WO2009088314A1 - Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием - Google Patents
Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием Download PDFInfo
- Publication number
- WO2009088314A1 WO2009088314A1 PCT/RU2007/000750 RU2007000750W WO2009088314A1 WO 2009088314 A1 WO2009088314 A1 WO 2009088314A1 RU 2007000750 W RU2007000750 W RU 2007000750W WO 2009088314 A1 WO2009088314 A1 WO 2009088314A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- drug
- brain
- subjected
- biologically active
- animals
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
Definitions
- a method of obtaining a biologically active complex with a neuroregenerative and neuroprotective effect is provided.
- the claimed technical solution relates to the chemical and pharmaceutical industry, specifically to the isolation of biologically active complexes from animal organs and can be used in medicine and veterinary medicine as a pharmaceutical agent, restoring the functions of the nervous system in case of damage, stimulating its physiological reparative regeneration.
- Several methods are known for producing a biologically active peptide preparation from tissues of various parts of the brain. All of them include operations of tissue homogenization, acid extraction, sediment separation and isolation of the target product from it / 1-2 / The methods differ in the conditions of operations and substances that are used in the process of operations.
- Cerebrolysin a drug for the treatment of hemorrhagic or ischemic strokes
- Cerebrolysin company Ebewe (Austria) (information published in the Handbook VIDAL-2007, 2007, page B-1195), which is a product of brain treatment of intact pigs.
- the composition of Cerebrolysin includes amino acids ( ⁇ 85%), peptides (-15%), trace elements, water.
- the trophic effect of the drug is carried out due to specific peptides, and the dominant amino acids that determine the properties of the drug are lysine, leucine and alanine.
- the prototype drug is intended for intravenous administration / 3 /.
- "Cerebrolysin" has a low concentration of biologically active components, therefore it is introduced into the patient's body in significant doses for a long time.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
- a disadvantage of the known drug is the significant duration of the course of treatment, a short period of remission and low activity.
- the objective of the present invention is to obtain a biologically active complex with a pronounced neuroregenerative and neuroprotective effect.
- the task is achieved by the claimed method.
- the essence of the proposed method for producing a biologically active complex is that the frozen brain of embryos of pigs, sheep or cattle with a gestation period from the beginning of the middle third to the middle of the last third of pregnancy is thawed, subjected to homogenization in a buffer solution at pH 7.2 - 8.4, the homogenate is filtered, the obtained filtrate is centrifuged, the supernatant is filtered and subjected to anion exchange chromatography, the obtained target fractions are ultrafiltered, desalted and subjected to real filtering.
- the pH of the buffer media be in the range of 7.2 - 8.4; in the described biologically active complex, the protein content with molecular masses from 5 kDa to 110 kDa was not less than 95% of the total protein content, the brain of pig, sheep or cattle embryos with gestational age from the beginning of the middle third to the middle of the last was used as raw material third of pregnancy. Other parameters will have different proteins.
- the isolated protein complex differs from the previously obtained complexes isolated from the brain of animals in terms of the source of raw materials, the molecular masses of the protein fractions included in it, and their quantitative and qualitative composition.
- Example 1 A method of obtaining a biologically active complex.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 300 g of frozen brain of pig embryos are thawed and homogenized in 1500 ml of 0.05 M glycine buffer pH 7.8 containing 1 mm EDTA for 5 minutes at 4 ° C.
- the homogenate is separated from the ballast substances by filtration through a dense tissue, followed by centrifugation at 25,000 g and filtration through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m at 4 - 8 ° C.
- the filtrate is applied to a pH of 7.8, balanced with 5 volumes of 0.05 M TRIS-glycine buffer, containing 0.1 mM EDTA and 1 M NaCl (buffer B), and then with 7 volumes of 0.05 M TRIS-glycine buffer, pH 7.8, containing 0.1 mM EDTA (buffer A) chromatographic column with a volume of 200 ml with anion exchange medium Touoreagl DEAE-650M.
- Separation of the proteins bound to the carrier is carried out by a stepwise gradient, increasing the concentration of buffer B in 5% increments, collecting the target fractions.
- the chromatographic process is carried out at a temperature of 4-8 0 C.
- the target fraction is subjected to ultrafiltration at the installation with a backpressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 5 kDa, desalted, diluted with 0.05 M glycine-NaOH solution pH 7, 5 to a protein concentration of 0.1 mg / ml.
- the solution is subjected to sterilizing filtration through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.22 ⁇ m.
- the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the wavelength region from 250 to 350 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 280 ⁇ 5 nm.
- the molecular weight of the proteins included in the preparation is determined by the following methods: gel chromatography on Surerdex 75 ("GE Healthcare"). To calibrate the column, protein standards are used with a molecular weight range from 13 kDa to 2000 kDa; by the method of denaturing "SDS-Page” electrophoresis in 12% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins.
- composition of the drug includes proteins with a molecular weight of from 5 kDa to 110 kDa.
- Amino acid analysis (%): Asp - 10.65; Thg - 5.00; Seg - 5.68; GIu 15.01; Pro - 6.55; GIy - 4.59; AIa - 6.06; VaI - 5.97; Met - 2.14; Not - 4.24; Leu - 8.74; Tug - 3.67; Phe - 4.54; Om 0.33; Ls - 7.93; His - 2.48; Arg - 6.18.
- Example 2 The effect of a biologically active complex (drug) on the development of brain explants.
- the experiments were performed on 52 fragments of the cerebral cortex and 40 fragments of the spinal cord ganglia of 10 -12-day old chicken embryos.
- the culture medium for explant cultivation consisted of 35% Eagle's solution, 25% fetal calf serum, 35% Hanks solution, 5% chicken embryonic extract, glucose (0.6%), insulin (0.5 units / ml) were added to the medium penicillin (100 units / ml), glutamine (2 mm). Fragments of the cerebral cortex or spinal cord ganglia were placed in this medium and cultured on a collagen substrate in Petri dishes in a thermostat at a temperature of 36.7 ° C for 2 days.
