KR20190011213A - 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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이경수
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Abstract

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 골 재생을 촉진시키며, 골 밀도를 증진시킴으로써 골다공증 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating osteoporosis comprising stem cell-derived exosomes}
본 발명은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인간을 포함한 다세포 생명체 내에 존재하는 다양한 세포에서는 ‘엑소좀’이라는 나노 크기의 소포체를 분비하는 것으로 알려졌다. 엑소좀은 세포 막과 동일한 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결함하여 막 구성요소, 단백질 RNA를 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 줄기세포에서 분비되는 엑소좀은 줄기세포가 분비하는 다양한 성장인자와 사이토카인을 함유하고 있어, 조직 재생에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 또한 엑소좀은 추출하는 과정에서 세포 배양액 내 세포 노폐물, 항생제, 혈청 등 불순물이 제거되므로, 세포 배양액의 효과와 동등하면서 안전하게 사용 가능하다.
골 조직은 파골세포의 골흡수와 조골세포의 골형성 과정이 순차적으로 발생하여 항상성을 유지하는 조직이다. 골다공증은 폐경, 노화 등 여러 가지 원인에 의하여 골 재형성 과정의 평형이 무너지고, 이에 따른 뼈 미세구조의 변화로 뼈의 강도가 약화되는 질환이다. 골다공증은 골밀도의 저하로 척추, 대퇴, 요골 등의 골절 위험도가 증가하며, 뚜렷한 증상 없이 서서히 진행되기 때문에 예방이 매우 중요한 질환이다.
골다공증의 원인은 크게 폐경 후 골다공증(제 1형 골다공증)과 노인성 골다공증(제 2형 골다공증)으로 나뉘는데, 폐경 후 골다공증은 여성에서 폐경 이후 에스트로겐 분비가 줄어들면서 급격한 골 흡수가 야기되어 나타나며, 노인성 골다공증은 연령 증가에 따라 뼈의 형성보다 흡수가 늘면서 골밀도가 줄어들어 나타난다.
2016년 고령자 통계(통계청)에 2015년 기준 65세 이상 인구는 657만명으로 전체 인구의 13.2%에 이른다. 노인 인구의 증가에 따라, 노인성 질환으로 분류되는 골다공증의 환자도 급격하게 증가하고 있는 추세이다. 50세 이상 성인의 5명중 1명(22.4%)이 골다공증, 2명 중 1명(47.9%)이 골감소증이다. 70대 이상 골다공증의 유병률은 여성이 68.5%, 남성이 18.0% 이다. 빠른 속도로 초고령화 사회에 진입하고 있는 국내 현실상 골다공증 유병률은 더욱 높아질 것으로 예상 가능하다.
현재 임상에서 쓰이고 있는 골다공증 치료제로는 비스포스포네이트(bisphosphonate), 칼시토닌(calcitonin) 등 골 흡수 억제제와, 골형성 촉진제인 부갑상선호르몬(parathyroid hormone)이 사용되고 있다. 폐경기 여성에서는 에스트로겐 투여가 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나 비스포스포네이트 제제는 장기 투여 시 위장관 장애, 과도한 골 재형성 억제로 인한 부작용이 발생할 가능성이 있으며, 에스트로겐 역시 장기 투여 시 정맥 혈전증, 심근경색 등 동맥경화성 질환을 증가시키며 유방암 발생률을 증가시킨다는 보고가 있다.
줄기세포를 이용한 골다공증 치료제가 특허 출원된 바 있으나[특허문헌 1~3], 성체 줄기세포는 이식 시 생존율과 생착률이 저조하기 때문에 효율이 떨어지며, 미분화 줄기세포가 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재하는 문제가 있다. 또한, 줄기세포 배양액은 세포 노폐물, 항생제, 소태아혈청(FBS) 등 불순물의 잔존 가능성이 있다.
이에, 부작용이 적고 장기 투여가 가능하며, 효능이 우수한 골다공증 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
국내 특허 공개특허공보 제2007-0101756호 국내 등록 특허 제679642호 국내 특허 공개특허공보 제2014-0006323호
이에, 본 발명자들은 종래 기술이 갖는 문제점을 해결하기 위하여 줄기세포로부터 OPG(osteoprotegerin)와 같이 파골형성억제 인자를 함유한 엑소좀을 추출하였고, 이를 이용한 골다공증 예방 및 치료용 조성물 개발에 응용하기 위한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 주사제를 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력뿐만 아니라, 세포가 위치하는 환경의 영향을 받아 필요에 따라 적절한 신호가 주어질 경우, 다중분화능(multi-potency)의 특성에 의해 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 특성이 있으며, 지방, 골수, 제대혈 및 태반 등에 포함되어 있다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다.
본 발명에서 용어 "지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)"란 지방조직에서 유래하는 줄기세포로, 지방조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, 지방 유래 줄기세포는 배양 시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 다양한 세포로의 분화가 가능하다.
본 발명에서 사용된 용어, "증식된 줄기세포"란, 조직에서 추출한 passage 0의 줄기세포를 일반배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)를 이용하여 passage 7까지 증식된 줄기세포를 의미한다. 이로부터 줄기세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "골세포로 분화되고 있는 줄기세포"란, 골세포 기원의 줄기세포로부터 골세포로 분화하는 중에 있는 줄기세포를 의미한다. 이로부터 골세포 분화와 관련된 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다. 구체적으로, 줄기세포가 골세포로 분화할 때 세포의 모양 및 특성이 변하는데, 이때 엑소좀을 추출하는 것이다. 따라서 일반 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 것과 다르다고 볼 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 엑소좀의 평균 직경은 대략 30-200 nm이다.
상기 증식된 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 줄기세포의 기본적인 특성을 가질 수 있고, 조직 재생에 필요한 중요한 성장인자, 생체활성 단백질 및 유전자 정보 등을 함유할 수 있다.
상기 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 줄기세포의 기본적인 특성을 가질 수 있고, 골 분화 시 중요한 성장인자, 여러 생체활성 단백질 및 유전자 정보 등을 함유할 수 있다. 구체적으로는 파골세포 활성 억제 물질로, 파골전구세포(pre-osteoclast)의 분화를 억제하는 OPG(osteoprotegerin), 골세포 활성 촉진인자 중 하나로 주변의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)를 끌어들여 골세포 분화를 촉진하는 역할을 하는 BMPs(bone morphogenic proteins) 골세포 활성 촉진인자 중 하나로 골조상세포(osteoprogenitor cells)의 이동(migration) 및 조골세포로의 분화를 촉진하며, 혈관생성을 도와 골 조직이 잘 재생될 수 있도록 돕는 TGF-β(transforming growth factor-β) 등 골다공증 예방 및 치료와 관련된 인자를 포함할 수 있다
상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법으로 이용하여 제조할 수 있고, 예를 들어
1) 줄기세포를 증식하는 단계;
2) 상기 증식된 줄기세포를 골 세포로 분화시키는 단계; 및
3) 골 세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출 및 정제하는 단계;를 포함하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 "골세포 분화 유도"란 줄기세포(stem cell)가 골세포로 분화(differentiation)되도록 유도하는 것을 의미할 수 있다.
상기 골 세포로 분화되는 줄기세포는 골세포로 분화 가능한 성체 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 골세포로 분화 가능한 성체 유래 줄기세포는 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 지방 유래 줄기세포는 인간 또는 포유동물 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 상기 추출방법으로 추출된 엑소좀이 골다공증 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명에 따른 "골다공증 예방 또는 치료용 조성물"은 효과적인 골 재생을 위한 효능 물질로서 골세포로 분화하는 줄기세포에서 추출한 엑소좀을 사용한다는 점에서 종래 기술들과 차별성이 있다. 추출, 정제된 엑소좀에 담지된 세포의 증식 및 분화 관련 다양한 성장인자들에 의해 효과적으로 지속 가능한 골 조직의 재생이 이루어지며, 기존의 성체줄기세포의 체외 세포배양의 문제점 또는 세포 사멸로 인한 조직의 석회화 등의 문제들을 해결할 수 있다.
본 발명에 따른 골세포로 분화하는 기간 동안 추출된 줄기세포 유래 엑소좀은 줄기세포의 특성뿐 아니라 골세포로의 분화 관련 활성인자들만을 효과적으로 전달하여, 부작용은 최소화하면서 기존 줄기세포를 이용한 치료와 같은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 골세포로 분화하는 기간 동안 추출된 줄기세포 유래 엑소좀은 세포에서 분비되는 생체막 소포체이다. 또한 세포막과 유사한 지질 구조를 가지고 있기 때문에 체내에 주입되었을 때 주변 세포로의 흡수율이 뛰어나 효능 물질의 빠른 전달로 골 조직의 효과적 재생 유도가 가능하다.
본 발명에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 골다공증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다.
또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물 성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화 수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으나, 바람직하게는 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 줄기세포를 골세포로 분화시키기 위하여 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 베타 글리세로인산(β-glycerophosphate) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Adipose tissue-derived stem cell; ASC-EXO) 및 골 세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Osteogenic differentiating stem cell-derived exosome; Osteo-EXO)의 크기를 확인한 결과, 각각의 평균 크기가 약 50 ~ 200 nm 임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명에 따른 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(ASC-EXO) 및 골 세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Osteo-EXO)을 포함하는 조성물은 생체 내 주입 시 골 재생 촉진 및 골 밀도 증진 효과가 우수한 것을 확인하였다
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 주사제를 제공한다.
상기 주사제는 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)를 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 주사제는 인산완충식염수에 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 담지하여 사용할 수 있다.
상기 주사제는 인산완충식염수 대신 하이드로젤을 포함할 수 있다.
상기 하이드로젤은 히알루론산, 젤라틴, 알지네이트, 키토산, 피브린, 엘라스틴, 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 히알루론산 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 주사제는 엑소좀이 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/mL 또는 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/day/체중 kg로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 주사제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물의 골 등의 손상 부위에 주사하여 투여할 수 있으며, 정맥 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 주사제 조성물로서 체내 주입이 용이하기 때문에 수술 시간과 비용 면에서 경제적이고, 이에 따라 환자의 고통, 후유증과 경제적 부담을 줄여준다. 또한 줄기세포가 골세포로 분화될 때 추출된 엑소좀에는 세포외기질 유도체, 세포의 증식 및 분화와 관련된 여러 성장인자들이 포함되어 있어 손상된 골 조직의 효과적인 재생 촉진 및 골밀도 증진이 가능하다. 따라서 한 번의 시술로 장기적인 효과를 기대할 수 있어 지속적인 효과를 얻기 위해 주기적으로 시술을 해야 했던 기존의 문제점을 극복할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 건강기능식품은 골다공증 예방 또는 개선을 위하여 골다공증의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 골다공증의 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 골다공증의 예방 또는 개선을 목적으로 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강기능식품에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강음료용 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 골다공증 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 용도를 제공한다.
상기 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 대하여는 전술한 바와 같고, 이를 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유효성분으로 포함하여 사용할 수 있음 또한 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료 방법을 포함한다.
상기 대상체는 골다공증이 발병하였거나 발병할 수 있는, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효성분에 대한 치료상 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 약학적으로 유효한 양은 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/day/체중 kg일 수 있으며, 4 x 109 particles/day/체중 kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 골다공증 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다.
구체적으로, 정맥주사요법, 흡입투여방식, 국소투여방식 등을 통해 대상체에 투여할 수 있으며, 흡입 및 국소 투여 방식으로 직접적으로 골에 엑소좀을 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 정맥주사 시 혈관을 따라 순환하던 엑소좀이 자연적으로 골에 축적되기 때문에 복잡한 치료 과정 없이 상기와 같은 간단한 방법으로 효율적으로 골다공증을 치료할 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 조골세포의 활성 및 파골세포의 활성을 억제하는 생체활성인자 발현율이 우수하여 골다공증을 예방 및/또는 치료하는데 효과가 있다. 또한, 기존 세포치료제에 대한 부작용은 최소화하면서 세포 유래 전달체로서 안정적이면서 신속하게 효능물질을 세포 내로 전달할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 조성물로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 이의 응용에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 분석에 대한 결과를 나타낸 도면으로, 투과전자현미경(transmission electron microscope)을 이용하여 확인한 엑소좀의 구조 및 모양과 나노입자분석기(nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 확인한 엑소좀의 크기 분포를 나타낸 것이다. (A)와 (B)는 증식하는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO), (C)와 (D)는 분화하는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)의 구조, 모양 및 크기를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 OPG(osteoprotegerin) 함량에 대한 ELISA 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO, Osteo-EXO)을 골다공증이 유발된 쥐 모델(자궁 적출 모델, ovariectomized mice model)에 정맥 주사하고, 투여 종료 2주 후, 쥐의 대퇴골을 적출하여 μCT를 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO, Osteo-EXO)을 골다공증이 유발된 쥐 모델(자궁 적출 모델, ovariectomized mice model)에 정맥 주사하고, 투여 종료 2주 후, 쥐의 대퇴골을 적출하여 μCT를 촬영하여 bone volume(BV, 골 부피), percent bone volume(BV/TV, 조직 부피 대비 골 부피), bone mineral density(BMD, 골 밀도), structure model index(SMI, 구조 모델 지수), tubercular thickness(Tb.Th, 결절 두께), trabecular number(Tb.N, 결절 개수) 등 파라미터를 비교 분석한 결과는 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1: 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀 ( ASC - EXO ) 추출
증식된 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위하여, 인간 지방 유래 줄기세포(passage 3-7)를 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM contating 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 배양한 후 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하여 얻은 세포 배양 상층액을 회수하였다. 이로부터, 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하였다.
구체적으로, 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 0.22 μm 가공 크기를 갖는 filter를 이용하여 세포 잔여물을 제거하였다. 여과 후 회수한 용액을 300 kD molecular weight cut off(MWCO)를 갖는 filter를 이용하여 TFF(tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였다. 회수한 용액에 saline buffer를 추가하여 TFF 과정을 연속 반복한 후 최종적으로 엑소좀을 수득하였다. 엑소좀은 사용 전까지 -70 ℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 2: 골 세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀 (Osteo-EXO) 추출
본 발명의 일 실시예에서, 엑소좀은 인간 지방 유래 줄기세포를 골세포로 분화하는 과정에서 추출하였다.
구체적으로, 인간 지방 유래 줄기세포(passage 3-7)를 골세포 분화 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 아스코르빈산(ascorbic acid), 0.01 M 베타-글리세로인산(β-glycerophosphate)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco Modified Eagle Medium))에서 배양하면서 3일에 한번씩 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하였다. 24시간 후, 분화하고 있는 줄기세포의 배양 상층액을 회수하였다. 상층액을 회수한 이후 다시 분화 배지를 첨가하여 줄기세포의 골세포 분화를 유도하였으며, 이러한 과정을 3주까지 반복하였다.
회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 5분간 원심분리하여 세포를 제거하였다. 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 0.22 μm 가공 크기를 갖는 filter를 이용하여 세포 잔여물을 제거하였다. 여과 후 회수한 용액을 300 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 filter를 이용하여 TFF (tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였다. 회수한 용액에 saline buffer를 추가하여 TFF 과정을 연속 반복한 후 최종적으로 엑소좀을 수득하였다. 분화 배지 교체 1주 후부터 세포 모양의 변화가 생기며, 분화 배지 교체 2주 후부터는 골세포로 분화 시 관찰되는 칼슘 침전물이 형성되는 것을 확인하였다. 따라서 세포 모양의 변화가 확실하게 나타나는 분화 유도 후 1주 후부터 4주까지의 기간 동안 회수한 상층액으로부터 엑소좀을 추출하였다.
실시예 3: 증식된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 골세포로 분화되고 있는 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 확인
상기 실시예 1 및 실시예 2로부터 추출한 엑소좀을 투과전자현미경(transmission electron microscope)을 이용하여 확인한 엑소좀의 구조 및 모양과 나노입자분석기(nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 확인한 엑소좀의 크기 분포를 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2의 (A)와 (B)는 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO), (C)와 (D)는 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)의 구조, 모양(TEM) 및 크기(NTA)를 나타낸다.
투과전자현미경 결과(도 2의 (A), (C))와 같이 추출된 엑소좀은 둥근 나노입자 모양이며, 이들 엑소좀의 평균 크기는 ASC-EXO 176.7 nm, Osteo-EXO 181.8 nm인 것으로 확인하였다(도 2의 (B), (D)).
