CN109045282A - 一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法 - Google Patents

Abstract

一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，包含有以下步骤：第一步，制备脐血细胞因子，制备脐血干细胞；第二步，激发自体外周血干细胞；第三步，将脐血细胞因子输注血液，使脐血细胞因子与自体外周血干细胞相联合进行治疗；第四步，定期随访治疗者的各项指标变化。本发明中，自体干细胞没有免疫排斥，可以长期存活，但细胞的活性不足；用输入细胞因子的方法改善自体干细胞的生存环境，二者联合使用体现了优势互补，且在延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松过程中无副作用，采用输入脐血细胞因子和自体外周血干细胞修复受损的组织以恢复脏器功能达到延缓卵巢衰老和治疗骨质疏松的目的。

Description

一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早 衰和治疗骨质疏松的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，特别涉及一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法。

背景技术

众所周知，衰老是伴随生命发生、发展过程中的一种活动，是机体从构成物质、组织结构到生理功能的丧失和退化过程。衰老过程是从受精卵到死亡之间持续发生的，只是到了一定的阶段衰老的特征才比较明显地显现出来。人体衰老过程中的生理变化主要体现在机体组织细胞和构成物质的丧失，机体代谢率的减缓，机体和器官功能减退。衰老是不可避免的，但延缓衰老却是可能的。细胞寿命有限，细胞自然衰老，于是人体也开始衰老。年老体衰是自然规律，不可抗拒，只有及时对受损细胞、衰老细胞进行有效治疗，使受损细胞得到康复，衰老细胞得到激活，器官组织和生理功能才能完全恢复正常，人体才从真正意义上保持健康、保持年轻态。目前主流抗衰老技术如清除自由基抗衰老治疗、激素替代治疗技术等也存在一定的不足与局限性，而且目前也没有效果很好的抗衰老药物，所以通过何种手段来达到抗衰老的目的仍是目前最大的问题与难点。

干细胞产业作为再生医学的一部分，已成为一种新兴的健康医药产业，并对包括传统再生医学在内的多种不同医学专科及应用技术产生重要影响。早在1956年，世界上已经开展“吸血鬼”式抗衰老的研究，通过将年轻老鼠和老年老鼠的血管相接，构建血液循环系统，实现“异种同生”模式。结果发现老年鼠的关节软骨得到年轻化恢复，并且发现老年鼠的肝脏、肌肉都呈现年轻化状态，并且修复了损伤的细胞。研究者在研究过程中发现，脐血细胞因子中含有大量的粒细胞刺激因子对人的外周血自体干细胞动员有较强的辅助作用。干细胞是探索人体生长、发育和衰老的核心环节，从临床医学的角度看，干细胞疗法可能彻底改变许多疾病的治疗方法，特别是通过组织和器官替代和修复治疗许多难治性疾病。干细胞能有效治疗血液病、自身免疫性疾病、糖尿病、治疗多发性硬化症，心肌梗死、慢性阻塞性肺疾病等，并有可能成为衰老性疾病治疗的新策略。干细胞治疗已经在世界范围开展。

在如今卵巢早衰和骨质疏松症日渐年轻化、广泛化的大背景下，越来越多的科学家研究用干细胞治疗衰老和相关疾病。随着我国干细胞技术与应用不断发展与成熟，干细胞技术在抗衰老和治疗相关疾病领域的应用也将迅速扩展开来。虽然有一些临床试验结果也初步显示干细胞对治疗衰老退行性疾病有效，也具有一定的治疗作用，但是生效时间较为缓慢，疗效持续时间较短，因此，亟需开发一种利用脐血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法。

发明内容

(1)技术问题

因此，如何开发一种利用脐血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，成了本领域技术人员亟待解决的问题。

(2)技术方案

针对上述问题，本发明的内容是提供一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，不具有药物性的副作用，能够增强人体体质和提高人体机能，对于卵巢早衰和骨质疏松有明显的治疗作用，且疗效持续时间较长。

一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，包含有以下步骤：

第一步，制备脐血细胞因子，制备脐血干细胞；

第二步，激发自体外周血干细胞；

第三步，将脐血细胞因子输注血液，使脐血细胞因子与自体外周血干细胞相联合进行治疗；

第四步，定期随访治疗者的各项指标变化。

在所述第一步中，所述脐血细胞因子是包含有GDF11和XZZY-5的脐血血浆，是经过离心、提取、冷冻保存等过程进行制备。脐血细胞因子具体提取过程为：分离脐血血浆，经检测脐血血浆中含有脐血细胞因子GDF11和XZZY-5；脐血经高速分离机离心使血细胞与血浆分层，提取血浆，将血浆与配置FBS保护剂1：1在4℃混合，使DMSO终浓度为10％，采用1℃/min程序降温将至-40℃，再以5℃/min的速率程序降温快速将至-80～-100℃，然后投入液氮中保存备用。

所述脐血干细胞是将脐血在无菌条件下采集单个核细胞，与配置FBS保护剂1：1在4℃混合，使DMSO终浓度为10％，采用1℃/min程序降温将至-40℃，再以5℃/min的速率程序降温快速将至-100℃，然后投入超低温液氮中保存备用。

