CN117769353A - 细胞外囊泡冻干保护剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可以保留细胞外囊泡的功能以及特性的细胞外囊泡冻干保护组合物以及利用其的细胞外囊泡冻干方法。本发明将海藻糖以及蔗糖添加到细胞外囊泡冻干工序中，从而可以解决现有冻干保护剂存在的结晶形成以及复溶能力减少的问题，同时保持细胞外囊泡固有的标志物、功能因子的表达以及治疗效果，因此可以以各种方式应用于生产利用细胞外囊泡的各种治疗剂。

Description

细胞外囊泡冻干保护剂
技术领域
本发明涉及一种可以保留细胞外囊泡的功能及特性的细胞外囊泡冻干保护组合物以及利用其的细胞外囊泡冻干方法。
背景技术
针对各种疾病已有报道利用干细胞，尤其是间充质干细胞(mesenchymal stemcells；MSC)的治疗方法以及积极的临床结果。然而，干细胞治疗剂存在产生血管闭塞、形成肿块、凝血障碍等细胞相关副作用的风险，至今仍需通过临床试验来验证功效。众所周知，干细胞的旁分泌(paracrine)效果诱导周围皮肤细胞再生以及增强血管再生能力，尤其，已知细胞外囊泡(extracellular vesicles；EV)为旁分泌效果的主要功效因子。
细胞外囊泡根据大小分为外泌体(exosome)以及微囊泡(microvesicle)，外泌体的直径为30～150nm，微囊泡的大小为100～1000nm。众所周知，细胞外囊泡是释放到血液中的细胞膜的一部分，由于包含蛋白质以及核成分而介导细胞之间的通讯。使用细胞外囊泡代替干细胞不仅使由于使用干细胞而导致的副作用最小化以提高稳定性，还有利于生物分布(biodistribution)以及生产工序。
然而，即使细胞外囊泡有用，到目前为止仍然缺乏对用于将难以得到的细胞外囊泡分离后稳定地保持以及储存的方法的技术以及对稳定剂型的研究。
因此，需要一种用于稳定地保持及储存可用作针对各种疾病的治疗物质的细胞外囊泡的新的保存方法。
发明内容
技术问题
对此，本发明人在对用于稳定地保持以及储存细胞外囊泡的技术进行研究的过程中，确认到可以有效改善在冻干过程中可能出现的问题，并保持细胞外囊泡固有的性质以及功能的新型冻干保护剂，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及一种包含海藻糖以及蔗糖的细胞外囊泡冻干保护组合物以及利用其的细胞外囊泡冻干方法。
解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供一种细胞外囊泡冻干保护组合物，其包含海藻糖以及蔗糖。
并且，本发明提供一种细胞外囊泡冻干保护剂，其包含海藻糖以及蔗糖。
并且，本发明提供一种细胞外囊泡冻干组合物，其包含海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂；以及细胞外囊泡。
并且，本发明提供一种细胞外囊泡的冻干方法，包括：步骤1)，将海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂和细胞外囊泡混合；以及步骤2)，冻干上述步骤1)中的混合物。
发明的效果
本发明将海藻糖以及蔗糖添加到细胞外囊泡冻干工序中，从而可以解决现有冻干保护剂中存在的晶体形成以及复溶能力减少的问题，并保持细胞外囊泡固有的标志物、功能因子的表达以及治疗效果，因此可以以各种方式应用于生产利用细胞外囊泡的各种治疗剂。
附图说明
图1为示出通过肉眼确认添加二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖、甘露糖醇作为冻干保护剂后进行冻干以及复水的细胞外囊泡的结果的图。
图2为示出将海藻糖、甘露糖醇用作冷冻保护剂处理并冻干后复水，然后通过qNano测定确认所得到的细胞外囊泡(EV)的数量((A)部分)以及大小分布((B)部分)的结果的图。
图3的(A)部分以及(B)部分为示出在没有细胞外囊泡(EV)的情况下仅冻干单独磷酸盐缓冲溶液(PBS)、稀释于酸盐缓冲溶液(PBS)中的甘露糖醇((A)部分)、海藻糖((B)部分)，然后通过X射线衍射(X射线衍射(XRD))峰分析确认纳米颗粒形成的结果的图。图3的(C)部分为示出通过qNano分析确认在将磷酸盐缓冲溶液(PBS)、0.07或0.17％的海藻糖(T)冻干后复溶的实验组中生成的未指定纳米颗粒的结果的图(Lyo：冻干实验组，-80：在-80℃的温度下冷冻后复溶的实验组)。图4的(D)部分为示出48小时内在常温下确认将磷酸盐缓冲溶液(PBS)、0.07％的海藻糖(T)冻干后所形成的未指定纳米颗粒的复溶的结果的图。
