WO2012166004A1 - Белково-полипептидный комплекс специфического действия на нервную систему, способ его получения и фармкомпозиция на его основе - Google Patents

Белково-полипептидный комплекс специфического действия на нервную систему, способ его получения и фармкомпозиция на его основе Download PDF

Info

Publication number
WO2012166004A1
WO2012166004A1 PCT/RU2012/000136 RU2012000136W WO2012166004A1 WO 2012166004 A1 WO2012166004 A1 WO 2012166004A1 RU 2012000136 W RU2012000136 W RU 2012000136W WO 2012166004 A1 WO2012166004 A1 WO 2012166004A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
pharmaceutical composition
tissue
animals
kda
Prior art date
Application number
PCT/RU2012/000136
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Анна Борисовна НАЗАРЕНКО
Михаил Анатольевич СОКОЛОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority to EP12793167.3A priority Critical patent/EP2730584B1/en
Publication of WO2012166004A1 publication Critical patent/WO2012166004A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells

Definitions

  • the invention relates to a biologically active substance - a protein-polypeptide complex (BOD), obtained from the embryonic nervous tissue of ungulate farm animals, which has antihypoxic, vascular and neuroprotective effects, stimulating physiological and reparative regeneration of nervous tissue, for use in the manufacture of drugs for diseases of the central and peripheral nervous system, hypoxic conditions, in disaster medicine, sports medicine, the method of its production and pharmaceutical compositions based on it.
  • BOD protein-polypeptide complex
  • I is the ionic strength of the solution
  • composition is a pharmaceutical composition.
  • a biologically active substance is a BOD with a molecular weight of its protein-polypeptide components in the range from 0.5 to 200 ka, with a molecular weight fraction in the range from 20 to 160 kDa of at least 70%
  • the pharmaceutical composition is a pharmaceutically diluted BOD an acceptable buffer with the addition of detergents, solubilizers, preservatives and an equivalent concentration of nucleotide components in the form of the sodium salt of deoxyribonucleic acid with a molecular weight of polynucleotides included in it in Yedelev from 12 kDa to 1000 (12 - 660 base pairs), the content of middle fractions in the range of 20 to 500 kDa is not less than 80%.
  • the protein-polypeptide complex was obtained by ion exchange chromatography of the filtrate of the supernatant of the centrifuged nervous tissue homogenate in the presence of a buffer solution, detergents, preservatives and solubilizers from the brain of ungulates of farm animals from gestation period from the middle of the first third to the middle of the last third of pregnancy.
  • the nucleotide fraction of the BPPN of the pharmaceutical composition was obtained by alkaline hydrolysis of a centrate of tissue homogenate remaining after obtaining the protein-polypeptide fraction with subsequent purification and precipitation of the target fraction with ethanol.
  • the obtained fractions are combined, in equivalent concentration ratios, forming BPNK with the addition of a pharmaceutically acceptable buffer, detergents, solubilizers and preservatives.
  • a number of biologically active substances and preparations of a peptide, nucleotide nature from raw materials of animal origin are known, which have regenerative and protective activity, which are used to treat diseases of the nervous system:
  • this method allows to obtain peptides and proteins with a final concentration of up to 12 m g / ml and an undetermined spread of molecular masses from the embryonic brain of animals using a long (up to 30 days ) extraction and subsequent enzymatic proteolysis with removal of the precipitate formed at all stages of isolation.
  • proteins and polypeptides obtained are not characterized by standard physicochemical methods (mass, optical density, phoresis, etc.) of proteins, and long-term extraction and enzymatic proteolysis suggest low molecular weight numbers of the obtained peptides and a rather high percentage of impurities in in the form of lipoproteins and peptidoglycans, which steadily leads to an increase in the immunogenicity of the drug;
  • a known method of treating diseases of the central nervous system involves obtaining an extract of proteins and nucleic acids from the brain tissue of human embryos according to a standard method followed by their sterilization and lyophilization using a mixture of lyophilisate and donor embryonic brain.
  • proteins and polypeptides obtained are not characterized by standard physicochemical methods (mass, optical density, phoresis, etc.), and the initial lyophilization of tissue changes the quaternary and tertiary structure of protein and polypeptide components, which steadily leads to a decrease in biological activity and the specificity of the pharmacological action of the obtained extract, as well as complicates its standardization;
  • a known method of manufacturing biologically active preparations from embryonic tissues allows to obtain a mixture containing no proteins from low molecular weight thermostable substances of uncertain composition with a molecular weight of less than 10 kDa with a peptide content of 1 to 3 mg / ml and a dry residue of 14 to 20 mg / ml
  • the presence of low molecular weight thermostable substances of indeterminate composition does not allow the use of this drug parenterally, and the presence of components of the cell walls and membranes of cell structures determines its high immunogenicity;
  • the resulting target product contains altered, denatured hydrolysis products of proteins and polypeptides with impaired Quaternary and Tertiary structures, as well as decay products of many active molecules, which determines its low biological activity.
  • a biologically active preparation from the spleen of cattle embryos and a pharmaceutical composition based on it with immunomodulating, antihypoxic and reparative activity [6]
  • this method allows to obtain a mixture of low molecular weight peptides, amino acids, nucleic acid derivatives and other components weighing from 5 to 50 kDa from the spleen of cattle embryos by the method of salt extraction of homogenate with 0.9% sodium chloride solution followed by sequential ultrafiltration th.
  • proteins, polypeptides and low molecular weight nucleic acids obtained are not characterized by standard physicochemical methods (optical density, phoresis, etc.), the initial salt extraction with physiological saline does not allow a large spectrum of active compounds to be obtained, and a rather high percentage of impurities in in the form of lipoproteins and peptidoglycans, which steadily leads to a decrease in the biological activity and specificity of the pharmacological action of the obtained drug, an increase in its immunogenicity, and t It also makes it difficult to standardize.
  • a known method of obtaining a drug from brain tissue of animal embryos and a pharmaceutical composition based on it [7]. This method allows you to get a mixture of peptides, amino acids, derivatives of nucleic acids and other components from the brain of animal embryos, aged after preliminary thawing for 24 hours at a temperature of + 10 ° C by the method of two-stage extraction of homogenate with 9% potassium sulfate solution, followed by stabilization with methyl ether -oxybenzoic acid to a concentration of 0.07% and subsequent sequential ultrafiltration to obtain the target fraction with molecular weights of its constituents from 10 d about YuOkDa.
  • a long time interval after thawing tissue prolongs post-mortem proteolysis, which negatively affects the quality of the extracted components and is steadily leading to loss tissue-specific biological activity, and a sufficiently high percentage of impurities in the form of tissue degradation products increases the immunogenicity of the drug and makes it difficult to standardize it.
  • a fraction is obtained containing alkaline polypeptides that have a stimulating (or restoring with decreasing brain activity) effect on the cells of the cerebral cortex.
  • the described method does not allow to extract acidic and neutral polypeptides from the cerebral cortex and to obtain biologically active substances with a different effect (for example, anticonvulsant activity).
  • a known method for producing biologically active lipophilic and hydrophilic fractions of porcine placenta allows to obtain a mixture of peptides, amino acids, hydroxyacids by chloroform-ethanol and water-ethanol extraction with salt fractionation, as well as the use of chladonic solvents to obtain lipophilic fractions.
  • This method does not allow to obtain tissue-specific for nervous tissue proteins and polypeptides, having a systemic effect, and the presence of growth factors without differentiation factors and signal tissue molecules significantly increases the risk of neoplastic processes, especially in the absence of polynucleotides with a pronounced immunomodulatory effect.
  • the obtained fractions do not have clear physicochemical characteristics, and the method of chloroform-ethanol and water-ethanol extraction and isolation alone allows one to obtain only low molecular weight polypeptides and proteins with altered quaternary and tertiary structures, which invariably leads to a decrease in specific biological activity.
  • the complex obtained by the above method is ultrafiltered on a 5 kDa membrane and desalted.
  • the characteristics of the target protein-polypeptide fraction are checked by UV spectrometry, gel chromatography, denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and amino acid analysis.
  • the biologically active complex has a maximum absorption of the ultraviolet spectrum at a wavelength of 280 + 5 nm, the mass of its constituent proteins and polypeptides from 5 to 1 YukDa.
  • the use of 1 M NaCl in the preparation of this complex at the stage of anion exchange chromatography as a part of the mobile phase creates too high ionic strength of the mobile phase equal to 1 mol / L, and the inclusion of EDTA and TRIS in it even further increases it.
  • the obtained target fraction contains a large number of acidic highly charged proteins and polypeptides that have mainly membrane localization in the brain tissue cells, which mainly perform structural functions and have only insignificant regulatory, not only not specific tissue-specific, but also pronounced biological activity .
  • a further stepwise increase in salt concentration in increments of 5% further increases the presence of these proteins, increasing the biological inertness of the mixture, thereby reducing its activity and increasing its allergenicity
  • the polynucleotide composition of Derinat in the form of the sodium salt of deoxyribonucleic acid denotes the main systemic effect of the drug as an immunomodulator that affects cellular and humoral immunity.
  • the drug stimulates reparative processes and hematopoiesis (normalizes the number of granulocytes, lymphocytes, platelets), has anti-inflammatory and antitumor effects, normalizes the state of tissues with dystrophic changes in vascular origin, and has a mild anticoagulant effect. Stimulation of leukopoiesis with leukopenia caused by polychemotherapy or radiation therapy is observed after a single injection.
  • the drug activates antiviral, antifungal and antimicrobial immunity, increases the activity of phagocytes against Chlamydiaceae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori. Derinat significantly reduces the sensitivity of cells to the damaging effects of cytotoxic drugs and radiotherapy, which is manifested in a decrease in cardio- and myelotoxicity in cancer patients and the stability of the therapeutic effect with repeated courses of treatment.
  • the drug has a nonspecific reparative and regenerative effect.
  • a disadvantage of the known drug is the low specificity of the drug due to the weak neuroprotective and regenerative effect, including reparative potential for nerve tissue.
  • the composition of Cerebrolysin includes amino acids ( ⁇ 85%), low molecular weight peptides ( ⁇ 15%), trace elements, the raw material for which is the pig’s brain.
  • the neuroprotective and trophic effect of the drug is carried out due to specific peptides and amino acids, with a molecular weight of not higher than 10,000 Daltons, of which the dominant and determining properties of the drug are alanine, leucine and lysine.
  • the drug is intended for intramuscular, intravenous administration and has a low concentration of biologically active components, therefore it is introduced into the patient's body in significant doses for a long time.
  • a disadvantage of the known drug is the significant duration of the course of treatment, low activity and specificity of the drug due to the weak neuroprotective effect, having an extremely low regenerative, including reparative potential for nervous tissue.
  • the composition of Cerebrocurin includes water-soluble prenatal neuropeptides and the cleavage products of inactive high molecular weight precursors from the brain homogenizate of animal embryos, which, after dilution with physiological saline, are reacted with an immobilized proteolytic enzyme, and the interaction mode is established based on the control sample of the obtained product, and the resulting solution is kept in for 30 days at a temperature not exceeding + 10 ° C.
  • a higher (compared with Cerebrolysin) activity of the obtained product is achieved and the spectrum of its action is significantly expanded due to the higher mass of the contained peptides and low molecular weight proteins remaining after proteolysis.
  • the composition of Cortexin includes a complex of water-soluble biologically active alkaline, acidic and neutral polypeptides with mol. m from 0.5 to 15 kDa and an isoelectric point of 3.5 - 9.5, obtained from crushed frozen tissue of the brain of cattle by extraction with a solution of acetic acid containing zinc chloride, separation of the precipitate, treatment of the supernatant with acetone, washing the precipitate formed acetone, drying, followed by purification, sterilization and lyophilization of the target product.
  • the drug is intended for intramuscular administration and has a low concentration of biologically active low molecular weight components, therefore it is introduced into the patient's body in significant doses for a long time.
  • composition of Cerebrolyzate also includes water-soluble polypeptides, as a result of hydrolysis of cattle brain tissue, with weak enzymatic activity, with a molecular weight of not more than 15 kDa.
  • variation in the amino acid composition of the preparation indicated in the patent allows a significant variation in the composition of the obtained peptide concentration ratios, determining the low tissue-specific activity and the stability of the pharmacological action, with a weak neurometabolic and unexpressed nootropic effect.
  • the objective of the present invention is the creation of a biologically active substance and pharmaceutical composition based on it, with advanced properties and high biological activity, with tissue-specific reparative-regenerative effect on the nervous tissue and the development of a method for its production by isolating a biologically active protein-polypeptide complex and polynucleotides to create a pharmaceutical composition from the nervous tissue of the embryos of ungulates farm animals, which is solved by the selected set of actions Wii and modes.
  • the task is achieved by the claimed group of inventions, subject to all conditions for obtaining BOD and pharmaceutical composition.
  • the claimed group of inventions includes a protein-polypeptide complex, a method for its production from embryonic nervous tissue of ungulate farm animals at certain gestational dates, and a pharmaceutical composition based on this protein-polypeptide complex.
  • MIC protein-polypeptide complex
  • MIC protein-polypeptide complex
  • SDS-Rade denaturing gel electrophoresis
  • the task is also achieved by a new method of obtaining the above-described protein-polypeptide complex, which has an antihypoxic, tissue-specific reparative effect on the central and peripheral nervous system, consisting in the fact that the embryonic nervous tissue of ungulates in farm animals with a gestation period from the middle of the first third to the middle of the last third of pregnancy in stages:
  • the filtrate is subjected to anion exchange chromatography on a column with an anion exchange carrier and separating the proteins and polypeptides bound to the carrier, using a buffer solution, initially having an ionic strength (I) of not higher than 0.1 mmol / l, increasing it smoothly or stepwise in steps 0.025 mmol / L and starting the collection of target fractions with an ionic strength of eluent from 0, 125 to 0, 15 mmol / L at a pH from 5.2 to 8.5;
  • I ionic strength
  • Another invention of the claimed group is a pharmaceutical composition having antihypoxic, immunomodulating, tissue-specific reparative action on nerve tissue, made in the form of a solution containing, as an active ingredient, the biologically active protein-polypeptide complex according to claim 1 at a concentration of 0.05 - 2 , 0 mg / ml obtained by the method according to claim 2 of the claims, and the polynucleotide fraction in the form of the sodium salt of deoxyribonucleic acid, exhibiting a complex with protein the olipeptide fraction specific immunoregulatory activity in at least equivalent concentration with the protein-polypeptide complex, and a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmacopoeial buffer solution and, optionally, excipients, including high molecular weight compounds, stabilizers, preservatives and solubilizers.
  • the pharmaceutical composition contains a polynucleotide fraction, preferably in the form of medium and low molecular weight fractions sodium salt of deoxyribonucleic acid - from 12 to 660 kDa (18 - 1000 base pairs), having a maximum UV absorption spectrum at a wavelength of 260 ⁇ 2 nm and a minimum at 230 ⁇ 2 nm in the range of wavelengths from 190 to 325 nm with a ratio D260 / 280 from 1, 6 to 2.0, the presence of characteristic specific bands during electrophoresis in an 8% agarose gel when stained with ethidium bromide, in comparison with a standard set of markers with a molecular weight range from 75 to 7000 base pairs and blue staining when stating a qualitative reaction to ribose, as well as an admixture of protein , when determining its concentration according to Lowry, not higher than 0.18%,
  • the specified pharmaceutical composition is intended for the pharmaceutical and cosmetic industries, for example, for use parenterally (intradermally, subcutaneously), intranasally or application to the mucous membranes and skin.
  • the homogenate is separated from the ballast substances by filtration through a dense tissue, followed by centrifugation with a g value in the range of 10,000 - 28,000 for 90 to 30 minutes, respectively, combining the obtained ballast tissue material after filtering through a dense fabric and a centrate, to obtain the nucleotide fraction of the pharmaceutical composition.
  • the supernatant is filtered through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m;
  • the filtrate is applied to a balanced chromatographic column with an anion exchange medium, for example Toyopearl DEAE-650M;
  • - separation of the proteins bound to the carrier is carried out by a smooth or stepwise gradient of the ionic strength of the solution, using as a mobile phase a buffer solution having an ionic strength of not higher than 0.1 mmol / L, increasing it in increments of 0.025 mmol / L and starting collecting the target fraction using buffer solution with ionic strength from 0, 125 to 0, 15 mmol / l, in the pH range from 5.2 to 8.5;
  • the target fractions are combined and ultrafiltered at the installation with a backpressure of not more than 8.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of more than 200 "Yes, diluted with a buffer solution, for example, 0.05 M glycine-NaOH pH 7.4 to a total protein concentration of 1, 0 - 2.0 mg / ml;
  • a buffer solution for example, 0.05 M glycine-NaOH pH 7.4 to a total protein concentration of 1, 0 - 2.0 mg / ml;
  • the resulting solution is subjected to sterilizing filtration through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.22 ⁇ m and determine the total concentration of proteins.
  • All preliminary processes and processes for producing a protein-peptide fraction are preferably carried out at a temperature of + 2 ° to + 8 ° C.
  • the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the wavelength range from 200 to 500 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm (Fig. 1).
  • the molecular weight of the proteins included in the preparation is determined by the method of denaturing gel electrophoresis ("SDS-Page") in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a range of molecular masses from 1 kDa to 250 kDa (figure 2.) - The value of the isoelectric point from 4.2 to 8.4.
  • the composition of the drug includes proteins with a molecular weight of from 0.5 kDa to 200 kDa, of which at least 70% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa.
  • the combined ballast tissue material and the centrate left after centrifugation of the filtered homogenate with a mixer are resuspended in a solution containing 2.5 mM EDTA and 25 mM sodium citrate pH 7.0 - 8.0, in the same temperature conditions in a ratio of at least 1 : 1, maintaining the resulting mass for 30 minutes;
  • YuM NaOH is added to the resulting mass, based on a final molar alkali concentration of not more than 2 and, after stirring, incubated for 16 hours at + 48 ° C;
  • the obtained dihydrolyzate is cooled in an ice bath (wet ice, 0 ° ⁇ ), and then, with continuous stirring and under the control of a pH meter, glacial acetic acid is added until the pH of the mixture is not higher than pH 5.4, while observing the precipitation of a white, denatured denatured precipitate proteins;
  • the precipitate is dissolved in 100 ml of H 2 O and 1/10 volume of 3M sodium acetate and 3 volumes of ethanol cooled to -20 ° C are added and mixed well;
  • the resulting precipitate was dissolved in 50 ml of H 2 0 on a magnetic stirrer; - in the final solution after sterilizing filtration through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.22 ⁇ m and determine the concentration of the obtained polynucleotide fraction.
  • the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the range of wavelengths from 190 to 325 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 260 ⁇ 2 nm, the absorption minimum is observed at 230 ⁇ 2 nm (Fig. Z.).
  • the ratio of D 2 6o 28o from 1, 6 to 2.0.
  • the molecular weight of the nucleotides included in the fraction is determined by electrophoresis in 1, 8% agarose gel, stained with ethidium bromide, in comparison with a standard set of markers with a range of molecular weights from 75 to 7000 base pairs: the presence of characteristic specific bands in the range is determined values from 12 to 660 kDa (figure 4.).
  • blue staining is obtained when a qualitative reaction to ribose is set up, as well as an admixture of protein when determining its concentration according to Lowry of not higher than 18%.
