KR102623437B1

KR102623437B1 - 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102623437B1
Application number: KR1020160082981A
Authority: KR
Inventors: 김성태; 조은경; 빈범호; 이태룡; 고용송; 김새롬; 홍가혜
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2024-01-11
Also published as: TW201805010A; KR20180003322A; TWI746588B; WO2018004143A1

Abstract

본 명세서에는 종래 성체줄기세포 유래의 엑소좀의 문제점을 개선시킨 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물 및 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하는 방법이 개시된다. 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 성체줄기세포를 2개 이상의 크기가 다른 멤브레인 필터로 크기가 큰 필터에서 작은 필터 순으로 순차적으로 통과시킨 성체줄기세포의 여과물에 포함된 나노 크기의 베지클이다.

Description

성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물{COMPOSITION FOR PROMOTING ANGIOGENIC ACTIVITY COMPRISING EXOSOME-MIMETIC NANOVESICLES DERIVED FROM ADULT STEM CELLS}

본 명세서에는 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물 및 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하는 방법이 개시된다.

혈관 신생(angiogenesis)이란 새로운 혈관이 생성되는 과정을 말하며, 정상적인 생체 조건에서는 드물게 일어나지만, 배발생, 황체 형성 또는 상처 치료 과정에서는 반드시 수반되는 과정이다.

혈관 신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관 신생 촉진 인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포의 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다. 혈관 생성 과정은 생장인자, 사이토카인, 지질대사물질 및 지혈 단백질의 잠재성 단편 등 여러 종류의 촉진 인자와 억제 인자에 의해 엄격하게 통제되는 것으로 알려져 있다.

발생 및 상처 치유, 기관 형성에 중요한 과정인 혈관 생성이 제대로 일어나지 않을 경우 심각한 질환이 발생하게 된다. 예를 들어, 발생 단계에서 혈관 형성이 되지 않을 경우 태반의 미발달을 초래하여 유산의 원인이 될 수 있으며, 조직의 궤양 및 허혈의 발생이 기관의 기능 이상을 유발시키고 더 나아가 사망에 이르게 한다. 최근 식생활의 변화, 영양 상태의 개선과 노년 인구의 증가에 따라 동맥경화, 심근경색 및 협심증, 뇌경색, 급성사지허혈과 같은 다양한 심혈관계 질환이 성인 사망률의 수위를 차지하는 심각한 질환으로 대두되고 있으나 뚜렷한 치료법이 정립되지 않은 상태이며, 이러한 허혈성 질환을 치료하기 위해 신생 혈관 형성을 유도 또는 촉진하는 새로운 치료법 및 인자의 개발이 주목을 받고 있다(김덕경 et al, 대한내분비학회, 16(3), 328-338, 2001).

혈관 신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관 신생 치료라 하며, 혈관내피 성장인자(VEGF)와 같은 혈관 신생 촉진 인자가 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있으나, 상기 인자들의 분리 및 정제가 어려우며, 고가이므로 임상 적용에 어려움이 있고, 혈관성 조직 복구에 의해 증상이 개선될 수 있는 질환의 치료를 위해 보다 효과적이고 새로운 인자들의 발굴이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

한편, 줄기세포(stem cell)란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 줄기세포는 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있으며, 세포학적 유래에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 분류할 수 있다. 배아줄기세포는 착상 전 수정란이나 발생중인 태아 생식기 조직 등에서 유래하는 반면, 성체줄기세포는 성체 내에서 존재하는 각 기관, 예를 들면 골수, 뇌, 간, 췌장 등에서 유래한다.

중간엽 줄기세포가 혈관세포에 미치는 영향(신생 혈관 생성 및 억제 등)은 잘 알려져 있다(Front Neurosci., 24(7):194, 2013). 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀 또한 신생 혈관 생성 효과 및 심혈관 질환 예방 효과가 있음이 알려져 있으며, 이로 인해 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀은 재생의학 분야에서 새로운 치료 물질로서 각광을 받고 있다(Front Immunol., 4(5):370, 2014). 그러나, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀은 분리 및 정제하기가 어렵고 수득률이 낮은 문제로 인해 그 활용이 어렵다.

