체 내 다양한 조직의 기질세포에서 분비되며, 발생과정에서 상피-간엽 상호작용의 매개체로서 각종 내장기관 골격계 및 태반의 형성에 관계하는 성장인자이며, 손상된 피부의 재생에 깊이 연관되어 있다.
이러한 간세포성장인자는 피부에 손상이 발생되면 호중구(neutrophils), 단핵구(monocytes), 비만세포(mast cells) 등이 상처 주위로 모여드는 것을 촉진시켜 상처 주위의 감염을 막아주고, 내상피세포와 케라티노사이트(keratinocyte)의 환부로의 이동 및 증폭을 촉진하여 상처주위의 혈관신생을 도와 환부에 새로운 상피형성을 재생시키는 데 중요한 역할을 담당하며, 다양한 내장기관 및 내장기관의 내상피세포의 재생에 필수적인 인자로써 다양한 장 질환의 치료제로 개발이 기대되는 물질이다.
상기 인터루킨-8(IL-8)은 CXCL-8 유전자에 의하여 전사되어 합성된 사이토카인으로써, IL-8 및 IL-8 수용체는 바이러스나 병원균의 감염 시 상피세포(epithelial cell)나 내피세포(endothelial cell)에서 생성되어 대식세포(macrophages), 중성구(neutrophil) 등의 면역 세포들이 감염된 부위로 이동(chemotactic)하는 것을 도우며, 이들 세포의 식세포활동(phagocytosis)을 촉진시켜 감염된 바이러스나 병원균을 제거하는데 중요한 역할을 한다.
감염에 의하여 IL-8의 농도가 높아지면 대식세포나 중성구 등 면역세포의 활동이 증가하여 자연적으로 감염부위에 염증반응이 일어나기 때문에, IL-8은 염증인자(pro-inflammatory agent)로 알려져 있다.
최근에 IL-8은 톨-라이크 수용체 3(Toll-like receptor 3: TLR3)의 리간드인 폴리리보이노신익-폴리리보씨키딜릭산(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid; poly I:C)에 의하여 생성되어, 피부 상피(epidermis)의 케라티노사이트(epidermis)로 변하는 하켓세포(HaCaT cell)의 이동을 유도하여 상처치료에 크게 기여함이 밝혀졌다.
이 작용은 IL-8의 항체를 넣어주면 상처치료가 지연되는 결과를 초래함으로써 IL-8이 상처치료에 중요한 역할을 하고 있음을 다시 한번 입증되었다. IL-8은 이 외에도 혈관신생에도 중요한 역할을 하며 특히 종양의 형성에도 관련된 것으로 알려져 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 시크리톰을 포함하는 상처 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 상처는 다양한 원인에 의해서 발생할 수 있으며, 의학용어로는 창상이라고도 한다.
상기 창상은 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되는 질병을 의미하여, 예를 들어, 찰과상, 타박상, 열상, 칼날에 의한 절창, 자창, 할창, 총창, 폭창 및 교창이 있다. 창상의 형태로는 표피박리창, 피하출혈, 좌상, 좌창, 변상창 등이 있으나, 크게 나누면 폐쇄창과 개방창으로 나누어진다.
이러한 창상은 일반적으로 상해를 받은 세포의 변성 및 사멸, 주위의 조직으로부터의 유주세포 및 조직액의 유출, 섬유소의 석출과 육아조직의 형성의 순서로 치료되게 된다.
상기 약제학적 조성물은 시크리톰의 약제학적 유효량을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물의 투여량은 1일 당 0.0001 내지 1000 ug(마이크로그램, 0.001 내지 1000 ug, 0.01 내지 1000 ug, 0.1 내지 1000 ug, 또는 1.0 내지 1000 ug일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 시크리톰을 포함하는 피부상태 개선용 화장품 조성물에 관한 것이다.
상기 피부상태 개선이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미하며, 예를 들어, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처 제거, 여드름 개선, 피부재생 또는 미백인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장품 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및/또는 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부상태 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 시크리톰과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 시크리톰을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 피부상태 개선이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미하며, 예를 들어, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처 제거, 여드름 개선, 피부재생 또는 미백인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품은 각종 식품, 음료, 식품 첨가제 등일 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 시크리톰의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
상기 식품이 음료인 경우에는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 시크리톰을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한 점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등, 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.
상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 중간엽줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 시크리톰 생산 방법에 관한 것으로, 상처치료, 피부 미백 효과를 나타내는 시크리톰을 대량 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC가 CD73을 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC가 CD90을 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC가 CD105를 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC가 CD31을 발현하지 않음을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 USC가 CD73을 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 USC가 CD90을 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시에에 따라 USC가 CD105를 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 USC가 CD31을 발현하지 않음을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라 무혈청배지에 첨가된 스피룰리나 추출물의 ASC에 대한 세포독성 시험(MTT assay)의 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 무혈청배지에 첨가된 스피룰리나 추출물의 USC에 대한 세포독성 시험(MTT assay)의 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC를 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청배지(SFM+SE) 또는 무첨가된 무혈청배지(SFM-only)에서 1일 배양 후 관찰한 ASC와 USC의 현미경 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC를 SFM+SE 또는 SFM-only 배지에서 8일 배양 후 현미경으로 관찰한 ASC와 USC의 현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC를 SFM+SE 또는 SFM-only 배지에서 13일 배양 후 현미경으로 관찰한 ASC와 USC의 현미경 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 날자 별로 수확한 ASC 시크리톰의 단백질 농도 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜 별로 수확한 USC 시크리톰의 단백질 농도 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 스리룰리나를 첨가하여 생산한 ASC와USC 시크리톰의 단백질 농도를 날짜별로 비교한 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 ASC 시크리톰의 HGF 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 USC 시크리톰의 HGF 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 ASC 시크리톰의 IL-8 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 USC 시크리톰의 IL-8 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 스피룰리나 추출물을 첨가하여 생산한 USC 시크리톰(USCsecretome(SFM+SE))의 HGF와 IL-8의 발현 패턴을 비교한 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC 시크리톰의 미백효과를 확인한 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC 시크리톰의 상처회복 효과(Wound healing)를 확인한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC가 CD90을 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC가 CD105를 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ASC가 CD31을 발현하지 않음을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 USC가 CD73을 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 USC가 CD90을 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시에에 따라 USC가 CD105를 발현함을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 USC가 CD31을 발현하지 않음을 확인하는 유동세포분석(flow cytometry) 결과 그래프이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라 무혈청배지에 첨가된 스피룰리나 추출물의 ASC에 대한 세포독성 시험(MTT assay)의 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 무혈청배지에 첨가된 스피룰리나 추출물의 USC에 대한 세포독성 시험(MTT assay)의 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC를 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청배지(SFM+SE) 또는 무첨가된 무혈청배지(SFM-only)에서 1일 배양 후 관찰한 ASC와 USC의 현미경 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC를 SFM+SE 또는 SFM-only 배지에서 8일 배양 후 현미경으로 관찰한 ASC와 USC의 현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC를 SFM+SE 또는 SFM-only 배지에서 13일 배양 후 현미경으로 관찰한 ASC와 USC의 현미경 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 날자 별로 수확한 ASC 시크리톰의 단백질 농도 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜 별로 수확한 USC 시크리톰의 단백질 농도 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 스리룰리나를 첨가하여 생산한 ASC와USC 시크리톰의 단백질 농도를 날짜별로 비교한 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 ASC 시크리톰의 HGF 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 USC 시크리톰의 HGF 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 ASC 시크리톰의 IL-8 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 날짜별로 수확한 USC 시크리톰의 IL-8 농도를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 스피룰리나 추출물을 첨가하여 생산한 USC 시크리톰(USCsecretome(SFM+SE))의 HGF와 IL-8의 발현 패턴을 비교한 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC 시크리톰의 미백효과를 확인한 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따라 ASC와 USC 시크리톰의 상처회복 효과(Wound healing)를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 중간엽줄기세포의 유동세포분석(Flow Cytometry)
인천제일여성병원으로부터 제공받은 인체 제대 유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC)와 인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC)가 중간엽줄기세포임을 확인하기 위하여, 일반적인 중간엽줄기세포 추출 방법으로 중간엽줄기세포를 추출하여 10% 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS)를 포함하는 중간엽줄기세포성장배지(growth medium; GM)에서 배양하였다.