  • the obtained protein-peptide complex and the nucleotide fraction are identified, after which, to obtain a pharmaceutical composition, they are combined at least in equal proportions with the calculation of the final concentration of the total protein and polypeptides in the resulting solution in the range of 0.05 - 2.0 mg / ml when diluted with a pharmaceutically acceptable buffer solution, for example 50 mm glycine phosphate, containing, if necessary, excipients, for example, with concentrations of 0.5% mannitol, 0.0005% polysorbate-80 and sodium disodium phosphate to a pH of not lower than 5.2 and not higher than 8.5. Re-identification of the mixture and filter sterilization are carried out.
  • a pharmaceutically acceptable buffer solution for example 50 mm glycine phosphate
  • the identification characteristic of the pharmaceutical composition is carried out by the methods of ultraviolet spectrophotometry and electrophoresis in 1.8% agarose gel.
  • the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the wavelength region from 200 to 500 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 260 ⁇ 2 nm, the absorption minimum is observed at a wavelength of 230 ⁇ 2 nm (Fig. 5).
  • electrophoresis in a 5% polyacrylamide gel when staining with silver nitrate, the presence of characteristic specific bands of protein and nucleotides is determined (Fig. 6), and when staining with Coomassie brilliant blue, the presence of staining bands characteristic only of the protein fraction is determined (Fig. 7. )
  • the pH of the buffer media was in the range of 5.2 - 8.5;
  • the ionic strength of the solution (I) of the eluent during separation of the proteins and polypeptides bound to the carrier was not lower than 0.1 mmol / l, and the target fractions were collected with the eluent having an ionic strength of the solution not higher than 0.15 mmol / l;
  • the protein content with molecular weights from 20kDa to 160kDa was at least 70% of the total protein content;
  • the inventive biologically active protein-polypeptide complex is fundamentally different from all known biologically active substances obtained from raw materials of animal origin by:
  • the qualitative composition as a certain fraction of tissue (membrane, cell, cytoplasmic, nuclear) hydrophilic, weakly charged negative proteins and polypeptides, with the concentration ratio of factors evolutionarily fixed in ontogenesis growth, differentiation factors and signal molecules with a molecular weight of from 0.5 kDa to 200 kDa;
  • the resulting protein-polypeptide complex does not contain impurities in the form of lipids, peptidoglycans, lipopoliproteins, carbohydrates, polysaccharides and other compounds;
  • the claimed pharmaceutical composition in the form of BPNK with a pharmaceutically acceptable diluent allows to increase the reparative and regenerative potential of BOD due to the specific action of medium and low molecular weight polynucleotides to activate humoral and cellular immunity in doses of not higher than 0.1 - 10 mg, as well as increase the stability of the solution of the entire composition and increase the duration of its action and storage.
  • Example 1 The method of obtaining BOD.
  • the molecular weight of the proteins included in the preparation is determined by the method of denaturing gel electrophoresis ("SDS-Rade”) in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 1 kDa to 250 ka, in the composition fractions include proteins with a molecular weight of from 0.5 kDa to 200 kDa, of which 76% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa ( Figure 2.);
  • Example 2 The method of obtaining the military-industrial complex.
  • ZOOg of embryonic nervous tissue of a gestational age of 16-18 weeks is thawed and homogenized in a pH 5.2 buffer solution containing 50 mM Tris-maleate, 1 mM (EDTA) and 0.1% mannitol for 5 minutes at + 2 ° C.
  • the homogenate is separated from the ballast substances by filtration through a dense fabric, followed by centrifugation at a value of g of 28,000 for 3 min, respectively, combining the resulting ballast tissue material after filtering through a dense fabric and a centrate to obtain nucleotide fraction of a pharmaceutical composition.
  • the supernatant is filtered through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m and applied to a chromatographic column 250 ml in volume with 4 volumes of maleate buffer solution pH 5.2 with an anion exchange medium DEAE-Sepharose. Separation of carrier-bound proteins is performed by smoothly increasing the gradient of the ionic strength of the maleate buffer
  • the target fraction is ultrafiltered at the installation with a backpressure of not more than 8.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of more than 200 kDa, desalted using dilise against a 50 mM solution of aspartate-NaOH pH 5.2.
  • the solution is subjected to sterilizing filtration through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.22 ⁇ m.
  • the ultraviolet spectrum of the solution is recorded in the wavelength range from 200 to 500 nm - the absorption maximum is observed at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm (Fig. 8.).
  • the molecular weight of the proteins and polypeptides that make up the complex is determined by denaturing gel electrophoresis (SDS-Rade) in 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 1 kDa to 250 kDa (Fig. 9.).
  • the composition of the drug includes proteins with a molecular weight of from 0.5 kDa to 200 kDa, of which 72% have a molecular weight in the range from 20 to 160 kDa. Quantitative determination of protein in the obtained MIC by the Lowry method (without preliminary precipitation) - 1, 85 mg / ml.
  • Example 3 A method of obtaining a pharmaceutical composition.
  • the combined ballast fabric material and the precipitate left after centrifugation of the filtered homogenate weighing 280 g are resuspended with a mixer in a solution containing 2.5 mm EDTA and 25 mm sodium citrate pH 7.8, in the same temperature conditions in a volume ratio of 1: 1, 5 (650 ml) keeping the resulting mass for 30 minutes, YuM NaOH is added to the resulting mass based on a final molar alkali concentration of not more than 2 (158 ml) and, after stirring, incubated for 16 hours at + 48 ° C.
  • the mixture cooled to + 2 ° C is centrifuged at -32000 g and + 4 ° C for 40 minutes, removing a thin yellow oil-fat film from the surface of the supernatant in centrifuge bottles before transfusion of the supernatant liquid using filter strips.
  • the obtained dihydrolyzate is cooled in an ice bath (wet ice, 0 ° ⁇ ), and then, with continuous stirring and under the control of a pH meter, glacial acetic acid is added until the pH of the mixture is not higher than 5.4 (63 ml), while observing sediment denatured proteins.
  • the mixture is centrifuged at -32000 g and + 4 ° C for 1. hours, 0.6 volumes of isopropanol are added to the obtained supernatant and, after incubation for 20 minutes at room temperature, centrifuged at -32000 g and + 20 ° C for 1 hour, forming a DNA precipitate.
  • the precipitate is dissolved in 100 ml of ⁇ 2 ⁇ and 1/10 volume of 3M sodium acetate and 3 volumes of ethanol cooled to -20 ° ⁇ are added and mixed well.
  • the resulting suspension is centrifuged at -32000 g and + 4 ° C for 1 hour, dissolving the resulting 50 ml of H 2 O on a magnetic stirrer.
  • the concentration of the obtained polynucleotide fraction is determined - 2.8 mg / ml.
  • the ultraviolet spectrum of the solution was recorded in the range of wavelengths from 190 to 325 nm: the absorption maximum was observed at a wavelength of 260 ⁇ 2 nm, the absorption minimum at 230 ⁇ 2 nm.
  • the ratio of D 26 o / 28o from 1, 6 to 2.0 (Fig.Z.);
  • the molecular weight of the nucleotides included in the fraction was determined by the method of denaturing "SDS-Rade” electrophoresis in 8% agarose gel, stained with ethidium bromide, in comparison with a standard set of markers with a range of base pairs from 75 to 7000. The presence of characteristic specific bands in the range of molecular weights from 12 to bbOKDa ( Figure 4.). With a qualitative reaction to ribose, we get a blue stain. When determining the protein concentration according to Lowry in the selected nucleotide fraction, it is defined as 0.16 mg / ml (i.e., it is ⁇ 0, 15% of DNA).
  • auxiliary substances to the obtained BPNC: detergents, solubilizers and preservatives and high molecular weight compounds (taking into account the final concentration of BPNK), in particular, up to 0.5% mannitol, 0.0005% polysorbate-80, 0.03% nipagin and disubstituted phosphate sodium to pH 8.5.
  • the resulting pharmaceutical composition is subjected to sterilizing filtration, through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.1 ⁇ m, it is poured into sterile glass bottles and sealed.
  • the identification characteristic of the protein-polypeptide-nucleotide complex is carried out by methods of ultraviolet spectrophotometry and electrophoresis in 1, 8% agarose gel, the ultraviolet spectrum of the drug solution is taken in the wavelength range from 200 to 500 nm: maximum absorption is observed at a wavelength of 260 ⁇ 2nm, the minimum absorption at a wavelength of 230 ⁇ 2nm ( Figure 5.).
  • electrophoresis in a 5% polyacrylamide gel when staining with silver nitrate, the presence of characteristic specific bands of protein and nucleotides is determined (Fig. 6.), and when staining with Coomassie brilliant blue, the presence of staining bands characteristic only of the protein fraction is determined (Fig. 7. )
  • Example 4 A method of obtaining a pharmaceutical composition.
  • the obtained dihydrolyzate is cooled in an ice bath (wet ice, 0 ° ⁇ ), and then, with continuous stirring and under the control of a pH meter, glacial acetic acid is added until the pH of the mixture is not higher than pH 5.4 (48 ml), while observing the precipitation of white heavy sediment of denatured proteins;
  • the mixture is centrifuged at ⁇ 32000 g and + 4 ° C for 1 hour, adding 0.6 volumes of isopropanol to the obtained supernatant and, after incubation for 20 min at room temperature, centrifuged at -32000 g and + 20 ° C for 1 hour, forming a DNA pellet.
  • the precipitate is dissolved in 100 ml of H 2 O and 1/10 volume of 3M sodium acetate and 3 volumes of ethanol cooled to -20 ° C are added and mixed well;
  • the resulting suspension is centrifuged at ⁇ 32000 g and + 4 ° C for 1 hour, dissolving the obtained in 50 ml of H 2 O on a magnetic stirrer.
  • the concentration of the obtained polynucleotide fraction was determined - 2.1 mg / ml.
  • the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the range of wavelengths from 190 to 325 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 260 ⁇ 2 nm, the absorption minimum - at 230 ⁇ 2 nm (Fig. 10.).
  • the ratio of D 2 6o 28o from 1, 6 to 2.0.
  • the molecular weight of the nucleotides included in the fraction is determined by electrophoresis in 1, 8% agarose gel, stained with ethidium bromide, in comparison with a standard set of markers with a range of molecular masses from 70 to 7000 base pairs: the presence of characteristic specific bands in the range is determined values from 12 to 660 kDa ( Figure 1 1.). With a qualitative reaction to ribose get a blue color. When determining the protein concentration according to Lowry in the selected nucleotide fraction, it is defined as 0.12 mg / ml (i.e., -0.14% of DNA).
  • b) take, obtained in example 2.
  • auxiliary substances to the obtained BPNCs: detergents, solubilizers and preservatives and high molecular weight compounds (taking into account the final concentration of BPNCs), in particular, up to 0.5% mannitol, 0.0005% polysorbate-80, 0.005% benzalkonium chloride and sodium disodium phosphate to a pH of 5.2.
  • the resulting pharmaceutical composition is subjected to sterilizing filtration, through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.1 ⁇ m, it is poured into sterile glass bottles and sealed.
  • BPNC identification characteristic of the protein-polypeptide-nucleotide complex, after combining equal protein and nucleotide fractions in equal concentrations, is carried out by methods of ultraviolet spectrophotometry and electrophoresis in 1, 8% agarose gel, ultraviolet the spectrum of the drug solution is recorded in the range of wavelengths from 200 to 500 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 260 ⁇ 2 nm, the absorption minimum is pr wavelength 230 ⁇ 2nm (12.).
  • the culture medium for explant cultivation consisted of 35% Eagle's solution, 25% fetal calf serum, 35% Hanks solution, 5% chicken embryonic extract, glucose (0.6%), insulin (0.5 units / ml) were added to the medium penicillin (100 units / ml), glutamine (2 mm). Fragments of the cerebral cortex or spinal cord ganglia were placed in this medium and cultured on a collagen substrate in Petri dishes in a thermostat at a temperature of 36.7 ° C for 2 days. The studied BPNK was added to the experimental medium and, as a positive control, cerebrolysin and cortexin at concentrations of 0.5, 1, 2, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 n g / ml.
  • the criterion of biological activity was the area index (PI) - the ratio of the area of the entire explant along with the growth zone to the outgoing area of the brain fragment.
  • the significance of differences in the compared mean IP values was evaluated using Student's t-test. The IP values were expressed as a percentage, the control IP value was taken as 100%.
  • the growth area of the control brain explants was composed of short neurites, as well as evicted glia cells and fibroblast-like cells. In studying the direct effect of drugs on brain fragments, the following series of experiments were performed. Cerebrolysin and cortexin in various concentrations were added to the nutrient medium of explants of the cerebral cortex and spinal ganglia of chick embryos.
  • a significant increase in the IP of explants of the cerebral cortex was noted at a concentration of cortexin of 100 ng / ml by 28 + 3.5%, a concentration of 200 ng / ml by 23 + 2%. Reliable IP values of cortical explants under the action of other concentrations of cortexin were not observed.
  • a distinct stimulation of the development of cerebral cortex explants was detected under the action of the studied BPNC at a concentration of 20 ng / ml, when the PI of experimental explants was 48 ⁇ 4.5% significantly higher than the PI of the control explants and comparison explants under the action of cortexin and cerebrolysin.
  • BPNK The general toxic effect of BPNK was studied in the regimes of acute toxicity with a single injection, as well as subacute and chronic toxicity with prolonged administration of the complex [17].
  • a study of acute toxicity was conducted on 72 white outbred male mice weighing 20-22 g. Animals were randomly divided into 6 equal groups. The complex was administered to animals once intramuscularly at doses of 5 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg, 200 mg / kg, 500 mg / kg in 0.5 ml of sterile 0.05 M glycine-NaOH solution of pH 7.5. Sterile 0.05 M glycine-NaOH solution, pH 7.5, was administered to the animals of the control group in the same volume.
  • the following methods were determined by conventional methods: the number of red blood cells, hemoglobin, reticulocytes, platelets, leukocytes, leukocyte formula, erythrocyte sedimentation rate (ESR), erythrocyte resistance.
  • ESR erythrocyte sedimentation rate
  • the content of total protein in blood serum was determined by the method of Lowry, potassium and sodium by plasma spectrophotometry.
  • a pathomorphological study of the brain and spinal cord, spinal ganglia, thyroid gland, parathyroid glands, adrenal glands, testes, pituitary gland, heart, lungs, aorta, liver, kidney, bladder, pancreas, stomach, small intestine, large intestine was performed.
  • Example 7 The study of subchronic toxicity of the pharmaceutical composition with intranasal administration to sexually mature animals.
  • Toxicity was evaluated according to the points on the observation checklist: survival, general appearance, condition and behavior of animals, change in body weight (weighing was carried out at the beginning and at the end of the experiment). The local irritant effect during the experiment was judged by changes in the nasal mucous membranes.
  • the experimental animals studied the morphological composition of peripheral blood (the number of red blood cells, white blood cells, platelets, hemoglobin level), biochemical parameters (protein, urea, creatine, glucose, total cholesterol and triglycerides), the activity of certain serum enzymes (aspartate) before and at the end of the experiment. - and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase). To determine these indicators, blood was taken from the ear vein in a volume of 1, 5 - 2.0 ml.
  • Blood cells were counted on an automatic Picoskel blood meter (Hungary). The hemoglobin level was determined by the hemiglobin cyanide method. The level of biochemical parameters was determined using an automated system. FP-901, "Labsystems" Finland. After the end of the chronic experiment, the animals were euthanized by an overdose of anesthesia. The autopsy of the animals was carried out immediately after their death according to the complete pathoanatomical scheme.
  • samples of fresh tissue were subjected to gelation and cryostation to obtain sections with a thickness of up to 5 ⁇ m. Then the tissues were fixed and stained with hematoxylin-eosin. Microscopy was performed using a Opton microscope (Germany).
  • the obtained experimental data were compared with the control and calculated using a computer statistical program.
  • Blood test hemoglobin content, the number of red blood cells, white blood cells, platelets in all groups within the physiological norm.
  • Biochemical studies blood glucose, the activity of alanine and aspartic aminotransferases in all groups within normal limits. The protein concentration in rabbits receiving the pharmaceutical composition 1 and 2 times a day did not statistically differ.
  • group 1 therapeutic dose
  • group 2 pharmaceutical composition 0, 1 mg / ml 0.2 ml, administered daily 2 times a day
  • Group 3 intact animals.
  • the term of introduction is 2 weeks.
  • Toxicity was evaluated according to the points on the observation checklist: survival, general appearance, condition and behavior of animals, change in body weight (weighing was carried out at the beginning and at the end of the experiment). The local irritant effect during the experiment was judged by changes in the nasal mucous membranes.
  • the experimental animals studied the morphological composition of peripheral blood (the number of red blood cells, white blood cells, platelets, hemoglobin level), biochemical parameters (protein, urea, creatine, glucose, total cholesterol and triglycerides), the activity of certain serum enzymes (aspartate) before and at the end of the experiment. - and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase).
  • blood was taken from the ear vein in a volume of 1, 5 - 2.0 ml. Blood cells were counted on an automatic Picoskel blood meter (Hungary). The hemoglobin level was determined by the hemiglobin cyanide method. The level of biochemical parameters was determined using an automated system. FP-901, Labsystems Finland.
  • samples of fresh tissue were subjected to gelation and cryostation to obtain sections with a thickness of up to 5 ⁇ m. Then the tissues were fixed and stained with hematoxylin-eosin. Microscopy was performed using a Opton microscope (Germany).
  • the obtained experimental data were compared with the control and calculated using a computer statistical program.
  • the animals maintained normal behavior, discharge from the nasal passages and the formation of crusts were not noticed.
  • the rabbits had a sneezing reflex, which stopped after 1-2 minutes.
  • the rabbits showed a mechanical irritant effect, manifested in the reflex of sneezing, twitching of the nose, the animals rubbed their nose with their paws.
  • the epithelial layer has a tightly packed structure, clearly differentiated cells. Cells are connected by gap junctions.
  • the nasal mucosa remained clean throughout the observation period: a faint pink color without discharge, no edema was observed.
  • the vessels of the mucous membrane do not changed.
  • the state of the epithelium was examined in crevice lighting. In any case, pathological changes were not detected.
  • Blood test hemoglobin content, the number of red blood cells, white blood cells, platelets in all groups within the physiological norm. The indices obtained in the experimental groups did not significantly differ from the control groups of intact animals and the comparison drug.
  • Example 8 The study of the specific activity of VPA and BPNK [17].
  • the guinea pigs were injected intracutaneously, in double dilutions, in the clipped back areas of the guinea pigs.
  • physiological saline was injected with the same animal onto another clipped skin.
  • the control animals were given permissive injection of a substance (equal to a sensitizing dose). Then animals were injected intravenously with 0.5 ml of a 1% solution of blue Evans.
  • a reaction is considered positive if the spot size is above 6 mm, not more than 3 mm in the control. In three cases, a positive reaction was observed in the group of animals that received the drug at a dose of 10 times the therapeutic dose. The number of reactions indicates the possibility of individual reactions.
  • mice were injected with 40 ⁇ l of the test drug solution in the Hanks solution in the paw pad. 24 hours after testing, the magnitude of the edema was measured using an engineering micrometer MK-0-25.
  • the reaction was carried out on white rats weighing 180-200 g.
  • the total number of animals in the experiment is 30, 10 in each group. Investigated two doses of the drug MIC: therapeutic and ten times her exceeding one third of the group - control.
  • the method is based on determining the optical density of a lysing solution after the destruction of phagocytes that have absorbed neutral red particles. Rats exposed to the study drug were killed by decapitation. 5 ml of 199 medium containing 20% ETS (fetal calf serum) was administered aseptically intraperitoneally. After massage of the abdominal cavity, the medium was aspirated with a syringe. Portions of cell suspension obtained from the entire group of animals were combined into a common pool. The concentration of living cells was adjusted to 1.5x10 3 cells / ml.
  • the cell suspension was sterilely poured into 2 ml into plastic Petri dishes with a diameter of 40 mm. The plates were incubated for 2 hours at 37 ° C. The supernatant containing non-adherent cells was discarded, and the plastic-fixed monolayer was washed twice with 199 medium. A solution containing neutral red was poured into slightly dried cups and kept at 37 ° C for 1 hour. The solution was drained. Cells were washed with 199 medium. Zml of lysis solution was added to each plate. Cells were carefully treated with a rotational movement of the cup. The solution was poured into test tubes and the optical density was measured on a spectrophotometer at a wavelength of 540 nm.
  • the reaction was carried out on rats weighing 180-200 g, females. The total number of animals in the experiment was 30. A solution of the VPA substance was administered intraperitoneally at a therapeutic dose and ten times its value, the intact group served as a control. To obtain a suspension of mast cells, animals were killed by decapitation, a buffer was introduced into the abdominal cavity; after massage of the anterior abdominal wall, a suspension of mast cells was collected in centrifuge tubes. The preparations were prepared on slides stained with a 0.3% alcohol solution of neutral red. 0.03 ml was added to 0.03 ml of mast cell suspension. the serum of the experimental animal and 0.03 ml of the test drug in a dilution of 1: 100. In the control, degranulation did not exceed 5%.