图4的(A)部分为示出通过qNano测定来确认在没有细胞外囊泡(EV)的情况下，对单独海藻糖(T)进行冻干以及复溶的实验组以及对海藻糖和蔗糖(T+S)的混合物进行冻干以及复溶的实验组中产生的未指定纳米颗粒的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图4的(B)部分为示出20分钟内确认在没有细胞外囊泡(EV)的情况下，对单独海藻糖(T)进行冻干以及复溶的实验组以及对海藻糖和蔗糖(T+S)的混合物进行冻干以及复溶的实验组中产生的未指定纳米颗粒的复溶以及溶解速度的结果的图。
图4的(C)部分为示出通过X射线衍射(XRD)分析确认在没有细胞外囊泡(EV)的情况下，对单独海藻糖(T)进行冻干以及复溶的实验组以及对海藻糖和蔗糖(T+S)的混合物进行冻干以及复溶的实验组中产生的晶体的结果的图。
图5为示出确认用浓度为2％至8％的海藻糖和蔗糖混合的冻干保护剂处理后进行冻干以及复溶的细胞外囊泡(EV)的EV颗粒数量的结果的图。
图6为示出确认用混合海藻和蔗糖的冻干保护剂处理后进行冻干以及复水的细胞外囊泡(EV)的大小分布变化的结果的图。
图7为示出确认冷冻电子显微镜(Cryo-EM)数据中各实验组的EV形状的结果的图。
图8为示出确认用混合2％至8％的海藻糖和蔗糖的冻干保护剂处理后进行冻干以及复水的细胞外囊泡(EV)中蛋白质总量的变化的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图9为示出确认用混合2％至8％的海藻糖和蔗糖的冻干保护剂处理后进行冻干以及复水的细胞外囊泡(EV)中RNA总量以及与治疗功效相关的miRNA表达量的变化的结果的图。
图10为示出确认用混合2％至8％的海藻糖和蔗糖的冻干保护剂(TS)处理后进行冻干以及复水的细胞外囊泡(EV)中EV标志物CD63的表达的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图11为示出通过用磷酸盐缓冲溶液(PBS)、血管内皮生长因子(VEGF)、新鲜细胞外囊泡(Fresh EV)以及混合海藻和蔗糖的冻干保护剂(TS)处理后进行冻干以及复水的细胞外囊泡(EV)的血管生成能力以及细胞迁移能力来确认血管再生效果的结果的图(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
具体实施方式
本发明提供一种包含海藻糖以及蔗糖的细胞外囊泡冻干保护组合物以及利用其的细胞外囊泡冻干方法。
本发明的细胞外囊泡冻干保护组合物可以解决现有冻干保护剂中存在的晶体形成以及复溶能力减少的问题，并保持或增加细胞外囊泡的固有标志物、功能因子的表达以及治疗效果。
以下，详细说明本发明。
本发明作为细胞外囊泡冻干保护剂可以包含海藻糖以及蔗糖作为有效成分，并提供一种包含海藻糖以及蔗糖的细胞外囊泡冻干保护组合物以及包含海藻糖以及蔗糖的细胞外囊泡冻干保护剂。如上所述，当混合海藻糖和蔗糖并用其处理细胞外囊泡时，不仅可以解决如海藻糖、甘露糖醇、蔗糖等单一成分在冻干过程中因磷酸盐缓冲溶液(PBS)成分与盐形成晶体而产生不明纳米颗粒的问题，还可以增加复溶冻干的细胞外囊泡时的溶解速度。
因此，本发明提供一种细胞外囊泡冻干组合物，其包含海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂；以及细胞外囊泡。
上述海藻糖以及蔗糖可以为分别1％(w/v)至10％(w/v)的海藻糖以及蔗糖，优选地，可以为2％(w/v)至9％(w/v)，更优选地，可以为2％(w/v)至8％(w/v)。当使用小于1％(w/v)的海藻糖或蔗糖时，可能存在产生许多不明纳米颗粒晶体，并且复溶速度也可能变慢。
本发明的特征在于，添加海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂的有效成分，优选地，可以以1：0.05至5的体积比混合上述海藻糖和蔗糖，更优选地，可以以1:0.5至3的体积比，更加优选地，可以以1:0.5至2的体积比混合。在本发明优选一实例中，利用以1:1的体积比混合的冻干保护剂以确认效果。
本发明的冻干保护组合物可以包含将1％(w/v)至10％(w/v)的海藻糖和蔗糖以1：0.05至5的体积比混合的混合物，可以包含将上述浓度的海藻糖以及蔗糖以1：0.1至3的体积比，更优选地，以1:0.5至1的体积比混合的混合物。
本发明的混合海藻糖和蔗糖的冻干保护剂组成可以减少细胞外囊泡的冻干、复水以及复溶过程中产生的晶体形成。
作为冻干保护剂的海藻糖以及蔗糖可以与作为冻干对象的细胞外囊泡以1：0.5至5的体积比，优选地，以1：0.5至3的体积比，更选地，以1：0.5至2的体积比混合。
可以通过混合上述冻干保护剂和细胞外囊泡并在-70℃至-90℃的温度下冷冻，然后在冻干机中冻干3天至7天来制备冻干的细胞外囊泡。
冻干保护剂以磷酸盐缓冲溶液(PBS)为基础稀释并制备，并且可以在冻干后复溶的过程中利用灭菌的蒸馏水。通过这种过程，将组成磷酸盐缓冲溶液(PBS)的化合物与细胞外囊泡再次溶解于蒸馏水中，可以使细胞外囊泡保存在磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