그 다음, 인간 중간엽줄기세포의 포지티브 마커(positive marker)인 FITC Mouse Anti-Human CD73 (BD Cat# 561254), PE Mouse Anti-Human CD90 (BD Cat# 555596), Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD105 (BD Cat# 561439)와 네거티브 마커(negative marker)인 PE Mouse anti-Human CD31 (BD Cat# 555446)를 이용하여 유동세포분석을 진행하였다.
구체적으로, 총 2 x 106 세포를 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 세포는 PBS를 500ul 넣어 풀어준 후, 5개의 튜브에 100ul씩 분주시켰다. 그 다음, 항체를 넣어준 후, 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 세포는 PBS 200ul를 넣어 풀어준 후 1000rpm으로 5분동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그 다음, 다시 PBS 200ul를 넣어 세포를 풀어준 후, 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그 다음, PBS 200ul를 넣어 세포를 풀어준 후, Beckman Coulter의 Navios로 유동세포분석을 진행하여, 그 결과를 도 1 내지 도 8에 나타내었다.
도 1 내지 도 8에서 확인할 수 있듯이, 실험에 사용한 인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC)와 인체 제대 유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC)가 모두 중간엽줄기세포의 세포표면 마커(surface marker)로 사용되는 CD73(도 1 및 도 5), CD90(도 2 및 도 6) 및 CD105(도 3 및 도 7)에 99%이상 양성반응을 보였고, 혈액모줄기세포의 세포표면 마커로 사용되는 CD31(도 4 및 도 8)에는 반응하지 않음으로써 이들 세포가 중간엽줄기세포임을 확인하였다.
실험예 2. 스피룰리나 추출물의 세포에 대한 독성 시험(MTT assay)
시크리톰 생산에 사용되는 스필룰리나 추출액의 농도를 결정하기 위하여 MTT 어세이를 이용하여 스피룰리나 추출물의 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하였다. 96-웰 플레이트에 웰 당 5000개의 ASC 또는 USC를 줄기세포성장배지 100ul에 넣고 CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 세포 상층액을 제거하고 인산완충용액(PBS)으로 세포를 세척하였다. 각 웰의 세포에 실험에 사용된 스피룰리나 추출물을 함유한 배지를 100ul씩 넣어주고 CO2 incubator에서 48시간 배양하였다. 각 웰에 WST-1 시약을 10ul씩 넣고 CO2 incubator에서 90분간 발색 시킨 후 Micro plate reader(TECAN, Sunrise-DS)를 이용하여 450 nm 흡광도를 측정하였다. 각 샘플의 데이터는 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 무혈청배지에서 배양한 세포의 흡광도에 대한 퍼센트(%)로 나타내었다. 그 결과를 표 1 및 도 9 내지 도 10에 나타내었다.
구체적으로 무혈청배지에 첨가된 스피룰리나 추출물은 이 실험에 사용된 농도(0.2 - 1.6mg/ml) 내에서는 ASC와 USC에 대해서 독성을 나타내지는 않았다. 그러나 스피룰리나 추출물의 농도 0.8mg/ml과 이 보다 높은 농도에서는 세포들이 세포배양용기 표면으로부터 떨어지는 현상이 일어나는 것이 관찰되었기 때문에, ASC와 USC 시크리톰의 생산을 위한 무혈청배지에 첨가되는 스피룰리나 추출물은 0.7mg/ml을 사용하였다.