  • the preparations were covered with a coverslip, the edges of which were sealed with paraffin. Then incubated for 15 minutes in a thermostat at 37 ° C. The preparations were microscopic under X40 magnification, counting mast cells that underwent degranulation and normal, in the amount of 100. The reaction was considered positive if the degree of degranulation exceeded 20%.
  • VPA substance at a concentration of 0.01 mg / kg does not cause mast cell degranulation, does not differ from the control and exceeds the threshold value by 5%.
  • the reaction in the group with the introduction of a dose of ten times the therapeutic dose is weakly positive, however, these values do not go beyond the statistical percentage of error.
  • BPNC The acute toxicity of the pharmaceutical composition of BPNK was studied in an experiment on BALB / C mice.
  • BPNC was administered in three ways: subcutaneously, intraperitoneally, orally and intranasally.
  • the maximum possible dose for administration to mice is 0.2 ml, which was 10 mg / kg, 100 ⁇ l of 0.1% solution was administered intranasally in each nasal passage. It was found that in the indicated doses in all methods of administration the drug did not cause the death of animals; no symptoms of acute poisoning were obtained.
  • test drug was administered subcutaneously at a therapeutic dose of 0.01 mg / kg and ten times greater than 0.1 mg / kg; intravenously at a dose of 0.0025 mg / kg and x10 - 0.025 mg / kg.
  • Intranasally 1 injection in each nasal passage, 2 times a day, which amounted to 400 ⁇ l of 0, 1% solution - 0.016 mg / kg was studied in Chinchilla rabbits.
  • study of toxicity used generally accepted methods for the study of hematological, biochemical blood parameters, as well as histological studies of internal organs.
  • BPNK used a set of the following tests [19]: - accounting for gene mutations in the Ames Salmonella test / microsome using Salmonella typhimurium TA 97, TA 98 and TA 100 strains as test objects;
  • a sample of the protein-polypeptide pharmaceutical composition was tested, which is a transparent liquid sterilely packed in a dark glass bottle in an amount of 20 ml, containing a substance in a concentration of 0.1 mg / ml.
  • the mutation test for Salmonella typhimurium is a bacterial test system for accounting for gene mutations to histidine prototrophy under the action of chemical compounds and (or) their metabolites, inducing mutations such as base changes or reading frame shifts in the genome of this organism.
  • Base pair mutagen inducers are agents that cause base pair mutations in a DNA molecule.
  • Mutagens that induce mutations in the reading shift of the genetic code are agents that cause the addition or lack of single or multiple base pairs in a DNA molecule.
  • This method is designed to detect the ability of pharmacological substances or their metabolites to induce gene mutations in indicator strains of Salmonella typhimurium.
  • Bacteria are treated with the test compound with a metabolic activation system (CM +) or without metabolic activation (CM-). After incubation for a certain period of time, the number of revertant colonies of different test strains is calculated in comparison with the number of spontaneous revertants in negative control variants (untreated or solvent-treated cultures). If the test compound and / or its metabolites have mutagenic activity, then they will induce reverse mutations from auxotrophy to histidine prototrophy in histidine-dependent Salmonella typhimurium strains.
  • the tested doses of the substance were 300; 00; 10; 1 and 0, 1 mcg per cup.
  • the experiment was accompanied by positive controls, which were used as substances inducing mutations in the corresponding tester strains in the presence or absence of activation conditions.
  • sodium azide was used in the amount of 10 ⁇ g per cup for strain TA 100 at CM-; 2,7-diamino-4,9-dioxio-5, 10-dioxo-4,5,9,10-tetrahydro-4,9-diazopyrene (DIAM) - 10 ⁇ g per cup for strain TA 98 at CM-; 9-aminoacridine (9AA) - 50 ⁇ g / cup for strain TA 97 at CM-.
  • ethidium bromide was used - 10 ⁇ g per a cup on strain TA 98 with CM +. Saline solution (0.1 ml per cup) was used as a negative control.
  • 0.1 ml of the sample was added to the agar tubes in the required dilutions, then 0.1 ml of the bacterial suspension and 0.5 ml of the microsomal activating mixture (for the variant with metabolic activation). Then the contents of the tube were quickly mixed and poured onto a layer of lower minimal agar in Petri dishes. The duration of the introduction of the microsomal activating mixture and the pouring of semi-liquid agar onto the plate did not exceed 10-15 seconds.
  • the cups were left at room temperature for 30-40 minutes and after complete solidification of the agar was transferred to a thermostat at + 37 ° C. Analysis was carried out after 48 hours of incubation.
  • CM- metabolic activation system
  • CM + metabolic activation system
  • the mutagenic effect was considered significant if the average number of colonies of revertants per cup in the experimental variant exceeded that in the control version 2 or more times.
  • the results of the experiment were taken into account in the presence of a standard response in all variants of positive and negative control.
  • the number of colonies of revertants in the control with solvent in the SM- and CM + variants was within the range of fluctuations of the spontaneous level for these strains.
  • the response of the strains to standard mutagens was within normal levels.
  • the studied pharmaceutical composition of BPNK in all tested concentrations did not show a mutagenic effect on strains TA 100, TA 98 and TA 97 in variants without and in the presence of a metabolic activation system.
  • CONCLUSION The pharmaceutical composition of BPNK does not have the ability to induce gene mutations on Salmonella typhimurium tester strains in the entire range of tested concentrations.
  • Cytogenetic activity the ability of a substance to cause structural and numerical chromosomal abnormalities in somatic and germ cells.
  • Micronuclei are small DNA-containing formations consisting of acentric fragments of chromosomes or lagging at the stage of the annelophase of chromosomes. At the telophase stage, these fragments can be incorporated into the nuclei of daughter cells or form single or multiple micronuclei in the cytoplasm.
  • the purpose of the study was to identify and quantify the cytogenetic (mutagenic) activity of pharmacological agents in polychromatophilic erythrocytes (PCE) of mammalian bone marrow.
  • the method is based on microscopic registration of cells with micronuclei.
  • the proposed method of using the pharmaceutical composition of BPNC in the clinic is intravenous, subcutaneous and intranasal; mice in this study used intraperitoneal administration of the substance.
  • the dose of BPNA for the assessment of mutagenic activity was calculated based on the highest recommended daily therapeutic dose (TD) for humans.
  • the therapeutic dose (TD) for a person, including a child can be 0.05 mg / kg / day.
  • the maximum possible dose of 10 mg / kg was used as subtoxic in the conditions of this experiment, since the substance was provided at a concentration of 0.1 mg / ml, and the standard amount of substance administered to mice was 0.1 ml per 10 g of weight. Accordingly, in terms of humans, the maximum tested dose is 1.7 mg / kg.
  • BPNK was administered once to males at doses of 0.2 mg / kg and 0.5 mg / kg.
  • Bone marrow cell preparations for micronuclei counting were prepared by the generally accepted method in accordance with accepted methodological recommendations [20]. Animals were killed by cervical dislocation 6 hours after the last injection. Both femurs were isolated and muscles were cleared. To wash the bone marrow, fetal calf serum (NPE PanE-KO) was used. Bone marrow from both femurs was washed with a syringe into a microtube. The suspension was centrifuged at 1000 rpm, for 5 minutes, the supernatant was removed, the precipitate was carefully resuspended. A smear was prepared from a drop of suspension, and it was dried in air. Fixed with methanol for 3 minutes.
  • a criterion for a positive result is a reproducible and statistically significant increase in the number of polychromatophilic red blood cells with micronuclei in at least one of the experimental groups compared to the control.
  • the obtained positive result indicates that the substance induces chromosomal damage and / or disturbance of the mitotic apparatus of cells in experimental animals.
  • results of micronuclei counting in polychromatophilic erythrocytes of mouse bone marrow in all experimental variants, the pharmaceutical composition of BPNC did not cause an increase in the frequency of cells with micronuclei in the bone marrow mice when comparing the experimental and the corresponding control series.
  • Cyclophosphamide positive control
  • Cyclophosphamide when administered intraperitoneally to male mice at a dose of 20 mg / kg caused an increase in the frequency of cells with micronuclei by 19.6 times (62, 1% vs. 3, 16% in the control, P ⁇ 0.001).
  • the percentage of PCEs from the total number of bone marrow red blood cells was approximately at the same level in the groups of the experimental and control series, which indicates the absence of the toxic effect of the composition in the tested doses on hematopoiesis.
  • the positive control cyclophosphamide
  • a shift in the ratio of polychromatophilic and normochromic red blood cells towards the latter was noted (when compared with the control, P ⁇ 0.005).
  • BPNK mutagenic activity of BPNK was not detected in the test for micronucleus induction in polychromatophilic erythrocytes of the bone marrow of mice under the condition of single and five-fold administration to males and females intraperitoneally at a dose of 0.42 mg / kg body weight, which in terms of the daily therapeutic dose for humans. No mutagenic activity was also detected under conditions of a single administration of a protein-polypeptide pharmaceutical composition to males at the maximum possible dose of 10 mg / kg. BPNK did not show toxic effects in terms of the proportion of polychromatophilic red blood cells.
  • BPNK does not have mutagenic activity in the Ames Salmonella / microsome test and in the test for micronucleus induction in mouse bone marrow cells under the conditions of experiments conducted in accordance with the Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances.
  • Example 10 The effect of a biologically active substance - BOD on the cytokinetic parameters of the cell population.
  • Mouse ZTZ fibroblasts were cultured on DMEM (PanEco, Moscow) supplemented with 584 mg / L glutamine, an antifungal-antimicrobial preparation (Sigma, USA) according to manufacturer's instructions, and 10% by volume of standardized fetal calf serum (HyClone, USA).
  • DMEM PanEco, Moscow
  • an antifungal-antimicrobial preparation Sigma, USA
  • 10% by volume of standardized fetal calf serum HyClone, USA
  • cells were plated on 24-well plates (Corning) at a concentration of 3000 cells per ml (per well).
  • coverslips with a diameter of 12 mm were placed in the wells of the plate, and cells were planted on them.
  • test substances Once the cell culture reached the required density, the culture medium was replaced with fresh medium of the same composition (control), with DMEM without serum with the addition of 2 mg / ml BSA (Sigma) (negative control), DMEM without serum with the addition of 10% by volume of BOD (experiment 1 ) and DMEM with the addition of 10% serum and 10% BPNK (experiment 2).
  • Mitotic index - 1 1, 9%. Apoptosis and necrosis - 0%. The number of cells in the hole is 265,000.
  • BSA 8 ocloc'k. Mitotic index - 5%. Apoptosis and necrosis - 0%.
  • a biologically active substance consisting of VPA is not a cytotoxic drug.
  • the substance contains growth factors, but is not as effective as a proliferation stimulator, as fetal blood serum.
  • Example 1 The effect of BPNC on the blood supply to the brain and the survival of rats under conditions of its ischemic damage.
  • the animals were obtained from the laboratory animal nursery of the FIBH RAS (Pushchino) and were quarantined for 5 days. All veterinary manipulations were carried out under aseptic conditions, allowing to maintain the status of experimental animals. For the maintenance of experimental animals, standard conditions were used [18].
  • rats under ether anesthesia diethyl ether h / h, OJSC Medkhimprom
  • the skin incision was sutured with surgical silk (Silk blk 100cM / M5 / Sgle armed KP-3USP2 / Non needled / Ethicon Johnson & Johnson, Cat-N Q W794), applying one or two surgical skin sutures, followed by wound treatment with 5% solution tinctures of iodine.
  • Saline or BPNC was administered intraperitoneally. The duration of all manipulations is 8-10 minutes, then the animals are placed in a cage. For the study, three groups of animals were used:
  • the survival of animals was monitored immediately after the ligation procedure and during the first day, i.e. final survival was recorded after 24 hours.
  • the biological activity of the drug in the form of brain protection in conditions of incomplete global ischemia with simultaneous ligation of the carotid arteries was evaluated as follows:
  • the increase in animal survival compared to control is 95%.
  • a biologically active substance which is a protein-polypeptide-nucleotide complex exerts a statistically significant increase in animal survival compared to control in conditions of incomplete global brain ischemia caused by simultaneous ligation of both carotid arteries, both with intraperitoneal and intranasal methods of administration.
  • Example 12 The study of the effect of the pharmacological composition of BPNCs on the local cerebral blood flow in the cerebral cortex of anesthetized rats under conditions of global transient ischemia.
  • the state of cerebral blood circulation in animals was assessed by recording local cerebral blood flow in the cerebral cortex of rats using laser Doppler flowmetry.
  • an ALF-21 flowmeter from Transonic System Inc. was used. (USA).
  • a 0.8 mm diameter flowmeter needle sensor was installed on the parietal region of the rat cerebral cortex using a micromanipulator and rocker arm.
  • changes in blood pressure were recorded through a polyethylene catheter previously inserted into the femoral artery.
  • the recording of blood flow and blood pressure was performed on a polygraph of the company "VURAC" USA and a personal computer.
  • the pharmacological composition of BPNC was administered at a dose of 0.2 mg / kg (0.5 ml of a 1% solution) through a polyethylene catheter into the femoral vein of animals.
  • the global transient ischemia model is widely used to study both cerebral blood flow disorders and changes in various biochemical parameters of brain function that occur after ischemic damage.
  • Global transient ischemia in rats was caused by a 10-minute occlusion of both common carotid arteries with using special clamps while reducing blood pressure to 40-50 mm RT.
  • Art. by taking arterial blood from a previously inserted polyethylene catheter into the femoral artery. After 10 minutes, the clamps from the carotid arteries are removed, and previously collected blood was injected back to the animal.
  • BPNK pharmacological composition of BPNK increases the survival of experimental animals under conditions of complete ligation of the carotid arteries.
  • a pharmacological substance increases local cerebral blood flow in the cerebral cortex of rats, decreased after global transient cerebral ischemia, which at the end of the experiment exceeds the control level observed prior to ischemia. It can be assumed that the increase in animal survival during ligation of the carotid arteries under the influence of a pharmacological substance may be due to its ability to increase blood supply to the cerebral cortex of experimental animals.
  • Example 13 Patient L ,. 22 years old. The diagnosis is the consequences of cerebral palsy (spastic paresis of the right hand with hypertonicity of the flexor muscles of the arm, motor hypodynamia).
  • the pharmaceutical composition of BPNK was prescribed in subcutaneous doses of 1 ml of 0, 1% solution for 10 days, with the course repeated in 7-10 days, 3 courses 4 times a year and intranasally 2 injections into each nasal passage (400 ⁇ l of 0, 1% solution) once in the morning for 10 days, 4 courses per year.
  • pronounced positive dynamics was observed in the form of regression of spastic tone with increase in range of motion.
  • the patient began to write, peel potatoes and perform other small movements with high accuracy. Started to swim. The use of known drugs over the previous 8 years has not yielded positive results.
  • FIG. 14 presents the results of tests and studies of the complex according to the invention.
  • FIG. 1 shows the ultraviolet spectrum of a solution of a protein-polypeptide complex in the wavelength range from 200 to 500 nm with a maximum absorption at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm, obtained according to example 1.
  • FIG. Figure 2 shows the denaturing electrophoresis of the protein fraction solution obtained according to Example 1. (2) in a 5% polyacrylamide gel stained with Coomassie brilliant blue in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 1 kDa to 250 kDa (1).
  • FIG. Figure 3 shows the ultraviolet spectrum of the nucleotide fraction of the pharmaceutical composition obtained in Example 1. They are recorded in the wavelength range from 190 to 325 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of ⁇ (260 ⁇ 2) nm, the absorption minimum at ⁇ (230 ⁇ 2) nm.
  • FIG. Figure 4 shows the electrophoresis of the nucleotide fraction of the complex in an 1, 8% agarose gel, when stained with ethidium bromide, in comparison with a standard set of markers with a molecular weight range from 100 to 7000 base pairs. The presence of characteristic specific bands in the range of values from 12 to 660 kDa is determined.
  • FIG. Figure 5 shows the ultraviolet spectrum of a solution of the pharmaceutical composition of BPNK in the wavelength range from 200 to 500 nm with a maximum absorption at a wavelength of ⁇ (260 ⁇ 2) nm and a minimum absorption at ⁇ (230 ⁇ 2) nm.
  • FIG. Figure 6 shows the denaturing electrophoresis of the BPKNA pharmaceutical composition, as described in Example 3. (2), in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins and a molecular weight range from 1 kDa to 250 kDa (1) when stained with silver nitrate. The presence of characteristic specific bands of protein and nucleotide fractions is determined.
  • FIG. Figure 7 shows the denaturing electrophoresis of the BPKNA pharmaceutical composition, as described in Example 3. (2), in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 1 kDa to 250 kDa when stained with Coomassie brilliant blue. The presence of staining bands characteristic of the protein fraction of BPNK is determined.
  • FIG. Figure 8 shows the ultraviolet spectrum of a solution of the protein-polypeptide complex obtained according to Example 2. in the wavelength range from 200 to 500 nm with a maximum absorption at a wavelength of 215 ⁇ 5 nm.
  • FIG. Figure 9 shows the denaturing electrophoresis of the protein-polypeptide complex obtained in Example 2. (2) in a 5% polyacrylamide gel stained with Coomassie brilliant blue in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 1 kDa to 250 kDa (1)
  • FIG. 10 shows the ultraviolet spectrum of the nucleotide fraction of the pharmaceutical composition according to example 4., is taken in the wavelength region from 190 to 325 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of ⁇ (260 ⁇ 2) nm, the absorption minimum at ⁇ (230 ⁇ 2) nm.
  • FIG. 1 1 shows the electrophoresis of the nucleotide fraction of the pharmaceutical composition according to example 4., in an 8% agarose gel, when stained with ethidium bromide, in comparison with a standard set of markers with a molecular weight range from 100 to 7000 base pairs. The presence of characteristic specific bands in the range of values from 12 to 660 kDa is determined.
  • FIG. 10 shows the ultraviolet spectrum of the nucleotide fraction of the pharmaceutical composition according to example 4., is taken in the wavelength region from 190 to 325 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of ⁇ (260 ⁇ 2) nm, the absorption minimum at ⁇ (230 ⁇ 2) n
  • FIG. 12 shows the ultraviolet spectrum of the BPNK pharmaceutical composition solution prepared according to Example 4. in the wavelength range from 200 to 500 nm with a maximum absorption at a wavelength of ⁇ (260 ⁇ 2) nm and a minimum absorption at ⁇ (230 ⁇ 2) nm;
  • FIG. Figure 13 shows the denaturing electrophoresis of the pharmaceutical composition of BPNK prepared according to Example 4. (2) in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 1 "Yes to 250 kDa (1) when stained with silver nitrate. The presence of characteristic specific bands of protein and nucleotide fractions is determined.
  • FIG. Figure 14 shows the denaturing electrophoresis of the pharmaceutical composition of BPNK prepared according to Example 4. (2) in a 5% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins with a molecular weight range from 1 kDa to 250 kDa when stained with Coomassie brilliant blue. The presence of staining bands characteristic of the protein fraction of BPNK is determined.
  • the invention allows to create a biologically active substance, with advanced properties and high biological activity, with tissue-specific reparative-regenerative effect on nerve tissue and to develop a method for its preparation by isolating a biologically active protein-polypeptide complex from the brain of ungulates of ungulates farm animals, which is solved by the selected combination actions and modes. It was especially important to determine the optimal gestational age of the embryonic brain, as well as a set of reagents, their doses, extraction modes, and buffering to maintain effective concentration ratios of proteins, polypeptides, and nucleotides fixed evolutionarily and determining the biological activity of the complex, providing a reparative-regenerative tissue-specific effect.
  • the invention is intended for use in the pharmaceutical industry and medicine and relates to a biologically active substance - a protein-polypeptide-nucleotide complex obtained from embryonic brain tissue of ungulate farm animals, which has antihypoxic, vascular and neuroprotective effects, stimulating physiological and reparative regeneration of nerve tissue, for use in the manufacture of drugs for diseases of the central and peripheral nervous system s, hypoxic conditions, in emergency medicine, sports medicine, a process for its preparation and pharmaceutical composition thereof.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Белково-полипептидный, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на нервную систему, получают из нервной ткани эмбрионов копытных с-х животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности путем гомогенизации в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН 5,2-8,5. Полученный гомогенат центрифугируют и фильтруют. Белки и пептиды отделяют на хроматографической колонке с анионообменным носителем. Полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации. Комплекс включает отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа. Фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента комплекс в концентрации 0,05-2,0 мг/мл и полинуклеотидную фракцию в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, а также фармацевтически приемлемый разбавитель.

