KR20230062452A

KR20230062452A - 연골 항상성 인자를 포함하는 엑소좀 및 이를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230062452A
Application number: KR1020220142773A
Authority: KR
Inventors: 김재영; 최용준
Original assignee: 주식회사 씨케이엑소젠
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2022-10-31
Publication date: 2023-05-09
Also published as: WO2023075557A1

Abstract

본 발명은 연골 항상성 인자를 함유하는 엑소좀 및 상기 엑소좀을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 연골 항상성 인자를 함유하는 엑조좀에 의하여 효과적인 연골세포의 재생이 가능하므로, 골관절염의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

연골 항상성 인자를 포함하는 엑소좀 및 이를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물{Exosome comprising Cartilage Homeostasis Factor and Composition for Preventing or Treating Osteoarthritis comprising the same}

본 발명은 연골 항상성 인자를 발현하는 엑소좀 및 이를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

퇴행성 관절염이라고도 불리는 골관절염은 연골의 손상 혹은 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 연골 및 인대 등에 손상이 일어나고 염증과 통증이 생기는 만성질환이다. 골관절염은 손가락, 무릎(슬관절), 엉덩이(고관절), 허리(요추관절), 목(경추관절) 등 체내 거의 모든 관절에서 발병한다.

골관절염은 그 발생이 나이와 연관이 있어 관절의 과다 사용이나 노화에 따른 연골 마모로 인하여 발생하는 것으로 여겨져 왔다. 따라서, 골관절염에 대한 임상적 치료는 만성관절통증 완화에 초점을 맞추어 퇴행성 관절에 대한 물리치료, 항통증제를 이용한 관절세정술 및 인공관절치환술이 주를 이루었다. 그러나, 이러한 시술은 일시적인 관절 통증완화 효과만을 제공하므로 반복적인 치료가 요구되며, 인공관절치환술의 경우, 연령 및 환자의 병력에 따라 제한되어 시행된다는 문제점이 존재하였다.

최근 골관절염의 발생 기전과 연골세포의 여러 자극에 대한 반응들이 알려지면서, 단순히 노화와 연관되어 피할 수 없는 현상이 아니라 연골세포 대사균형의 이상 등 다양한 원인에 의한 관절 손상과, 이로 인해 여러 전신적 인자와 국소적 인자들이 서로 작용하여 발생하는 관절질환으로 이해되고 있으나, 지난 20년 동안 질병 기전 및 관련 강화 요인을 밝히기 위한 광범위한 연구 작업에도 불구하고 질병에 대한 완전한 이해는 아직 이루어지지 않았다.

한편, 엑소좀(exosome)은 세포 내에서 자연적으로 만들어지는 나노 크기의 소포체로서, 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포 밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병의 진행 등에 관여하고 있다. 생체 나노소포체(nanovesicle)인 엑소좀의 경우 면역반응을 피할 수 있고, 인체 적합성이 뛰어나며, 약물탑재 기능, 특정세포로의 표적전달 효과, 혈액 내 안정성 등의 장점을 통해 최근 약물 전달체로 큰 관심을 받고 있다.

이에, 본 발명자들은 엑소좀 기반의 골관절염 치료제를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허등록 제10-2249652호

본 발명의 하나의 목적은 연골 항상성 인자를 포함하는 세포 유래 엑소좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 연골 항상성 인자를 포함하는 세포 유래 엑소좀을 제공한다.

본 발명은 연골 항상성과 관련된 질환, 특히 골관절염의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 수 있는, 연골 항상성 인자를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀에 관한 것이다.

본 발명의 엑소좀은 세포가 배양되는 배지로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 배지는 세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지일 수 있으며, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 엑소좀은 세포가 배양되는 배지로부터 당 분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 통하여 분리 및 정제될 수 있다.

본 발명의 엑소좀은 연골 항상성 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 의하여 형질전환된 세포로부터 분비되는 것일 수 잇다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 연골 항상성 인자는 TGFβ1(Transforming growth factor β1), TGFβ2, TGFβ3, LRRC32(Leucine-rich repeat-containing protein 32), BMP2(Bone morphogenetic protein 2), BMP6, BMP7 및 FGF18(Fibroblast growth factor 18)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질일 수 있다.

TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, LRRC32, BMP2, BMP6, BMP7 및 FGF18와 같은 연골 항상성 인자를 코딩하는 유전자 정보는 GenBank 등 당 분야에서 유전정보의 검색에 통상적으로 활용되는 데이터베이스로부터 당업자에 의하여 선택될 수 있다.

본 발명의 형질전환은 세포의 형질전환에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 벡터를 사용하여 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pLVTHM, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법에 의해 줄기세포에 도입될 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 세포 종류에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행될 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법(예를 들어, 리포펙타민(Lipofectamine) 2000), 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포는 줄기세포, 면역세포 및 체세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 줄기세포는 중배엽 줄기세포(mesoderm stem cell), 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell) 및 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 줄기세포는 불멸화 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 면역세포는 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(Cytokine Induced Killer Cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포 (keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 엑소좀을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: the science and practice of pharmacy 22nd edition (2013)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 골관절염 예방 또는 치료 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 골관절염의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 1000㎎/㎏일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등의 형태로 투여될 수 있으며, 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물을 경구투여 제형으로 제형화할 경우, 이의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 광물유가 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 제제화에 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함하여 조제될 수 있으며, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여될 수 있으며, 예를 들어, 피하주사, 정맥주사, 관절주사 또는 근육 내 주사 등의 방법을 통하여 투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

비경구 투여용 제형으로의 제제화는, 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 멸균되고, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 제제화될 수 있다.

이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가만을 요구하는 동결-건조 조건하에 저장할 수 있다. 즉석의 사용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조될 수 있다.

연골 항상성 인자를 포함 엑소좀 및 이를 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물에 따르면, 연골 항상성 인자를 함유하는 엑소좀에 의하여 효과적인 연골세포의 재생이 가능하므로, 골관절염의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 연골 항상성을 조절하는 인자를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 엑소좀이 연골 항상성 인자를 발현함을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 것이다.
도 3은 BMP6 또는 TGFβ3를 발현하는 엑소좀을 연골세포에 처리하였을 때 연골세포가 성장함을 확인한 것이다.
도 4는 BMP6 또는 TGFβ3를 발현하는 엑소좀을 연골세포에 처리하고 플레이트에 스크래치를 낸 후 세포의 이동능을 확인한 것이다.
도 5는 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 BMP6 또는 TGFβ3를 발현하는 엑소좀의 처리에 의한 연골세포의 증식능을 확인한 것이다.
도 6은 MTS 시약으로 염색하여 BMP6 또는 TGFβ3를 발현하는 엑소좀의 처리에 의한 연골세포의 증식능을 확인한 것이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 연골 항상성 인자 유전자가 도입된 형질전환 줄기세포의 제조

연골 항상성 인자를 포함하는 엑소좀을 제조하기 위하여, 실시예 1-1 내지 1-3의 방법에 따라, 엑소좀을 방출하는 줄기세포에 연골 항상성 인자를 코딩하는 유전자를 형질전환하여 연골 항상성 인자 유전자가 도입된 형질전환 줄기세포를 제조하였다.

1-1. 불멸화 줄기세포 준비

불멸화 줄기세포(immortalized stem cell)는 ATCC로부터 구매하여 준비하였으며, DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium) 배지에서 5% CO₂ 및 37℃ 조건으로 배양하였다.

1-2. 렌티바이러스 벡터 제조 및 보관

연골 항상성 인자 유전자를 형질도입하기 위하여 렌티바이러스 벡터를 사용하였다.

구체적으로, Addgene으로부터 pLVTHM 벡터를 구매하였으며, pLVTHM의 GFP(green fluorescent protein) 사이트(site)를 TGFβ1(Transforming growth factor β1), TGFβ2, TGFβ3, BMP2(Bone morphogenetic protein 2), LRRC32(Leucine-rich repeat-containing protein 32), BMP6, BMP7 또는 FGF18(Fibroblast growth factor 18)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 대체하여, 연골 항상성 인자의 형질전환에 사용하기 위한 pLVTHM-TGFβ1, pLVTHM-TGFβ2, pLVTHM-TGFβ3, pLVTHM-LRRC32, pLVTHM-BMP2, pLVTHM-BMP6, pLVTHM-BMP7 및 pLVTHM-FGF18 재조합 렌티바이러스 벡터를 각각 제조하였다.

재조합 렌티바이러스 벡터를 농축하기 위하여, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 재조합 렌티바이러스 벡터 12㎍, psPax2 85㎍ 및 pMD2G 3㎍으로 293T 세포를 형질전환하고, 24시간 및 48시간 후 26,000rpm으로 2시간 동안 4℃에서 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 재조합 렌티바이러스 펠릿을 DMEM 200㎕에 재부유시켜 -80℃에서 보관하였다.