| SE 농도 | ASC | USC | ||
| (mg/ml) | % Average | STDEV | % Average | STDEV |
| 0 | 100 | 2.1 | 100 | 4.7 |
| 0.2 | 123 | 4.4 | 136 | 6.1 |
| 0.4 | 122 | 4.3 | 142 | 5.0 |
| 0.6 | 119 | 2.7 | 155 | 5.9 |
| 0.8 | 114 | 1.9 | 147 | 6.5 |
| 1.0 | 112 | 6.3 | 144 | 7.2 |
| 1.2 | 115 | 5.3 | 140 | 6.4 |
| 1.4 | 112 | 4.7 | 129 | 5.6 |
| 1.6 | 107 | 6.7 | 129 | 6.6 |
| FBS 10% | 149 | 3.9 | 137 | 6.0 |
실시예 1. 스피룰리나 추출물을 첨가한 무혈청 배지(SFM+SE)에서 지방조직 유래 중간엽줄기세포 시크리톰 생산
인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC)를 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지(serum free media + spirulina extract; SFM+SE)로 배양하여 세포상층액을 생산하였다. 이때 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, ASC를 중간엽줄기세포성장배지(growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 80 내지 90% 정도 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포상층액 및 시크리톰을 함유하고 있음)을 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 14일간 반복하여 세포상층액을 회수하였다. 회수한 세포 상층액은 300 xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포 상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
실시예 2. 스피룰리나 추출물을 첨가한 무혈청 배지(SFM+SE)에서 제대 유래 중간엽줄기세포 시크리톰 생산
인체 제대 유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC)를 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지(serum free media + spirulina extract; SFM+SE)로 배양하여 세포 상층액을 생산하였다. 이때 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, USC를 중간엽줄기세포성장배지(growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 80 내지 90% 정도 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포상층액 및 시크리톰을 함유하고 있음)을 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 14일간 반복하여 세포상 층액을 회수하였다. 회수한 세포 상층액은 300 xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포 상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
비교예 1. 스피룰리나 추출물 무첨가 무혈청 배지(SFM-only)에서 지방조직 유래 중간엽줄기세포 시크리톰 생산
인체 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell; ASC)를 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 무혈청 배지(SFM-only)로 배양하여 세포상층액을 생산하였다. 이때 사용한 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, ASC를 중간엽줄기세포성장배지(growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 80 내지 90% 정도 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 배지를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포상층액 및 시크리톰을 함유하고 있음)을 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 14일간 반복하여 세포상층액을 회수하였다. 회수한 세포상층액은 300 xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
비교예 2. 스피룰리나 추출물
무첨가 무혈청 배지(SFM-only)에서 제대 유래 중간엽줄기세포 시크리톰 생산
인체 제대 유래 중간엽줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell; USC)를 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 배지(SFM-only)로 배양하여 세포상층액을 생산하였다. 이때 사용한 사용한 무혈청 배지는 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM/F-12이며 이 외에도 페놀레드(phenol red)가 없는 MEM, aMEM, DMEM, IMDM, F12, RPMI1640 등의 배지를 사용할 수 있으며 이에 국한하지 않는다.
구체적으로, USC를 중간엽줄기세포성장배지(growth medium; GM)에서 세포가 배양용기 표면의 80 내지 90% 정도 자랄 때까지 37℃ 항온 CO2 배양기에서 배양한 후, 세포 상층액을 제거하고 세포를 인산완충용액(PBS)로 한번 세척하였다. PBS로 세척한 세포에 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 배지를 넣어 주고, 세포배양용기에서 24시간 배양한 후, 세포 상층의 배지(세포상층액 및 시크리톰을 함유하고 있음)을 회수하고 세포는 새로운 스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 배지를 넣고 다시 배양하였으며, 동일한 방법으로 매일 새로운 동일 배지로 교체하며 14일간 반복하여 세포상층액을 회수하였다. 회수한 세포상층액은 300 xg, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 회수함으로 세포상층액으로부터 세포의 잔해물을 제거하였다.
실험예 3. 세포 관찰
매일 배지를 교환하기 전에 실시예 1 내지 2(스피룰리나 추출물이 첨가된 배지 사용: SFM+SE) 및 비교예 1 내지 2(스피룰리나 추출물이 첨가되지 않은 배지 사용: SFM-only)에서 배양된 ASC와 USC를 현미경으로 자세히 관찰하여 세포의 사진을 찍어, 그 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있듯이, 배양 초기 약 4일까지는 세포의 모양에 별다른 변화가 보이지 않았다. 비교예 1 및 2의 세포들은 배양을 시작한지 약 5일부터는 배양용기 플라스틱 표면에 부착은 되어 있지만, 세포의 모양에서는 세포의 활성이 중지됨(cell arrest)을 볼 수 있었다. 그러나, 실시예 1 및 2의 세포들은 정상의 세포 모양을 나타냈다.
도 12에서 확인할 수 있듯이, 배양을 시작한 지 약 8일 후부터는 실시예 2는 세포의 이동(cell migration)이 관찰되었으며, 그 결과 세포가 뭉치기 시작하였다.
도 13에서 확인할 수 있듯이, 배양을 시작한 지 약 13일 후, 실시예의 USC는 세포의 이동이 더욱 현저하게 관찰되었으며, 그 결과 육안으로도 보일 정도의 세포 콜로니(colony)가 형성되었다. 그러나 실시예 2는 배양을 시작한지 약 13일 후에도 정상적인 세포의 모양을 유지하였다.
실험예 4. 날짜 별 시크리톰의 단백질 농도 분석
사용된 사용한 무혈청 배지 DMEM/F-12에 들어있는 아미노산(amino acid)을 제거한 후, 시크리톰의 단백질 농도를 측정하기 위하여, 각 날짜 별로 회수한 상기 시크리톰을 분자량 3KDa 이하만 통과시키는 원심분리용 필터(3KDa MWCO)를 이용하여 4℃에서 원심분리하고, 필터 상층액을 회수하여 BCA 시약(Pierce, Cat# 23225)을 이용하여 각 날짜 별 시크리톰의 단백질 농도를 측정하여, 그 결과를 도 14 내지 도 15 및 표 2 내지 표 2에 나타내었으며, 스피룰리나 추출물이 첨가된 배지에서 배양한 ASC와 USC의 시크리톰을 직접 비교한 결과를 도 16 및 표 4에 나타내었다.