Description

БЕЛКОВО-ПОЛИПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС СПЕЦИФИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА НЕРВНУЮ СИСТЕМУ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМКОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ
Область техники
Изобретение относится к биологически активной субстанции - белково-полипептидного комплекса (БПК), получаемого из эмбриональной нервной ткани копытных сельскохозяйственных животных, обладающей антигипоксическим, сосудистым и нейропротективным действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях центральной и периферической нервной системы, гипоксических состояниях, в медицине катастроф, спортивной медицине, способу её получения и фармкомпозиции на его основе.
Принятые сокращения и условные обозначения:
БПК- белково-полипептидный комплекс;
БПНК - белково-полипептидно-нуклеотидный комплекс;
I - ионная сила раствора;
Фармкомпозиция - фармацевтическая композиция.
Предшествующий уровень техники В настоящее время, на фоне неуклонного роста заболеваний нервной системы сосудистого, травматического, токсического, инфекционного и аутоиммунного генеза, не существует препаратов группы прямых репарантов специфичных для нервной ткани. Целью данного изобретения явилось создание биологически активной субстанции, обладающей антигипоксическим, тканеспецифическим протективным действием на нервную ткань, путем выделения БПК из нервной ткани эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных.
Биологически активная субстанция представляет собой БПК с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 0,5 до 200 к а, с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 20 до 160 кДа не менее 70%, а фармкомпозиция - разбавлением полученного БПК фармацевтически приемлемым буфером с добавлением детергентов, солюбилизаторов, консервантов и равнозначной концентрации нуклеотидных компонентов в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты с молекулярной массой входящих в него полинуклеотидов в пределах от 12 до 1000 кДа (12 - 660 пар оснований), с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 20 до 500 кДа не менее 80%.
Белково-полипептидный комплекс получен путем ионообменной хроматографии фильтрата надосадочной фракции отцентрифугираванного гомогената нервной ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов, консервантов и солюбилизаторов из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности.
Нуклеотидная фракция БПНК фармкомпозиции получена методом щелочного гидролиза фугата гомогената ткани, оставшегося после получения белково-полипептидной фракции с последующей очисткой и осаждением целевой фракции этанолом. Полученные фракции объединяются, в равноценных концентрационных соотношениях, образуя БПНК с добавлением фармацевтически приемлемого буфера, детергентов, солюбилизаторов и консервантов.
Известен целый ряд биологически активных субстанций и препаратов пептидной, нуклеотидной природы из сырья животного происхождения, обладающие регенеративной и протективной активностью активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы:
Известен способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции центральной нервной системы [1], данный способ позволяет получать пептиды и белки с конечной концентрацией до 12 м г/мл и неустановленным разбросом молекулярных масс из эмбрионального мозга животных с помощью длительной (до 30 суток) экстракции и последующим ферментативным протеолизом с удалением образовывающегося осадка на всех этапах выделения. В данном способе полученные в белки и полипептиды не охарактеризованы стандартными физико-химическими методами (масса, оптическая плотность, форез и т.д.) белков, а длительная экстракция и ферментативный протеолиз позволяют предполагать низкие цифры молекулярных масс полученных пептидов и достаточно высокий процент примесей в виде липопротеидов и пептидгликанов, что неуклонно ведет к повышению иммуногенности средства;
Известен способ лечения заболеваний центральной нервной системы [2], данный способ предполагает получение экстракта белков и нуклеиновых кислот из ткани мозга эмбрионов человека по стандартной методике с последующей их стерилизацией и лиофилизацией, используя смесь лиофилизата и донорского эмбрионального головного мозга. В данном способе полученные в белки и полипептиды не охарактеризованы стандартными физико-химическими методами (масса, оптическая плотность, форез и т.д.), а изначальная лиофилизация ткани изменяет четвертичную и третичную структуру белковых и полипептидных компонентов, что неуклонно ведет к снижению биологической активности и специфичности фармакологического действия полученного экстракта, а так же затрудняет его стандартизацию;
Известен способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей [3], данный способ позволяет получать смесь, не содержащую белков, из низкомолекулярных термостабильных веществ неопределенного состава молекулярной массой менее 10 кДа с содержанием пептидов 1 - 3 мг/мл и сухим остатком 14 - 20 мг/мл. Наличие низкомолекулярных термостабильных веществ неопределенного состава не позволяет применение данного препарата парентерально, а присутствие компонентов клеточных стенок и мембран клеточных структур определяет его высокую иммуногенность;
Известна группа изобретений «Лекарственные средства на основе зародыша и способ их получения» [4], данный способ предполагает измельчение и гомогенизацию мягких тканей эмбрионов животных в смеси с физиологическим раствором без четких физико-химических характеристик. Данный способ не позволяет стандартизировать полученную смесь, а отсутствие четких физико-химических характеристик получаемого продукта - применение данного препарата парентерально, из-за присутствие компонентов клеточных стенок и мембран клеточных структур, что определяет его высокую иммуногенность;
Известен способ изготовления биологически активных препаратов на основе эмбриональных тканей [5], который предусматривает гидролиз гомогената от 2-х до 42 дней при температуре +4° - +45°С с дальнейшей термообработкой при температуре +60° - +120°С, отделением денатурированных веществ и выделение из гидролизата термостабильного целевого продукта со средней молекулярной массой менее ЮкДа неопределенного состава.
При данном способе изготовления получаемый целевой продукт содержит измененные, денатурированные продукты гидролиза белков и полипептидов с нарушенной четвертичной и третичной структурой, а так же продукты распада многих активных молекул, что определяет его невысокую биологическую активность. Известен способ получения биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота и фармацевтическая композиция на его основе с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью [6], данный способ позволяет получить смесь низкомолекулярных пептидов, аминокислот, производных нуклеиновых кислот и других компонентов массой от 5 до 50 кДа из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота методом солевой экстракции гомогената 0,9% раствором хлорида натрия с последующей последовательной ультрафильтрацией. В данном способе полученные в белки, полипептиды и низкомолекулярные нуклеиновые кислоты не охарактеризованы стандартными физико-химическими методами (оптическая плотность, форез и т.д.), изначальная солевая экстракция физиологическим раствором не позволяет получить большой спектр активных соединений, а достаточно высокий процент примесей в виде липопротеидов и пептидгликанов, что неуклонно ведет к снижению биологической активности и специфичности фармакологического действия полученного препарата, повышению его иммуногенности, а так же затрудняет его стандартизацию.
Известен способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармацевтическая композиция на его основе [7]. Данный способ позволяет получить смесь пептидов, аминокислот, производных нуклеиновых кислот и других компонентов из мозга эмбрионов животного, выдержанного после предварительного размораживания в течение 24 часов при температуре +10°С методом двухэтапного экстрагирования гомогената 9% раствором сульфата калия, с последующей стабилизацией метиловым эфиром п-оксибензойной кислоты до концентрации 0,07% и последующей последовательной ультрафильтрацией для получения целевой фракции с молекулярными массами входящих в нее компонентов от 10 до ЮОкДа. Длительный временной интервал после размораживания ткани продлевает посмортальный протеолиз, что негативно сказывается на качественном составе экстрагируемых компонентов и неуклонно ведет к потере тканеспецифической биологической активности, а достаточно высокий процент примесей в виде продуктов деградации ткани повышает иммуногенность лекарственного средства и затрудняет его стандартизацию.
Известен способ получения препарата [8], обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функции головного мозга, который позволяет выделить из коры головного мозга убойных животных биологически активные полипептиды щелочной природы. Препарат получают путем обработки исходного сырья (ткань, содержащая серое вещество полушарий головного мозга) ацетоном при температуре от -10° до -4°С и соотношении ткани мозга и ацетона 1 :5 в течение 18-30 ч, гомогенизации, экстрагирования гомогената 2-4%-ным раствором уксусной кислоты в течение 48-72 ч при рН=3,5-4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,6-1 ,2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1 : (8-4), центрифугирования, осаждения биологически активных веществ ацетоном при температуре от -3° до -5°С и соотношении супернатанта и ацетона 1 :(7-5) и ионообменной хроматографии полученного осадка на катионите "Биокарб". В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую щелочные полипептиды, которые обладают стимулирующим (или восстанавливающим при снижении активности мозга) действием на клетки коры головного мозга. Описанный способ не позволяет извлечь из коры головного мозга кислые и нейтральные полипептиды и получить биологически активные вещества, обладающие другим действием (например, противосудорожной активностью).
Известен способ получения биологически активных липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной [9, 10], данные способы позволяет получить смесь пептидов, аминокислот, оксикислот методом хлороформно-этанольной и водно-этанольной экстракции с солевым разделением фракций, а так же использование хладоновых растворителей для получения липофильной фракции. Данный способ не позволяет получить тканеспецифические для нервной ткани белки и полипептиды, обладая системным действием, а наличие ростовых факторов без факторов дифференцировки и сигнальных тканевых молекул значительно повышает риск неопластических процессов, особенно при отсутствии полинуклиотидов, обладающих выраженным иммуномодулирующим эффектом. Получаемые фракции не имеют четких физико-химических характеристик, а сам способ хлороформно-этанольной и водно- этанольной экстракции и выделения позволяет получить только низкомолекулярные полипептиды и белки с измененной четвертичной и третичной структурой, что неизменно ведет к снижению специфической биологической активности.
Наиболее близким к заявленной группе изобретений по достигаемым результатам и некоторым эффектам биологической активности является известный способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегеративным и нейропротективным действием [1 1]. Данный способ позволяет получить смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов сельскохозяйственных животных, взятого на определенной стадии гестации (от начала средней трети до середины последней трети), методом анионообменной хроматографии, используя для нанесения на уравновешенную колонку предварительно отфильтрованный супернатант гомогената ткани с буферным раствором рН 7,2 - 8,4, целевые фракции получают, разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы 0,05М ТРИС-глициновый буфер, содержащий 0, 1 мМ ЭДТА и 1 М NaCI, повышая концентрацию ступенчатым градиентом с шагом 5%. Полученный вышеуказанным способом комплекс подвергают ультрафильтрации на мембране 5кДа и обессоливают. Характеристику целевой белково- полипептидной фракции проверяют методами ультрафиолетовой спектрометрии, гель-хроматографии, денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Полученный вышеуказанным способом биологически активный комплекс имеет максимум поглощения ультрафиолетового спектра при длине волны 280 + 5нм, массу входящих в него белков и полипептидов от 5 до 1 ЮкДа. Использование при получении данного комплекса на этапе аинионообменной хроматографии в составе подвижной фазы 1 М NaCI создает слишком высокую ионную силу подвижной фазы, равную 1 моль/л, а включение в состав ЭДТА и ТРИС еще больше ее увеличивает. В связи с этим, полученная целевая фракция содержит большое количество кислых высоко заряженных белков и полипептидов, имеющих в клетках мозговой ткани преимущественно мембранную локализацию в основном выполняющие структурные функции и только в незначительной степени регуляторные, не имеющие, не только тканеспецифической, но и выраженной биологической активности. Дальнейшее ступенчатое повышение концентрации соли с шагом 5% еще больше увеличивает присутствие данных белков, увеличивая биологическую инертность смеси, тем самым снижая ее активность и повышая ее аллергенность
Из уровня техники известны также следующие фармацевтические средства:
Известен иммуномодулятор «Деринат» компании «Техномедсервис» ЗАО ФП (Россия) [12], влияющий на клеточный и гуморальный иммунитет, стимулирующий репаративные процессы и гемопоэз (нормализует количество гранулоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов), обладающий противовоспалительным и противоопухолевым действием, нормализующий состояние тканей при дистрофических изменениях сосудистого генеза, оказывающий слабо выраженное антикоагулянтное действие.
Известно средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов «Церебролизин» фирмы «Ebewe» (Австрия) [13], который является продуктом обработки мозга интактных свиней.
Известно лечебное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы - «Цереброкурин» фирмы ООО «НИР» (Украина) [14], который является продуктом обработки мозга эмбрионов животных.
Известен препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней - «Кортексин» фирмы ООО «Герофарм» (Россия), [15], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием.
Известен препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме - «Церебролизат» фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат) (Россия), [16], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат головного мозга крупного рогатого скота.
Полинуклеотидный состав «Дерината» в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (дезоксирибонуклеат натрия) обозначает системное основное действие препарата, как иммуномодулятора, влияющего на клеточный и гуморальный иммунитет. Препарат стимулирует репаративные процессы и гемопоэз (нормализует количество гранулоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов), обладает противовоспалительным и противоопухолевым действием, нормализует состояние тканей при дистрофических изменениях сосудистого генеза, оказывает слабо выраженное антикоагулянтное действие. Стимуляция лейкопоэза при лейкопении, вызванной полихимиотерапией или лучевой терапией, наблюдается уже после однократной инъекции. Применение препарата в первые 24 ч после воздействия облучения ускоряет начало и темп восстановления стволовых клеток, а также миелоидного, лимфоидного и тромбоцитарного ростков кроветворения. Препарат активизирует противовирусный, противогрибковый и противомикробный иммунитет, повышает активность фагоцитов в отношении Chlamydiaceae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori. Деринат существенно снижает чувствительность клеток к повреждающему действию цитотоксических препаратов и радиотерапии, что проявляется в снижении кардио- и миелотоксичности у онкологических больных и стабильности терапевтического эффекта при повторных курсах лечения. Препарат обладает неспецифическим репаративным и регенераторным действием. Недостатком известного препарата является низкая специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным и регенеративным действием, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.
В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (~85%), низкомолекулярные пептиды (~15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 Дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.
В состав «Цереброкурина» входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают, исходя из контрольной пробы получаемого средства, и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше +10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с Церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия, за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако, несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза, данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применении препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизантов на начальных этапах получения Цереброкурина, а так же неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов протеолиза ткани.
В состав «Кортексина» входит комплекс водорастворимых биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 0,5 до 15 кДа и изоэлектрической точкой 3,5 - 9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота, путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивании с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта. Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то, что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМК-позитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессорных воздействий, Кортексин имеет не высокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения. В состав «Церебролизата» также входят водорастворимые полипептиды, как результат гидролиза ткани головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15кДа. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание биологически активной субстанции и фармкомпозиции на ее основе, с расширенными свойствам и высокой биологической активностью, обладающей тканеспецифическим репаративно-регенеративным действием на нервную ткань и разработки способа ее получения, путем выделения биологически активного белково-полипептидного комплекса и полинуклеотидов для создания фармкомозиции из нервной ткани эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, которая решается за счет выбранной совокупности действий и режимов. Особенно важным оказалось определение оптимальных сроков гестации эмбриональной нервной ткани, подбора реагентов, их доз, режимов экстракции, буферизации и регуляции протеолитической активности, для сохранения эффективных концентрационных соотношений белков, полипептидов, закрепленных эволюционно и определяющих биологическую активность комплекса, обеспечивая репаративно-регенеративное тканеспецифическое действие, а так же полинуклеотидов для получения фармкомпозиции.
Поставленная задача достигается заявленной группой изобретений при соблюдении всех условий получения БПК и фармкомпозиции. В заявленную группу изобретений входит белково-полипептидный комплекс, способ его получения из эмбриональной нервной ткани копытных сельскохозяйственных животных на определенных сроках гестации и фармкомпозиция на основе этого белково-полипептидного комплекса.
Таким образом, поставленная задача достигается, новым белково- полипептидным комплексом (ВПК), обладающим антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, получаемый из эмбриональной нервной ткани сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий тканеспецифические отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа, причем не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа, имеющих характерный специфический набор полос при денатурирующем гель- электрофорезе («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле по сравнению со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа и максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм.
Поставленная задача достигается также новым способом получения выше охарактеризованного белково-полипептидного комплекса, обладающего антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, заключающегося в том, что эмбриональная нервная ткань копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности поэтапно:
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5 с последующим центрифугированием при значении g интервале 10 ООО - 28 ООО в течение 90 - 30 мин;
- полученный супернатант фильтруют;
- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии на колонке с анионообменным носителем и разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, первоначально имеющий ионную силу (I) не выше 0, 1 ммоль/л, повышая ее плавно или ступенчато с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракций с ионной силой элюента от 0, 125 до 0, 15 ммоль/л при рН от 5,2 до 8,5;
- полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
Еще одним изобретением заявленной группы является фармацевтическая композиция, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, выполненная в виде раствора, содержащего в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс по п.1 формулы изобретения в концентрации 0,05 - 2,0 мг/мл, полученный способом по п. 2 формулы изобретения, и полинуклеотидную фракцию в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, проявляющие комплексную с белково-полипептидной фракцией специфическую иммунорегулирующую активность в, по меньшей мере, равноценной концентрации с белково-полипептидным комплексом, и фармацевтически приемлемый разбавитель.
В качестве фармацевтически приемлемого разбавителяфармацевтическая композиция может содержать фармакопейный буферный раствор и, возможно, вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
Фармацевтическая композиция содержит полинуклеотидную фракцию, желательно в виде средне- и низкомолекулярной фракции натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты - от 12 до 660 кДа (18 - 1000 пар оснований), имеющие максимальный УФ-спектр поглощения при длине волны 260±2 нм и минимальный - при 230±2 нм в области длин волн от 190 до 325 нм с отношением D260/280 от 1 ,6 до 2,0, наличием характерных специфических полос при электрофорезе в ,8%-ном агарозном геле при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований и синее окрашивание при постановке качественной реакции на рибозу, а также примесью белка, при определении его концентрации по Лоури, не выше 0,18%,