- the studied drug was added to the experimental medium and, as a positive control, cerebrolysin and cortexin at concentrations of 0.5, 1, 2, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 ng / ml.
- the criterion of biological activity was the area index (PI) - the ratio of the area of the entire explant along with the growth zone to the outgoing area of the brain fragment.
- PI area index
- the significance of differences in the compared mean IP values was evaluated using Student's t-test. The IP values were expressed as a percentage, the control IP value was taken as 100%.
- the growth area of the control brain explants was composed of short neurites, as well as evicted glia cells and fibroblast-like cells.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Cerebrolysin and cortexin at various concentrations were added to the culture medium of explants of the cerebral cortex and spinal ganglia of chick embryos.
- a distinct stimulation of the development of cerebral cortex explants was detected under the action of the studied drug at a concentration of 20 ng / ml, when the PI of experimental explants was 48 ⁇ 4.5% significantly higher than the PI of the control explants and comparison explants under the action of cortexin and cerebrolysin.
- Cerebrolysin did not have a significant effect on the increase in the growth zone of explants of the spinal cord ganglia, cortexin significantly increased the PI by 24%, while the studied drug contributed to an increase in PI by. 36% This indicates a pronounced and directed stimulating effect of the drug on neurons of various parts of the brain.
- Example 3 The study of the toxicity of a biologically active complex (drug)
- a study of acute toxicity was conducted on 72 white outbred male mice weighing 20-22 g. Animals were randomly divided into 6 equal groups. The drug was administered to animals once intramuscularly at doses of 5 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg, 200 mg / kg, 500 mg / kg in 0.5 ml of sterile 0.05 M glycine-NaOH solution of pH 7.5. The control group animals were injected with the same volume of sterile 0.05 M glycine-NaOH solution pH 7.5.
- the animals of the control group were injected in the same volume with sterile 0.05 M glycine-NaOH solution pH 7.5.
- the morphological composition and properties of peripheral blood were studied in animals. At the end of the experiment, biochemical and coagulological blood parameters were examined.
- peripheral blood was determined by conventional methods: the number of red blood cells, hemoglobin, reticulocytes, platelets, white blood cells, white blood cell count, erythrocyte sedimentation rate (ESR), and erythrocyte resistance.
- ESR erythrocyte sedimentation rate
- erythrocyte resistance was determined by the method of Lowry, potassium and sodium by plasma spectrophotometry.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The study of subacute and chronic toxicity of the drug indicates the absence of side effects with prolonged use of the drug in doses exceeding the therapeutic by 3,000 times. When studying the effect of the drug on the morphological composition and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs after 3 and 6 months after the start of its administration, no significant change in the indicators was revealed.
- the drug obtained by the proposed method with long-term administration to animals does not have toxic properties that prevent its further use as a medicine, made in the form of a dosage form for parenteral administration.
- Example 4 Evaluation of the neuroprotective and antiamnestic effects of the drug in ischemic brain pathology.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) were statistically processed using Mann-Whitney U-test groups for pairwise comparison. The difference within each group between preoperative and postoperative parameters was assessed using the paired T-test of Wilcoxon. All experimental animals were divided into four groups: 1st intact, trained; 2nd — trained, falsely operated; 3rd — ischemic with intraperitoneal administration of a physiological solution; 4th — ischemic with intraperitoneal administration of the drug (dose - 0.1 mg - 1 ml of solution per rat) 1 hour after photothrombosis and then daily for 5 days.
- Passive avoidance reaction was developed according to the standard method (Buresh, Bureshova, Haston, 1983), evaluating the latent period (LP) in seconds. the transition of the rat from the dark compartment of the camera to the light. In the experiment, only those animals were taken whose LP passive avoidance reaction after training was 300 seconds.
- Figure. 2 reflects the change in the latent period of the conditioned reflex of passive avoidance in seconds after photothrombosis of the prefrontal cortex of rats; effect of the drug. 1- falsely operated; 2-phototrambosis + NaCl 0.9% (0.5 ml ip); 3-phototrombosis + preparation (0.5 ml of solution / day). # - difference of the 2nd group from the 1st (P ⁇ 0,01); A - difference of the 2nd group from the 3rd (P ⁇ 0.05).
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) that the course administration of the drug improved short-term memory in rats with symmetrical focal ischemic lesions in the prefrontal cortex.
- Example 5 The effect of the drug on damage in created by the method of photoinduced thrombosis in the prefrontal cortex of rat brain ischemic focus.
- the area of ischemic damage was measured blindly (when the experimenter does not know where the control is and where the experiment is) using computer image analysis programs in relative units and correlated with the area of the scanned square with a side of 10 mm, obtaining the value of the damage area in mm 2 .
- the length of the ischemic focus in the rats treated with the drug is less, both in the left and right hemispheres, as well as in the total length.
- N ° Injected substance Amount Amount Total rat slices, slices, number containing brain slices with ischemic ischemic ischemic lesion in the right lesion in the left hemisphere damage to the hemisphere
- V ⁇ S n x d, where d is the thickness of a pair of sections (200 ⁇ m); S n - the measured area of the ischemic focus of serial cut in mm 2 ; ⁇ is the sum of the volumes of ischemic damage in sections.
- the volume of lesion of the left hemisphere in the treated animals is significantly less (significantly, P ⁇ 0.05) in relation to the control with the introduction of physiological saline after damage to the cortex, whereas in the right it is practically the same.
- the total volume of the lesion in both hemispheres in animals with the introduction of the drug is less by 10 mm 3 (significantly, P ⁇ 0.05) compared with animals with the introduction of physiological saline.
- the protective effect of the drug is more clearly visible if we calculate the coefficient of effectiveness of protection (KEZ) according to the formula:
- V 0 the average total volume of the lesion in both hemispheres in animals with the introduction of saline
- V to - the average total volume of the lesion in both hemispheres in animals with the introduction of the substance
- the drug (0.1 mg -1 ml of r-ra, in / b) with a course of administration one hour after the creation of the ischemic focus in the cortex and daily for 5 days after the operation has a significant antiamnestic effect, helping to preserve conditioned reflexes of passive avoidance developed before surgery.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) A comparative pathomorphological study of the material provided showed that on histological sections of the control group stained by the Nissl method (cresyl violet), ischemic changes characteristic for this stage of the post-ischemic period were reliably detected, while the experimental group showed greater preservation of neuronal structures.