| 시크리톰 | ASC 시크리톰 단백질 농도 (ug/ml) | |
| 회수일 | 실시예 1 | 비교예 1 |
| No cells | 78.8 ± 2.9 | 0 ± 1.3 |
| D1 | 127.9 ± 2.0 | 85.2 ± 3.1 |
| D2 | 56.6 ± 1.5 | 17.0 ± 1.5 |
| D3 | 37.2 ± 2.1 | 16.2 ± 0.6 |
| D4 | 43.6 ± 2.3 | 5.6 ± 1.5 |
| D5 | 39.9 ± 2.6 | 1.6 ± 1.5 |
| D6 | 37.9 ± 2.6 | 1.9 ± 3.0 |
| D7 | 49.6 ± 1.5 | 1.9 ± 2.6 |
| D8 | 38.2 ± 2.9 | 0.0 ± 2.5 |
| D9 | 38.6 ± 0.6 | 0.0 ± 1.2 |
| D10 | 24.9 ± 1.0 | 0.0 ± 1.2 |
| D11 | 31.9 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| D12 | 18.9 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 시크리톰 | USC 시크리톰 단백질 농도 (ug/ml) | |
| 회수일 | 실시예 2 | 비교예 2 |
| No cells | 78.8 ± 2.9 | 0 ± 1.3 |
| D1 | 160.9 ± 3.3 | 68.4 ± 1.3 |
| D2 | 74.6 ± 3.7 | 12.1 ± 0.0 |
| D3 | 44.6 ± 4.5 | 2.5 ± 0.7 |
| D4 | 55.9 ± 3.3 | 7.1 ± 1.2 |
| D5 | 50.0 ± 3.8 | 2.5 ± 1.4 |
| D6 | 49.6 ± 4.5 | 3.0 ± 1.4 |
| D7 | 66.7 ± 4.4 | 3.0 ± 0.7 |
| D8 | 59.6 ± 5.4 | 0 ± 2.6 |
| D9 | 57.1 ± 1.3 | 0 ± 0.7 |
| D10 | 61.3 ± 0.7 | 0 ± 3.1 |
| D11 | 53.8 ± 0.7 | 0.0 ± 0.0 |
| D12 | 48.0 ± 0.7 | 0.0 ± 0.0 |
| 회수일 | 실시예 1 (ug/ml) | 실시예 2 (ug/ml) |
| No cells | 78.8 ± 2.9 | 78.8 ± 2.9 |
| D1 | 127.9 ± 2.0 | 160.9 ± 3.3 |
| D2 | 56.6 ± 1.5 | 74.6 ± 3.7 |
| D3 | 37.2 ± 2.1 | 44.6 ± 4.5 |
| D4 | 43.6 ± 2.3 | 55.9 ± 3.3 |
| D5 | 39.9 ± 2.6 | 50.0 ± 3.8 |
| D6 | 37.9 ± 2.6 | 49.6 ± 4.5 |
| D7 | 49.6 ± 1.5 | 66.7 ± 4.4 |
| D8 | 38.2 ± 2.9 | 59.6 ± 5.4 |
| D9 | 38.6 ± 0.6 | 57.1 ± 1.3 |
| D10 | 24.9 ± 1.0 | 61.3 ± 0.7 |
| D11 | 31.9 ± 0.0 | 53.8 ± 0.7 |
| D12 | 18.9 ± 0.0 | 48.0 ± 0.7 |
도 14 내지 도 15 및 표 2 내지 표 3에서 확인할 수 있듯이, 모든 날짜 구간에 있어서 실시예 1 내지 2의 시크리톰 단백질 농도가 비교예 1 내지 2의 시크리톰 단백질 농도에 비하여 월등히 높게 나타났다. 이는 실시예에서 생산한 시크리톰의 단백질에는 무혈청 배지에 첨가해준 스피룰리나 추출물에 포함되어 있는 단백질도 함께 측정되었기 때문이다. 스피룰리나 추출물의 유무에 관계없이 첫날 수확한 시크리톰의 단백질 농도는 다른 날 시크리톰의 단백질 농도에 비하여 월등히 높다. 이는 SFM 배지로 바꾸기 전 GM에서 배양할 때 합성된 단백질이 배지를 SFM으로 바꾼 후에 분비되었기 때문이다.
도 16 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1 및 2를 직접 비교한 결과, 모든 날짜 구간에서 실시예 2는 실시예 1보다 많은 양의 단백질을 분비했다. ASC는 성인의 지방조직에서 분리한 성체 줄기세포인 반면, 제대유래 줄기세포는 태아의 제대에서 분리한 줄기세포로써 USC의 세포활성이 ASC의 세포활성보다 높기 때문이라 볼 수 있다.
실험예 5. 시크리톰의 HGF 와 IL-8 의 농도 분석
ASC와 USC 시크리톰에 포함된 다양한 성장인자 중의 하나인 간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)와 다양한 싸이토카인 중의 하나인 인터루킨-8(interleukin-8; IL-8)의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. 이를 위하여 상기 시크리톰의 반복 실험을 통하여 적당한 희석배수를 결정하여 ELISA 분석을 함으로써 각 날짜 별로 회수한 각 시크리톰이 함유하고 있는 HGF와 IL-8의 농도를 측정하였다.
구체적으로, HFG 또는 IL-8과 면역 반응을 할 수 있는 캡쳐 항체(capture antibody; 1차 항체)를 웰 당 100uL씩 넣어 4℃에서 12시간 이상 반응시키고 웰 당 200uL의 블록킹 용액(1% BSA in PBS)을 넣고 상온에서 한 시간 반응시켰다. 그리고 각 웰에 기준시료와 시험시료를 각각 100uL를 넣고 상온에서 두 시간 반응시키고 나서 검출항체(detection antibody; 2차 항체)를 100uL씩 넣고 상온에서 한 시간 반응시켰다. 2차 항체가 항원과 반응한 1차 항체와 결합한 결합체에 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP를 100uL씩 넣고 상온에서 20분간 반응시키고 기질용액(substrate solution) 100uL를 넣고 상온에서 20분간 색상의 변화를 유도한 후 정지액(stop solution)을 50uL를 넣어줌으로 더 이상의 색상 변화를 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정(30min 이내), 기준 값에 비교 HGF와 IL-8의 농도를 결정하였다. 위의 방법을 진행하는 동안 각 스텝의 사이에 각 웰들을 세척액 300 uL로 3번 세척하였다.
5-1. ASC와 USC 시크리톰의 HGF 농도 분석
스피룰리나 추출물이 중간엽줄기세포 배양 시 성장인자의 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 상처치료, 혈관신생, 각종 내장장기의 재생에 중요한 역할을 하는 각종 성장인자 중의 하나인 HGF 발현 정도를 관찰하여, 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다.
| 시크리톰 | HGF in ASC 시크리톰 (pg/ml) | |
| 회수일 | 실시예 1 | 비교예 1 |
| Day0 | 84,813 ± 1,149 | |
| D1 | 43,500 ± 849 | 26,825 ± 35 |
| D2 | 13,475 ± 283 | 1,994 ± 62 |
| D3 | 5,309 ± 234 | 334 ± 4 |
| D4 | 3,013 ± 9 | 138 ± 4 |
| D5 | 1,859 ± 75 | 19 ± 5 |
| D6 | 1,682 ± 80 | 3 ± 1 |
| D7 | 1,320 ± 83 | 0 ± 0 |
| D8 | 943 ± 24 | 0 ± 0 |
| D9 | 606 ± 20 | 0 ± 11 |
| D10 | 985 ± 15 | 0 ± 5 |
| D11 | 812 ± 41 | 0 ± 5 |
| D12 | 458 ± 21 | 0 ± 2 |
| D13 | 491 ± 41 | 0 ± 11 |
| D14 | 354 ± 12 | 0 ± 72 |
| 시크리톰 | HGF in USC 시크리톰 (pg/ml) | |
| 회수일 | 실시예 2 | 비교예 2 |
| D0 | 18,567 ± 141 | |
| D1 | 32,883 ± 354 | 14,017 ± 165 |
| D2 | 32,967 ± 377 | 9,533 ± 1,084 |
| D3 | 19,717 ± 1,249 | 3,617 ± 0 |
| D4 | 14,025 ± 412 | 1,488 ± 53 |
| D5 | 7,233 ± 236 | 171 ± 6 |
| D6 | 8,200 ± 212 | 337 ± 26 |
| D7 | 5,858 ± 978 | 551 ± 18 |
| D8 | 3,617 ± 141 | 294 ± 20 |
| D9 | 2,325 ± 106 | 287 ± 14 |
| D10 | 1,013 ± 18 | 279 ± 11 |
| D11 | 0 ± 88 | 195 ± 16 |
| D12 | 0 ± 24 | 200 ± 97 |
| D13 | 17 ± 47 | 304 ± 13 |
| D14 | 0 ± 35 | 0 ± 26 |
도 17 및 도 18에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1 및 2가 비교예 1 및 2 보다 월등히 높은 HGF를 포함하고 있다. 이는 스피룰리나 추출물이 ASC와 USC 세포의 활성을 도울 뿐만 아니라 HGF의 발현을 촉진함을 나타낸다.
