JP6919951B2

JP6919951B2 - 幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む骨粗鬆症の予防または治療用の組成物

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Publication number: JP6919951B2
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Authority: JP
Inventors: ウチョ，ヨン; スイ，キョン; スックチェ，ジ
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Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2021-08-18
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Description

本発明は、幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む骨粗鬆症の予防または治療用の組成物に関する。

ヒトを含む多細胞生命体内に存在する多様な細胞からは、「エキソソーム」というナノサイズの小胞体を分泌すると知られている。エキソソームは、細胞膜と同じ膜構造の小嚢体であって、他の細胞及び組織に結合して、膜構成要素、タンパク質のＲＮＡを伝達する役割を果すと知られている。特に、幹細胞から分泌されるエキソソームは、幹細胞が分泌する多様な成長因子とサイトカインを含んでおり、組織再生に助かると知られている。また、エキソソームは、抽出過程で細胞培養液内の細胞老廃物、抗生剤、血清などの不純物が除去されるので、細胞培養液の効果と同等であり、安全に使用可能である。

骨組織とは、破骨細胞の骨吸収及び造骨細胞の骨形成の過程が順次発生して恒常性を維持する組織である。骨粗鬆症は、閉経、老化などのさまざまな原因によって骨再形成過程の平衡が崩れ、これによる骨微細構造の変化から骨の強度が弱化する疾患である。骨粗鬆症は、骨密度の低下によって、脊椎、大腿、腰骨などの骨折危険度が増加し、明らかな症状なく徐々に進むため、予防が非常に重要な疾患である。

骨粗鬆症の原因は、大きく、閉経後骨粗鬆症（第一型骨粗鬆症）と老人性骨粗鬆症（第二型骨粗鬆症）とに分けられ、閉経後骨粗鬆症は、女性において閉経以後、エストロゲンの分泌が減りながら急激な骨吸収が惹起されて発生し、老人性骨粗鬆症は、加齢に伴って骨の形成よりも吸収が増加することによって、骨密度が減少して発生する。

韓国の２０１６年高齢者統計（統計庁）において、２０１５年を基準にして６５歳以上の人口は６５７万名であって、全体人口の１３．２％に至る。高齢者人口の増加につれ、老人性疾患に分類される骨粗鬆症の患者も急増しつつある。５０歳以上の成人の５人中１人（２２．４％）が骨粗鬆症、２人中１人（４７．９％）が骨減少症である。７０代以上の骨粗鬆症の有病率は、女性が６８．５％、男性が１８．０％である。速い速度で超高齢化社会へ進入している韓国の現実上、骨粗鬆症の有病率はさらに高くなることが見込まれる。

現在、臨床で使用されている骨粗鬆症治療剤としては、ビスホスフォネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）などの骨吸収抑制剤と、骨形成促進剤である副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ）が使用されている。閉経期女性においては、エストロゲンの投与が効果的であると知られている。しかし、ビスホスフォネート製剤は、長期投与時、胃腸管障害、過度な骨再形成抑制による副作用が発生する恐れがあり、エストロゲンも、長期投与時、静脈血栓症、心筋梗塞などの動脈硬化性疾患を誘発し、乳癌の発生率を増加させるという報告がある。

幹細胞を用いた骨粗鬆症治療剤が特許出願されているが［韓国公開特許公報第２００７−０１０１７５６号、韓国特許第６７９６４２号、韓国公開特許公報第２０１４−０００６３２３号］、成体幹細胞は、移植時、生存率と生着率が低いことから効率が劣り、未分化幹細胞が腫瘍を形成する危険性が存在するという問題がある。また、幹細胞培養液は、細胞老廃物、抗生剤、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの不純物の残存可能性がある。

そこで、副作用が少なくて長期投与が可能であり、効能に優れた骨粗鬆症治療剤の開発が急がれる。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、幹細胞からＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）のように破骨細胞形成抑制因子を含むエキソソームを抽出しており、これを用いた骨粗鬆症の予防及び治療用の組成物の開発に応用するための研究を重ねて本発明を完成した。

そこで、本発明は、脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または治療用の薬学的組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分で含む、骨粗鬆症の予防または治療用の注射剤を提供することを他の目的とする。