- the studied drug has a certain effect on the state of the tone of the vessels of the brain.
- this indicator significantly decreased in the ischemia + physiological saline group, while with the same damage to the cortex and administration of the drug, the motor activity of the animals did not practically differ from the falsely operated control.
- Example 6 The effectiveness of the drug in patients with vascular encephalopathy
- the results of the study indicate the normalizing effect of the drug in a therapeutically effective dose of 0.28 ⁇ g on the integrative function of the brain in patients with vascular encephalopathies and the feasibility of its use for the treatment of patients with brain pathology in this dose intranasally once daily for 14 days.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относиться к химико-фармацевтической промышленности. Способ получения биологически активного комплекса, обладающего выраженным нейрорегенеративным и нейропотекторным действием, заключается в том, что замороженный головной мозг эмбрионов свиней, овец или крупного рогатого скота со сроком гистации от начала средней трети, до середины последней трети беременности, размораживают, подвергают гомогенизации в буферном растворе при рН 7,2 - 8,4, гомогенат фильтруют, полученный фильтр центрифугируют, супернатант фильтруют и подвергают анионообменной хроматографии, полученные целевые фракции подвергают ультрофильтрации, обессоливают и подвергают стерильному фильтрованию.
Description
Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием.
Заявляемое техническое решение относится к химико-фармацевтической промышленности, конкретно к выделению биологически активных комплексов из органов животных и может быть использовано в медицине и ветеринарии как фармацевтическое средство, восстанавливающие функции нервной системы при ее поражениях, стимулирующее ее физиологическую репаративную регенерацию. Известно несколько способов получения биологически активного пептидного препарата из тканей различных участков головного мозга. Все они предусматривают операции гомогенизации ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение из него целевого продукта /1-2/ Способы различаются условиями проведения операций и веществами, которые используются в процессе проведения операций.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов "Церебролизин" фирмы Еbеwе (Австрия) (информация опубликована в Справочнике BИДAЛЬ-2007, за 2007 год, стр. B-1195), который является продуктом обработки мозга интактных свиней. В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (~85%), пептиды (-15%), микроэлементы, вода. Трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов, а доминирующими аминокислотами, определяющими свойства препарата, являются лизин, лейцин и аланин. Препарат-прототип предназначен для внутривенного введения /3/. "Церебролизин" обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, короткий период ремиссии и низкая активность.
Задачей настоящего изобретения является получение биологически активного комплекса, обладающего выраженным нейрорегенеративным и нейропротекторным действием. Поставленная задача достигается заявленным способом.
Сущность заявляемого способа получения биологически активного комплекса состоит в том, что замороженный головной мозг эмбрионов свиней, овец или крупного рогатого скота со сроком гистации от начала средней трети, до середины последней трети беременности, размораживают, подвергают гомогенизации в буферном растворе при рН 7,2 - 8,4, гомогенат фильтруют, полученный фильтрат центрифугируют, супернатант фильтруют и подвергают анионообменной хроматографии, полученные целевые фракции подвергают ультрофильтрации, обессоливают и подвергают стерильному фильтрованию.
Возможны и другие схемы выделения целевого продукта, но важно, чтобы на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 7,2 - 8,4; в описываемом биологически активном комплексе содержание белка с молекулярными массами от 5 кДа до 110 кДа было не менее 95% от общего содержания белка, в качестве сырья используют головной мозг эмбрионов свиней, овец или крупного рогатого скота со сроком гестации от начала средней трети до середины последней трети беременности. При других параметрах будут другие белки
Выделяемый белковый комплекс отличается от полученных ранее комплексов, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, молекулярным массам входящих в него белковых фракций, их количественному и качественному составу.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ получения биологически активного комплекса.
I. Получение белковой фракции.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
300 г замороженного головного мозга эмбрионов свиньи размораживают и гомогенизируют в 1500 мл 0,05 M глицинового буфера рН 7,8, содержащего 1 мМ ЭДТА, в течение 5 минут при 4°C.
Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 25 000 g и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4 - 8°C. Фильтрат наносят на уравновешенную 5 объемами 0,05 M ТРИС-глицинового буфера рН 7,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 1 M NaCl (буфер Б), а затем 7 объемами 0.05 M ТРИС-глицинового буфера рН 7.8, содержащего 0.1 мМ ЭДТА (буфер А) хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Тоуореагl DEAE-650M. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом, повышая концентрацию буфера В с шагом 5%, собирая целевые фракции. Хроматографический процесс производят при температуре 4- 80C. Целевую фракцию подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 5 кДа, обессоливают, разводят 0,05 M раствором глицин-NаОН рН 7,5 до концентрации белка 0,1 мг/мл.
Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм.
Для характеристики полученной белковой фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа.
Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм.
Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют следующими методами: методом гель-хроматографии на Suреrdех 75 («GE Healthcare»). Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазон молекулярных масс от 13 кДа до 2000 кДа; методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-нoм полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят белки с молекулярной массой от от 5 кДа до 110 кДа.
Аминокислотный анализ (%): Аsр - 10,65; Тhг — 5,00; Sег - 5,68; GIu - 15,01 ; Рrо - 6,55; GIy - 4,59; AIa - 6,06; VaI - 5.97; Меt - 2,14; Не - 4.24; Lеu - 8,74; Туг - 3,67; Рhе - 4,54; Om- 0,33; Lуs - 7,93; Нis - 2,48; Агg - 6,18.
Пример 2. Влияние биологически активного комплекса (препарата) на развитие эксплантатов головного мозга.