또한, 도 18에서 확인할 수 있듯이, 스피룰리나 추출물에 의한 HGF의 촉진은 USC에서 더욱 뚜렷이 나타났다. USC를 GM에서 배양할 때 18ng/ml이었던 HGF가 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청배지 실시예로 바꾼 후 약 33ng/ml로 증가하고 그 후 3일 동안 GM(Day0)에서 보다 높은 수준을 유지했다. 이는 스피룰리나 추출물에 의해 HGF의 발현이 즉각적으로 촉진되어 무혈청배지임에도 GM(Day0)보다 더 많은 양의 HGF를 분비한 것이다.
반면, 도 15에서 확인할 수 있듯이, ASC는 GM(Day0)에서는 85ng/ml의 높은 HGF의 분비를 보였으나, 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청배지로 바꾼 후에 HGF의 농도는 급격히 감소했지만 스피룰리나 추출물이 없는 무혈청배지 보다는 높은 발현을 보이는 것으로 보아 ASC도 스피룰리나 추출물에 의하여 HGF의 발현이 촉진됨을 나타낸다.
5-2. ASC와 USC 시크리톰의 IL-8 농도 분석
중간엽줄기세포를 배양할 때 스피룰리나 추출물이 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 피부의 미백효과, 바이러스 등의 감염 시 호중구(neutrophil) 등의 면역세포를 불러(chemokine)오는 사이토카인 중의 하나인 IL-8의 분비 정도를 관찰하여, 그 결과를 도 19 및 도 20에 나타내었다.
| 시크리톰 | IL-8 in ASC 시크리톰 (pg/ml) | |
| 회수일 | 실시예 1 | 비교예 2 |
| D0 | 20,861 ± 978 | |
| D1 | 13,704 ± 890 | 1,288 ±29 |
| D2 | 9,336 ± 238 | 94 ± 0 |
| D3 | 7,707 ± 207 | 20 ± 1 |
| D4 | 6,072 ± 377 | 5 ± 0 |
| D5 | 6,171 ± 179 | 0 ± 1 |
| D6 | 8,634 ± 372 | 1 ± 1 |
| D7 | 11,839 ± 265 | 1 ± 2 |
| D8 | 8,753 ± 864 | 0 ± 1 |
| D9 | 15,456 ± 1,693 | 2 ± 3 |
| D10 | 9,167 ± 279 | 3 ± 1 |
| D11 | 10,296 ± 971 | 5 ± 4 |
| D12 | 12,692 ± 1,194 | 10 ± 4 |
| D13 | 9,854 ± 100 | 3 ± 3 |
| D14 | 9,995 ± 0 | 4 ± 1 |
| 시크리톰 | IL-8 in USC 시크리톰 (pg/ml) | |
| 회수일 | 실시예 2 | 비교예 2 |
| D0 | 16,113 ± 556 | |
| D1 | 3,648 ± 44 | 1,131 ± 21 |
| D2 | 3,271 ± 43 | 1,583 ± 29 |
| D3 | 7,942 ± 98 | 971 ± 17 |
| D4 | 34,478 ± 346 | 431 ± 9 |
| D5 | 81,490 ± 2,828 | 162 ± 9 |
| D6 | 66,800 ± 2,341 | 95 ± 0 |
| D7 | 117,110 ± 4,438 | 36 ± 2 |
| D8 | 56,352 ± 2,194 | 34 ± 2 |
| D9 | 77,455 ± 1,219 | 19 ± 0 |
| D10 | 152,110 ± 2,146 | 15 ± 1 |
| D11 | 115,076 ± 2,243 | 6 ± 1 |
| D12 | 44,283 ± 1,024 | 4 ± 1 |
| D13 | 34,359 ± 878 | 3 ± 1 |
| D14 | 13,662 ± 195 | 0 ± 0 |
도 19 및 도 20에서 확인할 수 있듯이, 스피룰리나 추출물은 ASC와 USC의 세포활성을 돕고 IL-8의 분비를 촉진했다. GM(Day0)에서는 ASC와 USC 모두 15 내지 20ng/ml의 IL-8을 분비했지만, 스피룰리나 추출물이 없는 비교예의 배지로 바꾼 후에는 IL-8 분비가 거의 측정되지 않았다.
반면, 스피룰리나 추출물을 첨가한 후 ASC와 USC 모두 IL-8의 분비가 월등히 증가하여, ASC는 IL-8의 분비를 배지의 회수를 종료할 때까지 약 2주 동안 5ng/ml 내지 15ng/ml로 유지하였고(도 19), USC는 Day10 에는 150ng/ml 이상 까지도 분비하여(도 20) ASC 보다 약 20배까지도 증가함을 볼 수 있었다.
5-3. 실시예 2의 HGF와 IL-8의 발현 패턴 분석
| 시크리톰 | USC 시크리톰 (실시예 2) | |
| 회수일 | HGF (pg/ml) | IL-8 (pg/ml) |
| D0 | 18,567 ± 141 | 16,113 ± 566 |
| D1 | 32,883 ± 354 | 3,648 ± 44 |
| D2 | 32,967 ± 377 | 3,271 ± 43 |
| D3 | 19,717 ± 1,249 | 7,942 ± 98 |
| D4 | 14,025 ± 412 | 34,478 ± 346 |
| D5 | 7,233 ± 236 | 81,490 ± 2,828 |
| D6 | 8,200 ± 212 | 66,800 ± 2,341 |
| D7 | 5,858 ± 978 | 117,110 ± 4,438 |
| D8 | 3,617 ± 141 | 56,352 ± 2,194 |
| D9 | 2,325 ± 106 | 77,455 ± 1,219 |
| D10 | 1,013 ± 18 | 152,110 ± 2,146 |
| D11 | 0 ± 88 | 115,076 ± 2,243 |
| D12 | 0 ± 24 | 44,283 ± 1,024 |
| D13 | 17 ± 47 | 34,359 ± 878 |
| D14 | 0 ± 35 | 13,662 ± 195 |
도 19도 21에서 확인할 수 있듯이, HGF와 IL-8의 발현 패턴은 서로 다르게 나타났다. 실시예 2의 HGF와 IL-8을 보면, HGF는 배양 초기 3 내지 4일 동안에 많이 발현되는 반면, IL-8은 무혈청 배지에 배양을 시작하고 처음 3일은 10ng/ml 미만의 IL-8을 분비하고, 4일 후부터 분비가 증가하기 시작하여 10일째에 최대치(152ng/ml)를 분비하였다. 즉, 스피룰리나 추출물을 첨가한 후 USC로부터 HGF는 즉시 발현이 촉진되어 분비가 되고, IL-8의 경우 시차를 두고 발현 및 분비가 됨을 볼 수 있다. 따라서 스피룰리나 추출물을 첨가한 후 시크리톰을 회수하는 날짜에 따라서 서로 다른 유용 단백질을 포함하는 시크리톰을 생산할 수 있다.