また、本発明は、脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または改善用の健康機能食品を提供することをさらに他の目的とする。

また、本発明は、骨粗鬆症の予防または治療のための医薬の製造において、脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌ）から抽出されたエキソソームの用途を提供することをさらに他の目的とする。

また、本発明は、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む薬学的組成物を治療に有効な量で対象体に投与する段階を含む、骨粗鬆症の予防または治療の方法を提供することをさらに他の目的とする。

本発明による幹細胞由来エキソソームは、造骨細胞を活性化し、破骨細胞の活性を抑制する生体活性因子の発現率が優秀であるため、骨粗鬆症の予防及び／または治療に効果を奏する。また、既存の細胞治療剤の副作用は最小化すると共に、細胞由来の伝達体として安定的かつ迅速に効能物質を細胞内へ伝達できる。これによって、本発明は、骨粗鬆症の予防及び治療用の組成物に適用することができる。

本発明の実施例１で製造された、増殖したヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム、実施例２で製造された骨細胞へ分化中のヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム及びこの応用に関わる模式図である。本発明の実施例１で製造された増殖したヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム、及び実施例２で製造された骨細胞へ分化中のヒロ脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの特性分析の結果を示す図であり、透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて確認したエキソソームの構造及び模様と、ナノ粒子分析機（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｔｒａｃｋｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて確認したエキソソームの大きさ分布を示したものである。（Ａ）及び（Ｂ）は、増殖したヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、分化中のヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）の構造、模様及び大きさを示す。本発明の実施例１で製造された、増殖したヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム、実施例２で製造された骨細胞へ分化中のヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームのＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）含量に対するＥＬＩＳＡ分析結果を示す図である。本発明の実施例１で製造された、増殖したヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）、実施例２で製造された骨細胞へ分化中のヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）を、骨粗鬆症が誘発されたマウスモデル（子宮摘出モデル、ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄｍｉｃｅｍｏｄｅｌ）の静脈に注射し、投与終了して２週後、マウスの大腿骨を摘出してμＣＴを撮影した写真である。本発明の実施例１で製造された、増殖したヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）、実施例２で製造された骨細胞へ分化中のヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）を、骨粗鬆症が誘発されたマウスモデル（子宮摘出モデル）の静脈に注射し、投与終了して２週後、マウスの大腿骨を摘出してμＣＴを撮影し、骨体積（ｂｏｎｅｖｏｌｕｍｅ；ＢＶ）、組織体積に対する骨体積の比（ｐｅｒｃｅｎｔｂｏｎｅｖｏｌｕｍｅ；ＢＶ／ＴＶ）、骨密度（ｂｏｎｅｍｉｎｅｒａｌｄｅｎｓｉｔｙ；ＢＭＤ）、構造モデル指数（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌｉｎｄｅｘ；ＳＭＩ）、結節厚さ（ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；Ｔｂ．Ｔｈ）、結節個数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒｎｕｍｂｅｒ；Ｔｂ．Ｎ）などのパラメータを比較分析した結果を示したものである。

前記の目的を達成するために、本発明は、脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。

本発明において、用語「幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）」とは、自己複製能力のみならず、細胞が位置する環境の影響を受けて必要に応じて適切な信号が与えられる場合、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）の特性によってさまざまな細胞に分化できる特性があり、脂肪、骨髄、臍帯血及び胎盤などに含まれている。本発明の幹細胞は、自己または同種由来の幹細胞であり得、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む任意の類型の動物由来であり得る。

本発明において、用語「脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍ
ｃｅｌｌ）」とは、脂肪組織から由来する幹細胞であって、脂肪組織は、多量の組織採取が容易であることから、幹細胞の収穫に良い条件を有し、脂肪由来幹細胞は、培養時に安定的な成長と増殖を示し、分化を誘導したときに多様な細胞への分化が可能である。

本発明において、用語「増殖した幹細胞」とは、組織から抽出したｐａｓｓａｇｅ０の幹細胞を、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が含まれている通常の培養培地（ＤｕｌｂｅｃｃｏＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ＤＭＥＭ）を用いてｐａｓｓａｇｅ７まで増殖させた幹細胞を意味する。これより、幹細胞の遺伝情報、タンパク質、成長因子を含んでいるエキソソームを抽出することができる。