Указанная фармацевтическая композиция предназначена для фармацевтической и косметической промышленности, например для применения парентерально (внутрикожно, подкожно), интраназально или апликационно на слизистые оболочки и кожу.
Ниже приводится краткое описание способа получения комплекса, сам комплекс и фармкомпзиция на его основе.
Лучший вариант осуществления изобретения Итак, белково-полипептидный комплекс получают следующим образом (некоторые операции описаны с указанием детализаций, которые не ограничивают способ):
- нервную ткань эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности, размораживают;
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в соотношениях не менее 1 : 0,5;
- гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g интервале 10 000 - 28 000 в течение 90 - 30 мин., соответственно, объединяя полученный балластный тканевой материал после фильтрования через плотную ткань и фугат, для получения нуклеотидной фракции фармкомпозиции.
Получение белково-полипептидного комплекса:
- надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм;
- фильтрат наносят на уравновешенную хроматографическую колонку с анионообменным носителем, например - Toyopearl DEAE-650M;
- разделение связавшихся с носителем белков производят плавным или ступенчатым градиентом ионной силы раствора, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, имеющий ионную силу не выше 0, 1 ммоль/л, повышая ее с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракции с помощью буферного раствора с ионной силой от 0, 125 до 0, 15ммоль/л, в интервале рН от 5,2 до 8,5;
- целевые фракции объединяют и подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью выше 200 «Да, разводят буферным раствором, например 0.05М глицин-NaOH рН 7,4 до общей концентрации белка 1 ,0 - 2,0 мг/мл;
- полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм и определяют суммарную концентрацию белков.
Все предварительные процессы и процессы получения белково- пептидной фракции желательно производить при температуре от +2° до +8°С.
Для идентификации полученного белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель- хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (фиг.1 .). Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (фиг.2.)- Значение изоэлектрической точки от 4,2 до 8,4. В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 0,5 кДа до 200 кДа, из которых не менее 70% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа.
Получение полинуклеотидной фракции для армкомпозиции и самой фармкомпозиции:
- объединенный балластный тканевой материал и фугат, оставленный после центрифугирования отфильтрованного гомогената с помощью миксера ресуспензируют в растворе, содержащем 2,5 мМ ЭДТА и 25 мМ цитрат натрия рН 7,0 - 8,0, в тех же режимах температур в соотношении не менее 1 :1 , выдерживая полученную массу в течение 30 минут;
- на этапе гидролиза к полученной массе добавляют ЮМ NaOH из расчета конечной молярной концентрации щелочи не более 2 и, после размешивания, инкубируют в течение 16 часов при +48°С;
- охлажденную до +2°С смесь центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 40 мин.;
- перед переливанием супернатанта с поверхности надосадочной жидкости в центрифужных флаконах с помощью полосок фильтровальной бумаги снимают тонкую масляно-жировую плёнку жёлтого цвета;
- в очищенный объединенный супернатант для повторного гидролиза добавляют 1/10 объема ЮМ NaOH и инкубируют 5 часов при +48°С;
- полученный дигидролизат охлаждают на ледяной бане (мокрый лёд, 0°С), а затем при непрерывном перемешивании и под контролем рН-метра добавляют ледяную уксусную кислоту до показателя рН смеси не выше рН 5,4, наблюдая при этом выпадение белого обильного осадка денатурированных белков;
- смесь центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 1 часа;
- к полученному супернатанту добавили 0,6 объёма изопропанола; - полученную смесь, после инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, центрифугируют при -32000 g и +20°С в течение 1 часа, формируя осадок ДНК;
- осадок растворяют в 100 мл Н2О и добавляют по 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 3 объёма охлаждённого до -20°С этанола и хорошо перемешивают;
- полученную суспензию центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 1 часа;
- полученный осадок растворили в 50 мл Н20 на магнитной мешалке; - в конечном растворе после стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм и определяют концентрацию полученной полинуклеотидной фракции.
Для идентификации полученной нуклеотидной фракции фармкомпозиции используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии и гель-электрофореза в 1 ,8% агарозном геле, а также качественные реакции на дезоксирибозу и натрий. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2 нм, минимум поглощения - при 230±2 нм (фиг.З.). Отношение D26o 28o от 1 ,6 до 2,0. Молекулярную массу нуклеотидов, входящих во фракцию, определяют методом электрофореза в 1 ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований: определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до 660 кДа (фиг.4.). При качественной реакции на рибозу получают синее окрашивание при постановке качественной реакции на рибозу, а также примесью белка при определении его концентрации по Лоури не выше 18%.
Проводят идентификацию полученных белково-пептидного комплекса и нуклеотидной фракции после чего, для получения фармкомпозиции их объединяют, как минимум в концентрационно равных соотношениях с расчетом конечной концентрации общего белка и полипептидов в полученном растворе в пределах 0,05 - 2,0 мг/мл при разбавлении фармацевтически приемлемым буферным раствором, например 50мМ глицин-фосфатным, содержащим при необходимости вспомогательные вещества, например, с концентрациями 0,5% маннитола, 0,0005% полисорбата-80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН не ниже 5,2 и не выше 8,5. Проводят повторную идентификацию смеси и фильтрующую стерилизацию.
Идентификационную характеристику фармкомпозиции (БПНК) проводят методами ультрафиолетовой спектрофотометрии и электрофореза в 1 ,8% агарозном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2 нм, минимум поглощения - при длине волны 230±2 нм (фиг.5.). При электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра определяется наличие характерных специфических полос белка и нуклеотидов (фиг.6.), а при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым определяется наличие полос окрашивания, характерных только для белковой фракции (фиг.7.).
Таким образом, при выделении БПК важно, чтобы:
- в качестве сырья использовалась эмбриональная нервная ткань копытных сельскохозяйственных животных со сроком гестации от конца первой трети до середины последней трети беременности;
- присутствие в буферном растворе, детергентов и солюбилизаторов в достаточных концентрациях;
- на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 5,2 - 8,5;
- при проведении анионообменной хроматографии ионная сила раствора (I) элюента при разделение связавшихся с носителем белков и полипептидов была не ниже 0,1 ммоль/л, а сбор целевых фракции производился элюентом, имеющим ионную силу раствора не выше 0, 15ммоль/л; - в описываемом БПК содержание белка с молекулярными массами от 20кДа до 160кДа было не менее 70% от общего содержания белка;
при индентификации заявленного БПК и проведении денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков отмечалось наличие характерных полос, подтверждающих и характеризующих спектр белково-полипептидных составляющих комплекса. При других параметрах получения, состав белково- полипептидного компонента и концентрационные соотношения входящих в него компонентов будут иными.
Заявляемый биологически активный белково-полипептидный комплекс принципиально отличается от всех известных биологически активных субстанций получаемых из сырья животного происхождения по:
- сырьевой основе - используется нервная эмбриональная ткань сельскохозяйственных животных на определенной стадии гестации от середины первой трети, до середины последней;
- методике получения - присутствие в экстрагирующем буферного раствора, детергентов и солюбилизантов и отсутствие денатурирующих и деградирующих соединений - спиртов, щелочей, кислот и ферментов, позволяет получить мембранные, межклеточные, цитоплазматические, ядерные белки и полипептиды с сохраненной третичной структурой;
- использование в составе подвижной фазы миллимолярных концентраций катиона для создания умеренной ионной силы, позволяя тем самым получить большое количество специфических для нервной ткани слабо заряженных белков и полипептидов, выполняющих регуляторные, сигнальные и ферментативные функции, определяющие выраженную регенеративно-репаративную биологическую
тканеспецифическую активность;
- качественному составу, как определенной фракции тканевых (мембранных, клеточных, цитоплазматических, ядерных) гидрофильных, слабо заряженных отрицательных белков и полипептидов, с эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношением факторов роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул с молекулярной массой от 0,5 кДа до 200 кДа;
- по идентификации и стандартизации полученной целевой фракции - наличие специфических, характерных для данного комплекса полос при электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле (фиг.6), а так же удаление с помощью мембранной фильтрации молекул выше 200 кДа;
- по чистоте - полученный белково-полипептидный комплекс не содержит примесей в виде липидов, пептидгликанов, липополипротеидов, углеводов, полисахаридов и других соединений;
- по способу применения - парентерально (внутрикожно, подкожно), на слизистые оболочки (интраназально, субконъюктивально) и кожу;
- по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств);
- по биологической и фармакологической активности (репаративно- регенеративная) и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная).
Изменение параметров гидролиза при получении полинуклеотидной фракции для фармацевтической композиции БПНК неизбежно приведут к изменению параметров фармкомпозиции за счет полинуклеотидных компонентов, однако при рекомендуемых концентрациях эти изменения незначительно скажутся на общей биологической активности фармкомпозиции в целом. При изменении природы сырьевого компонента для получения полинуклеотидной фракции (ткани животных, молоки промысловых рыб и т.д.), сохранением методик получения, заявляемых концентрационных соотношений с белково-полипептидным комплексом и соответствие полученной фракции заявленным критериям, биологическая активность БПНК, как фармкомпозиции значимо не меняется.
Заявленная фармкомпозиция в виде БПНК с фармацевтически приемлемым разбавителем позволяет повысить репаративно- регенераторный потенциал БПК за счет специфического действия средне- и низкомолекулярных полинуклеотидов по активизации гуморального и клеточного иммунитета в дозах не выше 0, 1 - 10 мг, а так же повысить стабильность раствора всей композиции и увеличить сроки его действия и хранения.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем.
Пример 1. Способ получения БПК.
Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональной нервной ткани овец.
440 г эмбриональную нервную ткань ягнят сроком гестации 16 - 18 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0.05М ТРИС- глициново-фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1 % маннит, в течение 5 минут при +4°С, гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g 10 000 в течение 90 мин., отделяя фугат. Надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45мкм, фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0.05М глициново-фосфатного буфера с рН 8,5 хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M, разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом тем же буферным раствором, содержащим 0,05 М KCI (I = 0, 1 ммоль/л), повышая концентрацию соли с шагом 0,025М (I = 0,025 ммоль/л) и начиная сбор целевых фракции с концентрациями соли от 0,075 М (I = 0, 125 ммоль/л) до 0, 1 М (I = 0, 15 ммоль/л), целевые фракции объединяют, целевые фракции объединяют, подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью выше 200 кДа и разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH рН 8,5, полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22мкм и определяют суммарную концентрацию белков. Все предварительные процессы и процессы получения белково- пептидной фракции производятся при температурах от +2° до +8°С.
Характеристика полученной белково-полипептидного комплекса:
- ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области ' длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.1.);
- молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 к а, в состав фракции входят белки с молекулярной массой от 0,5кДа до 200кДа, из которых 76% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160кДа (Фиг.2.);
количественное определение белка методом Лоури (без предварительного осаждения) - 2,4мг/мл;
- аминокислотный анализ (%): Asp - 10,82 + 2,8; Thr - 5,4 + 1 ,6; Ser - 5,2 + 1 ,8; Glu -16,2 + 3,4; Pro - 7,045 + 2,5; Gly - 5,2 + 2,4; Ala - 5,4 + 1 ,8; Val - 7,08 + 2,9; Met - 2,65 + 1 ,4; He - 4,45 + 1 ,8; Leu -9,4 + 2,6; Tyr - 4,02 + 1 ,2; Phe - 4,8 + 1 ,9; Orn- 0,48 + 0,2; Lys - 8,48 + 2,4; His - 2,8 + 0,9; Arg - 6,52 + 2,2.
Пример 2. Способ получения ВПК.
Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональной нервной ткани свиней.
ЗООг эмбриональной нервной ткани поросят сроком гестации 16 - 18 недель размораживают и гомогенизируют в буферном растворе рН 5,2, содержащего 50мМ Трис-малеата, 1 мМ (ЭДТА) и 0,1 % маннита, в течение 5 минут при +2°С. гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g 28 000 в течение ЗОмин., соответственно, объединяя полученный балластный тканевой материал после фильтрования через плотную ткань и фугат для получения нуклеотидной фракции фармацевтической композиции. Супернатант фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45мкм и наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,2 хроматографическую колонку объемом 250мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят плавным повышением градиента ионной силы малеатного буферного
раствора рН 5,2 содержащего 0,05 М NaCI (I = 0, 1 ммоль/л), начиная сбор целевой фракции с концентрации соли 0,075 М (I = 0,125 ммоль/л) и заканчивая до 0,1 М (I = 0, 15 ммоль/л), целевую фракцию подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью выше 200 кДа, обессоливают с помощью дилиза против 50 мМ раствора аспартата-NaOH рН 5,2. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм.
Для характеристики полученной белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель- хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.8.). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (Фиг.9.). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 0,5 кДа до 200 кДа, из которых 72% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Количественное определение белка в полученном ВПК методом Лоури (без предварительного осаждения) - 1 ,85мг/мл.
Аминокислотный анализ полученного комплекса (%): Asp - 8,3 + 2,7; Thr - 6,9 + 2, 1 ; Ser - 6,2 + 1 ,5; Glu -12,9 + 4,7; Pro - 7,05+ 2,4; Gly - 8,2 + 2, 1 ; Ala - 6, 1 + 1 ,4; Val - 7,5 + 2,6; Met - 1 ,4 + 0,7; He - 4,9 + 1 ,2; Leu - 8,7 + 2,3; Туг - 5,4 + 1 ,8; Phe - 5,5 + 2, 1 ; Orn- 0,6 + 0, 1 ; Lys - 8,6 + 2,8; His - 1 ,7 + 0,9; Arg - 7, 1 + 2,8.
Пример 3. Способ получения фармкомпозиции.
а) получение полинуклеотидной фракции:
- объединенный балластный тканевой материал и осадок, оставленный после центрифугирования отфильтрованного гомогената весом 280г, с помощью миксера ресуспензируют в растворе, содержащем 2,5мМ ЭДТА и 25мМ цитрат натрия рН 7,8, в тех же режимах температур в объемном соотношении 1 : 1 ,5 (650мл) выдерживая полученную массу в течение 30 минут, к полученной массе добавляют ЮМ NaOH из расчета конечной молярной концентрации щелочи не более 2 (158мл) и, после размешивания, инкубируют в течение 16 часов при +48°С.
- охлажденную до + 2°С смесь центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 40 мин., удаляя перед переливанием супернатанта с поверхности надосадоч ной жидкости в центрифужных флаконах с помощью полосок фильтровальной бумаги тонкую масляно-жировую плёнку жёлтого цвета.
- в очищенный объединенный супернатант для повторного гидролиза добавляем 1/10 объёма ЮМ NaOH (58мл) и инкубируем 5 часов при +48°С.
- полученный дигидролизат охлаждают на ледяной бане (мокрый лёд, 0°С), а затем при непрерывном перемешивании и под контролем рН-метра добавляют ледяную уксусную кислоту до показателя рН смеси не выше 5,4 (63мл), наблюдая при этом выпадение белого обильного осадка денатурированных белков.
- смесь центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 1 . часа, к полученному супернатанту добавляют 0,6 объёма изопропанола и, после инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, центрифугируют при -32000 g и +20°С в течение 1 часа, формируя осадок ДНК.
- осадок растворяют в 100мл Н2О и добавляют по 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 3 объёма охлаждённого до -20°С этанола и хорошо перемешивали. - полученную суспензию центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 1 часа, растворяя полученный в 50мл Н2О на магнитной мешалке. В конечном растворе после стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22мкм определяют концентрацию полученной полинуклеотидной фракции - 2,8 мг/мл.
Характеристика полученной нуклеотидной фракции:
- ультрафиолетовой спектр раствора снимали в области длин волн от 190 до 325нм: максимум поглощения отмечался при длине волны 260±2 нм, минимум поглощения при 230±2 нм. Отношение D26o/28o от 1 ,6 до 2,0 (Фиг.З.);
- молекулярную массу нуклеотидов, входящих во фракцию, определяли методом денатурирующего «SDS-Раде» электрофореза в ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном пар оснований от 75 до 7000. Отмечается наличие характерных специфических полос в интервале значений молекулярной массы от 12 до ббОкДа (Фиг.4.). При качественной реакции на рибозу получаем синее окрашивание. При определении концентрации белка по Лоури в выделенной нуклеотидной фракции она определена как 0,16 мг/мл (т.е. составляет ~0, 15% от ДНК).
б) берут, полученный по примеру 1 . раствор ВПК и объединяют с раствором полинуклеотидной фракции в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной известным способом, представленным, например, в примере 3, с таким условием, чтобы конечная концентрация общего белка (определяется по методу Лоури) и концентрация полинуклеотидов (определяется спектофометрически) после разбавления 50мМ глициново-фосфатным буферным раствором составляла 2 мг/мл. В полученный БПНК возможно добавление вспомогательных веществ: детергентов, солюбилизаторов и консервантов и высокомолекулярных соединений (с учетом конечной концентрации БПНК), в частности, до 0,5% маннитола, 0,0005% полисорбата-80, 0,03% нипагина и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН 8,5. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0, 1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Характеристика полученной фармкомпозиции с БПНК:
идентификационную характеристику белково-полипептидно- нуклеотидного комплекса, после объединения в равных концентрациях полученных белковой и нуклеотидной фракций, проводят методами ультрафиолетовой спектрофотометрии и электрофореза в 1 ,8% агарозном геле, ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2нм, минимум поглощения - при длине волны 230±2нм (Фиг.5.). При электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра определяется наличие характерных специфических полос белка и нуклеотидов (Фиг.6.), а при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым определяется наличие полос окрашивания, характерных только для белковой фракции (Фиг.7.).
Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.
а) получение полинуклеотидной фракции:
- объединенный балластный тканевой материал и фугат, оставленный после центрифугирования отфильтрованного гомогената весом 175г, с помощью миксера ресуспензируют в растворе, содержащем 2,5мМ ЭДТА и 25мМ цитрат натрия рН 7,8, в тех же режимах температур в объемном соотношении 1 : 3 (425 мл) выдерживая полученную массу в течение 30 минут, к полученной массе добавляют ЮМ NaOH из расчета конечной молярной концентрации щелочи не более 2 (1 12мл) и, после размешивания, инкубируют в течение 16 часов при +48°С;
- охлажденную до + 2°С смесь центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 40 мин., удаляя перед переливанием супернатанта с поверхности надосадочной жидкости в центрифужных флаконах с помощью полосок фильтровальной бумаги тонкую масляно-жировую плёнку жёлтого цвета; - в очищенный объединенный супернатант для повторного гидролиза добавляют 1/10 объёма ЮМ NaOH (42мл) и инкубировали 5 часов при +48°С;
- полученный дигидролизат охлаждают на ледяной бане (мокрый лёд, 0°С), а затем при непрерывном перемешивании и под контролем рН-метра добавляют ледяную уксусную кислоту до показателя рН смеси не выше рН 5,4 (48мл), наблюдая при этом выпадение белого обильного осадка денатурированных белков;
- смесь центрифугируют при ~32000 g и +4°С в течение 1 часа, к полученному супернатанту добавляя 0,6 объёма изопропанола и, после инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, центрифугируют при -32000 g и +20°С в течение 1 часа, формируя осадок ДНК.
- осадок растворяют в 100 мл Н2О и добавляют по 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 3 объёма охлаждённого до -20°С этанола и хорошо перемешивают;
- полученную суспензию центрифугируют при ~32000 g и +4°С в течение 1 часа, растворяя полученный в 50 мл Н2О на магнитной мешалке. В конечном растворе после стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22мкм определяли концентрацию полученной полинуклеотидной фракции - 2, 1 мг/мл.
Для характеристики полученной нуклеотидной фракции проводили ультрафиолетовую спектрофотометрию и гель-электрофорез в 1 ,8% агарозном геле, а также качественные реакции на дезоксирибозу и натрий. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2нм, минимум поглощения - при 230±2нм (Фиг.10.). Отношение D26o 28o от 1 ,6 до 2,0. Молекулярную массу нуклеотидов, входящих во фракцию, определяют методом электрофореза в 1 ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 70 до 7000 пар оснований: определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до 660 кДа (Фиг.1 1.). При качественной реакции на рибозу получают синее окрашивание. При определении концентрации белка по Лоури в выделенной нуклеотидной фракции она определена как 0,12 мг/мл (т.е. составляет -0,14% от ДНК).