실험예 6. 성장인자 및 싸이토카인 마이크로어레이
중간엽줄기세포의 시크리톰에 함유된 다양한 성장인자와 사이토카인의 농도를 측정하기 위하여 Raybiotech Quantibody의 Human Growth Factor Array (Cat. # QAH-GF-1-1)와 Human Cytokine Array Q1000 (Cat. # QAH-CAA-1000-1)를 이용하여 마이크로어레이를 제조사에서 권장하는 실험 방법에 의하여 실시하였다.
구체적으로, 각 웰에 샘플희석 용액을 100ul씩 넣고 약 30분 정도 상온에서 반응시켜 용기의 표면을 블락시킨 후 용액을 제거하였다. 각 웰에 100ul의 마이크로어레이 표준액 또는 시료를 넣고 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 150ul의 세척액I으로 5분씩 5 회 세척했다. 글래스 슬라이드와 슬라이드 프레임 박스에 넣고 세척액 I에 약 20분 동안 부드럽게 흔들어 준 후, 세척액 II로 2번 세척하였다. 상기의 각 웰에 항체 복합 용액을 80 ul씩 넣고 항체 항원의 반응을 위하여 2 시간 동안 실온에서 반응시키고 150ul의 세척액II로 5분씩 2번 세척하였다. 각 웰에 80ul의 검출 항체 칵테일 넣고 상온에서 2시간 반응시키고 다시 150ul의 세척액II로 5분씩 2번 세척하였다. 그리고 시아닌 형광 염료가 결합된 스트렙타아비딘 80 ul를 각 웰에 첨가하고 알루미늄 호일을 덮어 빛을 차단하거나 암소 하에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후 첨가된 용액을 제거하고 세척용액으로 5 회 세척한 뒤, 각 웰로부터 세척용액을 완전히 제거하였다. 그리고 마이크로어레이 레이저 스캐너를 이용하여 상기 표본을 분석하였으며, 표준용액 검출양과 비교하여 시료의 사이토카인 또는 성장인자의 함유량을 계산하여, 그 결과를 표 10 및 표 11에 나타내었다.
| 시크리톰 | ASC 시크리톰 (pg/ml) | USC 시크리톰 (pg/ml) | ||
| Spirulina | 실시예 1 | 비교예 1 | 실시예 2 | 비교예 2 |
| AR | 165 +/- 16 | 100 +/- 7 | 175 +/- 12 | 202 +/- 7 |
| BDNF | 8 +/- 1 | 5 +/- 1 | 17 +/- 1 | 7 +/- 1 |
| bFGF | 11 +/- 0 | 10 +/- 1 | 17 +/- 0 | 24 +/- 1 |
| BMP-4 | 422 +/- 33 | 496 +/- 9 | 1037 +/- 110 | 2931 +/- 101 |
| BMP-5 | 2286 +/- 86 | 2594 +/- 61 | 2361 +/- 336 | 4851 +/- 153 |
| BMP-7 | 952 +/- 19 | 944 +/- 58 | 796 +/- 30 | 1616 +/- 134 |
| b-NGF | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 |
| EGF | 1 +/- 0 | 0 +/- 0 | 2 +/- 0 | 0 +/- 0 |
| EGF R | 350 +/- 30 | 191 +/- 20 | 193 +/- 6 | 161 +/- 8 |
| EG-VEGF | 28 +/- 4 | 40 +/- 3 | 33 +/- 1 | 92 +/- 3 |
| FGF-4 | 867 +/- 20 | 939 +/- 106 | 799 +/- 40 | 1717 +/- 84 |
| FGF-7 | 242 +/- 9 | 105 +/- 11 | 290 +/- 8 | 295 +/- 38 |
| GDF-15 | 773 +/- 60 | 113 +/- 2 | 3107 +/- 207 | 555 +/- 35 |
| GDNF | 27 +/- 2 | 9 +/- 0 | 47 +/- 2 | 32 +/- 0 |
| GH | 193 +/- 7 | 152 +/- 18 | 168 +/- 5 | 323 +/- 17 |
| HB-EGF | 60 +/- 4 | 55 +/- 3 | 104 +/- 15 | 74 +/- 3 |
| HGF | 4288 +/- 194 | 1869 +/- 91 | 4895 +/- 232 | 927 +/- 36 |
| IGFBP-1 | 101 +/- 8 | 95 +/- 3 | 115 +/- 4 | 155 +/- 12 |
| IGFBP-2 | 213 +/- 15 | 135 +/- 8 | 273 +/- 14 | 400 +/- 23 |
| IGFBP-3 | 2408 +/- 79 | 1855 +/- 137 | 3547 +/- 127 | 6266 +/- 322 |
| IGFBP-4 | 4303 +/- 320 | 3752 +/- 195 | 4390 +/- 295 | 7709 +/- 353 |
| IGFBP-6 | 29761 +/- 2762 | 26952 +/- 952 | 4238 +/- 463 | 4793 +/- 171 |
| IGF-I | 613 +/- 36 | 216 +/- 5 | 425 +/- 24 | 0 +/- 0 |
| Insulin | 474 +/- 8 | 711 +/- 15 | 612 +/- 33 | 1504 +/- 103 |
| MCSF R | 85 +/- 6 | 86 +/- 7 | 111 +/- 7 | 174 +/- 4 |
| NGF R | 110 +/- 5 | 96 +/- 6 | 129 +/- 9 | 131 +/- 4 |
| NT-3 | 28 +/- 1 | 15 +/- 1 | 57 +/- 1 | 99 +/- 7 |
| NT-4 | 103 +/- 10 | 126 +/- 4 | 140 +/- 11 | 219 +/- 17 |