KR 10-2011-0121848A

일 측면에서, 본 명세서는 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 명세서는 종래 성체줄기세포 유래의 엑소좀의 문제점을 개선시킨, 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 높은 수득률로 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(exosome-mimetic nanovesicles)을 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 성체줄기세포를 2개 이상의 크기가 다른 멤브레인 필터로 크기가 큰 필터에서 작은 필터 순으로 순차적으로 통과시킨 성체줄기세포의 여과물에 포함된 나노 크기의 베지클인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 30 내지 200 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 성체줄기세포의 여과물로부터 10% 및 50% 농도의 이오딕사놀을 이용한 밀도 구배 초원심분리 시, 10% 농도의 이오딕사놀과 50% 농도의 이오딕사놀 사이에 위치하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 성체줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 피부, 지방 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 성체줄기세포는 TNF-α를 처리하여 배양한 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 성체줄기세포는 passage 6까지 계대배양한 후 TNF-α를 처리하여 배양한 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 멤브레인 필터는 1 내지 10 ㎛ 크기의 평균 공극을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 초원심분리는 100,000 ×g 이상에서 수행하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 혈관 내피세포의 이동을 유도 또는 증가시키는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 혈관 신생이 요구되는 질환에서 혈관 신생을 촉진하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 혈관 신생이 요구되는 질환은 상처, 화상, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 뇌혈관성 질환 및 탈모증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(exosome-mimetic nanovesicles)을 제조하는 방법으로서, (1) 성체줄기세포를 배양하는 단계; (2) 배양된 성체줄기세포를 수확하여 완충용액에 현탁시키는 단계; (3) 상기 현탁액을 2개 이상의 크기가 다른 멤브레인 필터로 크기가 큰 필터에서 작은 필터 순으로 순차적으로 통과시켜 여과물을 제조하는 단계; 및 (4) 상기 여과물로부터 초원심분리를 통해 엑소좀-모사 나노베지클을 수득하는 단계;를 포함하는 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하는 방법을 제공한다.

일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 종래 성체줄기세포 유래의 엑소좀의 문제점을 개선시킨, 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 높은 수득률로 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 명세서의 일 시험예에 따라 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하는 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 명세서의 일 시험예에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2a는 엑소좀-모사 나노베지클의 형태, 도 2b는 엑소좀-모사 나노베지클의 크기를 나타낸다.
도 3은 종래 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀과 본 명세서에 따른 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 단밸질의 양 및 입자수를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 명세서의 일 시험예에 따른 Matrigel plug assay 흐름도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 명세서의 일 시험예에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 신생 혈관 생성 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 명세서의 일 시험예에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 면역세포 침윤 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 명세서의 일 시험예에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 내피세포 증식 및 이동에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 본 명세서의 일 시험예에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 대식세포 이동에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 본 명세서의 일 시험예에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클로 처리된 대식세포가 내피세포 이동에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서는 종래 성체줄기세포 유래의 엑소좀이 갖는 문제점을 개선하여 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 높은 수득률로 제조하였고, 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 우수한 신생 혈관 촉진 효과가 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 "유효성분"은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 명세서에서 "엑소좀-모사 나노베지클"은 성체줄기세포로부터 얻은 나노 크기의 베지클을 의미하는 것으로서, 세포외 소낭인 엑소좀과 유사한 나노 크기를 갖는 베지클을 의미한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 30 내지 200 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 30 nm 이상, 32 nm 이상, 34 nm 이상, 36 nm 이상, 38 nm 이상, 40 nm 이상, 42 nm 이상, 44 nm 이상, 46 nm 이상, 48 nm 이상 또는 50 nm 이상이면서, 200 nm 이하, 190 nm 이하, 180 nm 이하, 170 nm 이하, 160 nm 이하, 150 nm 이하, 140 nm 이하, 130 nm 이하, 120 nm 이하, 110 nm 이하, 100 nm 이하, 95 nm 이하, 90 nm 이하, 85 nm 이하, 80 nm 이하, 75 nm 이하 또는 70 nm 이하의 직경을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 30 내지 100 nm, 40 내지 80 nm, 50 내지 100 nm, 또는 50 내지 80 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 40 내지 55 nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 40 nm 이상, 42 nm 이상, 44 nm 이상, 46 nm 이상, 48 nm 이상 또는 50 nm 이상이면서, 55 nm 이하, 54 nm 이하, 53 nm 이하, 52 nm 이하, 51 nm 이하 또는 50 nm 이하의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 42 내지 53 nm, 46 내지 52 nm, 48 내지 52 nm, 또는 50 nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 성체줄기세포는 자가 또는 동종 유래의 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함하는 임의 유형의 동물로부터 유래할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 멤브레인 필터는 크기가 다른 세 종류의 필터로 구성될 수 있으며, 예컨대 1 내지 2 ㎛ 크기의 평균 공극을 갖는 필터, 4 내지 6 ㎛ 크기의 평균 공극을 갖는 필터, 및 9 내지 10 ㎛ 크기의 평균 공극을 갖는 필터로 구성될 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 초원심분리는 100,000 ×g 이상, 구체적으로 100,000 내지 200,000 ×g, 또는 100,000 내지 150,000 ×g, 또는 150,000 내지 200,000 ×g에서 수행하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 엑소좀-모사 나노베지클은 예컨대, 표적 세포에서 원하는 기능을 효율적으로 수행할 수 있도록 막 성분이 화학적 또는 물리적으로 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, 엑소좀-모사 나노베지클의 막 성분이 티올기(-SH) 또는 아민기(-NH₂)를 이용하여 화학적인 방법으로 변형되거나, 엑소좀-모사 나노베지클에 표적유도 물질, 세포막융합 물질, 폴리에틸렌글리콜을 화학적으로 결합시켜 막 이외의 성분을 더 포함하는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 혈관내피세포의 이동을 유도 또는 증가시키는 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 혈관 신생에 유효한 양의 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관 신생 촉진 방법을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 동결건조된 제형일 수 있다. 상기 조성물은 즉시 사용 가능하도록(ready-to-use) 밀봉된 포장재 또는 포장 용기에 담긴 동결건조된 제형일 수 있다.