作为本发明的冻干对象的细胞外囊泡可以为从自然界生物个体中分离的细胞中分离的细胞外囊泡或从如牛奶等成分中分离的细胞外囊泡。并且，上述细胞可以来源于包括人类以及非人类哺乳类在内的任意种类的动物、植物，可以为各种类型的免疫细胞、肿瘤细胞、干细胞，优选地，上述干细胞可以为间充质干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
细胞外囊泡(Extracellular vesicle)是指释放到细胞外部的囊泡，包括微囊泡、凋亡囊泡、外泌体等。因此，本发明可以没有限制地包含可以通过添加海藻糖以及蔗糖作为冻干保护剂来实现其目的的各种细胞外囊泡，例如，细胞外囊泡可以为外泌体。
本发明的外泌体是指包括所有具有从各种动物、植物、细菌(bacteria)、真菌类(fungi)、藻类(algae)等的细胞中分泌并释放到细胞外空间的纳米级的囊泡结构并具有与外泌体相似的组成的囊泡(例如，外泌体样囊泡)。尤其，本发明的外泌体可以为来源于干细胞的外泌体。
在本发明中，上述细胞外囊泡可以为表现出治疗有用效果的细胞外囊泡，在这种细胞外囊泡的冻干过程中用本发明的冻干保护剂组合物以及冻干保护剂处理，从而可以保持细胞外囊泡的同等水平以上的固有特征、性质、治疗效果。
在本发明中，当添加海藻糖以及蔗糖并冻干细胞外囊泡时，确认到不仅抑制冻干过程中形成不需要的不明纳米颗粒晶体，其复水、溶解速度显著加快，进而，确认到细胞外囊泡所具有的总蛋白质的量、总RNA的量没有损失，表现出治疗效果的miRNA水平也同样保持。并且，经确认，与冻干之前相比，细胞外囊泡的标志物CD63也表现出相似或增加的表达模式。
通过冻干保护剂保持其功效的细胞外囊泡的治疗功效可以为广泛的再生或免疫调节作用作为细胞外囊泡固有的治疗功效，例如，可以为血管再生能力。通过本发明的冻干保护剂冻干的细胞外囊泡可以用作药物组合物、化妆品组合物、食品组合物、皮肤外用组合物，可以以口服或肠胃外给药。
可以应用本发明的冻干的细胞外囊泡的需要血管新生的疾病可以为选自由烧伤、溃疡、缺血、动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、心血管疾病、脑血管疾病以及脱发症组成的组中的一种以上，尤其，可以为心血管疾病或脑血管疾病。
除了上述有效成分以外，本发明的包含冻干的细胞器囊泡的药物组合物还可以包含在药物组合物的制备中常用的合适的载体、赋形剂以及稀释剂。本发明的药物组合物还可以包含除此以外的其他药物活性成分或活性混合物。
本发明的药物组合物可以根据分别的常规方法配制成如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等口服剂型、外用剂、栓剂以及无菌注射溶液形式使用。可以包含在组合物中的载体、赋形剂以及稀释剂可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇，木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁以及矿物油。当配制时，通过使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂通过在上述组合物中混合一种以上的赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙(Calcium carbonate)、蔗糖(Sucrose)或乳糖(Lactose)、明胶等来制备。并且，除了简单赋形剂以外，还使用硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。
用于口服的液体制剂包括悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除了水或液体石蜡等常用的简单稀释剂以外，可以包含各种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。可以使用如丙二醇(Propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、如油酸乙酯等可注射的酯类作为非水溶剂、悬浮剂。可以使用半合成脂肪酸酯(Witepsol)、聚乙二醇、吐温(Tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶作为栓剂的基质。
本发明的药物组合物的优选给药量根据患者的状态以及体重、疾病的程度、药物形式、给药途径以及期间而异，但可以由本领域的普通技术人员适当选择。可以一天一次给药，也可以分成多次给药。上述给药量不在任何方面限制本发明的范围。