本発明において、用語「骨細胞へ分化中の幹細胞」とは、骨細胞由来の幹細胞から骨細胞へ分化している途中の幹細胞を意味する。これより、骨細胞分化に関わる遺伝情報、タンパク質、成長因子を含んでいるエキソソームを抽出することができる。具体的に、幹細胞が骨細胞へ分化するとき、細胞の模様及び特性が変わり、この際にエキソソームを抽出するのである。したがって、通常の幹細胞からエキソソームを抽出することとは異なるといえる。

本発明において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、多種の細胞から分泌される膜構造の小嚢体であって、他の細胞及び組織に結合して膜の構成要素、タンパク質、ＲＮＡを伝達するなどの多様な役割を果すと知られており、エキソソームの平均直径は、おおよそ３０〜２００ｎｍである。

前記増殖した幹細胞から抽出されたエキソソームは、幹細胞の基本的な特性を有し、組織再生に必要な重要な成長因子、生体活性タンパク質及び遺伝子情報などを含み得る。

前記骨細胞へ分化中の幹細胞から抽出されたエキソソームは、幹細胞の基本的な特性を有し、骨分化時、重要な成長因子、多様な生体活性タンパク質及び遺伝子情報などを含み得る。具体的には、破骨細胞活性抑制物質として、前破骨細胞（ｐｒｅ−ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の分化を抑制するオステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ，ＯＰＧ）、骨細胞活性促進因子の一つであって、周辺の間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）を引き込んで骨細胞分化を促進する役割を果す骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＢＭＰｓ）、骨細胞活性促進因子の一つであって、骨幹細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ）の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び造骨細胞への分化を促進し、血管の生成を手伝って骨組織がよく再生されるようにするトランスフォーミング増殖因子-β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−β，ＴＧＦ−β）など、骨粗鬆症の予防及び治療に関わる因子を含み得る。

前記エキソソームは、当業界に知られたエキソソームの抽出方法を用いて製造することができる。例えば、
１）幹細胞を増殖させる段階と、
２）前記増殖した幹細胞を骨細胞へ分化させる段階と、
３）骨細胞へ分化する幹細胞からエキソソームを抽出及び精製する段階と、を含む方法を用いることができる。

前記「骨細胞分化誘導」とは、幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）が骨細胞へ分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）するように誘導することを意味する。

前記骨細胞へ分化する幹細胞は、骨細胞へ分化可能な成体由来幹細胞であり得る。前記骨細胞へ分化可能な成体由来幹細胞は、骨髓幹細胞、臍帯血幹細胞または脂肪由来幹細胞であり得る。

前記脂肪由来幹細胞は、ヒトまたは哺乳動物由来の幹細胞であり得る。

本発明による脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム、前記抽出方法で抽出されたエキソソームが骨粗鬆症の予防または治療の効果を奏することを確認した。

したがって、本発明は、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む骨粗鬆症の予防または治療用の薬学的組成物を含む。

本発明による「骨粗鬆症の予防または治療用の組成物」とは、効果的な骨再生のための効能物質として、骨細胞へ分化中の幹細胞から抽出したエキソソームを使用するという点で従来技術と差別性を有する。抽出、精製されたエキソソームに担持された細胞の増殖及び分化に関わる多様な成長因子によって効果的に持続可能な骨組織の再生が行われ、既存の成体幹細胞の体外細胞培養の問題点または細胞死滅による組織の石灰化などの問題を解決することができる。

本発明による骨細胞への分化中に抽出された幹細胞由来エキソソームは、幹細胞の特性のみならず、骨細胞への分化に関わる活性因子のみを効果的に伝達することで、副作用は最小化すると共に、既存の幹細胞を用いた治療と同様の効果を期待することができる。

本発明による骨細胞への分化中に抽出された幹細胞由来エキソソームは、細胞から分泌する生体膜小胞体である。また、細胞膜に類似の脂質構造を有しているため、体内に注入されたとき、周辺細胞への吸収率に優れ、効能物質の速い伝達で骨組織の効果的な再生誘導が可能である。

本発明による骨粗鬆症の予防または治療用の薬学的組成物は、薬学的に有効な量の脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを単独で含むか、または一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含み得る。前記薬学的に有効な量とは、骨粗鬆症の症状を予防、改善及び治療するのに十分な量を意味する。