Эксперименты проведены на 52 фрагментах коры головного мозга и 40 фрагментах спинно-мозговых ганглиев 10 -12 -суточных эмбрионов цыпленка. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты коры головного мозга или спинно-мозговых ганглиев помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7° С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли исследуемый препарат и как положительный контроль - церебролизин и кортексин в концентрациях 0,5, 1, 2, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) — соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.
Зону роста контрольных эксплантатов головного мозга составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки.
При исследовании непосредственного влияния препаратов на фрагменты головного мозга были поставлены следующие серии опытов.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
B питательную среду эксплантатов коры головного мозга и спинномозговых ганглиев эмбрионов цыплят добавляли церебролизин и кортексин в различных концентрациях.
На 3-й сутки культивирования с добавлением церебролизина при концентрации 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 24±3,5 %, по сравнению с контрольными значениями ИП. Достоверных значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций церебролизина не наблюдалось.
На 3-й сутки культивирования с добавлением кортексина при концентрации 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 32±4 %, по сравнению с контрольными значениями ИП. Отмечалось достоверное повышение ИП эксплантантов коры головного мозга при концентрации кортексина 100 нг/мл на 28+3,5%, концентрации 200 нг/мл на 23+2%. Достоверные значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций кортексина не наблюдалось.
Отчетливая стимуляция развития эксплантатов коры головного мозга выявилась при действии исследуемого препарата в концентрации 20 нг/мл, когда ИП экспериментальных эксплантатов на 48±4,5% был достоверно выше, чем ИП контрольных эксплантатов и эксплантатов сравнения при действии кортексина и церебролизина.
При добавлении церебролизина в среду для культивирования эксплантатов спинно-мозговых ганглиев достоверного увеличения ИП эксплантатов не отмечалось, в то время как при добавлении в среду кортексина наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 22±3%. При добавлении исследуемого препарата в среду для культивирования эксплантатов спинно-мозговых ганглиев наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 36±3,5%.
При исследовании эксплантатов коры головного мозга и спинно-мозговых ганглиев на более длительных сроках культивирования - 7 дней - выявились те же эффекты нейрит-стимулирующего действия в тех же концентрациях исследуемого препарата.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Таким образом, в отношении тканей головного мозга наблюдалось уменьшение порога эффективных концентраций для исследуемого препарата по сравнению с церебро лизином и кортексином. Так увеличение зоны роста эксплантатов фрагментов коры головного мозга выявлялось при действии церебролизина только в концентрации 100 нг/мл, кортексина только в концентрациях 50 и 100 нг/мл, а при действии исследуемого препарата — в концентрации 20, 10, 50 и 100 нг/мл соответственно. При этом интенсивность стимулирующего действия препарата была достоверно выше, чем кортексина и церебролизина. На увеличение зоны роста эксплантатов спинно-мозговых ганглиев церебролизин достоверного действия не оказывал, кортексин достоверно увеличивал ИП на 24%, в то время как исследуемый препарат способствовал увеличению ИП на. 36%. Это свидетельствует о выраженном и направленном стимулирующем действии препарата на нейроны различных отделов головного мозга.
Пример 3. Изучение токсичности биологически активного комплекса (препарата)
Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями ((Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических вeщecтв» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.
Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 5 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг, 500 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 M глицин-NаОН раствора рН 7,5. Животным контрольной группы в том же объеме вводили стерильный 0,05 M глицин-NаОН раствор рН 7,5.
Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 95 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 M глицин-NаОН раствора рН 7,5. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,05 M глицин-NаОН раствор рН 7,5. До введения препарата и на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата на 112 морских свинках-самцах с массой тела 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 мес. в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 M глицин-NаОН раствора рН 7,5. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,05 M глицин-NаОН раствор рН 7,5 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.
При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 3000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено.
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.
Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.
Пример 4. Оценка нейропротективного и антиамнестического действия препарата при ишемической патологии мозга.
Для адекватной оценки нейропротективного и антиамнестического действия препарата при ишемической патологии мозга применялась модель двустороннего ишемического повреждение префронтальной коры мозга крыс методом фототромбоза /4-5/ Данный неинвазивный метод позволяет выбрать нужную локализацию ишемического коркового инфаркта, объем которого воспроизводится из опыта в опыт, что дает возможность получить статистически достоверные количественные данные о степени повреждения мозга, динамике патологических и репаративных процессов в фокальном ишемическом очаге. Работа выполнена на нелинейных крысах-самцах, весом 210-260 г. Животные содержались в виварии при свободном доступе к пище и воде и естественной смене дня и ночи. Двусторонний фокальный ишемический очаг в префронтальной (поля FrI и Fг2) коре головного мозга крыс создавали методом фотохимического тромбоза, (В.D.Wаtsоп еt аl., 1985). Полученные данные
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
обрабатывали статистически, используя для попарного сравнения между группами U-tеst Манна-Уитни. Различие в пределах каждой группы между дооперационными и послеоперационными показателями оценивали по парному Т-критерию Вилкоксона. Все экспериментальные животные были разделены на четыре группы: 1-aя-интaктныe, обученные; 2-ая - обученные, ложнооперированные; 3-я -ишемизированные с внутрибрюшинным введением физиологического р-ра; 4-ая — ишемизированные с внутрибрюшинным введением препарата (доза - 0,1 мг - 1 мл р-ра на крысу) через 1 час после фототромбоза и далее ежедневно в течение 5 дней.
До начала выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) горизонтальную двигательную активность (ГА) крыс тестировали в автоматизированном "открытом поле" POДЭO-1, оценивая ГА животных за 5 мин. наблюдения. По показателям двигательной активности в «oткpытoм пoлe» экспериментальные группы были идентичны (табл.l) .
Таблица 1. Показатели двигательной активности крыс до и после двустороннего фотоиндуцируемого тромбоза префронтальной коры головного мозга.
Данные представлены в виде среднего значения в относительных единицах по сравнению со значением двигательной активности до фототромбоза *p<0,05 (критерий Вилкоксона).