본 명세서는 또한 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 유효성분으로 포함하고 동결건조된 제형을 갖는 조성물; 및 멸균수 또는 정제수;를 포함하는 혈관 신생 촉진용 키트를 제공한다. 상기 키트는 즉시 사용 가능하도록(ready-to-use) 밀봉된 포장재 또는 포장 용기에 담긴 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 엑소좀-모사 나노베지클 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.

상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 상기 비경구 투여 형태로는 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유효성분의 투여량 결정은 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일 측면에서 상기 조성물 1 ㎍/kg 내지 200 mg/kg, 다른 일 측면에서 50 ㎍/kg 내지 50 mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

예시적인 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다.

상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다.

상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 다른 측면에서 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 다양할 수 있으나, 본 명세서에 개시된 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또 다른 측면에서, 본 명세서는 상기 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(exosome-mimetic nanovesicles)을 제조하는 방법으로서, (1) 성체줄기세포를 배양하는 단계; (2) 배양된 성체줄기세포를 수확하여 완충용액에 현탁시키는 단계; (3) 상기 현탁액을 2개 이상의 크기가 다른 멤브레인 필터로 크기가 큰 필터에서 작은 필터 순으로 순차적으로 통과시켜 여과물을 제조하는 단계; 및 (4) 상기 여과물로부터 초원심분리를 통해 엑소좀-모사 나노베지클을 수득하는 단계;를 포함하는 성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

시험예 1. 인간 중간엽 줄기세포(Human mesenchymal stem cells, hMSCs) 유래의 엑소좀 -모사 나노베지클( exosome -mimetic nanovesicles , NVs )의 제조

본 시험예에서는 성체줄기세포의 일종인 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하였다. 상기 중간엽 줄기세포는 전체 골수 세포의 0.01%를 차지하고 있으며, 연골세포, 골격세포, 신경세포 등으로 분화할 수 있는 다능성(multipotency) 세포이다.