また、前記「薬学的に許容される」というのは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれに類似の反応を起こさない組成物を意味する。

前記薬学的組成物は、経口または非経口のさまざまな剤形であり得る。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、でん粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単なる賦形剤の外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、よく用いられる単なる希釈剤である水、リキッドパラフィンの外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が挙げられる。

前記具体例による薬学的組成物では、非水性溶剤、懸濁剤として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが使用可能である。また、坐剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥウィーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用可能である。

前記具体例による薬学的組成物の投与形態としては、これらの薬学的許容可能な塩の形態でも使用可能であり、単独で、または他の薬学的活性化合物との結合もしくは適切な集合としても使用可能である。前記塩としては、薬学的に許容可能なものであれば、特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などを用い得る。

前記具体例による薬学的組成物は、目的に応じて非経口投与または経口投与することができ、一日に体重１ｋｇ当り０．１〜５００ｍｇの両で投与されるように１回〜数回に分けて投与可能である。特定の患者に対する投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度などによって変わり得る。

前記具体例による薬学的組成物は、各々通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形、軟膏、クリームなどの外用剤、坐剤及び滅菌注射液などを含め、薬剤学的製剤に適した如何なる形態でも剤形化して用いることができる。

前記具体例による薬学的組成物は、マウス、ラット、家畜、ヒトなどの哺乳動物に、非経口、経口などの多様な経路で投与でき、投与の全ての方法は予想可能であり、望ましくは、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与され得る。

前記具体例による薬学的組成物は、幹細胞を骨細胞へ分化させるために、デキサメタソン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）及びβ−グリセロリン酸（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの分化誘導物質をさらに含み得るが、これらに限定されない。

本発明の一実施例で、増殖した脂肪組織由来幹細胞から抽出したエキソソーム（Ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌ；ＡＳＣ−ＥＸＯ）及び骨細胞へ分化中の脂肪組織由来幹細胞から抽出したエキソソーム（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｓｔｅｍｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅ；Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）の大きさを確認した結果、各々の平均サイズが約５０〜２００ｎｍであることを確認することができた。

本発明のさらに他の一実施例で、本発明による増殖した脂肪組織由来幹細胞から抽出したエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）及び骨細胞へ分化中の脂肪組織由来幹細胞から抽出したエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）を含む組成物は、生体内への注入時、骨再生促進及び骨密度増進の効果に優れることを確認した。

他の一つの様態として、本発明の脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または治療用の注射剤を提供する。

前記注射剤は、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）をさらに含み得る。即ち、前記注射剤は、リン酸緩衝食塩水に脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを担持して用いることができる。

前記注射剤は、リン酸緩衝食塩水の代わりにハイドロゲルを含み得る。

前記ハイドロゲルは、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルジネート、キトサン、フィブリン、エラスチン、コラーゲン及びメチルセルロースから構成された群より選択されたいずれか一種であり、具体的に、ヒアルロン酸ハイドロゲルであり得るが、これに限定されない。

前記注射剤には、エキソソームが１×１０^６〜１×１０^１１パーチクル／ｍＬまたは１×１０^６〜１×１０^１１パーチクル／日／体重ｋｇで含まれ得るが、これに限定されない。

前記注射剤は、マウス、ラット、家畜、ヒトなどの哺乳動物の骨などの損傷部位に注射して投与でき、静脈に投与し得る。

本発明による注射剤組成物は、体内注入が容易であるため、手術時間と費用面で経済的であり、これによって、患者の苦痛、後遺症と経済的負担を減らしてくれる。また、幹細胞が骨細胞へ分化する途中に抽出されたエキソソームには、細胞外基質誘導体、細胞の増殖及び分化に関わる多様な成長因子が含まれており、損傷した骨組織の効果的な再生促進及び骨密度の増進が可能である。したがって、一回の施術によって長期的な効果を期待することができ、持続的な効果を得るために周期的に施術しなければならなかった既存の問題点を解消することができる。

さらに他の一つの様態として、本発明は、脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または改善用の健康機能食品を提供する。即ち、本発明による健康機能食品は、骨粗鬆症の予防または改善のために骨粗鬆症の発病段階前または発病後、骨粗鬆症の治療のための薬剤と共に、または別に使用できる。