б) берут, полученный по примеру 2. раствор БПК и объединяют с раствором полинуклеотидной фракции в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной известным способом, представленным, например, в примере 3, с таким условием, чтобы конечная концентрация общего белка (определяется по методу Лоури) и концентрация полинуклеотидов (определяется спектофометрически) после разбавления 50мМ глициново-фосфатным буферным раствором составляла 0,05 мг/мл. В полученный БПНК возможно добавление вспомогательных веществ: детергентов, солюбилизаторов и консервантов и высокомолекулярных соединений (с учетом конечной концентрации БПНК), в частности, до 0,5% маннита, 0,0005% полисорбата-80, 0,005% бензалкония хлорида и однозамещенного фосфорнокислого натрия до рН 5,2. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0, 1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Характеристика полученной фармкомпозиции с условным обозначением, содержащегося в ней образующегося комплекса, БПНК: идентификационную характеристику белково-полипептидно- нуклеотидного комплекса, после объединения в равных концентрациях полученных белковой и нуклеотидной фракций, проводят методами ультрафиолетовой спектрофотометрии и электрофореза в 1 ,8% агарозном геле, ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2нм, минимум поглощения - при длине волны 230±2нм (Фиг.12.). При электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра определяется наличие характерных специфических полос белка и нуклеотидов (Фиг.13.), а при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым определяется наличие полос окрашивания, характерных только для белковой фракции (Фиг.14.). Пример 5. Влияние БПНК на развитие эксплантатов головного мозга. Эксперименты проведены на 52 фрагментах коры головного мозга и 40 фрагментах спинно-мозговых ганглиев 10-12 -суточных эмбрионов цыпленка. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты коры головного мозга или спинно-мозговых ганглиев помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7° С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли исследуемый БПНК и как положительный контроль - церебролизин и кортексин в концентрациях 0,5, 1 , 2, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 н г/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%. Зону роста контрольных эксплантатов головного мозга составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки. При исследовании непосредственного влияния препаратов на фрагменты головного мозга были поставлены следующие серии опытов. В питательную среду эксплантатов коры головного мозга и спинномозговых ганглиев эмбрионов цыплят добавляли церебролизин и кортексин в различных концентрациях. На 3-й сутки культивирования с добавлением церебролизина при концентрации 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 24±3,5 %, по сравнению с контрольными значениями ИП. Достоверных значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций церебролизина не наблюдалось. На 3-й сутки культивирования с добавлением кортексина при концентрации 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 32±4 %, по сравнению с контрольными значениями ИП. Отмечалось достоверное повышение ИП эксплантантов коры головного мозга при концентрации кортексина 100 нг/мл на 28+3,5%, концентрации 200 нг/мл на 23+2%. Достоверные значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций кортексина не наблюдалось. Отчетливая стимуляция развития эксплантатов коры головного мозга выявилась при действии исследуемого БПНК в концентрации 20 нг/мл, когда ИП экспериментальных эксплантатов на 48±4,5% был достоверно выше, чем ИП контрольных эксплантатов и эксплантатов сравнения при действии кортексина и церебролизина. При добавлении церебролизина в среду для культивирования эксплантатов спинно-мозговых ганглиев достоверного увеличения ИП эксплантатов не отмечалось, в то время как при добавлении в среду кортексина наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 22±3%. При добавлении исследуемого БПНК в среду для культивирования эксплантатов спинно-мозговых ганглиев наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 36±3,5%. При исследовании эксплантатов коры головного мозга и спинно-мозговых ганглиев на более длительных сроках культивирования - 7 дней - выявились те же эффекты нейрит- стимулирующего действия в тех же концентрациях исследуемого комплекса. Таким образом, в отношении тканей головного мозга наблюдалось уменьшение порога эффективных концентраций для исследуемого БПНК по сравнению с церебролизином и кортексином. Так увеличение зоны роста эксплантатов фрагментов коры головного мозга выявлялось при действии церебролизина только в концентрации 100 нг/мл, кортексина только в концентрациях 50 и 100 нг/мл, а при действии исследуемого БПНК - в концентрации 20, 10, 50 и 100 нг/мл соответственно. При этом интенсивность стимулирующего действия БПНК была достоверно выше, чем кортексина и церебролизина. На увеличение зоны роста эксплантатов спинно-мозговых ганглиев церебролизин достоверного действия не оказывал, кортексин достоверно увеличивал ИП на 24%, в то время как исследуемый белково-полипептидный комплекс способствовал увеличению ИП на. 36%. Это свидетельствует о выраженном и направленном стимулирующем действии БПНК на нейроны различных отделов головного мозга. Пример 6. Изучение токсичности фармкомпозиции БПНК [17].
Общетоксическое действие БПНК исследовали в режимах острой токсичности при однократном введении, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении комплекса [17]. Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Комплекс вводили животным однократно внутримышечно в дозах 5 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг, 500 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. Животным контрольной группы в том же объеме вводили стерильный 0,05 М глицин- NaOH раствор рН 7,5. Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 95 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150- 180г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили БПНК подкожно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,05 М глицин- NaOH раствор рН 7,5. До введения комплекса и на 30, 60 и 90 сутки после начала введения у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев на 1 12 морских свинках-самцах с массой тела 250-280г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно подкожно БПНК в течение 6 мес. в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор рН 7,5 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно- мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга. При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого комплекса животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 1000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте комплекса.
Изучение подострой и хронической токсичности комплекса свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при его длительном применении в дозах, превышающих предполагаемую терапевтическую в 600 раз. При исследовании влияния комплекса на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено.
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены. Следовательно, белково-полипептидный комплекс, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения. Пример 7. Исследование субхронической токсичности фармкомпозиции при интраназальном введении половозрелым животным.
Исследования проводили на половозрелых кроликах самках породы
Шиншилла весом 2500г. [17]. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха +18 - +20° С [18]. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0, 1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0, 1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раза в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 1 месяц.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1 ,5 - 2,0мл.
Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901 , «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.
Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
1. Визуальные наблюдения:
Выживаемость: Все подопытные животные перенесли введение фармкомпозиции в исследуемых дозах. Гибели не наблюдалось.
Поведение: повышенной или пониженной активности у подопытных животных сравнительно с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус у подопытных животных и контрольных не отличался повышенной возбудимостью. Замечено, что введение препарата не вызывает у животных чувство дискомфорта.
Внешний вид: все животные независимо от применяемой дозы были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.
Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы; экскрет по цвету и оформленности не отличался от контроля.
2. Клинические исследования:
Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная, и достоверно не отличалась от интактного контроля.
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.
Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах нормы. Концентрация белка у кроликов, получавших фармкомпозицию 1 и 2 раза в день статистически не различалась.
3. Патоморфологические данные:
Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.
Таким образом, проведены исследования субхронической токсичности назальной формы фармкомпозиции. При субхроническом исследовании спрея не было выявлено значимых изменений внутренних органов испытуемых животных, не обнаружено местнораздражающего действия. При изучении субхронической токсичности использовали клинические методы исследования, общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов и слизистых носа.
Исследование субхронической токсичности фармкомпозиции на неполовозрелых кроликах при интраназальном введении.
Исследования проводили на 3 недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500г. Нанесение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 1 впрыску в течение 2 недель [17]. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха +18 - +20°С [18]. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0, 1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1 ,5 - 2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901 , «Labsystems» Финляндия.
После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
Оценка раздражающего действия на слизистую оболочку носа.
Прижизненные биомикроскопические исследования
На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальноё поведение, выделений из носовых ходов и образования корок не замечено. При использовании капель у кроликов возникал рефлекс чихания, который прекращался через 1-2 минуты. При закапывании капель, как в терапевтической группе, так и в группе превышенной дозы у крольчат отмечалось механическое раздражающее действие, выразившееся в рефлексе чихания, подергивания носом, животные терли лапами нос.
Контрольная интактная группа. Слизистая оболочка бледно-розового цвета, без отеков и выделений. Во время наблюдение с отоларингологическим зеркалом изъянов на эпителии не обнаруживались. Слизистое отделяемое носа прозрачного водянистого вида. Рефлексы соответствовали физиологической норме.
При конфокальной микроскопии: эпителиальный слой имеет плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.
В группе терапевтической дозы слизистые носа оставались чистыми на протяжении всего срока наблюдения: слабо-розового цвета без выделений, отеков не наблюдалось. Сосуды слизистой оболочки не изменены. Состояние эпителия исследовали на щелевом освещение. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.
В группе х10. Ни в одном случае патологических изменений слизистой не выявлено.
Клинические и биохимические исследования
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.
Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.
Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных оригинальной фармкомпозиции.
Введение препарата интраназально как в терапевтической дозе, так и в десяти кратно превышающих в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывал местнораздражающего действия.
Пример 8. Изучение специфической активности ВПК и БПНК [17].
Местнораздражающее действие. Проведенные исследования показали, что при подкожном, внутривенном и интраназальном введение субстанции биологически активного ВПК не оказывает местнораздражающего действия. При быстром внутривенном введении возможны эффекты гипертермии. Не обнаружено местнораздражающего действия на слизистую носа и горла при интраназальном введении кроликам в течение 1 месяца.
Исследование иммуннотоксических и аллергизирующих свойств Активная кожная анафилаксия
Опыт проводили на морских свинках в количестве по 10 голов в группе, всего 3 группы. Сенсибилизировали животных по схеме: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. На 14 день на выстриженных участках спины морским свинкам вводили субстанцию ВПК внутрикожно, в двукратных разведениях. Для контроля реактивности кожи вводили физиологический раствор тому же животном на другой выстриженный участок кожи. Контрольным животным вводили разрешающую инъекцию субстанции (равную сенсибилизирующей дозе). Затем животным вводили внутривенно по 0,5 мл 1 % раствора синего Эванса. Через 30 минут животных умерщвляли эфиром и определяли размер синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения. Положительной считается реакция при размере пятна выше 6 мм, не более 3 мм в контроле. В трех случаях отмечена положительная реакция в группе животных, получавшей препарат в дозе 10 кратно превышающей терапевтическую. Количество реакций свидетельствует о возможности индивидуальных реакций.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах.
Опыты проводили на нелинейных мышах, массой 18-20 г, по 10 животных в группе. Общее количество животных в опыте - 30. Животных однократно сенсибилизировали внутрикожно в основании хвоста эмульсией ВПК в НАФ (1 : 1 ). Доза введения составила 60 мкл. Контрольных животных сенсибилизировали эмульсией ПАФ с раствором Хенкса (1 : 1 ). Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы ввели 40 мкл раствора тест - препарата в растворе Хенкса. Через 24 часа после тестирования измеряли величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25. При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница в толщине лапок опытных групп и контрольной (Р>0,05). Введение субстанции БПНК не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.
Постановку реакции проводили на белых крысах массой 180-200г.
Общее число животных в опыте 30, по 10 в каждой группе. Исследовали две дозы препарата ВПК: терапевтическую и десятикратно ее превышающую, треть группа - контроль. Метод основан на определение оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Крыс, подвергнутых воздействию исследуемого препарата, забивали методом декапитации. Асептически внутрибрюшинно вводили 5 мл среды 199, содержащей 20% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка). После массажа брюшной полости среду отсасывали шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяли в общий пул. Концентрацию живых клеток доводили до 1 ,5x103 клеток/мл. Суспензию клеток стерильно разливали по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки инкубировали 2 часа при 37°С. Надосадок, содержащий не прилипшие клетки, сливали, а фиксированный на пластике монослой дважды промывали средой 199. В слегка подсушенные чашки наливали раствор, содержащий нейтральный красный, и выдерживали при 37°С в течение 1 часа. Раствор сливали. Клетки промывали средой 199. В каждую чашку вносили по Змл лизирующего раствора. Клетки тщательно обрабатывали вращательным движением чашки. Раствор сливали в пробирки и, на спектрофотометре при длине волны 540 нм измеряли оптическую плотность.
При введении субстанции БПНК фагоцитарная активность магрофагов не снижается. Статистически достоверных различий между показателями в опытных группах и контрольной нет.
Реакция дегрануляции тучных клеток
Постановку реакции проводили на крысах массой 180-200 г, самках. Общее количество животных в опыте - 30. Раствор субстанции ВПК вводили внутрибрюшинно в терапевтической дозе и десятикратно ее превышающей, контролем служила интактная группа. Для получения взвеси тучных клеток животных забивают декапитацией, в брюшную полость вводили буфер; после массажа передней брюшной стенки взвесь тучных клеток собирали в центрифужные пробирки. Препараты готовили на предметных стеклах, окрашенных 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляли 0,03 мл сыворотки опытного животного и 0,03 мл исследуемого препарата в разведении 1 :100. В контроле дегрануляция не превышала 5%. Препараты накрывали покровным стеклом, края которого герметизировали парафином. Затем инкубировали 15 минут в термостате при 37°С. Препараты микроскопировали под увеличением Х40, подсчитывая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные, в сумме 100. Реакцию считали положительной, если степень дегрануляции превышала 20%.
Введение субстанции ВПК в концентрации 0,01 мг/кг не вызывает дегрануляции тучных клеток, не отличается от контроля и превышает пороговое значение на 5%. Реакция в группе с введением в дозе десятикратного превышения терапевтической слабо положительная, однако, эти значения не выходят за статистический процент ошибки.
Исследование на прионы. Пробы брали из 4х флаконов. Реакцию проводили методом иммуноферментного анализа, на 96-луночном полистироловом планшете. Диагностическая тест-система - PrionScreen..Спектрофотометр Digiscan. Каждую пробу ставили в 4-х повторностях. Контроли: К-: 8 лунок, К+: 8 лунок. Полученные оптические плотности контролей и исследуемых образцов соответствовали условиям проведения реакции.
Результаты: инфекционные белки, прионы в исследуемой субстанции ВПК не обнаружены.
Общее заключение. Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной субстанции биологически активного ВПК, а так же изучение его местнораздражающего, иммунотоксического действия, аллергизирующих свойств и выявление наличия прионовых инфекций.
Острую токсичность фармкомпозиции БПНК изучали в эксперименте на мышах линии BALB/C. БПНК вводили тремя способами: подкожно, внутрибрюшинно, перорально и интраназально. Максимально возможная для введения мышам доза составляет 0,2 мл, что составило 10 мг/кг, интраназально вводили по 100 мкл 0, 1 % раствора в каждый носовой ход. Было выявлено, что в указанных дозах во всех способах введения препарат не вызывал гибели животных, симптомов острого отравления получено не было.
Исследования в субхроническом эксперименте проводили на половозрелых и отдельно на неполовозрелых крысах линии Wistar. Исследуемый препарат вводили подкожно в терапевтической дозе 0,01 мг/кг и десятикратно превышающей 0,1 мг/кг; внутривенно в дозе 0,0025 мг/кг и х10 - 0,025 мг/кг. Интраназально, по 1 впрыску в каждый носовой ход, 2 раза в день, что составило 400 мкл 0, 1 % раствора - 0,016 мг/кг изучали на кроликах породы Шиншилла. При исследовании токсичности использовали общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов.
Было получено, что введение фармкомпозиции БПНК различными способами как в терапевтической дозе, так и в десяти кратно превышающих в течение 1 месяца не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывал местнораздражающего действия при различных способах введения.
Исследование аллергизирующих свойств проводили на морских свинках при внутрикожных аппликациях. Было обнаружено, что фармкомпозиция БПНК не вызывала аллергических реакций в терапевтических дозах. Отмечено 2 случая повышенной чувствительности животных к препарату в дозе в 10 раз, превышающую терапевтическую. Исследование иммуннотоксичности проведено на макрофагах крыс линии Вистар и не обнаружило данного эффекта.
Проведены исследования фармкомпозиции БПНК на наличие прионовых инфекций методом иммунноферментного анализа. БПНК оказался свободным от искомых возбудителей. Пример 9. Мутагенность фармкомпозиции.
Для оценки мутагенных свойств заявляемой фармкомпозиции БПНК применили набор следующих тестов [19]: - учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100;
- учет микроядер в клетках костного мозга мышей.
Испытан образец белково-полипептидной фармкомпозиции, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно, упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидно-нуклеотидной фармкомпозиции в тесте Эймса.
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест- системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.
Данный метод предназначен для выявления способности фарма- кологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени под-считывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium. Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосН И И Генетика.
Регламент работы с бактериальными культурами, проверка геноти- пов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для прове- дения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.
Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.
Фармкомпозиция БПНК в виде стерильного раствора с равным содержанием белка и нуклеотидов - 0, мг/мл, исследовали 1 ,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 00; 10; 1 и 0, 1 мкг на чашку.
Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у со- ответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в ко- личестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9- диокси-5, 10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0, 1 мл на чашку).
Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при +100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой +45° - +46°С.
Сначала в пробирки с агаром вносили 0, 1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросо-мальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при +37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.
Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболиче- ской активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней. Исследованная фармкомпозиция БПНК во всех тестируемых концентрациях не показала мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: фармкомпозиция БПНК не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.
Оценка мутагенных свойств БПНК фармкомпозиции микроядерным методом в клетках млекопитающих.
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна- телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.
Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.
Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов F1(CBAx C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств БПНК при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении. Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения фармкомпозиции БПНК в клинике - внутривенный, подкожный и интраназальный, мышам в данном исследова- нии использовали внутрибрюшинное введение субстанции. Дозу БПНК для оценки мутагенной активности рассчитывали, исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение фармкомпозиции БПНК в количестве 2 мл при концентрации 0,1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела , и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг).
В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0, 1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0, 1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1 ,7 мг/кг.
Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0, 1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково- полипептидного комплекса.
В двух других опытных группах БПНК вводили однократно самцам в дозах 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг.
В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофос- фамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.
Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с принятыми методическими рекомендациями [20]. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспенди-ровали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 поли- хроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку результатов по учету микроядер про- водили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта фармкомпозиция БПНК не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутрибрюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62, 1 %о против 3, 16% в контроле, Р<0,001 ). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).
Таким образом, мутагенная активность БПНК не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково- полипептидной фармкомпозиции самцам в максимально возможной дозе - 10 мг/кг. БПНК не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».
Заключение по оценки мутагенных свойств БПНК.
БПНК не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella /микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.
Пример 10. Действие биологически активной субстанции - БПК на цитокинетические параметры клеточной популяции.
Материалы и методы. Мышиные фибробласты ЗТЗ культивировали на среде ДМЕМ (ПанЭко, Москва) с добавлением 584 мг/л глютамина, противогрибково-противомикробного препарата (Sigma, США) согласно инструкции производителя, и 10% по объему стандартизованной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Для проведения экспериментов клетки высаживали на 24-х луночные планшеты (Corning) в концентрации 3000 клеток на мл (на лунку). Для морфологических исследований в лунки планшета помещали покровные стекла диаметром 12 мм (Ted Pella, США), и высаживали клетки на них.
Внесение тестируемых веществ. По достижении клеточной культурой требуемой плотности заменяли среду культивирования на свежую того же состава (контроль), на ДМЕМ без сыворотки с добавлением 2 мг/мл БСА (Sigma) (отрицательный контроль), ДМЕМ без сыворотки с добавлением 10% по объему БПК (опыт 1 ) и ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки и 10% БПНК (опыт 2).
Экспериментальные процедуры. Клетки анализировали через 8, 24 и 48 часов после внесения тестируемых реактивов. Состояние культуры in vivo анализировали и фотографировали клетки с помощью фазово- контрастного инвертированного микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия), оснащеного объективом ЕС Plan-Nefluar 10х NA 0,5 и цифровой камерой ORCA II Erg-2 (Hamamatsu Photonics, Япония). Для определения количества клеток диссоциировали клеточный пласт смесью р-ра Версена (ПанЭко) и 0,025% р-ра трипсина (ПанЭко) в отношении 3: 1 . Полученную суспензию центрифугировали при ЗООд, осадок ресуспендировали в растворе Хэнкса (ПанЭко) и считали в камере Горяева. Для анализа цитокинетических параметров популяции клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 1 % глютаровым альдегидом на 0, 1 М фосфатном буфере при +4С, пермеабилизировали 0,5% р-ром Тритона X- 100 на PBS 10 минут, промывали дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином Майера (90 секунд) (Sigma), обезвоживали и заключали в DePeX. После пермеабилизации также окрашивали клетки DAPI (0, 1 мкг/мл) и заключали в Moviol. Полученные препараты изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioskop II (Carl Zeiss), используя объективы Plan-Neofluar 40х NA 1 ,2 и 100х NA 1 ,3.
Результаты. Цитокинетические параметры популяций. Контроль. 8 часов. Митотический индекс - 8%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 1 1 ,9%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 265000.
48 часов. Митотический индекс - 9%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 780000.
БСА. 8 часов. Митотический индекс - 5%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 5,5%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 167500.
48 часов. Митотический индекс - 3%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 625000.
БПНК.
8 часов. Митотический индекс - 6%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 7, 1 %. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 250000.
48 часов. Митотический индекс - 6%. Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке: посчитано 187000, реально ~ 400000 (выброс).
Сыворотка+ БПНК.
8 часов. Митотический индекс - 8%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 4,5% (выброс). Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 317500.
48 часов. Митотический индекс - 9%. Апоптоз и некроз - 1 %. Количество клеток в лунке - 680000.
Все экспериментальные линии демонстрируют прирост биомассы, не наблюдается цитотоксического действия ни в одном из случаев. В отрицательном контроле эффективность пролиферации минимальна, в присутствие БПНК наблюдается стимуляция пролиферации по сравнению с отрицательным контролем. Положительный контроль и среда с добавлением БПНК и сыворотки показывают одинаковый уровень пролиферации.
Клетки, инкубированные в присутствие с БПНК, формируют тонкие длинные отростки. Особенно хорошо заметно на первые сутки эксперимента. В присутствие сыворотки на фоне БПНК эффект сохраняется
Выводы: 1 ) Биологически активная субстанция состоящая из ВПК не является цитотоксичным препаратом.
2) Субстанция содержит ростовые факторы, однако не так эффективена в качестве стимулятора пролиферации, как эмбриональная сыворотка крови.
3) Субстанция вызывает изменение формы клеток с хорошо заметным формированием отростков.
Пример 1 1 . Влияние БПНК на кровоснабжение мозга и выживаемость крыс в условиях его ишемического поражения.
Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-250 г в условиях необратимой двусторонней окклюзии общих сонных артерий (см. Гусев Е.И., Скворцова В. И., 2001 ). Животных получали из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (г. Пущино) и подвергали карантину в течение 5 дней. Все ветеринарные манипуляции проводились в асептических условиях, позволяющие сохранить статус экспериментальных животных. Для содержания экспериментальных животных использовали стандартные условия [18]. У крыс под эфирным наркозом (эфир диэтиловый х/ч, ОАО «Медхимпром») в области шеи по средней линии делали небольшой разрез кожи длиной 8-10мм, для обеспечения доступа к сонным артериям. Выделяли обе сонные артерии, отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями. Под сосуды подводили шелковые лигатуры (Silk Ык 17 х 45 CM/M3/USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», KaT.Ne W203) и вместе с ассистентом производили одномоментную перевязку обеих сонных артерий тройным хирургическим узлом. Кожный разрез зашивали хирургическим шелком (Silk blk 100cM/M5/Sgle armed KP-3USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат-NQ W794), накладывая один или два хирургических кожных шва, с последующей обработкой раны 5% раствором настойки йода. Физиологический раствор или БПНК вводили внутрибрюшинно. Продолжительность всех манипуляций составляет 8-10 минут, затем животных помещают в клетку. Для исследования использовали три группы животных:
- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;
- группа 2 - ложнооперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;
- группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили БПНК в дозе 0,5 мл 0, 1 % раствора (0,2мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;
- группа 4 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили БПНК в дозе 200 мкл 0, 1 % раствора на крысу интраназально непосредственно перед операцией, сразу после наркотизации, через 1 и 5 часов после операции.
Выживаемость животных отслеживали сразу после проведения процедуры перевязки и в течение первых суток, т.е. конечную выживаемость фиксировали через 24 часа. Биологическая активность препарата в виде защиты головного мозга в условиях неполной глобальной ишемии при одномоментной перевязке сонных артерий оценивалась следующим образом:
- выраженная - при выживании более 80% крыс
- средневыраженная - при выживании 70-80% крыс
- невыраженная - при выживании менее 70% крыс
Статистическую обработку данных проводили с использованием точного критерия Фишера с учетом множественности сравнений.
Проведенные опыты показали, что в контрольных опытах после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 1 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1 ). Среди ложнооперированных животных погибло 2 крысы сразу после операции (17%).
БПК при внутрибрюшинном введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1 % раствора) внутрибрюшинно вызывал гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%.
БПК при интраназальном введении крысам непосредственно перед операцией и через 1 и 5 часов после операции вызывал гибель шести животных, а 30 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 83%. Полученные данные представлены в таблице .
Таблица 1. Влияние биологически активной субстанции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий
Figure imgf000057_0001
* - р .5 0,01 по сравнению с контролем.
Таким образом, биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидно-нуклеотидный комплекс оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий, как при внутрибрюшинном, так и при интраназальном способах введения.
Пример 12. Изучение влияния фармакологической композиции БПНК на локальный мозговой кровоток в коре головного мозга наркотизированных крыс в условиях глобальной преходящей ишемии.
Опыты проводили на наркотизированных крысах-самцах линии Вистар массой 220-250г при естественном дыхании. Крыс наркотизировали уретаном (фирма Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany) в дозе 1400 мг/кг внутрибрюшинно [21 ,22,23].
Методика. Состояние мозгового кровообращения у животных оценивали по регистрации локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс с помощью метода лазерной Допплеровской флоуметрии. Для регистрации локального мозгового кровотока в теменной области коры головного мозга крыс использовали флоуметр ALF-21 фирмы "Transonic System Inc." (США). Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8мм устанавливали на теменной области коры большого мозга крысы с помощью микроманипулятора и коромысла. Одновременно регистрировали изменения артериального давления через предварительно введенный в бедренную артерию полиэтиленовый катетер. Запись показателей кровотока и артериального давления производили на полиграфе фирмы «ВЮРАК» США и персональном компьютере. Фармакологическую композицию БПНК вводили в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0, 1 % раствора) через полиэтиленовый катетер в бедренную вену животных.
Модель глобальной преходящей ишемии широко используется для изучения, как нарушений мозгового кровотока, так и изменений различных биохимических показателей функции мозга, происходящих после ишемического поражения. Глобальную преходящую ишемию у крыс вызывали 10-минутной окклюзией обеих общих сонных артерий с помощью специальных зажимов с одновременным снижением артериального давления до 40-50 мм рт. ст. путем забора артериальной крови из предварительно вставленного полиэтиленового катетера в бедренную артерию. Через 10 минут зажимы с сонных артерий снимают, а забранную ранее кровь вводили обратно животному.
Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений и критерия множественных сравнений по Даннету с использованием программы Biostat.
Результаты исследования
Проведенные опыты показали, что в результате глобальной преходящей ишемии в коре головного мозга крыс наблюдается резкое снижение локального мозгового кровотока, которое в среднем составляет 6,1 ±1 ,0 усл.ед или 82±2,2% от исходного уровня. После снятия зажимов с сонных артерий и последующей реинфузии крови наблюдается резкое увеличение локального кровотока, которое постепенно снижается и через 30 минут после реперфузии составляет в среднем 25±2,8 усл.ед или 23±2,4% от исходного уровня (р<0,05).
Фармакологическая композиция БПНК, введенная через 30 минут после реперфузии внутривенно в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0, 1% раствора) уже через 10 минут после введения в большинстве опытов вызывал увеличение локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в среднем на 12 ±3,3% (в 7 из 10 опытов). Статистически значимое увеличение локального мозгового кровотока начинало проявляться на 50 минуте, которое составляло в среднем 39±9,2%, и продолжалось до 90 минуты наблюдения (табл.2). Здесь следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора уровень локального мозгового кровотока практически не изменяется.
Параллельно изменениям мозгового кровотока проводили регистрацию артериального давления. Опыты показали, что через 10 минут после введения фармакологической субстанции крысам наблюдалось постепенное снижение уровня артериального давления, которое через 50 минут снижалось в среднем на 15±3,4% и оставалось пониженным до конца эксперимента.
Следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора также наблюдается небольшое снижение уровня артериального давления в среднем на 18%, поэтому можно сказать, что фармакологическая субстанция БПНК не оказывает существенного влияния на уровень артериального давления.
Заключение
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что фармакологическая композиция БПНК увеличивает выживаемость экспериментальных животных в условиях полной перевязки сонных артерий. Вместе с тем, фармакологическая субстанция увеличивает локальный мозговой кровоток в коре головного мозга крыс, сниженный после глобальной преходящей ишемии головного мозга, который к концу эксперимента по величине превосходит контрольный уровень, наблюдаемый до ишемии. Можно полагать, что повышение выживаемости животных при перевязке сонных артерий под влиянием фармакологической субстанции может быть обусловлено его способностью усиливать кровоснабжение коры головного мозга экспериментальных животных.
Пример 13. Больной Л,. 22 года. Диагноз - последствия детского церебрального паралича (спастический парез правой кисти с гипертонусом мышц сгибателей руки, двигательная гиподинамия). Фармкомпозиция БПНК назначалась курсовыми дозами подкожно по 1 мл 0, 1 % раствора 10 дней, с повтором курса через 7-10 дней по 3 курса 4 раза в год и интраназально по 2 впрыска в каждый носовой ход (400 мкл 0, 1 % раствора) однократно утром в течении 10 дней 4 курса в год. После лечения заявляемым препаратом в течение одного года в сочетании с физиотерапевтическими методами отмечалась выраженная положительная динамика в виде регресса спастического тонуса с нарастанием объема движений. Больной стал писать, чистить картофель и выполнять другие мелкие движения с высокой точностью. Начал плавать. Применение известных лекарственных средств в течение предыдущих 8 лет не дало положительных результатов.
На прилагаемых фиг. 1 - фиг. 14 представлены результаты испытаний и исследований комплекса по изобретению.
На фиг. 1 приведен ультрафиолетовый спектр раствора белково- полипептидного комплекса в области длин волн от 200 до 500 нм с максимум поглощения при длине волны 215±5 нм, полученного по примеру 1.
На фиг. 2 приведен денатурирующий электрофорез раствора белковой фракции, полученного по примеру 1. (2) в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (1 ).
На фиг. 3 приведен ультрафиолетовый спектр нуклеотидной фракции фармкомпозиции, полученного по примеру 1. , снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны ~(260±2) нм, минимум поглощения при ~(230±2) нм.
На фиг. 4 приведен электрофорез нуклеотидной фракции комплекса в 1 ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 100 до 7000 пар оснований. Определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до 660 кДа.
На фиг. 5 приведен ультрафиолетовый спектр раствора фармкомпозиции БПНК в области длин волн от 200 до 500 нм с максимумом поглощения при длине волны ~(260±2) нм и минимумом поглощения при ~(230±2) нм. На фиг. 6 приведен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК, по примеру 3. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков и диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (1) при окрашивании нитратом серебра. Определяется наличие характерных специфических полос белковой и нуклеотидной фракций.
На фиг. 7 приведен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК, по примеру 3. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым. Определяется наличие полос окрашивания, характерных для белковой фракции БПНК.
На фиг. 8 приведен ультрафиолетовый спектр раствора белково- полипептидного комплекса полученного по примеру 2. в области длин волн от 200 до 500 нм с максимум поглощения при длине волны 215±5 нм.
На фиг. 9 приведен денатурирующий электрофорез белково- полипептидного комплекса, полученного по примеру 2. (2) в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (1 )
На фиг. 10 приведен ультрафиолетовый спектр нуклеотидной фракции фармкомпозиции по примеру 4., снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны ~(260±2) нм, минимум поглощения при ~(230±2) нм. На фиг. 1 1 приведен электрофорез нуклеотидной фракции фармкомпозиции по примеру 4., в ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 100 до 7000 пар оснований. Определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до 660 кДа. На фиг. 12 приведен представлен ультрафиолетовый спектр раствора фармкомпозиции БПНК, полученной по примеру 4., в области длин волн от 200 до 500 нм с максимумом поглощения при длине волны ~(260±2) нм и минимумом поглощения при ~(230±2) нм; На фиг. 13 приведен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК, полученной по примеру 4. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 «Да до 250 кДа (1 ) при окрашивании нитратом серебра. Определяется наличие характерных специфических полос белковой и нуклеотидной фракций.
На фиг. 14 приведен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК, полученной по примеру 4. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым. Определяется наличие полос окрашивания, характерных для белковой фракции БПНК.
Изобретение позволяет создать биологически активную субстанцию, с расширенными свойствами и высокой биологической активностью, обладающую тканеспецифическим репаративно-регенеративным действием на нервную ткань и разработать способ ее получения путем выделения биологически активного белково-полипептидно комплекса из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, которая решается за счет выбранной совокупности действий и режимов. Особенно важным оказалось определение оптимальных сроков гестации эмбрионального мозга, а так же набора реагентов, их доз, режимов экстракции, буферизации для сохранения эффективных концентрационных соотношений белков, полипептидов и нуклеотидов закрепленных эволюционно и определяющих биологическую активность комплекса, обеспечивая репаративно-регенеративное тканеспецифическое действие. Промышленная применимость
Изобретение предназначено для использования в химико- фармацевтической промышленности и в медицине и касается биологически активной субстанции - белково-полипептидно-нуклеотидного комплекса, получаемого из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных, обладающей антигипоксическим, сосудистым и нейропротективным действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях центральной и периферической нервной системы, гипоксических состояниях, в медицине катастроф, спортивной медицине, способу её получения и фармкомпозицию на его основе.
Источники информации, принятые во внимание:
1. Патент РФ NQ 2128511 С1
2. Патент РФ Ns 2129427 С1
3. Патент РФ 2132688 С 1
4. Заявка Франции Ns 2413912
5. патент РФ Ns 2132688 МПК А61 К35/48
6. Евразийский патент NQ 004788 В1
7. Евразийский патент Ns 003301 В1
8. Патент РФ N 1298979, кл. А 61 К 35/50, 1993 г
9. Патент РФ Ns 2237486 С 1
10. Патент UA 15241 , МПК 6 А 61 К 35/50, Бюл. Ns4, 2000 г..
11. Международная заявка WO 2009/088314 А1 , 2007 г.
12. «Деринат» компании «Техномедсервис» ЗАО ФП (Россия).
(информация опубликована Справочник «ВИДАЛЬ» Москва,
«АстраФармСервис» 2010г., Б-506).
13. «Церебролизин» фирмы «Ebewe» (Австрия) (информация опубликована в Справочнике ВИДАЛЬ-2007, за 2007 год, стр. В- 1 195)
14. «Цереброкурин» фирмы ООО «НИР» (Украина) заявка 971 19997/14, патент (19) RU (1 1) 212851 1
15. «Кортексин» фирмы ООО «Герофарм» (Россия), патент (19) RU
(1 1)2104702
16. «Церебролизат» фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат) (Россия), Патент N010068
17. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р. У. Хабриева.- 2 изд., перераб. И доп. - М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.131-170Патент РФ NQ 212851 1 (1999)/
18. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН от ноября 2005 г. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р. У. Хабриева.- 2 изд., перераб. И доп. -М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.100- 122.
Методических рекомендаций «Оценка микроядерным методом мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих» (М., 2001).
И.В.Силкина, Т.С.Ганьшина, С.Б.Серединин, Р.С.Мирзоян, Усилиние кровоснабжения ишемизированного мозга под влиянием афобазола, Ж.Эксперимен. и клин. Фармакология, 2004, т.67, Ne5, с.9-13.
Smith M.L., Bendek G., Dahlgen N. at all, Models for studing, long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. A 2-vessell occlusion model.// Neurol.Scan., 1984, v.69, p.385 - 400.
Ф Y.Wang-Fisher. Manual of Stroke Models in rats. CRC press, 2008,

