JP2024517762A

JP2024517762A - 細胞外小胞の凍結乾燥保護剤

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Publication number: JP2024517762A
Application number: JP2023566769A
Authority: JP
Inventors: チャ、ジャエミン; カン、ウヨン; キム、ウンニ; シン、ウンギョン; バン、ジャエボク
Original assignee: S&e Bio Co Ltd
Current assignee: S&e Bio Co Ltd
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2024-04-23
Also published as: WO2022231347A1; CN117769353A; KR20220148124A; EP4331361A1

Abstract

本発明は、細胞外小胞の機能および特性を維持することができる細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物およびこれを用いた細胞外小胞の凍結乾燥方法に関するものである。本発明のトレハロースおよびスクロースは、細胞外小胞の凍結乾燥工程に添加し、既存の凍結乾燥保護剤の問題点である結晶生成および再溶解能が減少する問題点を解決すると同時に、細胞外小胞の固有のマーカー、機能因子の発現および治療効果を維持させることができるため、細胞外小胞を用いた各種治療剤の生産に多様に活用されることができる。

Description

本発明は、細胞外小胞の機能および特性を維持することができる細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物並びにこれを用いた細胞外小胞の凍結乾燥方法に関するものである。

多様な疾患において、幹細胞、特に間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）を用いた治療法と肯定的な臨床結果が報告されてきた。ただし、幹細胞治療剤には、副作用として血管閉塞、腫よう形成、凝固障害などの細胞関連副作用のリスクがあり、臨床試験による有効性検証が依然として必要なのが実情である。幹細胞の傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果により、周辺皮膚細胞の再生と血管再生能力の増進が誘導されることが知られており、特に、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）が主な傍分泌効果の有効性因子として知られている。
細胞外小胞とは、大きさによってエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）に分類されるが、エクソソームは直径３０～１５０ｎｍであり、微小小胞体は１００～１，０００ｎｍの大きさを有する。細胞外小胞は、細胞膜の一部が血中に放出されたものであり、タンパク質と核成分の両方を含有しており、細胞間コミュニケーションを媒介することが知られている。幹細胞の代わりに細胞外小胞を使用することは、幹細胞の使用による副作用を最小限に抑え、安全性を高めるだけでなく、生体内分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、生産工程の面でも有利である。
しかし、細胞外小胞の有用性にもかかわらず、取得が困難な細胞外小胞を分離した後、安定に維持して保管することができる方法に関する技術および安定的な剤形についての研究はまだ至らないのが実情である。
したがって、さまざまな病気に対する治療物質として活用可能な細胞外小胞を安定して維持、保管するための新規な保存方法が必要とされている。

そこで、本発明者らは、細胞外小胞を安定的に維持し、保管するための技術について研究していた中、凍結乾燥の過程で発生しうる問題点を効果的に改善し、細胞外小胞固有の性質および機能を保存し得る新規な凍結乾燥保護剤を確認し、本発明を完成した。
したがって、本発明は、トレハロースおよびスクロースを含む、細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物並びにこれを用いた細胞外小胞の凍結乾燥方法に関するものである。

前記目的を達成するために、本発明は、トレハロースおよびスクロースを含む、細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物を提供する。
また、本発明は、トレハロースおよびスクロースを含む、細胞外小胞の凍結乾燥保護剤を提供する。
また、本発明は、凍結乾燥保護剤として、トレハロースとスクロースとの混合物；および細胞外小胞；を含む、細胞外小胞の凍結乾燥用組成物を提供する。
また、本発明は、１）凍結乾燥保護剤であるトレハロースとスクロースとの混合物を物細胞外小胞と混合する段階；および２）前記１）段階における混合物を凍結乾燥させる段階を含む、細胞外小胞の凍結乾燥方法を提供する。

本発明におけるトレハロースおよびスクロースは、細胞外小胞の凍結乾燥工程に添加され、既存の凍結乾燥保護剤の問題点である結晶の生成および再溶解能が減少する問題点を解決し、かつ、細胞外小胞の固有マーカ、機能因子の発現および治療効果を維持させることができるので、細胞外小胞を用いた各種の治療剤の生産に多様に活用されることができる。