1-3. 렌티바이러스 벡터 형질전환

실시예 1-1에서 준비한 불멸화 줄기세포를 5×10⁴cells/well의 밀도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 후 실시예 1-2에서 준비한 재조합 렌티바이러스 벡터 20㎕를 DMEM 배지에 첨가하여 16시간 동안 배양한 다음 세포를 세척하였다. 48시간 후, 재조합 렌티바이러스 벡터의 형질전환율을 증가시키기 위하여 상기 과정을 한번 더 반복하였다.

실시예 2. 형질전환 줄기세포의 배양 및 엑소좀 분리

실시예 1에서 제조한 연골 항상성 인자 유전자가 도입된 형질전환 줄기세포 1×10⁶cell/㎖를 DMEM 배지에서 5% CO₂ 및 37℃ 조건으로 배양하였다. 형질전환 줄기세포로부터 엑소좀을 분리하기 위하여, 상기 배지에 IFN-γ(10U/㎖) 및 TNF-α(50ng/㎖)를 동시에 처리하고 산소농도를 3%로 낮추고, 24시간 동안 배양한 다음, 각 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 농축하여 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 배양액을 수득하였다.

그 후, 배양액을 300×g에서 10분간 원심분리하고 상등액을 분리한 후, 분리된 상등액을 2,000×g에서 20분간 원심분리한 후, 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액을 다시 100,000×g에서 70분간 원심분리한 후, 상등액을 제거한 펠렛을 PBS에 부유하고 소니케이션(sonication)하여 엑소좀 입자를 분리하였다.

실시예 3. 분리된 엑소좀의 연골 항상성 인자 발현 확인

분리된 엑소좀으로부터 연골 항상성 인자가 발현되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2에서 분리한 엑소좀을 PBS로 씻어낸 후, 프로테아제 억제제 칵테일(GenDEPOT, Barker, TX, USA)과 포스파타아제 억제제 칵테일(GenDEPOT, Barker, TX, USA)을 함유한 RIPA 버퍼(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 12.5μL, 1M의 DTT(DiThioThreitol) 5 μL이 포함된 수용액 50μL에 용해하였다. 용해물을 100℃에서 5분간 끓여 웨스턴 블롯을 위한 엑소좀 표본을 준비하였다. 샘플을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석하고, PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 5% 탈지분유 중 Tween-20을 함유하는 PBS로 블로킹하였다. 그 후, TGFβ3, BMP6, LRRC32 및 GAPDH에 대한 일차 항체와 각각 4℃에서 밤새 배양한 다음, 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 항체-항원 복합체는 향상된 화학발광(chemiluminescent) 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 검출하였고, 신호 강도는 Fusion Solo 2 화상이미지 분석기(Vilber Lourmat, Paris, France)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, pLVTHM-TGFβ3, pLVTHM-BMP6, 및 pLVTHM-LRRC32 재조합 렌티바이러스 벡터로 각각 형질전환된 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀은 각각 TGFβ3, BMP6, 또는 LRRC32를 발현하는 것으로 확인되었다.

실시예 4. 분리된 엑소좀의 연골세포 증식 효과 확인

4-1. 연골세포의 성장 및 상처 치유 효과 확인

연골세포(Chondrocyte)는 아래의 방법으로 분리된 토끼 연골세포를 아주대학교병원 정형외과 실험실에서 수득하여 사용하였다. 구체적으로, 뉴질랜드 화이트종(New Zealand White) 토끼의 무릎관절의 연골을 얇게 저며서 분리한 후 연골을 PBS로 3회 세척하였다. 0.2% 타입 Ⅱ 콜라게나아제가 함유된 DMEM에 연골을 넣고, 37℃ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 120rpm으로 6시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세포 부유액을 셀 스트레이너(cell strainer)에 여과한 후 원심분리기에 넣고 1600 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 3회 세척하고 배지(DMEM + 10% FBS)로 세포 부유액을 제조하였다. 세포를 5×10⁴ cells/cm²의 세포 밀도가 되도록 플레이트에 넣어준 뒤, 5% CO₂ 및 37℃ 조건으로 인큐베이터에 넣어 배양하였다.

다음으로, 150mm 플레이트에서 배양한 연골세포를 6 웰 플레이트에 8 × 10⁴/well의 세포를, 60mm 플레이트에 3.2 × 10⁶/well의 세포를 각각 접종한 후 5% CO₂ 및 37℃ 조건으로 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 대조군(control)을 제외하고 6well 플레이트에 0.22 μL 필터링을 한 엑소좀을 100μL, 500 μL 분주 한 후 시간이 지남에 따라 세포 성장의 차이를 확인하였다. 60mm 플레이트는 세포 성장 확인 후 멸균한 tip 끝으로 바닥에 스크래치를 낸 후 엑소좀을 100 μL, 500 μL 분주 한 후 스크래치 난 부분의 세포 성장 차이를 확인하였다. 6 웰 플레이트, 60mm 플레이트의 세포 사진을 확보한 후 warm up 한 1X PBS로 3번 세척한 후 세포 고정(fixation)을 위해 4% 파라포름알데히드를 플레이트 표면이 잠길 정도로 분주 후 실온에서 30분간 고정하였다. 고정이 끝난 후 각 플레이트를 1X PBS로 3번 세척한 후 크리스탈 바이올렛을 20% 에탄올 100ml에 1g (1%)로 만들어 준 후 플레이트 표면이 잠길 정도로 분주 후 실온에서 10분 간 염색 과정을 진행하였다. 크리스탈 바이올렛을 제거한 후 세포에 붙지 않은 염색약 제거를 위해 1X PBS로 5번 세척하였다. 세척된 세포의 모양, 분포를 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3 내지 도 5에 나타난 바와 같이, TGF-β3 또는 BMP6를 발현하는 엑소좀을 처리한 군에서 처리한 엑소좀의 양이 증가할수록 세포 성장이 빨라지고, TGFβ3 또는 BMP6을 발현하는 엑소좀을 처리한 군 모두에서 손상 부위가 재생되는 것으로 나타났다.

이로부터, 연골 항상성 인자 유전자가 도입된 형질전환 줄기세포 유래 엑소좀이 골관절염을 치료하는 효과를 나타냄을 알 수 있다.

4-2. MTS 분석

연골세포를 150mm 플레이트에서 배양하고 세포 안정화를 진행한 후 96 웰 플레이트에 세포를 1 × 10⁴/well 만큼 도말 한 후 5% CO₂ 및 37℃ 조건으로 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 대조군(control)을 제외하고 96 웰 플레이트에 0.22 μL filter로 여과한 엑소좀을 2 μL, 10 μL씩 분주하였다. 48시간 뒤 MTS reagent를 각 웰에 10 μL 분주한 후 5% CO₂ 및 37℃ 조건으로 인큐베이터에서 배양하여 발색 반응을 시키고 색이 변하기 시작할 때까지 5분 단위로 확인하였다. MTS 시약이 노란색에서 보라색으로 바뀌는 발색 반응이 시작되면 490nm파장에서 흡광도 측정하였다.

그 결과, [표 1] 및 [도 6]에 나타난 바와 같이, TGFβ3 또는 BMP6를 발현하는 엑소좀을 처리한 군에서 처리한 엑소좀의 양이 증가할수록 세포 성장이 더욱 빨라지는 것을 확인하였다.

	대조군	엑소좀 2 μL	엑소좀 10 μL
BMP 6 발현 엑소좀	0.203	0.261	0.37
TGFβ3 발현 엑소좀	0.209	0.260	0.394

이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 연골 항상성 인자 유전자가 도입된 형질전환 줄기세포 유래 엑소좀은 골관절염의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있는 것으로 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

연골 항상성 인자를 포함하는 세포 유래 엑소좀.
청구항 1에 있어서,
상기 연골 항상성 인자는 TGFβ3 또는 BMP6인 세포 유래 엑소좀.
청구항 1에 있어서,
상기 세포는 줄기세포, 면역세포 및 체세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포인 것인 세포 유래 엑소좀.
청구항 3에 있어서,
상기 줄기세포는 중배엽 줄기세포(mesoderm stem cell), 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell) 및 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포인 것인 세포 유래 엑소좀.
청구항 3에 있어서,
상기 줄기세포는 불멸화 줄기세포인 것인 세포 유래 엑소좀.
청구항 3에 있어서,
상기 면역세포는 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(Cytokine Induced Killer Cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포인 것인 세포 유래 엑소좀.
청구항 3에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포 (keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포인 것인 세포 유래 엑소좀.
청구항 1의 엑소좀을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.