인간 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하기 위해서, 세포를 passage 6까지 배양하고 신생 혈관 생성 효과를 증가시키기 위해서, TNF-α(20 ng/mL)를 처리하여 12시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, PBS buffer로 세포를 두 번 washing한 후, 멸균된 cell scrapper를 이용하여 세포를 떼어내고 600 ×g, 5분 조건에서 세포를 침전시켰다. 침전된 세포는 PBS buffer로 재현탁시킨 후, 10 μm, 5 μm, 1 μm의 평균 공극 크기를 갖는 멤브레인 필터를 각각 5번씩 순차적으로 통과시켜 나노 크기의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하였다. 또한, 순수한 엑소좀-모사 나노베지클만을 분리하기 위해서, 튜브에 이오딕사놀(iodixanol) 50%, 10% 및 샘플을 아래에서부터 쌓고 밀도 구배 초원심분리(density gradient ultracentrifugation)를 100,000 ×g, 2시간, 4 ℃ 조건에서 수행하였다. 10%와 50% 이오딕사놀 사이에 존재하는 순수한 엑소좀-모사 나노베지클 층을 모으고, 버퍼 교환을 위해 HBS buffer로 희석하여 초원심분리를 100,000 ×g, 2시간, 4 ℃ 조건에서 수행하였다(도 1 참조).

시험예 2. 인간 중간엽 줄기세포(Human mesenchymal stem cells, hMSCs) 유래의 엑소좀 -모사 나노베지클( exosome -mimetic nanovesicles , NVs )의 분석

(1) 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM)

글로-방전 탄소-코팅 구리 그리드(glow-discharged carbon-coated copper grids)(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)에 정제된 NVs을 가하였다. NVs가 1시간 동안 그리드 상에 흡수되도록 한 후, 그리드를 4% 파라포름알데하이드로 10분간 고정시켰으며 탈이온수의 물방울로 세척한 다음, 2% 우라닐 아세테이트(Ted Pella, Redding, CA)로 음성 염색(negative stain)하였다. 전자 현미경 사진은 100 kV의 가속 전압에서 JEM 1011 microscope(JEOL, Tokyo, Japan)로 기록되었다.

(2) 동적 광 산란법(Dynamic light scattering; DLS)

NVs의 크기 분포를 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instrument Ltd., Malvern, U.K.)로 측정하였다. 상대적 빈도에 기초한 크기 분포는 10 × 30 s에 대한 산란 강도에서 샘플을 통과하는 적외선(파장 = 633 nm)으로 측정하였다.

시험예 3. 인간 중간엽 줄기세포(Human mesenchymal stem cells, hMSCs) 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(exosome-mimetic nanovesicles, NVs) 효능의 인 비보( in vivo ) 분석

(1) Matrigel plug assay

상기 제조한 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 신생 혈관 생성 및 면역세포 침윤 효과를 확인하기 위해서, 세포 외 기질 성분 복합체인 Matrigel(0.5mL)에 엑소좀-모사 나노베지클(10 μg)을 섞어 6주령 수컷 마우스에 피하 주사하고, 7일 후에 주입한 Matrigel을 얻어 면역형광염색법을 수행하였다. 양성 대조군으로는 VEGF(250 ng)을 사용하였다. 내피세포 마커인 CD31과 대식세포 마커인 F4/80를 염색하였고, Hoechst을 활용하여 세포의 핵을 염색한 후, 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 관찰하였다(도 4 참조).

시험예 4. 인간 중간엽 줄기세포(Human mesenchymal stem cells, hMSCs) 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(exosome-mimetic nanovesicles, NVs) 효능의 인 비트로( in vitro ) 분석

(1) Proliferation assay(WST-1)

인간 내피세포(Human microvascular endothelial cell, HMEC-1)를 96-웰 플레이트에 5 × 10⁴ cells/well씩 분주하여 배양하고, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 다양한 농도(0, 0.1, 1, 10 μg/mL)로 처리한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. Washing 과정 없이, 배양액에 WST-1 시약을 10 μL/well로 첨가한 후 4시간 동안 37 ℃에서 배양하고 420-480 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 VEGF(10 ng/mL)를 사용하였다.

(2) Migration assay(Boyden chamber assay)