| OPG | 39 +/- 1 | 14 +/- 1 | 188 +/- 2 | 83 +/- 2 |
| PDGF-AA | 0 +/- 0 | 0 +/- 0 | 10 +/- 0 | 40 +/- 0 |
| PIGF | 33 +/- 2 | 35 +/- 2 | 31 +/- 2 | 55 +/- 4 |
| SCF | 81 +/- 15 | 70 +/- 2 | 120 +/- 7 | 57 +/- 11 |
| SCF R | 104 +/- 3 | 85 +/- 4 | 108 +/- 4 | 162 +/- 8 |
| TGFa | 164 +/- 2 | 102 +/- 11 | 134 +/- 4 | 277 +/- 18 |
| TGFb1 | 5213 +/- 65 | 7462 +/- 362 | 8182 +/- 296 | 11719 +/- 436 |
| TGFb3 | 271 +/- 17 | 162 +/- 5 | 254 +/- 14 | 669 +/- 32 |
| VEGF | 986 +/- 84 | 278 +/- 16 | 8 +/- 0 | 23 +/- 1 |
| VEGF R2 | 108 +/- 9 | 125 +/- 8 | 181 +/- 10 | 212 +/- 2 |
| VEGF R3 | 88 +/- 14 | 74 +/- 4 | 89 +/- 3 | 113 +/- 12 |
| VEGF-D | 38 +/- 5 | 7 +/- 0 | 10 +/- 1 | 37 +/- 1 |
| 시크리톰 | ASC 시크리톰 (pg/ml) | USC 시크리톰 (pg/ml) | ||
| Spirulina | 실시예 1 | 비교예 1 | 실시예 2 | 비교예 2 |
| IL-1a | 7 +/- 0 | 17 +/- 1 | 27 +/- 1 | 34 +/- 2 |
| IL-1b | 9 +/- 2 | 0 +/- 0 | 16 +/- 1 | 9 +/- 1 |
| IL-2 | 28 +/- 2 | 7 +/- 0 | 53 +/- 5 | 29 +/- 1 |
| IL-4 | 7 +/- 0 | 2 +/- 0 | 17 +/- 2 | 7 +/- 0 |
| IL-5 | 25 +/- 2 | 15 +/- 1 | 70 +/- 4 | 33 +/- 1 |
| IL-6 | 14871 +/- 2787 | 199 +/- 27 | 3888 +/- 289 | 403 +/- 35 |
| IL-8 | 446 +/- 72 | 96 +/- 11 | 332 +/- 30 | 56 +/- 10 |
| IL-10 | 910 +/- 206 | 443 +/- 61 | 1339 +/- 138 | 808 +/- 26 |
| IL-12p70 | 4 +/- 1 | 1 +/- 0 | 2 +/- 0 | 2 +/- 0 |
| IL-13 | 9 +/- 1 | 4 +/- 0 | 15 +/- 2 | 5 +/- 0 |
| GM-CSF | 29 +/- 4 | 0 +/- 0 | 44 +/- 3 | 17 +/- 0 |
| GRO | 28008 +/- 4511 | 11744 +/- 1529 | 25928 +/- 2275 | 16904 +/- 2001 |
| IFNg | 365 +/- 41 | 142 +/- 9 | 602 +/- 52 | 328 +/- 9 |
| MCP-1 | 6468 +/- 618 | 3346 +/- 128 | 4794 +/- 229 | 1558 +/- 91 |
| MIP-1a | 49 +/- 5 | 0 +/- 0 | 30 +/- 0 | 7 +/- 0 |
| MIP-1b | 2 +/- 0 | 1 +/- 0 | 5 +/- 0 | 5 +/- 0 |
| MMP-9 | 29 +/- 3 | 0 +/- 0 | 32 +/- 2 | 2 +/- 0 |
| RANTES | 1365 +/- 123 | 48 +/- 3 | 4 +/- 0 | 2 +/- 0 |
| TNFa | 49 +/- 5 | 5 +/- 0 | 68 +/- 4 | 75 +/- 3 |
| VEGF | 1415 +/- 60 | 485 +/- 22 | 23 +/- 1 | 6 +/- 0 |
표 10 및 표 11에서 확인할 수 있듯이, ASC의 경우는 76%의 단백질이 스피룰리나 추출물에 의하여 농도가 증가하였고, USC는 48%의 단백질이 스피룰리나 추출물에 의하여 발현 농도가 증가하였다. 반면, 스피룰리나 추출물의 첨가에 의하여 각각 17%와 46%의 단백질은 감소하였다. 스피룰리나 추출물의 전체 시크리톰 단백질의 발현 및 분비에 미치는 영향을 보았을 때 결론적으로 스피룰리나 추출물은 ASC와 USC의 성장인자와 사이토카인의 발현 및 분비를 촉진시켰다.
마이크로어레이 데이터를 이용하여, 무혈청 배지에 첨가한 스피룰리나 추출물이 전체 시크리톰의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 스피룰리나 추출물에 의하여 발현이 증가 또는 감소한 이들 성장인자와 사이토카인의 수를 파악하여 비교하여, 그 결과를 표 12에 나타내었다.
| 증가한 단백질 | 감소한 단백질 | 유사한 단백질 | |
| ASC 시크리톰 | 76% | 15% | 9% |
| USC 시크리톰 | 48% | 46% | 6% |
표 12에서 확인할 수 있듯이, 마이크로어레이로 측정한 60개의 이들 성장인자와 사이토카인 중에서 ASC의 경우는 76%의 단백질이 스피룰리나 추출물에 의하여 농도가 증가하였고, USC는 48%의 단백질이 스피룰리나 추출물에 의하여 발현 농도가 증가하였다. 반면에 스피룰리나 추출물의 첨가에 의하여 각각 17%와 46%의 단백질은 감소하였다. 스피룰리나 추출물의 전체 시크리톰 단백질의 발현 및 분비에 미치는 영향을 보았을 때 결론적으로 스피룰리나 추출물은 ASC와 USC의 성장인자와 사이토카인의 발현 및 분비를 촉진시켰다.