Через 7 суток после фототромбоза префронтальной коры были выявлены значительные изменения в поведении животных. В группе с фототромбозом при введении исследуемого препарата сохранили выработанные рефлексы 80% животных, тогда как в группе с таким же повреждением коры и введением физиологического раствора сохранили УРПИ только 20% крыс. Значения ЛП
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
УРПИ и показатели двигательной активности снижались по сравнению с исходным уровнем, (рис. 1, таблица 1). Рисунок фиг.l иллюстрирует изменение латентного периода УРПИ после фотохимического ишемического повреждения коры головного мозга крыс при фармакологической коррекции препаратом. 1- интактные животные, 2-лoжнooпepиpoвaнныe животные, 3- фототромбоз+изотонический раствор, 4-фoтoтpoмбoз+ препарат. *-oтличиe группы 3 от группы 1, p<0,005; Λ- отличие группы 3 от группы 2, p<0,007, #- отличие группы 3 от группы 4, p<0,05.
При этом двигательная активность снижалась во всех экспериментальных группах, причем не было выявлено статистически значимых различий по показателям двигательной активности при сравнении всех групп животных как до, так и после фокального коркового инфаркта. Это указывает на то, что уменьшение двигательной активности, по-видимому, обусловлено реакцией животных на наркоз и манипуляции, связанные с проведением операции, но не с самим повреждением префронтальной области коры. Общее снижение двигательной активности при повторении проверки после операции объясняется привыканием животных к обстановке «oткpытoгo пoля». Систематическое введение животным исследуемого препарата (0,1 мг -1 мл р-ра в сутки на крысу, внутрибрюшинно) после создания двустороннего локального ишемического инфаркта значительно облегчало сохранение и воспроизведение УРПИ (рис. 1). Проявление такого действия через 48ч после отмены препарата указывает на формирование устойчивых изменений, которые связаны как с уменьшением степени повреждения корковых структур, так и с изменениями на уровне медиаторных, метаболических или трофических систем.
Полученные данные были подтверждены во 2-ом эксперименте.
Результаты 2-го эксперимента:
Все экспериментальные животные были разделены на три группы: 1-ая - обученные, ложнооперированные 2-ая - ишемизированные с внутрибрюшинным введением физиологического р-ра; 3-я - ишемизированные с внутрибрюшинным введением исследуемого препарата (доза - 0,1 мг - lмл р-ра препарата на крысу) через 1 час после фототромбоза и далее ежедневно в течение 5 дней.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
До начала выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) горизонтальную двигательную активность (ГА) крыс тестировали в автоматизированном "открытом поле" POДЭO-1, оценивая ГА животных (отн. ед.) за 5 мин. наблюдения. По показателям двигательной активности в «oткpытoм пoлe» экспериментальные группы были идентичны (тaбл.2) .
Таблица 2. Изменение горизонтальной активности (ГА) до и после фототромбоза префронтальной коры крыс; эффект препарата (0,1 мг).
ГА Ложнооперированные Фототромбоз Фототромбоз
(через 6 дней) +NaCl 0,9% +Пpeпapaт
(через 6 дней)
До 198 208 198,6 фототромбоза
После 138 87,5 157,3 фототромбоза
УРПИ вырабатывали по стандартному методу (Буреш, Бурешова, Хастон, 1983), оценивая латентный период (ЛП) в сек. перехода крысы из темного отсека камеры в светлый. В эксперимент брали только тех животных, ЛП УРПИ которых после обучения составлял 300 сек.
Полученные данные обобщены в таблице 2 и представлены на рисунке 2. Рисунок фиг. 2 отражает изменение латентного периода условного рефлекса пассивного избегания в секундах после фототромбоза префронтальной коры крыс; эффект препарата. 1- ложнооперированные; 2-фoтoтpoмбoз+NaCl 0,9% (0,5 мл в/б); 3-фoтoтpoмбoз+пpeпapaт(0,5 мл р-ра/день). # - отличие 2-ой группы от 1- ой (P< 0,01); A - отличие 2-ой группы от 3-eй (P<0,05).
Повреждение корковых структур может приводить к нарушению процессов, связанных с выработкой, сохранением и воспроизведением кратковременной памяти. Известно, что префронтальная область коры головного мозга играет ключевую роль в этих процессах (KoIb В., 1984). Ишемическое повреждение этой структуры мозга приводит к амнезии. Можно констатировать,
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
что курсовое введение средства улучшало кратковременную память у крыс с симметричными очаговыми ишемическими повреждениями в префрональной области коры.
Пример 5. Влияние препарата на повреждения в созданном методом фотоиндуцированного тромбоза в префронтальной коре головного мозга крыс ишемическом очаге.
Для морфометрического измерения площади и объема очага ишемического повреждения в префронтальной коре, созданного методом фототромбоза, использовали мозги экспериментальных животных, выделенные на 6 сутки после создания ишемического очага. Препараты обрабатывали по стандартной гистологической методике.
Площадь ишемического повреждения промеряли слепым методом (когда экспериментатор не знает, где контроль, а где опыт) с помощью программ анализа компьютерного изображения в относительных единицах и соотносили с площадью сканированного квадрата со стороной 10 мм, получая значение площади повреждения в мм2.
Как видно из таблицы 3, протяженность ишемического очага у леченных препаратом крыс меньше, как в левом, так и в правом полушариях, а также и по суммарной протяженности.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Таблица 3. Протяженность очага поражения (количество срезов, содержащих очаг)
N° Вводимое вещество Количество Количество Общее крысы срезов, срезов, количество содержащих содержащих срезов мозга с ишемический ишемический ишемическим очаг в правом очаг в левом повреждением полушарии полушарии
1 Исследуемый препарат 11 11 22
14 Исследуемый препарат 21 0 21 19 Исследуемый препарат 24 13 37
В среднем на крысу с 56 24 80 исследуемым препаратом 21 физ. раствор 16 16 32
(0,9% NaCl) 27 физ. раствор 22 22 44
(0,9% NaCl) 35 физ.раствор 27 20 47
(0,9% NaCl)
В среднем на крысу с физ. 65 58 123 раствором
Объем очага повреждения фотоиндуцированным тромбозом определяли по формуле: V = Σ Sn х d, где d - толщина пары срезов (200 мкм); Sn - измеренная площадь ишемического очага серийного среза в мм2; Σ - сумма объемов ишемического повреждения на срезах.