폴리카보네이트 멤브레인(8-μm pore: 대식세포, 12-μm pore: 내피세포)을 0.1% 젤라틴으로 코팅하였다. 세포는 5 μM의 5-chloromethylfluorescein diacetate(CMFDA)가 포함된 serum-free media로 30분 동안 37 ℃에서 배양하여 세포질을 염색한 후, 염색이 끝난 세포는 새로운 serum-free media로 재현탁시켰다. 아래쪽 챔버에 CMFDA로 염색된 세포를 3 × 10⁴ cells/well로 분주하고, 그 위에 젤라틴으로 미리 코팅한 멤브레인을 올렸다. 이후, 챔버를 뒤집어서 2시간 동안 37 ℃의 인큐베이터에서 배양한 다음, 다시 챔버를 뒤집어서 위쪽 챔버에 처리하고자 하는 다양한 농도의 엑소좀-모사 나노베지클 또는 세포 배양액(CM)을 넣은 후, 뒤집어서 2시간 동안 37 ℃의 인큐베이터에서 추가 배양하였다. 세포의 이동이 끝나면, 70% ice-cold 에탄올을 이용하여 고정시킨 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 양성 대조군으로는 VEGF(10 ng/mL) 및 EGM2-MV를 사용하였다.

(3) Preparation of conditioned medium(CM)

마우스 유래 대식세포(RAW264.7)를 배양하고, 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 1 μg/mL)의 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 죽은 세포 등을 제거하기 위해, 500 ×g, 5분간 원심분리를 한 후 0.22 μm filtration을 통해 대식세포 유래 세포 배양액(CM)을 얻었다.

(4) RNA isolation and Real-time PCR

Trizol을 이용하여 세포의 RNA를 분리한 후, High capacity RNA to cDNA kit(AB Applied Biosystems)를 활용하여 cDNA을 만들었다. 각 cDNA(30ng)는 One Step SYBR RT-PCR Kit(TaKaRa Bio)를 활용하여 LightCycler 2.0 PCR system(Roche Diagnostics)으로 real-time PCR을 진행하였다. 이때, 사용한 프라이머의 종류는 다음과 같다.

서열번호 1 : hKGF Forward 5'-AAAGGGGATTCCTGTAAGAG-3'

서열번호 2 : hKGF Reverse 5'-TGCTGGAACTGGTTCTTTAT-3'

서열번호 3 : hTGF-α Forward 5'-TGTTATCTTCAAGCCAGGTT-3'

서열번호 4 : hTGF-α Reverse 5'-GGTCTCCTGAGCAGTGTTAG-3'

서열번호 5 : hGAPDH Forward 5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3'

서열번호 6 : hGAPDH Reverse 5'-TTCACACCCATGACGAACAT-3'

시험결과 1. 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀 -모사 나노베지클의 제조 및 분석 결과

중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하기 위해서, 세포를 passage 6까지 계대배양하고 신생 혈관 생성 효과를 증가시키기 위해서, TNF-α(20 ng/mL)를 처리하여 12시간 추가 배양하여 엑소좀-모사 나노베지클을 제조하였으며, 도 2a 및 2b에서 보는 바와 같이 제조된 엑소좀-모사 나노베지클의 형태와 크기를 투과 전자 현미경 및 동적 광산란 분석을 통해 확인하였다. 제조된 엑소좀-모사 나노베지클은 47.55 ± 5.03 nm의 평균 직경을 갖는 것으로 나타났다.

또한, 동일한 배양 조건에서 분리 및 정제한 기존의 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀과 본 명세서에 따른 엑소좀-모사 나노베지클의 수득률을 비교하면, 1개의 150 mm 배양 접시를 기준으로 엑소좀-모사 나노베지클은 엑소좀에 비해 단백질 양으로는 약 40배, 입자수로는 약 150 배 많은 양을 얻을 수 있음을 확인하였다(도 3 참조). 따라서, 종래 분리 및 정제가 어렵고 수득률이 매우 낮아 그 활용이 어려운 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀이 갖는 문제를 해결할 수 있다.

시험결과 2. 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 신생 혈관 생성 효과

(1) 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 신생 혈관 생성 및 면역세포 침윤 효과

중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 신생 혈관 생성 및 면역세포 침윤 효과를 확인하기 위해서, 세포 외 기질 성분 복합체인 Matrigel에 엑소좀-모사 나노베지클을 섞어 마우스에 피하 주사하고 7일 뒤 주입한 Matrigel을 얻어 면역형광염색법을 시행하였다.

내피세포 마커로 잘 알려진 CD31을 활용하여 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 신생 혈관 생성 효과를 확인한 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 대조군(PBS)에 비해 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(10 μg) 그룹은 Matrigel 내부에 새로운 혈관을 많이 생성하였으며, 이는 기존에 혈관 관련 연구에서 많이 사용하는 양성 대조군인 VEGF(250 ng)와 유사한 효과임을 확인하였다. 특히, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클 그룹은 VEGF 그룹보다 곧고 길쭉하며, 끊어짐이 적은 혈관을 더 많이 관찰할 수 있었다.