| 단백질종류 | Growth Factor | Chemokine | ||||
| 스피룰리나 후 변화 | 증가 | 감소 | 유사 | 증가 | 감소 | 유사 |
| ASC 시크리톰 | 63% | 23% | 14% | 100% | 0% | 0% |
| USC 시크리톰 | 29% | 65% | 6% | 82% | 12% | 6% |
표 13에서 확인할 수 있듯이, 스피룰리나 추출물의 단백질 발현에 미치는 영향은 단백질 종류에 따라 다르게 나타났다. ASC 시크리톰에서는 스피룰리나 추출물에 의하여 사이토카인과 성장인자 모두 분비가 증가한 단백질의 수가 감소한 수 보다 월등히 높았다. 그러나, USC 시크리톰의 경우는 스피룰리나 추출물의 첨가에 의하여 분비가 증가한 사이토카인의 수는 ASC 시크리톰처럼 감소한 수보다 컸으나, 성장인자의 경우는 분비량이 감소한 단백질의 수가 증가한 단백질의 수 보다 많았다.
| Media | ASC>USC | ASC<USC | ASCUSC |
| 실시예 | 27% | 56% | 17% |
| 비교예 | 16% | 84% | 0% |
표 14에서 확인할 수 있듯이, 세포의 종류에 따른 상기 성장인자와 사이토카인의 발현 양을 비교하였다. 스피룰리나 추출물이 첨가된 무혈청배지에 세포를 배양하였을 때 ASC에 비하여 USC에서 더 많이 발현된 단백질의 수가 그 반대의 경우 보다 크게 나타났다. (세포의 종류에 따른 성장인자와 사이토카인의 발현 정도의 비교. ASC와 USC를 비교하여 더 많은 양을 발현한 단백질 수의 백분율을 나타냄)
실험예 7. 미백효과 (Melanin Synthesis inhibition assay)
ASC와 USC 시크리톰이 미백에 미치는 효과를 측정하기 위하여 B16BL6 세포를 이용하여 멜라닌색소합성억제(Melanin synthesis inhibition assay) 실험을 실시하였다.
구체적으로, B16BL6 melanoma 세포(KCTC 생물자원센터)를 1 X 105 cells/well 농도로 6-웰 플레이트에 분주 하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고 세포를 1x PBS로 1회 씻어준 후 1% FBS가 함유된 새 배지를 첨가하였다. 시크리톰을 각 세포에 처리한 후, 72 시간 동안 37℃, 5% CO- 조건의 배양기에서 배양하였다. 72 시간 후 배지는 제거하고 1x PBS로 세포를 1회 세척하였다. 0.05% Trpysin-EDTA를 각 세포에 500ul 처리한 후 세포들을 회수하였다. 원심분리를 통해 세포를 가라 앉히고 상층액은 전부 제거하였다. 1N NaOH를 150 ul 첨가하여 70℃에서 1시간 동안 세포를 완전히 녹여 준 후 96웰 플레이트에 얻은 용액을 각각 분주하였다. 스피룰리나 추출물을 첨가 또는 첨가하지 아니하고 생산한 ASC와 USC의 시크리톰을 원액의 농도와 원액의 1/2의 농도로 B16BL6세포를 배양, 멜라닌색소합성억제 효과를 520nm에서 흡광도 값을 확인하여, 그 결과를 도 22 및 표 15에 나타내었다.
| 시크리톰/ control |
농도 | Melanin Synthesis Inhibition (%) | |
| 실시예 | 비교예 | ||
| Arbutin (control) |
10 ug/ml | 40.6 ± 2.3 | - |
| 100 ug/ml | 82.7 ± 1.5 | - | |
| ASC | 1:1 dilution (½ x) | 63.7 ± 3.6 | 53.4 ± 4.0 |
| USC | 1:1 dilution (½ x) | 67.7 ± 3.4 | 55.6 ± 4.0 |
| ASC | No dilution (1 x) | 88.4 ± 4.8 | 87.2 ± 7.9 |
| USC | No dilution (1 x) | 85.9 ± 1.4 | 83.9 ± 6.8 |
도 20 및 표 14에서 확인할 도 22 및 표 15에서 확인할 수 있듯이, 스피룰리나 추출물을 첨가하여 생산한 시크리톰이 스피룰리나 추출물 없이 생산한 시크리톰보다 멜라닌색소합성억제 효과가 향상됨을 확인하였다.
실험예 8. 상처회복 효과(Wound healing)
Fibroblast NIH3T3 세포(KCTC 생물자원센터)를 2.5 X 105 cells/well 농도로 24-웰 플레이트에 분주 하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 200ul 팁을 이용하여 각 well의 중앙에 상처를 주었다. 배지를 제거하고 세포를 1x PBS로 1회 세척한 후 1% FBS가 함유된 새 배지를 첨가하였다. 시크리톰을 각 웰의 세포에 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 48시간 경과 후 세포사진 촬영 및 세포간격을 측정하여 상처 회복능을 확인하여, 그 결과를 도 23 및 표 16에 나타내었다.
| control | 0% FBS | 4% FBS |
| SFM (24hr) | 0±0 | 21.5±5.45 |
| SFM (72hr) | 12.3±3.4 | 52.3±7.37 |
| 시크리톰 | 실시예 | 비교예 |
| ASC (24h) | 38±3.65 | 22±5.89 |
| USC (24h) | 20.8±6.65 | 17.5±3.51 |
| ASC (72h) | 75.8±6.85 | 45.8±4.65 |
| USC (72h) | 68.8±4.27 | 54.8±5.25 |
도 23 및 표 16에서 확인할 수 있듯이, 무혈청배지(SFM)로 배양한 대조군에 비하여 ASC USC의 모든 시크리톰에서 상처회복 효과를 확인할 수 있었고, 또한, 스피룰리나 추출물을 첨가한 배지에서 생산된 시크리톰의 상처회복효과가 첨가하지 않은 배지보다 향상됨을 확인하였다.
Claims (9)
- 하기의 단계를 포함하는 시크리톰 생산 방법:
줄기세포성장배지에서 제대유래 중간엽줄기세포를 배양용기 표면의 80 내지 90%까지 배양하는 단계 제1 배양 단계; 및
스피룰리나 추출물을 포함하는 무혈청 배지에서 제대유래 중간엽줄기세포를 배양하는 제2 배양 단계. - 제1항에 있어서, 상기 제2 배양 단계는 24 내지 48 시간 수행하는 것인, 시크리톰 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 배양 단계는 0.01 내지 3.0 mg/ml 농도의 스피룰리나 추출물을 무혈청 배지에 첨가하여 중간엽줄기세포를 배양하는 것인, 시크리톰 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생산 방법은 제2 배양 단계 이 후에 세포 상층의 배지를 회수하는 회수 단계를 추가로 포함하는 것인, 시크리톰 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 방법은 제2 배양 단계 및 회수 단계를 1 내지 14회 반복 수행하는 것인, 시크리톰 생산 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080085330A1 (en) * | 2005-05-02 | 2008-04-10 | Cyndy Davis Sanberg | Compounds for stimulating stem cell proliferation including spirulina |
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2021
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