本発明で使われる用語「改善」とは、治療される状態に関わるパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。

本発明による健康機能食品組成物は、骨粗鬆症の予防または改善の目的から、食品、飲み物などの健康補助食品に添加し得る。

前記食品の種類は特に制限されない。前記有効成分を添加できる食品の例には、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、餠、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲み物、アルコール飲料及びビタミン複合剤、乳製品及び乳加工製品などがあり、通常の意味の健康機能食品を全て含む。

本発明による健康機能食品においては、有効成分を食品にそのまま添加するか、他の食品または食品成分と共に使用でき、通常の方法によって適切に使用可能である。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）に応じて適合に決定され得る。通常、食品または飲料の製造時、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、望ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の攝取の場合、前記量は、前記範囲以下であり得る。

本発明の健康飲料用組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含むことを除いた他の成分は特に制限されず、通常の飲み物のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含み得る。上述した天然炭水化物の例としては、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロースなど；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールが挙げられる。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使い得る。前記天然炭水化物の割合は、当業者の選択によって適切に決定され得る。

前記の外に本発明の健康機能食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含み得る。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて用い得る。このような添加剤の割合も、当業者によって適切に選択可能である。

さらに他の一つの様態として、本発明の骨粗鬆症の予防または治療のための医薬の製造において、脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの用途を提供する。

前記脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームについては、前述のとおりであり、これを骨粗鬆症の予防または治療用の薬学的組成物に有効成分として含めて使用できることも、上述したようである。

さらに他の一つの様態として、本発明は、脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌ）から抽出されたエキソソームを有効成分として含む薬学的組成物を治療に有効な量で対象体に投与する段階を含む骨粗鬆症の予防または治療方法を含む。

前記対象体は、骨粗鬆症が発病した、または発病し得るヒトを含む全ての動物を意味する。

本願において使用された用語「治療上有効量」とは、研究者、獣医者、医者またはその他の臨床医によって考えられる組織系、動物またはヒトにおいて生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量を意味し、これは、治療する疾患または障害の症状の緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分の治療上有効量及び投与回数は、所望の効果によって変わり得ることは、当業者にとって自明である。そのため、投与される最適の投与量は、当業者によって適切に決定され得、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の含量、剤形の種類、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率などによってその範囲が多様である。本発明による脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの薬学的に有効な量は、１×１０^６〜１×１０^１１パーチクル／日／体重ｋｇであり得、４×１０^９パーチクル／日／体重ｋｇであり得る。しかし、前記薬学的に有効な量は、骨粗鬆症の症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間などによって適切に変わり得る。

本発明の治療方法において、本発明の脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌ）から抽出されたエキソソームを有効成分として含む組成物は、目的とする方法によって経口投与または非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができる。

具体的に、静脈注射療法、吸入投与方式、局所投与方式などによって対象体に投与することができ、吸入及び局所投与方式で直接的に骨にエキソソームを伝達することができるだけでなく、静脈注射時に血管に沿って循環していたエキソソームが自然に骨に蓄積されるため、複雑な治療過程なく前記のような簡単な方法で効率的に骨粗鬆症を治療することができる。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

発明の実施のための形態

以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであるだけで、本発明の範疇及び技術思想の範囲内で多様な変形及び修正が可能であることは、本技術分野の通常の技術者にとって明白であり、このような変形及び修正が添付の特許請求範囲に属することは言うまでもない。

［実施例１：増殖したヒト脂肪由来幹細胞からのエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）の抽出］
増殖した幹細胞からエキソソームを抽出するために、ヒト脂肪由来幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ３−７）を、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が含まれている通常の培養培地（ＤｕｌｂｅｃｃｏＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ＤＭＥＭ）で培養した後、無血清、無抗生剤、無フェノールレッド（ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅ）のＤＭＥＭ培地に変えて、２４時間維持して得た細胞培養上澄液を回収した。これより、増殖したヒト脂肪由来幹細胞からエキソソームを抽出した。

具体的に、回収した細胞培養上澄液を３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、０．２２μｍの加工サイズを有するフィルターを用いて細胞残余物を除去した。ろ過した後に回収した溶液を３００ｋＤＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｃｕｔｏｆｆ）を有するフィルターを用いてＴＦＦ（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｆｌｏｗｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）過程を経てタンパク質を除去した。回収した溶液にｓａｌｉｎｅｂｕｆｆｅｒを追加してＴＦＦ過程を連続して繰り返した後、最終的にエキソソームを得た。エキソソームは、使用前まで−７０℃で冷凍保管した。

［実施例２：骨細胞へ分化中のヒト脂肪由来幹細胞からのエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）の抽出］
本発明の一実施例において、エキソソームは、ヒト脂肪由来幹細胞が骨細胞へ分化する過程で抽出した。

具体的に、ヒト脂肪由来幹細胞（ｐａｓｓａｇｅ３−７）を骨細胞分化培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１μＭデキサメタゾン、０．５ｍＭアスコルビン酸、０．０１Ｍβ−グリセロリン酸が含まれたＤＭＥＭ高濃度グルコース）で培養しながら、３日に一回ずつ、無血清、無抗生剤、無フェノールレッドのＤＭＥＭ培地に替えて２４時間維持した。２４時間後、分化中の幹細胞の培養上澄液を回収した。上澄液を回収した後、さらに分化培地を添加して幹細胞の骨細胞分化を誘導し、このような過程を３週間繰り返した。

回収した細胞培養上澄液を３００ｘｇで５分間遠心分離し、細胞を除去した。さらに、回収した細胞培養上澄液を３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、０．２２μｍの加工サイズを有するフィルタを用いて細胞残余物を除去した。ろ過後に回収した溶液を３００ｋＤＭＷＣＯを有するフィルタを用いてＴＦＦ過程を経てタンパク質を除去した。回収した溶液にｓａｌｉｎｅｂｕｆｆｅｒを追加してＴＦＦ過程を連続して繰り返した後、最終的にエキソソームを得た。分化培地を交替して１週間後から細胞模様に変化が生じ、分化培地を交替して２週間後からは骨細胞への分化時に観察されるカルシウム沈殿物が形成されることを確認した。したがって、細胞模様の変化が確実に現われる分化誘導１週間後から４週間までの期間に回収した上澄液からエキソソームを抽出した。

［実施例３：増殖した脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム及び骨細胞へ分化中の脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームの特性確認］
前記実施例１及び実施例２から抽出したエキソソームを透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて確認したエキソソームの構造及び模様と、ナノ粒子分析機（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｔｒａｃｋｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて確認したエキソソームの大きさ分布と、を確認した。その結果は、図２に示した。

図２の（Ａ）及び（Ｂ）は、増殖したヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、骨細胞へ分化中のヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）の構造、模様（ＴＥＭ）及び大きさ（ＮＴＡ）を示す。

透過電子顕微鏡の結果（図２の（Ａ），（Ｃ））のように、抽出されたエキソソームは丸いナノ粒子模様であり、これらのエキソソームの平均サイズは、ＡＳＣ−ＥＸＯが１７６．７ｎｍ、Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯが１８１．８ｎｍであることを確認した（図２の（Ｂ），（Ｄ））。

［実施例４：ＯＰＧ（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）発現確認］
本発明の実施例１及び実施例２で抽出したエキソソーム１×１０^８パーチクル／ｍＬをｈｕｍａｎｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎＥＬＩＳＡＫｉｔを用いてエキソソーム内のＯＰＧ発現を定量分析した。この際、比較対照群として、骨髓由来幹細胞（ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）から抽出したエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−ＥＸＯ）を用いた。

その結果、増殖した幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）は、骨髓由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−ＥＸＯ）に比べて遥かに高いＯＰＧ含量を示した（４６．７９ｐｇ／１０^８パーチクルエキソソーム）。骨細胞へ分化中のヒト脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）のＯＰＧ含量は、２９．３８ｐｇ／１０^８パーチクルエキソソームであって、骨髓由来幹細胞から抽出されたエキソソーム（ＢＭ−ＭＳＣ−ＥＸＯ）のＯＰＧ含量（２７．４４ｐｇ／１０^８パーチクルエキソソーム）に比べて０．００１有意水準で差があることを確認した（Ｐ＜０．００１）［図３参照］。