Claims

Формула изобретения
1. Белково-полипептидный комплекс (ВПК), обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, получаемый из эмбриональной нервной ткани сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий тканеспецифические отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа, причем не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа, имеющих характерный специфический набор полос при денатурирующем гель-электрофорезе («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле по сравнению со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа и максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм.
2. Способ получения ВПК, обладающего антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, заключающийся в том, что нервную ткань эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности поэтапно:
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5 с последующим центрифугированием при значении g в интервале 10 000 - 28 000 в течение, соответственно, 90 - 30 мин.;
- полученный супернатант фильтруют; - фильтрат подвергают анионообменной хроматографии на колонке с анионообменным носителем и разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, первоначально имеющий ионную силу (I) не выше 0, 1 ммоль/л, повышая ее плавно или ступенчато с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракций с ионной силой элюента от 0, 125 до 0, 15 ммоль/л при рН от 5,2 до 8,5;
- полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
3. Фармацевтическая композиция, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, выполненная в виде раствора, содержащего в качестве активного инградиента биологически активный белково- полипептидный комплекс по п.1 в концентрации 0,05 - 2,0 мг/мл, полученный способом по п. 2, и полинуклеотидную фракцию в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, проявляющие комплексную с белково-полипептидной фракцией специфическую иммунорегулирующую активность в, по меньшей мере, равноценной концентрации с белково-полипептидным комплексом, и фармацевтически приемлемый разбавитель.
4. Фармацевтическая композиция по п.З, отличающаяся тем, что в качестве фармацевтически приемлемого разбавителя содержит фармакопейный буферный раствор и, возможно, вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
5. Фармацевтическая композиция по п.З, отличающаяся тем, что она содержит полинуклеотидную фракцию в виде средне- и низкомолекулярной фракции натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты - от 12 до 660 кДа (18 - 1000 пар оснований), имеющие максимальный УФ-спектр поглощения при длине волны 260±2 нм и минимальный - при 230±2 нм в области длин волн от 90 до 325 нм с отношением D260/280 от 1 ,6 до 2,0, наличием характерных специфических полос при электрофорезе в 1 ,8%-ном агарозном геле при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований и синее окрашивание при постановке качественной реакции на рибозу, а также примесью белка, при определении его концентрации по Лоури, не выше 0,18%,
6. Фармацевтическая композиция по п.З, отличающаяся тем, что она предназначена для применения парентерально - внутрикожно или подкожно, интраназально или апликационно на слизистые оболочки и кожу.
PCT/RU2012/000136 2011-05-30 2012-02-28 Белково-полипептидный комплекс специфического действия на нервную систему, способ его получения и фармкомпозиция на его основе WO2012166004A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12793167.3A EP2730584B1 (en) 2011-05-30 2012-02-28 Protein-polypeptide complex obtained from nervous tissue of hoofed livestock embryos, process for preparing same and pharmaceutical composition

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011121686/10A RU2485132C2 (ru) 2011-05-30 2011-05-30 Белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе
RU2011121686 2011-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012166004A1 true WO2012166004A1 (ru) 2012-12-06

Family

ID=47259597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2012/000136 WO2012166004A1 (ru) 2011-05-30 2012-02-28 Белково-полипептидный комплекс специфического действия на нервную систему, способ его получения и фармкомпозиция на его основе

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2730584B1 (ru)
RU (1) RU2485132C2 (ru)
WO (1) WO2012166004A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2577135C2 (ru) * 2014-07-01 2016-03-10 Диамондзлите Лимитед Способ лечения пациентов с онкологическими заболеваниями кожи при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный, плоскоклеточный рак (варианты)
RU2586286C2 (ru) * 2014-10-16 2016-06-10 ДИАМОНДЗЛИТЕ ЛИМИТЕД Тридент Чамберс Применение для лечения и профилактики атеросклероза белково-пептидного комплекса (далее-бпк), полученного из эмбриональной нервной ткани или из быстрозамороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных, влияющего на обратный транспорт холестерина из сосудистой стенки и профиль активации моноцитов у пациентов с выраженным атеросклерозом магистральных сосудов или с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям и способ профилактики и лечения пациентов с атеросклерозом артериальных сосудов и с заболеваниями, вызванными атеросклерозом магистральных и периферических сосудов головного мозга, сердца, сосудов нижних конечностей и аорты (два варианта)
RU2619208C2 (ru) * 2015-10-08 2017-05-12 ДИАМОНДЗЛИТЕ ЛИМИТЕД Тридент Чамберс Способ профилактического лечения при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный рак, плоскоклеточный рак

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413912A1 (fr) 1978-01-10 1979-08-03 Bontemps Raymond Medicaments a base de substances d'origine foetale et leur procede preparation
RU2104702C1 (ru) 1996-10-16 1998-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологическая композиция и ее применение
RU2128511C1 (ru) 1997-02-28 1999-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "НИР" Способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы
RU2129427C1 (ru) 1996-04-30 1999-04-27 Аникин Александр Юрьевич Способ лечения заболеваний центральной нервной системы
RU2132688C1 (ru) 1996-07-25 1999-07-10 Дмитрий Бориславович Шорох Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей
EA200000634A1 (ru) * 2000-04-28 2001-10-22 Научно-Производственное Республиканское Унитарное Предприятие "Диалек" Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
EA004788B1 (ru) 2000-12-29 2004-08-26 Научно-производственное республиканское унитарное предприятие диагностических и лекарственных препаратов "ДИАЛЕК" Способ получения биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота и фармацевтическая композиция на его основе с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью
RU2237486C1 (ru) 2003-08-07 2004-10-10 Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Агрофарм" Способ получения биологически активных липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной
UA15241U (en) 2005-12-29 2006-06-15 Kyiv Polytechnical Institute Method for production of annular parts
WO2009088314A1 (ru) 2007-12-29 2009-07-16 Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием
WO2010007620A1 (en) * 2008-07-13 2010-01-21 Delapharm Ltd. Pharmaceutical composition comprising porcine brain extract

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413912A1 (fr) 1978-01-10 1979-08-03 Bontemps Raymond Medicaments a base de substances d'origine foetale et leur procede preparation
RU2129427C1 (ru) 1996-04-30 1999-04-27 Аникин Александр Юрьевич Способ лечения заболеваний центральной нервной системы
RU2132688C1 (ru) 1996-07-25 1999-07-10 Дмитрий Бориславович Шорох Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей
RU2104702C1 (ru) 1996-10-16 1998-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологическая композиция и ее применение
RU2128511C1 (ru) 1997-02-28 1999-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "НИР" Способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы
EA200000634A1 (ru) * 2000-04-28 2001-10-22 Научно-Производственное Республиканское Унитарное Предприятие "Диалек" Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
EA003301B1 (ru) 2000-04-28 2003-04-24 Научно-Производственное Республиканское Унитарное Предприятие "Диалек" Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
EA004788B1 (ru) 2000-12-29 2004-08-26 Научно-производственное республиканское унитарное предприятие диагностических и лекарственных препаратов "ДИАЛЕК" Способ получения биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота и фармацевтическая композиция на его основе с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью
RU2237486C1 (ru) 2003-08-07 2004-10-10 Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Агрофарм" Способ получения биологически активных липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной
UA15241U (en) 2005-12-29 2006-06-15 Kyiv Polytechnical Institute Method for production of annular parts
WO2009088314A1 (ru) 2007-12-29 2009-07-16 Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием
WO2010007620A1 (en) * 2008-07-13 2010-01-21 Delapharm Ltd. Pharmaceutical composition comprising porcine brain extract

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A Program for Care and Management of Laboratory Animals of the Nursery for laboratory animals", November 2005, INSTITUTE OF BIOORGANIC CHEMISTRY OF THE RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES
"Drug Reference Book", 2010, ASTRAPHARMSERVICE, article "Vidal", pages: B-506
"Recommended Practice", 2001, article "Micronucleus Test of Environmental Factors Mutagenic Activity in Various Organs of Mammals"
"Technomedservis", ZAO PHARMACEUTICAL COMPANY
EBEWE: "Drug Reference Book", 2007, article "Vidal", pages: B-1195
I.SILKINA; T.GANSHINA; S.SEREDININ; R.MIRZOYAN: "Increase of Ischemic Brain Blood Supply under the Stimulus of Afobazole", JOURNAL ''EKSPERIMENTALNAYA I KLINICHESKAYA FARMAKOLOGIYA, vol. 67, no. 5, 2004, pages 9 - 13
R.U.KHABRIYEV.: "Guidelines for Experimental (Non-Clinical) Study of New Pharmaceutical Substances", 2005, M., OAO IZDATELSTVO MEDITSYNA, pages: 131 - 170
R.U.KHABRIYEV: "Guidelines for Experimental (Non-Clinical) Study of New Pharmaceutical Substances", 2005, OAO IZDATELSTVO MEDITSYNA, article "Instructional Guidelines for Pharmaceutical Substances Mutagenic Properties Assessment", pages: 100 - 122
SPRAVOCHNIK VIDAL.: "Lekarstvennye preparaty v Rossii. Spravochnik", IZDANIE XVI. M. ASTRAFARMSERVIS, 2010, pages 506 - 507 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2485132C2 (ru) 2013-06-20
RU2011121686A (ru) 2012-12-10
EP2730584A1 (en) 2014-05-14
EP2730584B1 (en) 2018-04-18
EP2730584A4 (en) 2014-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2589390B1 (en) Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin
RU2428196C1 (ru) Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс
RU2485133C2 (ru) Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе
RU2485132C2 (ru) Белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе
WO2009088314A1 (ru) Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием
RU2460736C1 (ru) Белково-полипептидный комплекс (бпк), обладающий тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ получения белково-полипептидного комплекса, обладающего тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, и фармацевтическая композиция на основе бпк, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом
JP2021520351A (ja) 皮膚を治療するための組成物
RU2477637C2 (ru) Способ лечения острого нарушения мозгового кровообращения ишемического и геморрагического характера
RU2275924C2 (ru) Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга и фармацевтическое средство на его основе
RU2771678C1 (ru) Биологически активная субстанция и фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субъюнктивального, пара-, ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний
WO2007020222A2 (en) Pharmaceutical composition containing as active substance a protein fraction extracted from oviparous embryos at the cell differentiation stage and preparation process thereof
US20040076618A1 (en) Placental preparation having antitumor activity
EA003301B1 (ru) Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
RU2716819C1 (ru) Белково-пептидный комплекс и средство для приготовления лекарственного препарата, представляющее собой белково-пептидный комплекс
US20230242870A1 (en) Cranial nerve disorder therapeutic agent including culture supernatant of tissue cells derived from fetal appendage
RU2302871C1 (ru) Средство, нормализующее функции головного мозга, и способ его получения
RU2128514C1 (ru) Способ получения противовоспалительного средства
RU2301072C1 (ru) Средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, и способ его получения
CN113476587A (zh) 一种脑靶向的神经保护剂ss31-ha-rt及其制备方法和应用
DE1617436A1 (de) Verfahren zur Herstellung eines Mittels fuer die Behandlung von Neoplasmen
PL173321B1 (pl) Środek biologicznie aktywny i sposób wytwarzania środka biologicznie aktywnego

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12793167

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012793167

Country of ref document: EP