凍結乾燥保護剤として、ＤＭＳＯ、トレハロース、マンニトールを添加し、凍結乾燥および再水和した細胞外小胞を肉眼で確認した結果を示す図である。トレハロース、マンニトールを凍結保護剤で処理し、凍結乾燥した後、再水和させ、ｑＮａｎｏ測定により取得される細胞外小胞（ＥＶ）の数（Ａ）およびサイズ分布（Ｂ）を確認した結果を示す図である。細胞外小胞（ＥＶ）なしにＰＢＳ単独、ＰＢＳに希釈したマンニトール（Ａ）、トレハロース（Ｂ）のみを凍結乾燥し、凍結乾燥後にナノ粒子形成をＸＲＤピーク分析を通じて確認した結果を示す図である。ＰＢＳ、トレハロース（Ｔ）は、０．０７または０．１７％を凍結乾燥した後に、再溶解した実験群において生成される不特定のナノ粒子をｑＮａｎｏ分析を通じて確認した結果を示す図である（Ｌｙｏ：凍結乾燥の実験群、－８０：－８０℃で凍結後、再溶解した実験群）。ＰＢＳ、トレハロース（Ｔ）の０．０７％を凍結乾燥した後に形成される不特定のナノ粒子の再溶解を常温で４８時間確認した結果を示す図である。細胞外小胞（ＥＶ）なしに凍結乾燥し、再溶解した後、トレハロース（Ｔ）単独の実験群およびトレハロースとスクロース（Ｔ＋Ｓ）との混合凍結乾燥および再溶解した実験群において生成される不特定のナノ粒子をｑＮａｎｏ測定を通じて確認した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。細胞外小胞（ＥＶ）なしに凍結乾燥および再溶解後、トレハロース（Ｔ）単独の実験群およびトレハロースとスクロース（Ｔ＋Ｓ）との混合凍結乾燥および再溶解した実験群にて生成される不特定のナノ粒子の再溶解および溶解速度を２０分間確認した結果を示す図である。細胞外小胞（ＥＶ）なしに凍結乾燥および再溶解後、トレハロース（Ｔ）単独の実験群およびトレハロースとスクロース（Ｔ＋Ｓ）との混合凍結乾燥および再溶解した実験群にて生成される結晶をＸＲＤ分析を通じて確認した結果を示す図である。２～８％のトレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤を処理した後、凍結乾燥および再溶解した細胞外小胞（ＥＶ）のＥＶ粒子数を確認した結果を示す図である。トレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤で処理後、凍結乾燥および再水和された細胞外小胞（ＥＶ）のサイズ分布の変化を確認した結果を示す図である。Ｃｒｙｏ－ＥＭデータから各実験群におけるＥＶ形状を確認した結果を示す図である。２～８％のトレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤で処理後、凍結乾燥および再水和された細胞外小胞（ＥＶ）における総タンパク質量の変化を確認した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。２～８％のトレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤で処理後、凍結乾燥および再水和された細胞外小胞（ＥＶ）における総ＲＮＡ量と治療効果と関連するｍｉＲＮＡ発現量の変化を確認した結果を示す図である。２～８％のトレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤（ＴＳ）で処理後、凍結乾燥および再水和された細胞外小胞（ＥＶ）におけるＥＶマーカー、ＣＤ６３の発現を確認した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＰＢＳ、ＶＥＧＦ、ＦｒｅｓｈＥＶおよびトレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤（ＴＳ）で処理後、凍結乾燥および再水和された細胞外小胞（ＥＶ）における血管再生効果をチューブ形成能および細胞移動能で確認した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

本発明は、トレハロースおよびスクロースを含む細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物並びにこれを用いた細胞外小胞の凍結乾燥方法を提供する。
本発明による細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物は、既存の凍結乾燥保護剤の問題点である結晶生成および再溶解能が減少する問題点を解決し、かつ、細胞外小胞固有のマーカー、機能因子の発現および治療効果を維持または増加させることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、細胞外小胞の凍結保護剤として、トレハロースおよびスクロースを有効成分として含むことを特徴とすることができ、トレハロースおよびスクロースを含む細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物並びにトレハロースおよびスクロースを含む細胞外小胞の凍結乾燥保護剤を提供する。このように、トレハロースとスクロースとを混合し、細胞外小胞に処理すると、トレハロース、マンニトール、スクロースのような単一成分が、凍結乾燥の過程でＰＢＳ成分によって塩と結晶をなして形成される未確認のナノ粒子が形成される問題点を解決することができるだけでなく、凍結乾燥された細胞外小胞を再溶解させる際、溶解速度を増加させることができる。
したがって、本発明は、凍結保護物質としてトレハロースとスクロースとの混合物；および細胞外小胞；を含む、細胞外小胞の凍結乾燥用組成物を提供する。

前記トレハロースおよびスクロースは、それぞれ１～１０％（ｗ／ｖ）のトレハロースおよびスクロースであってもよく、好ましくは２～９％（ｗ／ｖ）、より好ましくは２～８％（ｗ／ｖ）であってもよい。１％（ｗ／ｖ）未満のトレハロースまたはスクロースを使用する場合、未確認のナノ粒子結晶が多数発生する問題点があり得、再溶解速度も遅くなり得る。

本発明は、凍結乾燥保護剤の有効成分として、トレハロースとスクロースとを混合し、添加することを特徴とし、前記トレハロースおよびスクロースは、好ましくは１：０．０５～５の体積比で混合されてもよく、より好ましくは１：０．５～３、さらに好ましくは１：０．５～２の体積比で混合されてもよい。本発明の好ましい一具現例では、１：１の体積比で混合された凍結乾燥保護剤を用いて効果を確認した。

本発明の凍結乾燥保護用組成物は、１～１０％（ｗ／ｖ）のトレハロースおよびスクロースを１：０．０５～５の体積比で混合した混合物を含むものであってもよく、前記濃度のトレハロースおよびスクロースを１：０．１～３、より好ましくは１：０．５～１の体積比で混合した混合物を含むものであってもよい。