Как видно из таблицы 4 и рис.З, объем поражения левого полушария у леченых животных существенно меньше (достоверно, P<0,05) по отношению к контролю с введением после повреждения коры физиологического раствора, тогда как в правом практически такой же. Однако, суммарный объем очага поражения в обоих полушариях у животных с введением препарата меньше на 10 мм3 (достоверно, P<0,05) по сравнению с животными с введением физиологического раствора. Защитный эффект препарата нагляднее виден, если вычислить коэффициент эффективности защиты (КЭЗ) по формуле:
KЭЗ=(V0- Vк)/Vox 100%,
Где V0- средний суммарный объем очага поражения в обоих полушариях у животных с введением физиологического раствора, Vк - средний суммарный объем очага поражения в обоих полушариях у животных с введением вещества
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
соответственно. Этот параметр позволяет сравнивать эффективность действия различных веществ на разных моделях ишемии. В данном случае КЭЗ равен 54%. KЭЗ=(18,37-8,3)/! 8,37χ 100%=54%
Таблица 4.
.No Объем очага Объем очага Суммарный крыс ПРЕПАРАТ поражения в поражения в объем очага ы левом правом поражения в полушарии (мм3) полушарии (мм3) обоих полушариях
(мм3)
1 Исследуемый препарат 3,86 1,44 5,30 14 Исследуемый препарат 0 11,17 11,17 19 Исследуемый препарат 1,34 7,09 8,43
В среднем на крысу с 1,73±1,13 6,57+2,82 8,30+1,7 исследуемым препаратом 21 физ. раствор 7,97 3,28 11,25
(0,9% NaCl) 35 физ. раствор 22,77 11,74 34,51
(0,9% NaCl)
В среднем на крысу с 12,42±5,19 5,95±2,9 18,37±8,09 физ. раствором
Таким образом, можно заключить, что препарат (0,1 мг -1 мл р-ра, в/б) при курсовом введении через час после создания ишемического очага в коре и ежедневно в течение 5 дней после операции оказывает значительное антиамнестическое действие, способствуя сохранению выработанных до операции условных рефлексов пассивного избегания.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Проведенное сравнительное патоморфологическое исследование предоставленного материала показало, что на гистологических срезах контрольной группы, окрашенных по методу Ниссля (крезиловый фиолетовый), достоверно выявлены ишемические изменения, характерные для данной стадии постишемического периода, тогда как в экспериментальной группе отмечается большая сохранность нейрональных структур.
После проведенного морфологического анализа можно сделать заключение о нейропротективных свойствах исследуемого фармакологического препарата. Предположительно исследуемый препарат имеет и определенное влияние на состояние тонуса сосудов головного мозга.
Выводы 5 примера:
1. До фототромбоза префронтальной коры головного мозга все взятые в эксперимент животные имели ЛП УРПИ - 300 сек. На 6-ой день после создания ишемического очага в группе с введением преперата (через 1 час после операции и курсом в течение 5 дней) сохранили выработанный до фототромбоза УРПИ - 88% животных, тогда как в контрольной группе - с ишемическим повреждением коры и введением физиологического раствора только 33%. В группе ложнооперированных животных выработанный навык сохранился у всех крыс. Отличия средних показателей по группам статистически достоверны.
2. До фототромбоза двигательная активность животных в тесте «oткpытoe пoлe» была идентична во всех экспериментальных группах.
На 6-ой день после ишемического повреждения коры этот показатель значительно снизился в группе ишемия+физиологический раствор, тогда как при таком же повреждении коры и введении преперата двигательная активность животных практически не отличалась от ложнооперированного контроля.
3. В заключение можно отметить высокую антиамнестическую активность препарата, подтвержденную повторным экспериментом, что указывает на
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
достоверность полученных данных и позволяет рекомендоватьпрепарат для дальнейших испытаний в клинике.
4. Морфологическое исследование мозга ишемизированных животных при сравнительном анализе леченных препаратом и нелеченых животных, получавших в том же объеме физиологический раствор, выявило значительный нейропротективный эффект препарата: значительно снижался объем ишемического повреждения. Гистологическое исследование показало большую сохранность пенумбры - области мозговой ткани вокруг ишемического очага, где и происходят регенеративные процессы, вследствие которых улучшается сохранение памятного следа.
Пример 6. Эффективность применения препарата у больных сосудистыми энцефалопатиями
Исследование проведено с участием 30 больных сосудистыми энцефалопатиями в возрасте 58 - 82 лет. Все больные ранее получали традиционные лекарственные средства симптоматического и патогенетического действия, при применении которых отмечался кратковременный терапевтический эффект, требующий увеличения дозы препаратов на курс лечения и продолжительного их приема.
Все пациенты, принимавшие участие в исследовании, методом рандомизации были разделены на 2 группы. 18 пациентам, составившим основную группу, вводили препарат в дозе 0,14 мкг в каждую ноздрю интраназально, ежедневно, однократно течение 14 дней. 12 пациентам контрольной группы на фоне общепринятого лечения, назначали интраназальное введение 0,05 M раствора глицин-NаОН рН 7,5 в том же объеме и режиме, что и основной группе. При сопоставлении субъективных показателей состояния больных до и после применения препарата установлено, что количество жалоб на здоровье уменьшилось в 4,6 раза. Больные отмечали улучшение памяти, сообразительности, уменьшение интенсивности и длительности головных болей, появление эмоциональной уравновешенности, волевых качеств, чувства отдыха после ночного сна.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Оценка влияния препарата на интегральную функцию головного мозга - внимание и на биоэлектрическую активность исследовали с помощью корректурной пробы и электроэнцефалографии соответственно.