［実施例５：骨再生促進及び骨密度増進の確認］
エキソソームを用いて骨再生及び骨密度増進を確認するために、増殖した幹細胞からのエキソソーム（ＡＳＣ−ＥＸＯ）及び骨細胞へ分化中の幹細胞から抽出されたエキソソーム（Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ）を、骨粗鬆症が誘発されたマウス（卵巣摘出モデル）に１×１０^８パーチクル／ｍＬのパーティクル濃度で２週間６回静脈に投与した。陰性対照群としては、ＰＢＳを２週間６回静脈に投与した。陽性対照群としては、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を５×１０^５個ずつ２回静脈に投与し、開腹手術のみを行ったｓｈａｍ群も共に分析した。

投与を終了してから２週間後、マウスの大腿骨を摘出してμＣＴを撮影し、骨体積（ｂｏｎｅｖｏｌｕｍｅ；ＢＶ）、組織体積に対する骨体積の比（ｐｅｒｃｅｎｔｂｏｎｅｖｏｌｕｍｅ；ＢＶ／ＴＶ）、骨密度（ｂｏｎｅｍｉｎｅｒａｌｄｅｎｓｉｔｙ；ＢＭＤ）、構造モデル指数（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌｉｎｄｅｘ；ＳＭＩ）、結節厚さ（ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｔｈｉｃｋｎｅｓｓ；Ｔｂ．Ｔｈ）、結節個数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒｎｕｍｂｅｒ；Ｔｂ．Ｎ）などのパラメータを比較分析した。

μＣＴの撮影結果を図４に示した。また、骨体積（ＢＶ）、組織体積に対する骨体積の比（ＢＶ／ＴＶ）、骨密度（ＢＭＤ）、構造モデル指数（ＳＭＩ）、結節厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）、結節個数（Ｔｂ．Ｎ）などのパラメータを比較分析した結果は図５に示したようである。

結節厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）の数値は、陰性対照群（ＰＢＳ）に比べて、ＡＳＣ、ＡＳＣ−ＥＸＯ、Ｏｓｔｅｏ−ＥＸＯ投与群で有意差を示さなかったが、骨体積（ＢＶ）、組織体積に対する骨体積の比（ＢＶ／ＴＶ）、骨密度（ＢＭＤ）、結節個数（Ｔｂ．Ｎ）は、陰性対照群（ＰＢＳ）と比較して０．０１の有意水準で増加したことを確認した。また、海綿骨構造を分析する構造モデル指数（ＳＭＩ）の場合、陰性対照群（ＰＢＳ）に比べて、ＡＳＣ、ＡＳＣ−ＥＸＯ投与群で０．０５の有意水準で減少したことを確認した。

ＳＭＩは、構造モデル指数であって、高齢または骨粗鬆症のような疾病があるときに指数が増加する様相を見せる。エキソソームの投与時、陰性対照群と比較したとき、有意味な減少結果からエキソソームが骨粗鬆症を緩和させることを確認した。Ｔｂ．Ｔｈ数値は、結節部位の骨厚さを意味するものであって、骨粗鬆症モデルにおいては、厚さが減少する傾向を見せる。本技術においてＴｂ．Ｔｈには差がなかったが、残りの骨体積（ＢＶ）、組織体積に対する骨体積の比（ＢＶ／ＴＶ）、骨密度（ＢＭＤ）、結節個数（Ｔｂ．Ｎ）、海綿骨構造指数（ＳＭＩ）においては、ＡＳＣ−ＥＸＯとＯｓｔｅｏ−ＥＸＯを処理したとき、留意差を示すことから、骨粗鬆症に効能があると判断される。

Claims

増殖した脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または治療用の薬学的組成物。
前記脂肪組織由来幹細胞が、ヒトまたは哺乳動物由来幹細胞である、請求項１に記載の骨粗鬆症の予防または治療用の薬学的組成物。
増殖した脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または治療用の注射剤。
前記注射剤は、エキソソームが１×１０^６〜１×１０^１１パーチクル／ｍＬの濃度で含まれるものである、請求項３に記載の骨粗鬆症の予防または治療用の注射剤。
増殖した脂肪組織由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む、骨粗鬆症の予防または改善用の健康機能食品。