本発明のトレハロースとクロースとの混合凍結乾燥保護剤組成は、細胞外小胞の凍結乾燥および再水和、再溶解の過程で発生する結晶形成を減少させることができる。

凍結乾燥保護剤であるトレハロースおよびスクロースは、凍結乾燥対象である細胞外小胞と１：０．５～５の体積比、好ましくは１：０．５～３の体積比、より好ましくは１：０．５～２の体積比で混合されてもよい。

前記凍結乾燥保護剤を細胞外小胞に混合し、－７０～－９０℃で凍結し、凍結乾燥機で３～７日間凍結乾燥させ、凍結乾燥した細胞外小胞を製造することができる。

凍結乾燥保護剤は、ＰＢＳをベースに希釈製造し、凍結乾燥後、再溶解の過程では、滅菌された蒸留水を用いることができる。このような過程を通じて、細胞外小胞と共に凍結乾燥したＰＢＳを構成する化合物が蒸留水に再び溶解され、細胞外小胞がＰＢＳにて保存されるようにすることができる。
本発明の凍結乾燥の対象となる細胞外小胞は、自然系生物個体から分離された細胞から分離された細胞外小胞または牛乳のような成分から分離された細胞外小胞であることができる。また、前記細胞は、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む任意類型の動物、植物に由来するものであることができ、多様な種類の免疫細胞、腫瘍細胞、幹細胞であってもよく、好ましくは前記幹細胞は、間葉系幹細胞、万能幹細胞、誘導万能幹細胞または胚幹細胞であってもよい。

細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）は、細胞外部に放出される小胞を意味し、微小小胞、アポトーシス小胞、エクソソームなど含む。したがって、本発明は、トレハロースおよびスクロースを凍結乾燥保護剤として添加し、その目的を達成することができる多様な細胞外小胞を制限なく含むことができ、例えば、細胞外小胞は、エクソソームであることができる。

本発明のエクソソームは、様々な動物、植物、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌（ｆｕｎｇｉ）、藻類（ａｌｇａｅ）などの細胞にて分泌される細胞外空間に放出されたナノサイズのベシクル構造を有しており、エクソソームと同様の組成を有するベシクル（例えば、エクソソーム様ベシクル）を全部含むことを意味する。特に、本発明におけるエクソソームは、幹細胞に由来のエクソソームであることができる。

本発明において、前記細胞外小胞は、治療的に有用な効果を示す細胞外小胞であることができ、このような細胞外小胞の凍結乾燥の過程で本発明の凍結乾燥保護剤組成物および凍結乾燥保護剤を処理することによって、細胞外小胞の固有の特徴、性質、治療的効果は、同等レベル以上に維持されることができる。

本発明では、トレハロースおよびスクロースを添加し、細胞外小胞を凍結乾燥する場合、凍結乾燥の過程中、所望しない未確認のナノ粒子結晶の形成が抑制されるだけでなく、これらの再水和、溶解速度が著しく速くなったことを確認し、さらに細胞外小胞が有している総タンパク質の量、総ＲＮＡ量に対する損失がなく、治療効果を示すｍｉＲＮＡレベルもまた同等に維持されることを確認した。また、細胞外小胞のマーカーであるＣＤ６３もまた凍結乾燥前に比べて同様のまたは増加した発現パターンを示すことが確認された。

凍結乾燥保護剤によりそられの効能が維持される細胞外小胞の治療的有効性は、細胞外小胞固有の治療有効性の幅広い再生または免疫調節の効果であることができ、例えば、血管再生分解能であることができる。本発明の凍結乾燥保護剤により凍結された細胞外小胞は、薬学的組成物、化粧料組成物、食品組成物、皮膚外用剤組成物として使用することができ、経口または非経口投与されることができる。

本発明の凍結乾燥した細胞外小胞が活用され得る血管新生が必要な疾患の種類は、これに制限されるものではないが、火傷、潰瘍、虚血、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、心血管系疾患、脳血管性疾患および脱毛症からなる群より選択された１以上であることができ、特に心血管疾患または脳血管疾患であることができる。

本発明の凍結乾燥された細胞外小胞が含まれる薬学的組成物は、前記有効成分の外に薬学的組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含むことができる。本発明の薬学的組成物は、他の医薬活性成分や活性混合物をさらに含むことができる。

本発明の薬学的組成物は、それぞれ常法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射用溶液の形態で剤形化して使用されることができる。組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（Ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。

経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標））、マクロゴール、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどを使用することができる。

本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路、および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択することができる。投与は一日に一回投与することもでき、複数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与のあらゆる方式は予想されるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与することができる。

本発明の前記した賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、着香料などに対する用語の定義は、当業界に公知の文献に記載されたものであって、その機能が同一ないし類似するものを含む。

また、本発明は、１）凍結乾燥保護剤であるトレハロースとスクロースとの混合物を細胞外小胞と混合する段階；および２）前記１）段階の混合物を凍結乾燥させる段階を含む、細胞外小胞の凍結乾燥方法を提供する。