У больных после лечения с применением препарата значительно возросло количество просмотренных знаков и уменьшилось количество ошибок (Таблица 5). В группах больных, получавших лечение с применением препарата, получены лучшие результаты при анализе динамики выполнения корректурной пробы до и после лечения. Это выражалось в отсутствии резких колебаний в количестве просмотренных знаков за равные отрезки времени, наличии периода "врабатываемости" к середине выполнения задания и постепенном снижении кривой к концу задания, что свидетельствует о большей устойчивости внимания после применения препарата.
Таблица 5
Количество Группа пациентов просмотренных Количество ошибок знаков
Здоровые 2889,3±68,1 3,7±0,4
Больные до лечения 1375,2±127,4 15,6±1,7
Больные после лечения с применением 1791 З± 128 5* 11 8±1 4* общепринятых средств
Больные после лечения с применением 2495 6±121 7*# 5 l±l 6*# препарата
*- P<0,05 по сравнению с показателем у больных до лечения;
# - P<0,05 по сравнению с показателем у больных после лечения с применением общепринятых средств.
Для оценки влияния препарата на биоэлектрическую активность головного мозга проводился расчет альфа-индекса до и после лечения. Наиболее выраженные изменения биоэлектрической активности головного мозга наблюдались у больных после лечения с применением препарата по сравнению с
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
пациентами контрольной группы. Установлено, что под влиянием лечения с применением препарата произошло достоверное увеличение альфа-индекса у больных исследуемой группы (Таблица 6). Таблица 6
Группа пациентов Альфа-индекс
Здоровые 50,1+2,5
Больные до лечения 30,2+4,3
Больные после лечения с применением общепринятых средств 39,5+4, 1 *
Больные после лечения с применением препарата 48,9+2,8*#
* - P<0,01 по сравнению с показателями у больных до лечения. # - P<0,05 по сравнению с показателем у больных после лечения с применением общепринятых средств. * - P<0,05 по сравнению с показателем в контроле, принятым за 100%.
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о нормализующем действии препарата в терапевтически эффективной дозе 0,28 мкг на интегративную функцию головного мозга у больных сосудистыми энцефалопатиями и целесообразности его применения для лечения больных с патологией головного мозга в данной дозе интраназально однократно ежедневно в течение 14 дней.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Литература
1. Патент РФ Xs 2275924, Dл. A61K 35/30, 2006 г.
2. Патент РФ Λэ 2302871, Dл. A6 IK 35/30, 2006 г.
3. Справочник по клинической фармакологии. Под ред. И. С.Чекмана, А.П.Полещука, О. А. Пятака. Kиeв,»3дopoв'я», 1987 г
4. Wаtsоп B.D., Diеtriсh W.D. аt аl, Am. Neurol.,1985, vоl. 17, р. 497-504.
5. Романова Г. А., Шакова Ф.M.,и др., Бюлл. Эксп. Биологии и медицины т. 137 JЧ°2, cтp.l35-138, 2004г.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Claims
1. Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием и вырабатываемого из головного мозга сельскохозяйственных животных путем операций гомогенизации ткани, экстракции, отделения осадка и выделения целевого продукта, заключающийся в том, что замороженный головной мозг эмбрионов свиней, овец или крупного рогатого скота со сроком гистации от начала средней трети до середины последней трети беременности, размораживают, подвергают гомогенизации в буферном растворе, содержащем ЭДТА, при рН 7,2 - 8,4, гомогенат фильтруют от балластных веществ, полученный фильтрат центрифугируют до удаления водонерастворимых компонентов и подвергают анионообменной хроматографии, используя в качестве элюента буферный раствор с рН не ниже 7,2, полученные целевые фракции подвергают ультрофильтрации для удаления компонентов с молекулярной массой ниже 5 кДа, обессоливают и подвергают стерильному фильтрованию.
2. Способ получения биологически активного комплекса по п.l заключающийся в том, что головной мозг эмбрионов свиньи, овец или крупного рогатого скота со сроком гистации от начала средней трети до середины последней трети беременности головной мозг эмбрионов замороженный при температуре до минус 20° С, размораживают, подвергают гомогенизации в течение 5 минут, в 0,05 M ТРИС-глициновом буфере рН 7,8 с содержанием ЭДТА 1 мМ, гомогенат фильтруют, полученный фильтрат центрифугируют при 25 000 g в течение 40 — 60 минут, супернатант фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и подвергают анионообменной хроматографии на носителе Тоуореагl DEAE-650M, используя в качестве элюента 0,05 M ТРИС- глициновый буфер рН 7,8 с содержанием ЭДТА 0,1 мМ, смывая целевые фракции ступенчатым градиентом NaCl с шагом 50 мМ, целевые фракции подвергают ультрофильтрации на установке при противодавлении не более 1,0 кгc/cм2 через материалы с задерживающей способностью 5 кДа, обессоливают, разводят 0,05 M раствором глицин-NаОН рН 7,5 до концентрации белка 0.1 мг/мл, подвергают стерильному фильтрованию через мембрану с диаметром пор не более 0,22 мкм.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2007/000750 WO2009088314A1 (ru) | 2007-12-29 | 2007-12-29 | Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2007/000750 WO2009088314A1 (ru) | 2007-12-29 | 2007-12-29 | Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2009088314A1 true WO2009088314A1 (ru) | 2009-07-16 |
Family
ID=40853274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2007/000750 WO2009088314A1 (ru) | 2007-12-29 | 2007-12-29 | Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2009088314A1 (ru) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012166005A1 (ru) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе |
| WO2012166006A1 (ru) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе |
| WO2012166004A1 (ru) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на нервную систему, способ его получения и фармкомпозиция на его основе |
| EP2589390A1 (en) * | 2010-07-01 | 2013-05-08 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin |
| EP2589389A1 (en) * | 2010-07-01 | 2013-05-08 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Method for producing a biologically active complex. biologically active protein/polypeptide complex |
| EP2656853A1 (en) * | 2010-12-24 | 2013-10-30 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature |
| CN111727238A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-09-29 | 阿里斯制药有限公司 | 胎儿组织提取物、生产提取物的方法及其用途 |