在所述第二步中，激发自体干细胞的过程为：a.对脐血干细胞进行37℃恒温水浴复苏，洗涤DMSO，使得DMSO浓度在1％以下。b.对治疗者静脉滴注脐血干细胞一个单位，观察2-3天后，皮下注射粒细胞集落刺激因子，以下简称G-CSF，用量为7μg/kg，2次/日，两次用药时间需间隔十小时以上，5-7天为一疗程。c.治疗者用药后每天观察体温和全身症状。第3天开始每天上午用药后2h，采血查血常规，观察各项指标变化。第4天开始血液涂片显微镜下观察有无干细胞，如有干细胞观察其数量及形态。一般5-7天左右干细胞数量达到峰值。d.促使干细胞归巢：当血液中干细胞达到峰值后，进行第二次脐血干细胞静脉滴注，促使多余的干细胞归巢。

在所述第三步中，对脐血细胞因子进行37℃恒温水浴复苏，热源检测和内毒素检测后输注入治疗者血液。

所述脐血细胞因子复苏，将脐血细胞因子37℃恒温水浴，洗涤DMSO，使得DMSO浓度在1％以下。再离心洗涤，取少许上层上清加入到鲎试剂中进行热源检测和内毒素监测。最后，回输的血型配对与静脉回输，取回输者少许血液样本与脐血细胞因子进行血液血型配对检测，检测合格后进行静脉回输。

进一步的，所述脐血细胞因此内毒素检测，检测结果为阴性，才可进行下一步，如结果为阳性，废弃。内毒素检测为阴性的制品取样与输注者血液进行检测，无溶血等不良反应才可进行回输。

进一步的，所述脐血细胞因子从超低温液氮中取出后，冷藏保存，应在6h内及时回输。

第四步中，整个治疗疗程中，分别在治疗者治疗一个月、三个月、五个月、七个月后进行复查，通过体能测试结果、骨密度测试、结果退行性关节炎以及绝经后卵巢大小变化。

(3)有益效果

本发明中脐血细胞因子辅助自体外周血干细胞进行治疗，自体干细胞没有免疫排斥，可以长期存活，但细胞的活性不足；用输入细胞因子的方法改善自体干细胞的生存环境，二者联合使用体现了优势互补，且在延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松过程中无副作用，干细胞归巢后，高活性、年轻的细胞因子有助于自体干细胞更好的发挥作用，采用输入脐血细胞因子和自体外周血干细胞修复受损的组织以恢复脏器功能达到延缓卵巢衰老和治疗骨质疏松的目的。

附图说明

图1是本发明简易流程图。图2为本发明具体实施例中骨质疏松症患者治疗后骨密度变化统计图，图3是本发明具体实施例中退行性关节炎患者疼痛缓解状况统计图，图4是本发明具体实施例中绝经后卵巢治疗后变化统计图，图5是具体实施例中不同治疗时间的雌激素水平变化图，图6是具体实施例中不同治疗时间的卵巢大小比较图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，包含有以下步骤，如图1所示：①制备脐血细胞因子，制备脐血干细胞；②激发自体外周血干细胞；③将脐血细胞因子输注血液，使脐血细胞因子与自体外周血干细胞相联合进行治疗；④定期随访治疗者的各项指标变化。

具体实施例：通过对117人采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞进行治疗，分别对其进行体能测定，并对注射脐血细胞因子的身体状况数据进行对比得出表1所示的数据：

表1：体能测定数据

参与治疗的117人中有43人患有骨质疏松症，采用本发明提供的治疗方法治疗7个月，分别在1个月、3个月、5个月、7个月对其骨密度变化进行统计，所用超声骨密度仪为日本ALOA公司的AOS-100NW，数据见表2：

表2骨质疏松症患者治疗后骨密度变化统计表

图2为骨质疏松症患者治疗后骨密度变化统计图，图2中空白条框代表骨密度显著增加，斜线条框代表骨密度轻度增加，点框色代表骨密度无明显改变。

从表2和附图2的数据可得出，43名骨质疏松症患者中，骨密度增加者占总数的25.6％。

参与治疗的117人中，有51人患有退行性关节炎，采用本发明提供的治疗方法治疗7个月，分别在1个月、3个月、5个月、7个月对其疼痛缓解状况进行统计，统计数据如表3和图3所示，图3中交叉网框代表疼痛消失，十字点框代表疼痛明显减轻，竖线条框代表疼痛轻度减轻，空白条框代表无明显改变。从图3、表3可以看出退行性关节疾病的治疗近期效果不及远期效果，但是随着时间延长，其效果也越来越明显，退行性关节炎症状缓解者占总数的98.0％。

表3退行性关节炎患者疼痛缓解状况统计表

参与治疗的117人中，有33人已经绝经，采用本发明提供的治疗方法治疗7个月，分别在1个月、3个月、5个月、7个月对其卵巢体积进行观察，统计数据见表4，绝经后卵巢体积明显增大者占21.2％。图4为绝经后卵巢治疗有效率统计图，其中星形条框代表卵巢显著增大，虚线条框代表卵巢轻微增大，空白条框代表卵巢无明显改变。

表4绝经后卵巢治疗统计数据表

对于卵巢体积未增大的绝经患者，随机选取其中一人，分别在治疗时即0个月、治疗2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月对其体内的雌激素进行测量，得出不同治疗时间的雌激素水平变化表，如表5所示，雌激素水平变化图如图5所示。其中，雌激素检测设备为美国雅培i2000化学发光免疫分析仪，试剂为雅培配套试剂。从表5和图5的数据可得出，病人经治疗，其雌激素水平持续性波动升高。

同时，还对该病人双侧卵巢体积大小进行持续观察，得出不同治疗时间卵巢的体积大小表，如表6所示，其中ROV是指右侧卵巢，LOV是指左侧卵巢。图6是不同治疗时间的卵巢大小比较图，空白条框代表LOV左侧卵巢大小，斜线条框代表ROV右侧卵巢大小。从表6和图6的数据可得出，病人经治疗，其双侧卵巢体积持续增大，随着治疗时间的加长，卵泡也再现，重新具备怀孕的指标。

表5不同治疗时间的雌激素水平变化表

表6不同治疗时间卵巢大小的变化

经上述实施例中的117人次经过本发明提供的脐血细胞因子联合自体外周血干细胞治疗前后身体状况比较可以看出：经过治疗体能明显改善者为100％(117/117)；退行性关节炎症状缓解者占总数的98.0％(50/51)，绝经后卵巢体积明显增大者21.2％(7/33)，其中1例经过多疗程治疗卵泡再现，卵巢恢复可怀孕的指标。骨质疏松患者中骨密度增加者占总数25.6％(11/43)。

根据以上的研究数据表明：本发明提供的治疗方法对于延缓卵巢衰老有效，对骨质疏松症也具有一定的治疗效果。

本发明不局限于上述实施方式，任何人在本发明的启示下都可以得出其他各种形式的产品。凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，其特征在于：包含有以下步骤：

第一步，制备脐血细胞因子，制备脐血干细胞；

第二步，激发自体外周血干细胞；

第三步，将脐血细胞因子输注血液，使脐血细胞因子与自体外周血干细胞相联合进行治疗；

第四步，定期随访治疗者的各项指标变化。

2.根据权利要求1所述的一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，其特征在于：

所述脐血细胞因子是包含有GDF11和XZZY-5的脐血血浆，脐血细胞因子具体提取过程为：分离脐血血浆，经检测脐血血浆中含有脐血细胞因子GDF11和XZZY-5；脐血经高速分离机离心使血细胞与血浆分层，提取血浆，将血浆与配置FBS保护剂1：1在4℃混合，使DMSO终浓度为10％，采用1℃/min程序降温将至-40℃，再以5℃/min的速率程序降温快速将至-80～-100℃，然后投入液氮中保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，其特征在于：

所述脐血干细胞是将脐血在无菌条件下采集单个核细胞，与配置FBS保护剂1：1在4℃混合，使DMSO终浓度为10％，采用1℃/min程序降温将至-40℃，再以5℃/min的速率程序降温快速将至-100℃，然后投入超低温液氮中保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，其特征在于：

在所述第二步中，激发自体干细胞的过程为：

a.对脐血干细胞进行37℃恒温水浴复苏，洗涤DMSO，使得DMSO浓度在1％以下；

b.对治疗者静脉滴注脐血干细胞一个单位，观察2-3天后，皮下注射粒细胞集落刺激因子，以下简称G-CSF，用量为7μg/kg，2次/日，两次用药时间需间隔十小时以上，5-7天为一疗程；

c.治疗者用药后每天观察体温和全身症状；第3天开始每天上午用药后2h，采血查血常规，观察各项指标变化；第4天开始血液涂片显微镜下观察有无干细胞，如有干细胞观察其数量及形态；一般5-7天左右干细胞数量达到峰值；

d.促使干细胞归巢：当血液中干细胞达到峰值后，进行第二次脐血干细胞静脉滴注，促使多余的干细胞归巢。

5.根据权利要求1所述的一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，其特征在于：

在所述第三步中，对脐血细胞因子进行37℃恒温水浴复苏，热源检测和内毒素检测后输注入治疗者血液。

6.根据权利要求5所述的一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，其特征在于：

所述脐血细胞因子复苏，将脐血细胞因子37℃恒温水浴，洗涤DMSO，使得DMSO浓度在1％以下。再离心洗涤，取少许上层上清加入到鲎试剂中进行热源检测和内毒素监测。最后，回输的血型配对与静脉回输，取回输者少许血液样本与脐血细胞因子进行血液血型配对检测，检测合格后进行静脉回输。

7.根据权利要求1所述的一种采用脐血干细胞输注联合自体外周血干细胞延缓卵巢早衰和治疗骨质疏松的方法，其特征在于：整个治疗疗程中，分别在治疗者治疗一个月、三个月、五个月、七个月后进行复查，通过体能测试结果、骨密度测试、结果退行性关节炎以及绝经后卵巢大小变化。