本凍結乾燥方法に対する説明は、前で説明した凍結乾燥保護用組成物、凍結乾燥保護剤に関する説明が同様に適用されることができる。

前記凍結乾燥方法において、２）段階の凍結乾燥させる段階は、－７０～－９０℃で凍結させた後、３～７日間凍結乾燥させる段階を含むものであることができる。前記凍結は一晩実行することができ、凍結乾燥の段階は１～７ｍＴｏｒｒの圧力下で実行されるものであることができ、１、２、または３次の凍結乾燥の過程が実行されるものであることができる。

重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略し、本明細書において特に断りのない用語は、本発明が属する技術分野で通常使用される意味を有するものである。

本明細書にて特に断りのない用語は、本発明が属する技術分野で通常使用される意味を有するものである。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。

実施例１．細胞培養および細胞外小胞の回収
実験に用いられる細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ；以下、ＥＶ）であるエクソソームを回収するために、ヒト骨髄由来の幹細胞を培養した。細胞は１００ｍｍｃｕｌｔｕｒｅｄｉｓｈ（ＳＰＬ、２０１００）に２．５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓの濃度で培養し、０．２μｍでフィルターされたｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）と１０％のＦｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の培地で培養された。Ｐ２からＰ６まで８０～９０％毎に継代培養を行い、３７℃で５％のＣＯ_２の条件でインキュベーターで培養した。
Ｐ６以降同様の条件で培養された幹細胞をｌｏｗ－ｇｌｕｃｏｓｅＤＭＥＭと１０％のｅｘｏｓｏｍｅｄｅｐｌｅｔｅｄＦｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）と１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓからなる培地で５日間培養した。その後、培養液を収穫し、４℃、２５００ｇ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離をし、上澄み液のみを取り、０．２μｍでフィルターした。このように回収されたｍｅｄｉｕｍは、直ちにＴａｎｇｅｎｔｉａｌｆｌｏｗｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＴＦＦ）を進め、各々濃縮およびバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を進めて、開始体積に対して約１０倍程度の濃縮を行った。このとき、ｍｅｍｂｒａｎｅは、ＭｉｎｉｍａｔｅＴＦＦ３００Ｋｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いた。前記のような工程によりエクソソームを回収し、これを凍結乾燥実験に用いた。

実施例２．凍結乾燥の処理
ＥＶの凍結乾燥を行うために、実施例１と同様にＥＶを回収した後、可変抵抗パルス検知（Ｔｕｎａｂｌｅｒｅｓｉｓｔｉｖｅｐｕｌｓｅｓｅｎｓｉｎｇ）技術を使用するｑＮａｎｏ（ＩＺＯＮＬｔｄ、Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ、Ｎｅｗｚｅａｌａｎｄ）により大きさと濃度を測定した。その後、最終濃度が１ｘ１０^１１ＥＶｓ／ｍｌとなるように、１：１の体積の比率で凍結乾燥保護剤とエクソソームとを混合した。エクソソームに好適な凍結乾燥保護剤を選別するための候補群として、トレハロース（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、マンニトール（Ｓｉｇｍａ）、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）およびスクロース（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
実験群としてマンニトール０～５％（ｗ／ｖ）、ＤＭＳＯ０～１０％（ｗ／ｖ）、トレハロース０～４％（ｗ／ｖ）の濃度を単独投与群として設定し、それぞれ２～８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロースとトレハロースとを１：１の体積比で混合した混合物を実験群として用いた。混合された後、－８０℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔした後、４日間凍結乾燥（－８０℃、５ｍＴｏｒｒ）を進めた。凍結乾燥が終わった後に、密封して常温で保管した。このように保管されたサンプルは、実験にて用いるために再水和の過程を経て、再水和の際、０．２μｍでフィルターした脱イオン水を元の混合物の容量分だけ入れた後、３７℃で３０分間保持して用いた。

実施例３．凍結乾燥後、目視分析
凍結乾燥保護剤としてＤＭＳＯ０％～１０％、マンニトール０．１％～５％、トレハロース０．０３％～０．１７％に変化させつつ、エクソソームと混合し、凍結状態および再水和以後の状態を目視により確認した結果を図１に示した。
図１に示すように、トレハロースおよびマンニトールの場合、目視観察をした際、凍結乾燥後、微細な粒子が存在し、凍結乾燥が進んだことが確認できたが、ＤＭＳＯの場合、凍結乾燥後、薄いフィルムのような物質が形成され、ＥＶの凍結乾燥剤としてＤＭＳＯが不適切であることが確認された。特にＤＭＳＯの混合群は、肉眼でもＰＢＳで溶解されておらず、大きな粒子が存在することが確認された。一方、トレハロースとマンニトールとの混合群は、再水和後にも目視上、全て再溶解が良好に行なわれたことが確認された。

実施例４．ＥＶの濃度とサイズ分析
実施例２と同様にトレハロース、マンニトールを凍結保護剤として処理し、凍結した後、再水和させ、ｑＮａｎｏ測定によって得られたＥＶの数および大きさを確認した。ｑＮａｎｏは、可変抵抗パルス検知（Ｔｕｎａｂｌｅｒｅｓｉｓｔｉｖｅｐｕｌｓｅｓｅｎｓｉｎｇ）技術を通じて粒子の濃度およびサイズを測定する装備である。実験に使用されたｎａｎｏｐｏｒｅは、ＮＰ２００であり、ｒａｄｉａｌｓｔｒｅｔｃｈは、４６．５ｍｍであり、０．６６ｍＶの電圧を加え、０．０７５ｍｌのサンプルを用いてサンプル中のＥＶの濃度およびサイズを測定した。全てのサンプルは、少なくとも５００個のｐａｒｔｉｃｌｅ測定を通じて分析し、全部ＣＰＣ１００（１００ｍｍ、１．４Ｅ＋１３ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ、ＩＺＯＮＬｔｄ）でｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎを進めた。測定の結果を図２に示す。一方、ＤＭＳＯ処理群は、ＰＢＳに溶解され難いため、ｑＮａｎｏ測定が不可能であった。
図２に示すように、ＥＶ単離後、直ちにｑＮａｎｏを測定した実験群であるＦｒｅｓｈＥＶ群と同じＥＶ個数を凍結乾燥保護剤と混合し、再水和し、ＥＶの数を測定したにもかかわらず、トレハロースとマンニトール投与群の全部において、並びにＰＢＳ処理群において、ナノ粒子の数が増加したことが確認された。これは、ＥＶの外、多量の未確認のナノ粒子が追加で生成されることを意味するもので、ｑＮａｎｏのナノ粒子の粒度分布解析の結果、未確認のナノ粒子の大きさも、８０～３００ｎｍの範囲でＥＶと同様の大きさを有することが確認された。

実施例５．凍結乾燥保護剤処理後、ＥＶのＸＲＤ分析
凍結乾燥保護剤がＰＢＳの成分によって塩と結晶をなすことができ、特定条件で結晶化が促進され得ることが知られている。実施例４にて確認したようなＥＶ外に新たに生成された未確認のナノ粒子を確認するために、ＥＶなしにＰＢＳ単独、ＰＢＳに希釈したマンニトール、トレハロースのみを凍結乾燥し、凍結乾燥後に、ナノ粒子が形成されるか否かをＸＲＤピーク分析により確認した。Ｓｍａｒｔｌａｂ（Ｒｉｇａｋｕ、ＪＰ）を用いて、Ｃｕｒａｄｉａｔｉｏｎ（４５ｋＶ×２００ｍＡ）でＸＲＤを測定し、内部構造を分析した。２θの範囲は２～４５とし、ｓｔｅｐｓｉｚｅは０．０５°とし、ｄｗｅｌｌｔｉｍｅは２ｓｅｃと設定して、分析を行い、その結果を図３に示した。ＸＲＤピーク分析において、２２°～２３°および２７°～２８°のピークは、ＰＢＳ成分による塩化ナトリウムの結晶を意味し、３２°～３３°のピークは、リン酸塩の結晶を意味する。
図３に示すように、マンニトールを添加し、凍結乾燥した実験群（図３のＡ）のＸＲＤピーク分析の結果、ＰＢＳ成分による塩分結晶以外にも複数のピークが発生しており、これはマンニトール成分による自身の結晶が生成されることを示す結果である。マンニトールは、結晶性凍結保護物質として知られており、計３つの結晶形態を有している。このうち代表的な結晶型の一つであるβマンニトールの結晶は安定状態の結晶であって、水に溶解され難いことが知られている。一方、トレハロースの場合（図３Ｂ）、ＰＢＳの成分による塩化ナトリウムの結晶とリン酸塩結晶に対するピークのみ形成されることが確認された。
図３のＣは、ＥＶなしにＰＢＳまたはトレハロース溶液のみ凍結乾燥し後、再溶解したとき、従来にない不特定のナノ粒子が形成されることをｑＮａｎｏ分析により確認した結果を示す図である。－８０℃で乾燥凍結することなく凍結のみ行った後、溶解した実験群では（図中、－８０と表示）全部において溶解され、このようなナノ粒子が形成されないことを確認し、ｑＮａｎｏ測定においてパーティクルが測定されなかった。一方、低濃度のトレハロース添加の実験群である０．０７％のトレハロースの実験群（２ｍＭ）または０．１７％のトレハロースの実験群（８ｍＭ）は、ＰＢＳ単独凍結乾燥時よりもより多くの粒子が形成された。
ＸＲＤ分析の結果、トレハロース／ＰＢＳ溶液を凍結乾燥時、生成された不特定のナノ粒子が塩化ナトリウムとリン酸塩であることが推定されたので、これらが時間が経過するとともに徐々に溶解されるか否かを確認した。常温でこれらを振りながら再溶解させたところ、図３のＤから確認できるように、約４８時間後にほぼすべての塩が再溶解されることが確認された。
このような結果を総合すると、トレハロースを低い濃度で凍結乾燥保護剤として利用した時、凍結乾燥の過程で結晶化された塩が発生し、これは再溶解に長時間が所要されることを確認した。

実施例６．凍結乾燥保護剤処理による結晶性減少の実験
実施例５では、低濃度のトレハロースを凍結乾燥保護剤として用いる場合、塩結晶が発生するという問題点が確認されたので、これを解決すべくトレハロースの濃度を２％～４％に変化させた実験群、トレハロースと非晶質性凍結保護剤として知られたスクロースを混合した実験群によりナノ粒子が形成されるか否かを確認した。２％～８％（ｗ／ｖ）のトレハロースおよびスクロースを１：１の体積比で混合し、凍結乾燥保護剤の実験群として用いた。前記実験群を用いて、ＥＶなしに凍結乾燥保護剤とＰＢＳとを混合して再溶解し、ｑＮａｎｏ分析、およびＸＲＤ分析を実施例４、５と同様の方法で行った。その結果を図４に示す。
図４のＡに示すように、凍結乾燥および再溶解直後（３分以内）のｑＮａｎｏ測定の結果、ＰＢＳ単独の処置群に比べて、２％のトレハロース群において若干のナノ粒子が測定され、４％のトレハロース、１：１のトレハロースとスクロースとの混合物処理群では、完全に再溶解され、測定されたナノ粒子がないことを確認した。
図４のＢでは、再溶解時間に伴う溶解速度を確認し、凍結乾燥保護剤の濃度が高いほど溶解速度が速くなる傾向があることを確認した。特にトレハロースとスクロースとの混合溶液は、再溶解が５分以内に達成され、非常に優れた溶解能を示した。
図４のＣに示すように、凍結乾燥保護剤の濃度を増加させるほどＸＲＤ分析ピークも減少し、特に、トレハロースとスクロースとの混合溶液は、結晶形成度が非常に低いことが確認された。
前記したような結果を通じて、濃度が増加するほど結晶の発生および再溶解能が増加され、特にトレハロースとスクロースとの混合物が凍結乾燥中、結晶の発生率が著しく低く、再溶解率に優れているという事実を確認した。
このような結果は、トレハロースとスクロースとの混合物を凍結乾燥保護剤として用いてＥＶを凍結乾燥する場合、未確認のナノ粒子の結晶が形成されないか、または、速やかに再溶解されるため、前記混合物がＥＶの数を制御し、患者に投与することが必要なＥＶ治療剤の凍結乾燥保護剤として適切であることを示す結果である。

実施例７．トレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤の結晶形成の抑制効果の確認
トレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤がＥＶ治療剤の凍結乾燥保護物質として適切であるという事実を確認したので、実際に実施例１にて得られたＭＳＣ－ＥＶの凍結乾燥に適用したとき、再溶解率を確認し、その結果を図５および図６に示した。実験群としては、トレハロースおよびスクロース２、４、８％（ｗ／ｖ）を１：１の体積比で混合した凍結乾燥保護剤を、実施例２の方法と同様にＥＶに処理し、凍結乾燥し再溶解した実験群、凍結乾燥保護剤なしにＰＢＳに含まれたＥＶ凍結乾燥および再溶解の実験群（０％）、凍結乾燥していないＥＶ単離直後のＥＶであるＦｒｅｓｈＥＶを用いた。
凍結乾燥保護剤処理後、凍結乾燥し再溶解し、ＥＶ粒子数を確認し、その結果を図５に示す。
図５に示すように、凍結乾燥後、再溶解の際、２％の濃度のトレハロースとスクロースとの混合群では統計的に有意な差はみられなかったが、ＦｒｅｓｈＥＶに比べて、ナノ粒子の数がわずかに減少したことが確認された。その反面、４、８％の実験群では、初期の凍結乾燥ＥＶの数をほぼ１００％保存し、再溶解されたことが確認あれた。
凍結乾燥後、再溶解した時、ＥＶの大きさの変化を確認し、その結果を図６に示す。
図６に示すように、凍結乾燥保護剤を添加した実験群において、ＦｒｅｓｈＥＶと同様のサイズ分布を示したが、ＰＢＳ単独で添加した実験群では、多少大きさの小さいナノ粒子が確認された。
また、各実験群のＥＶ粒子形状をＣｒｙｏ－ＥＭを介して確認した。ＦｒｅｓｈＥＶ実験群はそのまま使用することができるが、凍結乾燥された実験群は３７℃で３０分間再溶解させてから、実験に用いた。サンプリングを行う前に先だってＧｒｉｄｓ（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ、Ｒ１．２／１．３、２００ｍｅｓｈ、ＥＭＳ）を親水性表面にするため、Ｇｌｏｗｄｉｓｃｈａｒｇｅｓｙｓｔｅｍ（ＰＥＬＣＯｅａｓｉＧｌｏｗ（商標）、Ｔｅｄｐｅｌｌａ）を用いた。各サンプルをｇｒｉｄに４ｕｌを載置し、４℃の１００％の湿気を保持した状態でｂｌｏｔｆｏｒｃｅ３を１．５秒間加えた。次いでサンプルをガラス化するために液体エタンでＶｉｔｒｏｂｏｔＭａｒｋＩＶ（ＦＥＩ）方法を用いて凍結を行った。その後、ｇｕｎｔｙｐｅＬａｂ６を１２０ｋＶでＴａｌｏｓＬ１２０Ｃ（ＦＥＩ）顕微鏡でＮａｎｏｂｉｏｉｍａｇｉｎｇｃｅｎｔｅｒ（Ｓｅｏｕｌｎａｔｉｏｎａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｋｏｒｅａ）で分析を行った。その結果を図７に示す。
図７に示すように、本発明の凍結乾燥保護剤なしにＰＢＳのみを用いて、凍結乾燥し再水和したＥＶでは、塩と推定される微小粒子が、バッググラウンドで多数観察されたが、トレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤を用いたＥＶでは、微細粒子がほとんど観察されなかったことが確認された。
上記のような結果は、ＰＢＳを用いた凍結乾燥群では、初期の凍結乾燥ＥＶに比べて約２倍近いナノ粒子が確認され、ＥＶのサイズ分布を外れる新たなナノ粒子が確認され、前で特定したような結晶形成の問題点があるということを示す結果である。その反面、トレハロースとスクロースとの混合物を凍結乾燥保護剤で処理した場合、このような結晶形成の問題点がなく、ＥＶの数を保存し、凍結乾燥した後に再溶解し、ＥＶが得られることを確認した。

実施例８．トレハロースとスクロースとの混合凍結乾燥保護剤のＥＶに対する影響の確認
ＥＶ治療剤の凍結乾燥保護剤として活用するためには、凍結乾燥および再溶解後、ＥＶ損失や他の物質を生成することなく取得されることが重要であるだけでなく、凍結乾燥の対象となるＥＶの特性および機能に影響を及ぼさないことが重要である。従って、トレハロースとスクロースとの混合物を凍結保護剤で処理し、凍結および再溶解したＥＶにおいて、ＥＶに含まれた総ＲＮＡが損失なく復元されるかどうか、ＥＶの有効性因子であるｍｉＲＮＡの変化を誘導するかしないかを確認し、ＥＶマーカーであるＣＤ６３の発現変化を確認した。
タンパク質の定量分析は、以下のような方法で行った：サンプルをすべて超高速遠心分離機（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）で１２００００ｇで１ｈｒまで遠心分離した後、上澄液を捨て、ｌｙｓｉｓを行った。Ｌｙｓｉｓは、ＲＩＰＡ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で進め、ＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通じてタンパク質を定量した。
ＥＶマーカーであるＣＤ６３分析は、ＥＬＩＳＡを用いて確認し、次のような方法を通じて行った：ＥＬＩＳＡは、メーカーのマニュアルに従って市販キットを用いて行った。ＣＤ６３（ＥＨ９５ＲＢ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ、ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）ＥＬＩＳＡキットには、標準的なタンパク質を含んでいるため、タンパク質および細胞外小胞の量は、キットの標準曲線に基づいて決定される。分離されたＦｒｅｓｈＥＶと凍結乾燥されたＥＶを前処理過程なく、ｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｂｏｄｙがコーティングされた９６ｗｅｌｌｍｉｃｒｏｐｌａｔｅにＳｔａｎｄａｒｄと共にＥＶを同量（２００ｕＬ／ｗｅｌｌ）で分注した後、４°Ｃで反応させた。翌日、Ｓａｎｄｗｉｃｈ方式のＥＬＩＳＡ方法により進め、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
ＥＶの有効性因子であるｍｉＲＮＡ発現分析は、ｑＰＣＲで行い、次のように進めた：Ｔｒｉｚｏｌ(商標)を用いてメーカーの指針に従ってＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）でＲＮＡを定量化した。ＲＮＡは逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）過程を経て、ｃＤＮＡで作製し、それぞれのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに適したＴａｑｍａｎｐｒｏｂｅを用いて、メーカーのマニュアルに従ってＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲを進めた。
上記のようなＥＶのタンパク質量、総ＲＮＡ復元率、ｍｉＲＮＡ量、ＥＶマーカー発現の変化を確認した結果を図８～図１０に示した。
図８に示すように、ＰＢＳ処理群はＦｒｅｓｈＥＶに比べて約３８％のタンパク質量の減少が示されたが、本発明のトレハロースとスクロースとの混合物を凍結乾燥保護剤で処理した実験群では、タンパク質の減少が少ないことが示され、特に４％および８％の混合群ではＦｒｅｓｈＥＶ群と同様の水準のタンパク質量を測定した。
図９に示すように、凍結乾燥後、再溶解時、総ＲＮＡ復元率は、全ての実験群において統計的に有意な差を示さず、治療有効性を有するｍｉＲＮＡ発現も是全ての実験群から有意な差なく均一に発現した。
図１０に示すように、ＥＶマーカーであるＣＤ６３発現は、各実験群間の有意な差はなかった。

実施例９．凍結乾燥保護剤処理後、凍結解凍されたＥＶの血管再生能の検証
ＥＶは、血管再生能を有しており、各種の血管新生が必要な疾患の治療剤として活用可能であることが知られている。本発明の凍結乾燥保護剤と混合した後に、凍結、再溶解ＥＶがＥＶが有している固有の血管再生能を同程度に維持するか、または効果を改善することができるかを確認するための実験を行った。ＥＶ血管再生能は、ＨＵＶＥＣ細胞を用いたチューブ形成能実験および細胞移動能実験を通じて確認した。より具体的には実施例１によって得られたＥＶによる新生血管増殖効果を示すために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に付着したＨＵＶＥＣにＥＶを処理し、チューブ形成効果を確認した。具体的にＨＵＶＥＣを２０％のＦＢＳ、５Ｕ／ｍＬのヘパリンおよび３ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが補充されたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。細胞を１．０×１０^４細胞の密度でμ－ＳｌｉｄｅｓＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ｉｂｉｄｉ、Ｇｒａｅｆｅｌｆｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にて成長因子が低減されたＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）に接種し、３７℃、５％のＣＯ_２の加湿チャンバで７時間チューブを形成するようにした。位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で画像を撮影し、チューブ状構造の数を、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて顕微鏡視野（４倍の倍率）で定量化した。
細胞移動能分析のために、ＨＵＶＥＣは２０％のＦＢＳ、５Ｕ／ｍＬのヘパリンおよび３ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦが補充されたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）で３７℃、５％のＣＯ_２加湿チャンバで培養した。１．０×１０^５細胞を２４ｗｅｌｌプレートで１００％になるように培養した後、ＭＭＣ（２．５ｕｇ／ｍｌ）を処理し、細胞の分裂を停止させた。細胞をピペットチップを用いて垂直に引っ掻いたのち、ＰＢＳで洗浄した。引っ掻き傷を位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で画像を撮影し、当該部位を表示した。同領域の引っ掻き傷を７時間後に再び撮影した後、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて細胞が移動し、創傷縫合の程度を測定した。凍結乾燥保護剤の実験群としては、トレハロースおよびスクロース０（ＰＢＳ処理後、凍結乾燥および再水和）、２、４、８％（ｗ／ｖ）を１：１の体積比で混合した凍結乾燥保護剤を処理し、凍結乾燥および再水和のＥＶ実験群、凍結乾燥保護剤処理なしで分離された直後のＥＶのＦｒｅｓｈＥＶ、陽性対照群ＶＥＧＦ処理群およびＰＢＳ処置群を用いた。陰性対照群としては、ＨＵＶＥＣにＰＢＳ処理した実験群を用いた。ＥＶは全て５×１０^８ＥＶ／ｍｌで処理し、ＶＥＧＦは１００ｎｇ／ｍｌで処理した。血管新生能を確認した結果を図１１に示す。
図１１に示すように、全てのＥＶ処理群は、ＶＥＧＦを処理した実験群と同様の水準の血管再生効果を示し、特に、２～４％の濃度のトレハロースおよびスクロースの１：１の混合物を凍結乾燥保護剤で処理し、凍結、再溶解ＥＶを処理した実験群において優れた血管再生能を確認した。これは、本発明の凍結乾燥保護剤を処理し、凍結乾燥後、再溶解時、ＥＶが有している治療有効性の喪失なく維持、復元させることができることを示す結果である。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないという点は自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物により定義されるといえる。

Claims

トレハロースおよびスクロースを含む、細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物。
前記トレハロースおよびスクロースは、それぞれ１～１０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物。
前記トレハロースおよびスクロースは、１：０．０５～５の体積比で混合して含まれるものである、請求項１に記載の細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物。
前記トレハロースおよびスクロースは、細胞外小胞の凍結乾燥および再水和の過程で結晶の形成を減少させるものである、請求項１に記載の細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物。
前記組成物は、細胞外小胞と１：０．５～５の体積比で混合されるものである、請求項１に記載の細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物。
前記細胞外小胞は、エクソソームまたは微小小胞である、請求項１に記載の細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物。
前記細胞外小胞は、免疫細胞、腫瘍細胞または幹細胞に由来の細胞外小胞である、請求項１に記載の細胞外小胞の凍結乾燥保護用組成物。
トレハロースおよびスクロースを含む、細胞外小胞の凍結乾燥保護剤。
凍結乾燥保護剤として、トレハロースとスクロースとの混合物；および細胞外小胞；を含む、細胞外小胞の凍結乾燥用組成物。
前記細胞外小胞は、血管再生能を有するものである、請求項９に記載の細胞外小胞の凍結乾燥用組成物。
１）凍結乾燥保護剤であるトレハロースとスクロースとの混合物を細胞外小胞と混合する段階；および
２）前記１）段階における混合物を凍結乾燥させる段階を含む、細胞外小胞の凍結乾燥方法。
前記２）段階は、１）段階の混合物を－７０～－９０℃で凍結させた後、３～７日間凍結乾燥させる段階を含むものである、請求項１１に記載の細胞外小胞の凍結乾燥方法。