또한, 신생 혈관이 생성된 주변의 면역세포 침윤 정도를 확인하기 위해서, 대식세포 마커인 F4/80을 활용하여 Matrigel 절편을 염색한 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 CD31 염색 결과와 유사하게 PBS 그룹에 비해 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(10 μg) 그룹에서 Matrigel 내로 많은 수의 대식세포가 침윤되었음을 확인하였다. 이는 양성 대조군인 VEGF(250 ng)와 유사한 효과였다. 더불어, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클 그룹과 달리 VEGF 그룹은 침윤된 대식세포가 새롭게 생성된 혈관 주변(흰색 실선)에 더 많이 모여 있는 현상이 관찰되었다. 이러한 현상은 혈관 및 혈관 주변에 손상 또는 그로 인한 재생 등이 일어나는 경우에 관찰되는 것으로서(Int J Dev Biol., 55(4-5):495-503, 2011), VEGF에 의해 새롭게 생성된 혈관이 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클에 의해 생성된 혈관에 비해 건강하지 않음을 간접적으로 알 수 있었다.

결론적으로, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 신생 혈관 생성 및 면역세포 침윤 효과를 확인하였다.

(2) 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 내피세포 증식 및 이동에 미치는 영향

중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 Matrigel 내부에 새로운 혈관을 생성하는 효과가 내피세포의 증식 또는 이동에 의한 효과인지 확인하기 위해서, 인간 내피세포(Human microvascular endothelial cell, HMEC-1)를 배양하고 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 다양한 농도(0, 0.1, 1, 10 μg/mL)로 처리한 후 내피세포의 증식 및 이동 효과를 확인하였다.

WST-1 proliferation assay로 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 처리된 내피세포의 증식률을 확인한 결과, 다양한 농도의 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클 처리 여부와 상관 없이 내피세포의 증식 효과는 확인하지 못하였다(도 7의 A 참조). 그러나, boyden chamber assay를 통해 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 처리된 내피세포의 이동 효과를 확인한 결과, 1 μg/mL의 농도에서 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클의 내피세포 이동 효과가 가장 높음을 확인하였다(도 7의 B, C 참조). 양성 대조군으로는 VEGF(10 ng/mL)를 사용하였다.

(3) 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 대식세포 이동에 미치는 영향

중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 신생 혈관 생성 지역으로 면역세포 침윤을 직접적으로 유도하는지 확인하기 위해서, 마우스 대식세포(Raw264.7)를 배양하고 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 1 μg/mL)로 처리한 후 대식세포의 이동 효과를 확인하였다.

Boyden chamber assay를 통해 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 처리된 대식세포의 이동 효과를 확인한 결과, 기존과 유사하게 1 μg/mL의 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 처리된 대식세포가 가장 많이 이동하였으며, 양성 대조군으로 처리한 VEGF(10 ng/mL)보다 더 많은 대식세포 이동 유도 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

결과를 종합해 보면, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클은 내피세포와 대식세포의 이동을 유도하여 신생 혈관을 형성하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 이에 따라, 세포의 손상 등의 증상 완화 및 개선 효과를 기대할 수 있음을 확인하였다.

(4) 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클로 처리된 대식세포가 내피세포 이동에 미치는 영향

중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 대식세포를 통해 간접적으로 내피세포의 이동에 미치는 영향을 확인하기 위해, 마우스 대식세포(Raw264.7)를 배양하고 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 1 μg/mL)의 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포 배양액(conditioned medium, CM)을 얻었다. 세포 배양액은 상기와 동일한 시험 방법을 통해 내피세포의 이동 효과를 확인하였다.

Boyden chamber assay를 통해 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클로 처리된 대식세포 세포 배양액의 내피세포 이동 효과를 확인한 결과, 기존과 유사하게 1 μg/mL의 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 처리된 대식세포에서 얻은 세포 배양액에서 내피세포 이동 효과가 가장 높은 것을 확인하였다(도 9 참조). 또한, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클을 내피세포에 직접 처리한 것과 유사 혹은 더 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다. 양성 대조군으로는 VEGF(10 ng/mL)를 사용하였다.