本发明的药物组合物可以通过各种途径给药到小鼠、大鼠、家畜、人类等哺乳动物。可以预测给药的所有方式，例如，可以通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑血管内(Intracerebroventricular)注射来给药。
本发明的上述赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香料的术语定义记载于本领域公知的文献中，包括具有相同或相似功能的含义。
并且，本发明提供一种细胞外囊泡的冻干方法，包括：步骤1)，将海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂和细胞外囊泡混合；以及步骤2)，冻干上述步骤1)中的混合物。
对本冻干方法的说明可以同样应用关于上述冻干保护组合物、冻干保护剂的说明。
在上述冻干方法中，步骤2)的进行冻干的步骤可以包括在-70至-90℃的温度下冷冻后冻干3天至7天的步骤。上述冷冻可以进行过夜，冻干步骤可以在1毫托至7毫托(mTorr)的压力下进行，可以进行1、2或3次冻干过程。
考虑到本说明书的复杂性，省略重复的内容，未在本说明书中另外定义的术语具有本发明所属领域的普通技术人员常用的含义。
未在本说明书中另外定义的术语具有本发明所属领域的普通技术人员常用的含义。
以下，通过实施例详细说明本发明。但是，下述实施例仅用于示例本发明，本发明的内容不限于下述实施例。
本发明的实施方式
实施例1.培养细胞以及收集细胞外囊泡
培养人骨髓来源干细胞，以收集外泌体作为即将用于实验的细胞外囊泡(Extracellular vesicle；以下称为EV)。将细胞以2.5×105个细胞(cells)的浓度在100mm的培养盘(culture dish)(SPL，20100)中培养，并在过滤至0.2μm的低葡萄糖杜氏改良Eagle培养基(low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，美国加利福尼亚州生命技术公司(Life Technologies Corporation，CA，USA))、10％的胎牛血清(Fetalbovine serum，FBS，生命技术公司(Life Technologies Corporation))以及1％的抗生素-抗真菌素(antibiotics-antimycotics)(生命技术公司(Life TechnologiesCorporation))的培养基中培养。从P2到P6，每80～90％进行一次传代培养，并在37℃的5％CO2的条件的培养箱中培养。
P6之后，将以相同条件培养的干细胞在由低葡萄糖DMEM(low-glucose DMEM)、10％的去外泌体胎牛血清(exosome depleted Fetal bovine serum)(美国加利福尼亚州帕洛阿托系统生物科学公司(System Biosciences，Palo Alto，CA，USA))以及1％的抗生素-抗真菌素(antibiotics-antimycotics)组成的培养基中培养5天。然后，收集培养液并以4℃的温度、2500g、10分钟(min)的条件离心，仅取上清液并以过滤至0.2μm。将以此方式收集的培养基(medium)立即进行切向流过滤(Tangential flow filtration，TFF)并分别进行浓缩以及缓冲液置换(渗滤，diafiltration)，相对于初始体积，进行约10倍程度的浓缩。在此情况下，膜(membrane)使用Minimate切向流过滤300K膜(Minimate TFF 300Kmembrane)(美国纽约颇尔公司(Pall Corporation，NY，USA))。通过如上所述的工序收集外泌体并将其用于随后的冻干实验中。
实施例2.冻干处理
为了对EV进行冻干，与实施例1相同地收集EV后，通过使用可调电阻脉冲传感(Tunable resistive pulse sensing)技术的qNano(新西兰基督城IZON公司(IZON Ltd，Christchurch，New zealand))测定大小以及浓度。然后，以1:1的体积比混合冻干保护剂和外泌体，使得最终浓度为1×1011EVs/ml。使用海藻糖(美国密苏里州圣路易斯西格玛(Sigma，St.Louis，MO，USA))、甘露糖醇(西格玛(Sigma))、二甲基亚砜(DMSO)(西格玛(Sigma))以及蔗糖(西格玛(Sigma))作为用于筛选适合外泌体的冻干保护剂的候选组。
作为实验组，将浓度为0～5％(w/v)的甘露糖醇、0～10％(w/v)的二甲基亚砜(DMSO)、0～4％(w/v)的海藻糖设定为单独给药组，并用浓度分别为2％(w/v)至8％(w/v)的蔗糖以及海藻糖以1:1的体积比混合的混合物作为实验组。混合后在-80℃的温度下放置过夜(overnight)，然后冻干(-80℃，5毫托(mTorr))4天。冻干完成后密封并在常温下储存。通过这种方式储存的样品经过复水过程后用于实验，并在复水过程中将过滤至0.2μm的去离子水添加至原混合物的容量并在37℃的温度下保持30分钟后使用。
实施例3.冻干后肉眼分析
将浓度改变为0～10％的二甲基亚砜(DMSO)、0.1～5％的甘露糖醇、0.03～0.17％的海藻糖作为冻干保护剂和外泌体混合，并将通过肉眼确认冷冻状态以及复水后状态的结果示于图1中。
如图1所示，当通过肉眼观察时，海藻糖以及甘露糖醇在冻干后存在细小颗粒，因此确认已进行冻干，但二甲基亚砜(DMSO)在冻干后形成类似薄膜的物质，因此确认到二甲基亚砜(DMSO)不适合作为EV的冻干剂。尤其，从肉眼上来看，确认到二甲基亚砜(DMSO)混合组未在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中溶解并存在大颗粒。相反，从肉眼上来看，确认到海藻糖和甘露糖醇的混合组即使在复水后也实现良好的复溶。
实施例4.分析EV浓度以及大小
与实施例2相同地，将海藻糖、甘露糖醇用作冷冻保护剂处理并冷冻后复水，然后通过qNano测量确认所得到的EV的数量以及大小。qNano为通过可调电阻脉冲传感(Tunableresistive pulse sensing)技术测定颗粒的浓度以及大小的设备。实验中使用的纳米孔(nanopore)为NP200、径向拉伸(radial stretch)为46.5mm，施加0.66mV的电压，利用0.075ml的样品测量样品中EV的浓度以及大小。所有样品均通过测量至少500个颗粒(particle)来进行分析，并均利用CPC100(100mm，1.4E+13颗粒/ml(particles/ml)，IZONLtd公司)进行校准(calibration)。将测定结果示于图2中。另一方面，由于二甲基亚砜(DMSO)处理组未在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中很好地溶解，因此无法进行qNano测量。
如图2所示，新鲜EV(Fresh EV)组为分离EV后立即测量qNano的实验组，尽管在将与新鲜EV组相同量的EV和冻干保护剂混合并复水后测量EV数量，也确认到所有海藻糖给药组、甘露糖醇给药组以及磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理组中纳米颗粒的数量增加。这意味着额外产生大量除EV以外的不明纳米颗粒，qNano的纳米颗粒大小分布分析结果确认，不明纳米颗粒具有与EV相似的大小，也在80nm至300nm的范围内。
实施例5.分析用冻干保护剂处理后的EV的X射线衍射(XRD)
众所周知，冻干保护剂由于磷酸盐缓冲溶液(PBS)成分能够与盐形成晶体，并在特定条件下能够促进晶化。为了确认如实施例4中所确认的除EV以外新形成的不明纳米颗粒，在没有EV的情况下进冻干单独磷酸盐缓冲溶液(PBS)、稀释于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的甘露糖醇、海藻糖，并通过X射线衍射(XRD)分析确认冻干后是否形成纳米颗粒。利用Smartlab(日本理学公司(Rigaku，JP))在Cu射线(Cu radiation)(45kV×200mA)处测定X射线衍射(XRD)以分析内部结构。将2θ的范围设为2至45、步长(step size)设为0.05°、停留时间(dwell time)设为2秒(sec)来进行分析，并将其结果示于图3中。在X射线衍射(XRD)峰分析中，22°至23°以及27°至28°的峰表示因磷酸盐缓冲溶液(PBS)成分而形成的氯化钠的晶体，32°至33°的峰表示磷酸盐的晶体。
如图3所示，添加甘露糖醇后冻干的实验组(图3的(A)部分)的X射线衍射(XRD)峰分析结果，除了因磷酸盐缓冲溶液(PBS)成分而形成的盐晶体以外还产生许多峰，这结果表示甘露糖醇成分本身形成晶体。众所周知，甘露糖醇为结晶性冷冻保护剂，总共具有3种形式的晶体。其中，已知作为代表性的晶型之一的β甘露糖醇的晶体为稳定状态的晶体，因此不容易溶于水中。另一方面，在海藻糖(图3的(B)部分)的情况下，确认到仅形成因磷酸盐缓冲溶液(PBS)成分而产生的氯化钠的晶体以及磷酸盐的晶体的峰。
图3的(C)部分为示出当在没有EV的情况下仅冻干磷酸盐缓冲溶液(PBS)或海藻糖溶液后复溶时，通过qNano分析确认形成以往不存在的未指定纳米粒子的结果的图。经确认，在-80℃的温度下仅进行冷冻后解冻而没有冻干的实验组(附图中表示为-80)中，由于全部复溶而没有形成这种纳米颗粒，并在qNano测量中未测定到颗粒。另一方面，与单独用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冻干时相比，0.07％的海藻糖实验组(2mM)或0.17％的海藻糖实验组(8mM)作为低浓度的海藻糖添加实验组形成更多的颗粒。
X射线衍射(XRD)分析结果推测，在用海藻糖/磷酸盐缓冲溶液(PBS)冻干时产生的未指定纳米颗粒为氯化钠以及磷酸盐，因此确认其是否可以随着时间的推移而逐渐溶解。将其在常温下振荡来复溶的结果，如图3的(D)部分所示，确认到在约48小时后几乎所有盐均复溶。
综合如上所述的结果确认，当将海藻糖以低浓度用作冻干保护剂时，在冻干过程中产生晶化的盐，并且其复溶需要消耗较长时间。
实施例6.根据用冻干保护剂处理减少结晶度的实验
在实施例5中确认当使用低浓度的海藻糖作为冻干保护剂时存在产生盐晶体的问题，因此通过将海藻糖的浓度改变为2～4％的实验组、将海藻糖和已知为非结晶性冷冻保护剂的蔗糖混合的实验组确认是否形成纳米颗粒，以解决该问题。将浓度为2％(w/v)至8％(w/v)的海藻糖以及蔗糖以1:1的体积比混合来用作冻干保护剂实验组。利用上述实验组在没有EV的情况下混合冻干保护剂和磷酸盐缓冲溶液(PBS)后复溶，并通过与实施例4、实施例5相同的方法进行qNano分析以及X射线衍射(XRD)分析。将其结果示于图4中。
如图4的(A)部分所示，冻干以及复溶后立即(3分钟以内)进行qNano测量的结果确认，与磷酸盐缓冲溶液(PBS)单独处理组相比，在2％的海藻糖组中测量到一些纳米颗粒，在4％的海藻糖以及1:1的海藻糖和蔗糖的混合物处理组中，因完全复溶而没有测量到纳米颗粒。
在图4的(B)部分中，确认到根据复溶时间的溶解速度，并确认到冻干保护剂的浓度越高，溶解速度越快。尤其，海藻糖和蔗糖的混合溶液在5分钟内实现复溶，因此表现出优异的溶解能力。
如图4的(C)部分所示，经确认，X射线衍射(XRD)分析峰随着冻干保护剂的浓度增加而减少，尤其，海藻糖和蔗糖的混合溶液的晶体形成率非常低。
通过如上所述的结果确认，晶体形成以及复溶能够力随着浓度的增加而增加，尤其，海藻糖和蔗糖的混合物在冻干过程中具有显著低的晶体形成率以及优异的复溶率。
这种结果显示，当使用海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂来冻干EV时，不形成不明纳米颗粒晶体或快速复溶，因此上述混合物适合作为需要通过控制EV的数量给药到患者的EV治疗剂的冻干保护剂。
实施例7.确认混合海藻糖和蔗糖的冻干保护剂的晶体形成抑制效果
由于已确认混合海藻糖和蔗糖的冻干保护剂适合作为EV治疗剂的冻干保护剂，因此进一步确认到当将其实际上应用于实施例1中得到的间充质干细胞的细胞外囊泡(MSC-EV)的冻干时的复溶率，并将其结果示于图5以及图6中。使用通过与实施例2相同的方法用浓度为2、4、8％(w/v)的海藻糖以及蔗糖以1:1的体积比混合的冻干保护剂处理EV后进行冻干以及复溶的实验组、在没有冻干保护剂的情况下对磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的EV进行冻干以及复溶的实验组(0％)、分离未冻干的EV后即刻的新鲜EV(Fresh EV)作为实验组。
用冻干保护剂处理后进行冻干以及复溶，然后确认到EV颗粒数量，并将其结果示于图5中。
如图5所示，经确认，当冻干后复溶时，2％浓度的海藻糖和蔗糖的混合组没有统计显著性的差异，但与新鲜EV(Fresh EV)相比，纳米颗粒的数量略微减少。相反，经确认，浓度为4、8％的实验组中几乎100％保留初始冻干的EV数量并复溶。
当冻干后复溶时，确认到EV大小的变化，并将其结果示于图6中。
如图6所示，在添加冻干保护剂的实验组中表现出与新鲜EV(Fresh EV)相似的大小分布，但在单独添加磷酸盐缓冲溶液(PBS)的实验组中确认到略小的纳米颗粒。
并且，通过冷冻电子显微镜(Cryo-EM)确认到各实验组的EV颗粒的形状。新鲜EV(Fresh EV)实验组可以立即使用，但将冻干的实验组在37℃的温度下复溶30分钟后用于实验。在取样之前，使用辉光放电系统(Glow discharge system)(PELCO easiGlowTM，Tedpella)，以将网格(Grids)(Quantifoil，R1.2/1.3，200目(mesh)，EMS)制成亲水性表面。将4ul的各样品置于网格(grid)上，并在保持4℃的100％湿度的状态下施加1.5秒的螺栓力3(blot force 3)。然后，利用Vitrobot Mark IV(FEI)方法将样品在液体乙烷中进行冷冻，以使样品玻璃化。然后，在纳米生物成像中心(Nanobioimaging center)(韩国首尔大学(Seoul national university，Korea))使用Lab6型枪(gun type Lab6)为120kV的TalosL120C(FEI)显微镜进行分析。将其结果示于图7中。
如图7所示，经确认，在没有本发明的冻干保护剂的情况下仅利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行冻干以及复水的EV中的背景中观察到许多推测为盐的细小颗粒，但在利用混合海藻糖和蔗糖的冻干保护剂的EV中几乎没有观察到细小颗粒。
如上所述的结果表示，在利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)的冻干组中确认到比初始冻干的EV大约2倍的纳米颗粒，并确认到脱离EV大小分布的新的纳米颗粒，因此正如之前所确认的存在晶体形成问题。相反，当用海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂处理时，确认到可以保留EV的数量并通过冻干后复溶来得到EV，而没有这种晶体形成问题。
实施例8.确认混合海藻和蔗糖的冻干保护剂对EV的影响
为了将其用作EV治疗剂的冻干保护剂，重要的是不仅要得到冻干以及复溶后没有EV损失或产生其他物质的EV，还要不影响作为冻干对象的EV的性质以及功能。因此，在用海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂处理后进行冻干以及复溶的EV中确认EV中所包含的总RNA是否完好无损地恢复、是否诱导作为EV的功效因子的miRNA的变化，并确认作为EV标志物的CD63表达变化。
通过如下方法进行蛋白质定量分析：将所有样品用超高速离心机(美国加利福尼亚州贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter，CA，USA))以120000g离心1小时后弃上清液并进行溶胞(lysis)。用RIPA(生命技术公司(Life Technologies Corporation))进行溶胞(lysis)并通过BCA蛋白浓度测定(BCA protein assay)(生命技术公司(LifeTechnologies Corporation))来对蛋白质进行定量。
通过酶联免疫吸附试验(ELISA)确认对作为EV标志物的CD63的分析，并通过如下方法进行：根据制造商的说明书利用常用试剂盒进行ELISA。CD63(EH95RB，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，Inc，waltham，MA，USA))ELISA试剂盒中包含标准蛋白质，因此基于试剂盒的标准曲线来确定蛋白质以及细胞外囊泡的量。在没有预处理过程的情况下，将分离的新鲜EV(Fresh EV)以及冻干的EV与标准品(Standard)一起以等量(200uL/孔(uL/well))接种于涂有捕获抗体(capture antibody)的96微孔板(96well microplate)中，然后在4℃的温度下反应。次日，根据三明治(Sandwich)方式进行ELISA并用酶标仪测定吸光度。
通过qPCR如下进行作为EV的功效因子的miRNA表达分析：根据制造商的指南利用TrizolTM提取RNA并用分光光度计(nanodrop)对RNA进行定量。将RNA通过逆转录(reversetranscription；RT)过程转录为cDNA，并根据制造商的说明书利用适合每种miRNA以及mRNA的Taqman探针(Taqman probe)进行实时荧光定量PCR(Real Time PCR)。
将确认如上所述的EV的蛋白质量、总RNA恢复率、miRNA量、EV标志物表达的变化的结果示于图8至图10中。
如图8所示，与新鲜EV(Fresh EV)相比，磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理组的蛋白质量减少约38％，但用本发明的海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂处理的实验组中表现出蛋白质的减少较少，尤其，在4％以及8％的混合物组中测量到与新鲜EV(Fresh EV)组相似水平的蛋白质量。
如图9所示，当冻干后复溶时，总RNA恢复率在所有实验组中没有表现出具有统计显著性的差异，并且具有治疗功效的miRNA表达也在所有实验组中均匀地表达而没有显著的差异。
如图10所示，作为EV标志物的CD63表达在各实验组之间没有显著的差异。
实施例9.验证用冻干保护剂处理后冻融的EV的血管再生能力
众所周知，EV具有血管再生能力，因此可用作各种需要血管生成的疾病的治疗剂。进行实验以确认与本发明的冻干保护剂混合后冷冻以及复溶的EV是否能够等同程度地保持EV固有的血管再生能力或提高效果。通过利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成能力实验以及细胞迁移能力实验来确认EV血管再生能力。更具体地，为了观察通过实施例1得到的EV的新生血管增殖效果，用EV处理粘附在基质胶(Matrigel)上的HUVEC来确认血管生成效果。具体地，将HUVEC在补充有20％的胎牛血清(FBS)、5U/mL的肝素以及3ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的M199培养基(Gibco公司)中进行培养。将细胞以1.0×104个细胞的密度接种于μ-Slides血管生成载玻片(μ-Slides Angiogenesis)(德国格雷费尔芬伊比迪(ibidi，Graefelfing，Germany))上的生长因子减少基底膜基质胶(MatrigelMatrix)(美国马塞诸塞州BD生物科技(BD Bioscience，MA，USA))，然后在37℃的温度、5％的CO2环境的加湿腔室中生成血管7小时。在相差显微镜(奥林巴斯(Olympus))拍摄图像，并利用ImageJ软件在显微镜视野(4倍倍率)下对血管状结构的数量进行定量。
为了分析细胞迁移能力，将HUVEC在补充有20％的胎牛血清(FBS)、5U/mL的肝素以及3ng/mL的bFGF的M199培养基(Gibco公司)中于37℃的温度、5％的CO2环境的加湿腔室中进行培养。将1.0×105个细胞在24孔板中培养至100％，然后用MMC(2.5ug/ml)处理以停止细胞的分裂。利用移液器头垂直刮擦细胞后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗。在相差显微镜(奥林巴斯(Olympus))下拍摄划痕的图像以标记相应部位。7小时后再次拍摄划伤伤口的相同区域，然后利用ImageJ软件测定细胞迁移使伤口愈合的程度。将用浓度为0(用磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理后进行冻干以及复水)、2、4、8％(w/v)的海藻糖以及蔗糖以1:1的体积比混合的冻干保护剂处理后进行冻干以及复水的EV实验组、新鲜EV(Fresh EV)作为在未用冻干保护剂处理的情况下分离后即刻的EV、阳性对照组VEGF处理组以及磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理组用作冻干保护剂实验组。将用磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理HUVEC的实验组用作阴性对照组。EV均以5×108EV/ml的量处理，VEGF以100ng/ml的量处理。将确认血管生成能力的结果示于图11中。
如图11所示，所有EV处理组均表现出与用VEGF处理的实验组相似水平的血管再生效果，尤其，确认到在用浓度为2％、4％的海藻糖以及蔗糖以1:1的体积比混合的混合物作为冻干保护剂处理后进行冷冻以及复溶的EV处理的实验组中具有优异的血管再生能力。这结果表示，当用本发明的冻干保护剂处理并冻干后复溶时，可以保持以及恢复EV具有的治疗功效而没有损失。
以上，详细说明本发明内容的具体部分，对本领域的普通技术人员来说显而易见的是，这种具体说明仅仅是优选实施方式，本发明的范围并不限于此。因此本发明的实质范围将由所附的发明要求范围以及其等同物定义。

Claims (12)

1.一种细胞外囊泡冻干保护组合物，其特征在于，包含海藻糖以及蔗糖。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡冻干保护组合物，其特征在于，上述海藻糖以及蔗糖的浓度分别为1％(w/v)至10％(w/v)。
3.根据权利要求1所述的细胞外囊泡冻干保护组合物，其特征在于，以1：0.05至5的体积比混合上述海藻糖和蔗糖。
4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡冻干保护组合物，其特征在于，上述海藻糖以及蔗糖减少细胞外囊泡冻干以及复水过程中的晶体形成。
5.根据权利要求1所述的细胞外囊泡冻干保护组合物，其特征在于，以1：0.5至5的体积比混合上述组合物和细胞外囊泡。
6.根据权利要求1所述的细胞外囊泡冻干保护组合物，其特征在于，上述细胞外囊泡为外泌体或微囊泡。
7.根据权利要求1所述的细胞外囊泡冻干保护组合物，其特征在于，上述细胞外囊泡为来源于免疫细胞、肿瘤细胞或干细胞的细胞外囊泡。
8.一种细胞外囊泡冻干保护剂，其特征在于，包含海藻糖以及蔗糖。
9.一种细胞外囊泡冻干组合物，其特征在于，包含海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂；以及细胞外囊泡。
10.根据权利要求9所述的细胞外囊泡冻干组合物，其特征在于，上述细胞外囊泡具有血管再生能力。
11.一种细胞外囊泡的冻干方法，其特征在于，包括：
步骤1)，将海藻糖和蔗糖的混合物作为冻干保护剂和细胞外囊泡混合；以及
步骤2)，冻干上述步骤1)中的混合物。
12.根据权利要求11所述的细胞外囊泡的冻干方法，其特征在于，上述步骤2)包括将步骤1)中的混合物在-70℃至-90℃的温度下冷冻后冻干3天至7天的步骤。
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