실시예 4: OPG ( Osteoprotegerin ) 발현 확인
본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에서 추출한 엑소좀 1 x 108particles/mL을 human osteoprotegerin ELISA Kit를 이용하여 엑소좀 내 OPG 발현을 정량 분석하였다. 이때, 비교 대조군으로서 골수 유래 줄기세포(bone-marrow mesenchymal stem cells)로부터 추출된 엑소좀(BM-MSC-EXO)을 사용하였다.
그 결과, 증식된 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO)은 골수 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(BM-MSC-EXO)에 비교하여 월등히 높은 OPG 함량을 보였다(46.79 pg/108 particle exosomes). 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)의 OPG 함량은 29.38 pg/108 particle exosomes 으로, 골수유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(BM-MSC-EXO)의 OPG 함량(27.44 pg/108 particle exosomes)과 비교하여 0.001 유의수준에서 차이가 있는 것을 확인하였다(P < 0.001)[도 3 참조]
실시예 5: 골 재생 촉진 및 골 밀도 증진 확인
엑소좀을 이용하여 골 재생 및 골 밀도 증진을 확인하기 위하여 증식하고 있는 줄기세포 엑소좀(ASC-EXO) 및 골세포로 분화되어 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)을 골다공증이 유발된 쥐(난소적출모델)에 1x108 particles/mL의 파티클 농도로 2주 동안 6번 정맥 투여하였다. 음성 대조군으로는 PBS를 2주동안 6번 정맥 투여하였다. 양성 대조군으로는 지방유래 줄기세포(ASC)를 5x105개씩 2번 정맥 투여하였으며, 개복수술만 진행한 sham 그룹도 함께 분석하였다.
투여 종료 2주 후, 쥐의 대퇴골을 적출하여 μCT를 촬영하여 bone volume(BV, 골 부피), percent bone volume(BV/TV, 조직 부피 대비 골 부피), bone mineral density(BMD, 골 밀도), structure model index(SMI, 구조 모델 지수), tubercular thickness(Tb.Th, 결절 두께), trabecular number(Tb.N, 결절 개수) 등 파라미터를 비교 분석하였다.
μCT를 촬영 결과는 도 4에 나타내었다. 또한, bone volume(BV, 골 부피), percent bone volume(BV/TV, 조직 부피 대비 골 부피), bone mineral density(BMD, 골 밀도), structure model index(SMI, 구조 모델 지수), tubercular thickness(Tb.Th, 결절 두께), trabecular number(Tb.N, 결절 개수) 등 파라미터를 비교 분석한 결과는 도 5와 같다.
비록 결절 두께(Tb.Th) 수치는 음성대조군(PBS)에 비하여 ASC, ASC-EXO, Osteo-EXO 투여군에서 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 골 부피(BV), 조직 부피 대비 골 부피(BV/TV), 골 밀도(BMD), 결절 개수(Tb.N)는 음성대조군(PBS)와 비교했을 때 0.01 유의수준에서 증가한 것을 확인하였다. 또한, 해면골 구조를 분석하는 구조 모델 지수(SMI)의 경우 음성대조군(PBS)에 비하여 ASC, ASC-EXO 투여군에서 0.05 유의수준에서 감소한 것을 확인하였다.
(SMI는 구조모델지수로서 고령 혹은 골다공증과 같은 질병이 있을 때 지수가 증가하는 양상을 보인다. 엑소좀 투여 시 음성대조군과 비교하였을 때 유의적으로 감소하는 결과를 통해 엑소좀이 골다공증을 완화시킨다고 확인하였다. Tb.Th 수치는 결절부위의 골 두께를 의미하는 것으로 골다공증 모델에서는 두께가 감소하는 경향을 보인다. 본 기술에서 TbTh에는 차이가 없었지만 나머지 골 부피(BV), 조직 부피 대비 골 부피(BV/TV), 골 밀도(BMD), 결절 개수(Tb.N), 해면골 구조지수(SMI)에서는 ASC-EXO과 Osteo-EXO을 처리했을 때 유의한 차이를 보이는 바, 골다공증에 효능이 있다고 판단된다.)

Claims (9)

  1. 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 골세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방조직 유래 줄기세포는 인간 또는 포유동물 유래 줄기세포인, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 주사제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 주사제는 엑소좀이 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/mL 농도로 포함되는 것인 골다공증 예방 또는 치료용 주사제.
  7. 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 골세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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