이에 따라, 중간엽 줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클이 생체 내에서 면역세포(대식세포 등)의 침윤을 유도하고, 이들에 의해 내피세포의 이동이 유도 또는 촉진됨으로써 최종적으로 신생 혈관 형성에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 일 측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 주사제

엑소좀-모사 나노베지클 50 mg, 주사용 멸균 증류수 적량, pH 조절제 적량을 혼합하고, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

[제형예 2] 연질캅셀제

엑소좀-모사 나노베지클 50mg, L-카르니틴 80~140mg, 대두유 180mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 6mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 1캡슐 당 400mg씩 충진하여 연질캅셀제를 제조하였다.

[제형예 3] 정제

엑소좀-모사 나노베지클 50mg, 갈락토올리고당 200mg, 유당 60mg 및 맥아당 140mg을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6mg을 첨가하여 타정기로 타정하여 정제를 제조하였다.

[제형예 4] 과립제

엑소좀-모사 나노베지클 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 과립제를 제조하였다.

[제형예 5] 드링크제

엑소좀-모사 나노베지클 50mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300ml를 가하여 각 병에 200ml씩 충진하였다. 병에 충진한 후 130℃에서 4~5초간 살균하여 드링크제 음료를 제조하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PROMOTING ANGIOGENIC ACTIVITY COMPRISING EXOSOME-MIMETIC NANOVESICLES DERIVED FROM ADULT STEM CELLS <130> 16P247/IND <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 aaaggggatt cctgtaagag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 tgctggaact ggttctttat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 tgttatcttc aagccaggtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 ggtctcctga gcagtgttag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 cgagatccct ccaaaatcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 ttcacaccca tgacgaacat 20

Claims

성체줄기세포 유래의 엑소좀-모사 나노베지클(exosome-mimetic nanovesicles)을 유효성분으로 포함하며, 상기 성체줄기세포는 passage 6까지 계대배양한 후 TNF-α를 처리하여 배양한 것이고,
상기 엑소좀-모사 나노베지클은 42 내지 53 nm의 평균 직경을 갖는 것인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 엑소좀-모사 나노베지클은 성체줄기세포를 2개 이상의 크기가 다른 멤브레인 필터로 크기가 큰 필터에서 작은 필터 순으로 순차적으로 통과시킨 성체줄기세포의 여과물에 포함된 나노 크기의 베지클인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 엑소좀-모사 나노베지클은 48 내지 52 nm의 평균 직경을 갖는 것인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 엑소좀-모사 나노베지클은 성체줄기세포의 여과물로부터 10% 및 50% 농도의 이오딕사놀을 이용한 밀도 구배 초원심분리 시, 10% 농도의 이오딕사놀과 50% 농도의 이오딕사놀 사이에 위치하는 것인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 피부, 지방 및 태반으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
삭제
삭제
제 2항에 있어서,
상기 멤브레인 필터는 1 내지 10 ㎛ 크기의 평균 공극을 갖는 것인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 초원심분리는 100,000 ×g 이상에서 수행하는 것인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 혈관 내피세포의 이동을 유도 또는 증가시키는 것인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 혈관 신생이 요구되는 질환에서 혈관 신생을 촉진하는 것인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 혈관 신생이 요구되는 질환은 상처, 화상, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 뇌혈관성 질환 및 탈모증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물인, 혈관 신생 촉진용 조성물.
제 1항 내지 제 5항, 제 8항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 혈관 신생 촉진용 조성물을 제조하는 방법으로서,
(1) 성체줄기세포를 passage 6까지 계대배양한 후 TNF-α를 처리하여 배양하는 단계;
(2) 배양된 성체줄기세포를 수확하여 완충용액에 현탁시키는 단계;
(3) 상기 현탁액을 2개 이상의 크기가 다른 멤브레인 필터로 크기가 큰 필터에서 작은 필터 순으로 순차적으로 통과시켜 여과물을 제조하는 단계; 및
(4) 상기 여과물로부터 초원심분리를 통해 42 내지 53 nm의 평균 직경을 갖는 엑소좀-모사 나노베지클을 수득하는 단계;를 포함하는 혈관 신생 촉진용 조성물을 제조하는 방법.