| RU2771678C1 (ru) * | 2021-08-03 | 2022-05-11 | Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Биологически активная субстанция и фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субъюнктивального, пара-, ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2049471C1 (ru) * | 1992-12-21 | 1995-12-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Способ получения гидролизата мозговой ткани "церебролизат" |
| US6140116A (en) * | 1994-11-08 | 2000-10-31 | Diacrin, Inc. | Isolated and modified porcine cerebral cortical cells |
| RU2259836C1 (ru) * | 2004-03-19 | 2005-09-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат и способ лечения паркинсонизма |
| RU2275924C2 (ru) * | 2004-08-04 | 2006-05-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга и фармацевтическое средство на его основе |
-
2007
- 2007-12-29 WO PCT/RU2007/000750 patent/WO2009088314A1/ru active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2049471C1 (ru) * | 1992-12-21 | 1995-12-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Способ получения гидролизата мозговой ткани "церебролизат" |
| US6140116A (en) * | 1994-11-08 | 2000-10-31 | Diacrin, Inc. | Isolated and modified porcine cerebral cortical cells |
| RU2259836C1 (ru) * | 2004-03-19 | 2005-09-10 | ЗАО "РеМеТэкс" | Биотрансплантат и способ лечения паркинсонизма |
| RU2275924C2 (ru) * | 2004-08-04 | 2006-05-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга и фармацевтическое средство на его основе |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2589390A4 (en) * | 2010-07-01 | 2014-01-01 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo Pharm Sintez | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM AND PERIPHERAL NERVOUS SYSTEM DISEASES WITH VASCULAR, TRAUMATIC, TOXIC, HYPOXIC OR AUTOIMMUNE GENESIS |
| EP2589389A4 (en) * | 2010-07-01 | 2013-12-18 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo Pharm Sintez | METHOD FOR PRODUCING A BIOLOGICALLY ACTIVE COMPLEX BIOLOGICALLY ACTIVE PROTEIN / POLYPEPTIDE COMPLEX |
| EP2589389A1 (en) * | 2010-07-01 | 2013-05-08 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Method for producing a biologically active complex. biologically active protein/polypeptide complex |
| EP2589390A1 (en) * | 2010-07-01 | 2013-05-08 | Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin |
| EP2656853A4 (en) * | 2010-12-24 | 2014-06-25 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo Pharm Sintez | METHOD FOR THE TREATMENT OF ACUTE BRAIN AND BACK-MARK BLOODING DISORDERS OF ISCHEMIC OR HEMORRHAGIC NATURE |
| EP2656853A1 (en) * | 2010-12-24 | 2013-10-30 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature |
| WO2012166004A1 (ru) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на нервную систему, способ его получения и фармкомпозиция на его основе |
| RU2485133C2 (ru) * | 2011-05-30 | 2013-06-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе |
| WO2012166006A1 (ru) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе |
| RU2485132C2 (ru) * | 2011-05-30 | 2013-06-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе |
| WO2012166005A1 (ru) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе |
| CN111727238A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-09-29 | 阿里斯制药有限公司 | 胎儿组织提取物、生产提取物的方法及其用途 |
| EP3704225A4 (en) * | 2017-10-27 | 2021-08-18 | Alis Pharma Ltd. | FETAL TISSUE EXTRACT, METHODS FOR PRODUCING THE EXTRACT AND RELATED USE |
| RU2771678C1 (ru) * | 2021-08-03 | 2022-05-11 | Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Биологически активная субстанция и фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субъюнктивального, пара-, ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nieto-Sampedro et al. | Brain injury causes a time-dependent increase in neuronotrophic activity at the lesion site | |
| WO2009088314A1 (ru) | Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием | |
| EA035336B1 (ru) | Способ лечения связанного со старением когнитивного расстройства или заболевания | |
| CN104884611A (zh) | Nprcp、pfdnc和它们的应用 | |
| EP2589390B1 (en) | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin | |
| CN112639076A (zh) | 促进细胞生长和组织修复的方法及组合物 | |
| ES2671246T3 (es) | Procedimiento de producción de un complejo biológicamente activo. Complejo proteico-polipeptídico biológicamente activo | |
| RU2275924C2 (ru) | Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга и фармацевтическое средство на его основе | |
| WO2012166006A1 (ru) | Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе | |
| RU2104702C1 (ru) | Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологическая композиция и ее применение | |
| RU2460736C1 (ru) | Белково-полипептидный комплекс (бпк), обладающий тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ получения белково-полипептидного комплекса, обладающего тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, и фармацевтическая композиция на основе бпк, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом | |
| JPH03503530A (ja) | ヒト腫瘍治療薬およびその製造方法 | |
| EP0308926B1 (en) | Method of determining behaviour of drugs in living bodies | |
| Oppenheimer | Asymmetry revisited | |
| EP2656853A1 (en) | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature | |
| RU2485132C2 (ru) | Белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе | |
| IL194346A (en) | Tripeptide having a stimulating effect on the regeneration of neurons and pharmaceutical composiions comprising it | |
| EA010735B1 (ru) | Средство, нормализующее репродуктивную функцию у мужчин, и способ его получения | |
| RU2302871C1 (ru) | Средство, нормализующее функции головного мозга, и способ его получения | |
| RU2301072C1 (ru) | Средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, и способ его получения | |
| EP0889053B1 (de) | BK-RiV-Präparate zur Behandlung von proliferativen Zellerkrangungen | |
| US20120308550A1 (en) | Method of Using Fish Plasma Components to Promote Functional Recovery in the Mammialian CNS | |
| EA003301B1 (ru) | Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе | |
| Mehdipour-Mossafer | Investigating Systemic Aging and its Effects on Aged Tissues by Utilizing a Small Animal Blood Exchange Model | |
| Mehdipour | Investigating Systemic Aging and its Effects on Aged Tissues by Utilizing a Small Animal Blood Exchange Model |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 07873388 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 07873388 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |