EA004788B1

EA004788B1 - Способ получения биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота и фармацевтическая композиция на его основе с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью

Info

Publication number: EA004788B1
Application number: EA200100114A
Authority: EA
Inventors: Людмила Васильевна Пленина; Станислав Валентинович Хлюстов; Елена Борисовна Ковалева; Татьяна Ренольдовна Романовская; Александр Сергеевич Федулов; Людмила Александровна Мелентович
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2000-12-29
Publication date: 2004-08-26
Also published as: EA200100114A1

Abstract

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к технологии получения биологически активных препаратов, и касается способа получения отечественного препарата, выделенного из селезенки крупного рогатого скота и проявляющего иммуномоделирующее, антигипоксическое и репаративное действие. Способ включает гомогенизацию селезенки эмбрионов крупного рогатого скота, воздействие на нее экстрагирующим агентом, отделение экстракта, перед гомогенизацией сырье подвергают замораживанию и автолизу, а экстракцию охлажденного гомогената проводят путем двукратного воздействия экстрагирующим агентом, замораживания и ультрафильтрации на ультрафильтрациожных установках с последовательным применением мембран, имеющих величины предела задержания по молекулярной массе 50000 и 5000, причем в качестве экстрагирующего агента используют 0,9%-ный раствор хлорида натрия, и к полученному экстракту добавляют консервант - метиловый эфир параоксибензойной кислоты - и собирают целевой продукт. Объектом изобретения является также фармацевтическая композиция с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота, полученного в соответствии с п.1 формулы, и консервант - метиловый эфир параоксибензойной кислоты - при следующем соотношении компонентов:Полученный в соответствии с изобретением биологически активный депротеинизированный экстракт селезенки эмбрионов коров представляет собой смесь высокоактивных низкомолекулярных пептидов,

Description

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к технологии получения биологически активных препаратов, и касается способа получения отечественного препарата, выделенного из селезенки крупного рогатого скота и проявляющего иммуномодулирующее, антигипоксическое и репаративное действие.

Создание новых эффективных лекарственных средств на основе регуляторных пептидов, обладающих широким спектром биологической активности и способных восстанавливать многие нарушенные функции различных органов и систем организма, является одним из наиболее перспективных направлений современной фармакологии и медицины. В организме существует тесная связь между системами биорегуляции, реализация которых может осуществляться путем взаимодействия регуляторных пептидов, обеспечивающих поддержание гомеостаза. Поэтому уникальные свойства регуляторных пептидов как полифункциональных регуляторов открывают новые возможности их практического использования.

К числу таких лекарственных средств относятся цитомедины, представляющие собой кислотные гидролизаты некоторых тканей животных, полученные методом кислотной экстракции с последующей очисткой методом гельхроматографии. На основе ряда цитомединов и регуляторных пептидов созданы лекарственные препараты, применяемые для коррекции нарушений гомеостаза.

Сырьем для получения действующего начала указанных препаратов служит селезенка крупного рогатого скота, которую после предварительной обработки подвергают депротеинизации. Режимы технологического процесса получения указанных препаратов не описаны и являются предметом ноу-хау фирм-производителей.

Известны лекарственные препараты, отнесенные к биогенным стимуляторам, представляющие собой депротеинизированные экстракты, получаемые из селезенки крупного рогатого скота [1, 2], которые обладают свойством стимулировать репаративные процессы, нарушенные в связи с различными заболеваниями: ишемические процессы, дистрофические изменения, вызванные ионизирующим поражением тканей, применяемые для лечений, в частности, при ионизирующей терапии, при лечении токсикозов беременных и т.д.

Препараты получают из селезенки крупного рогатого скота путем экстракции экстрагирующим агентом (органическим растворителем, например этанолом или ацетоном) в соотношении 1:2, экстрагируют биологически активные вещества, после чего отделяют экстракт, удаляют из него экстрагент и фильтруют.

Недостатками этого способа являются низкий выход экстрактивных веществ, длительность процесса экстракции и применение экологически вредного растворителя.

Препараты-аналоги проявляют недостаточно выраженный терапевтический эффект.

Известен также лекарственный препарат, депротеинизированный из телячьей селезенки с низкомолекулярными пептидами и производными нуклеиновой кислоты, который обладает противовоспалительным, ранозаживляющим, оптимизирующим функциональное состояние тимуса, ингибирующим процессы перекисного окисления липидов действием [3].

Препарат получают путем гомогенизации замороженного сырья, полученного из органов эмбрионов животного, водной или кислотной экстракции, отделением балластных веществ путем центрифугирования и лиофилизации супернатанта.

Наиболее близким по технической сущности является способ [4], сырьем для получения действующего начала которого служит селезенка крупного рогатого скота, которую подвергают экстракции раствором 1,0 М фосфатного буфера с последующим центрифугированием и очисткой методом ультрафильтрации и сорбции на гельфосфате кальция. Затем сорбент обрабатывают раствором 60 мМ фосфатного буфера. Полученный фильтрат подвергают экстракции, центрифугируют и стерилизуют. Затем проводят лиофилизацию и жидкостную хроматографию.

Препарат содержит высокоактивные низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, фрагменты нуклеиновых кислот и некоторые другие, биологически активные компоненты, которые в комплексе обладают антигипоксическим и репаративным действием.

В технологическом отношении способ является трудоемким, требует использования сложной аппаратурной схемы и большой длительности процесса.

Задачей настоящего изобретения является повышение специфической активности и выхода целевого продукта и получение фармацевтической композиции на его основе с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью.

Поставленная задача решается тем, что для получения биологически активного препарата из селезенки крупного рогатого скота в качестве сырья используют предварительно обработанную селезенку эмбрионов коров, которую гомогенизируют, гомогенат подвергают двукратной экстракции 0,9% раствором хлорида натрия и замораживанию. Затем проводят отделение белковой фракции путем ультрафильтрации с последовательным применением мембран, имеющих величины предела задержания по молекулярной массе 50000 и 5000, и к полученному диализату добавляют консервант - метиловый эфир параоксибензойной кислоты.

Полученный в соответствии с изобретением биологически активный депротеинизирован3 ный экстракт селезенки эмбрионов коров представляет собой смесь высокоактивных низкомолекулярных пептидов, аминокислот, производных нуклеиновых кислот и других компонентов.

По внешнему виду целевой продукт представляет собой прозрачную жидкость светложелтого цвета со специфическим запахом. Подлинность определяют полярографическим методом и методом тонкослойной хроматографии.

Сравнение предлагаемого способа с известными показывает, что общими существенными признаками для них являются подготовка сырья и отделение белковой фракции ультрафильтрацией. Однако, в отличие от аналогичных способов, в заявляемом способе экстракт получают путем двукратного воздействия 0,9%ным хлоридом натрия, а ультрафильтрацию проводят, последовательно подключая модули с мембранами разной величины номинального молекулярно-массового предела задержания, что позволило получить биологически активный препарат, обладающий ценным фармакологическим спектром действия.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Проводят забор селезенки эмбрионов коров. Сырье замораживают до -(18+2)°С. Затем замороженное сырье подвергают автолизу, для чего помещают его в холодовую камеру на 72 ч при температуре 10°С. Подготовленное таким образом сырье гомогенизируют и проводят двойную экстракцию 9%-ным раствором натрия хлорида. Экстракт центрифугируют и помещают в морозильную камеру на 24 ч при температуре -(18+2)°С.

Полученный полуфабрикат размораживают при комнатной температуре и центрифугируют. Собирают надосадок и снова замораживают в морозильной камере при температуре -(18+2)°С (1-я фракция экстракта).

Полученный продукт подвергают ультрафильтрации на установках с мембранами ПС100 (Ф-9) и ПА-10 (Ф-12), соединенными с реакторами, к которым подведено охлаждение. Далее продукт подвергают ультрафильтрации, последовательно подключая модули с мембранами разной величины номинального молекулярно-массового предела задержания (ММ 50000, ММ 5000). В результате, получают биологически активный препарат из депротеинизированного экстракта селезенки - прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом.

Для приготовления лекарственной формы препарата после контроля на соответствие требованиям временной фармакопейной статьи (ВФС) к полученной активной субстанции добавляют стабилизатор (1% №С1) и консервант (0,02-0,1%). Затем полученный целевой биологически активный препарат стерильно фильтруют и разливают в ампулы по 2 мл, 5 мл или флаконы по 50 мл.

Подлинность определяют полярографическим методом, который позволяет оценить способность препарата стимулировать дыхание клеток гепатоцитов в гомогенате ткани печени.

Определение дыхательной активности гепатоцитов проводят на полярографе с помощью ячейки со встроенным электродом Кларка закрытого типа. Ускорение дыхания должно быть не менее 30% при внесении в полярографическую ячейку 100 мкл заявляемого препарата.

В ячейку вносят 1,8 мл инкубационной смеси, 100 мкл гомогената печени (20 мг сырого веса ткани), 100 мкл субстрата дыхания. В течение 90-180 с регистрируют исходную скорость потребления кислорода, затем в ячейку вносят 100 мкл препарата и регистрируют скорость потребления кислорода. Методом графического дифференцирования по изменению тангенса угла наклона полярографической кривой рассчитывают скорость поглощения кислорода за 1 мин или за любой другой отрезок времени.

Ускорение дыхания препарата У(О₂) рассчитывают по формуле ά (О₂)

У(О₂) =---------- 100 ά

где б(О₂) - длина отрезка (потребление кислорода) на полярографической кривой после внесения в ячейку препарата, см;

б - длина отрезка (потребление кислорода) на полярографической кривой до внесения в ячейку препарата, см.

Вторым методом определения подлинности выделенного продукта является метод тонкослойной хроматографии, основанный на разной подвижности низкомолекулярных компонентов, входящих в состав препарата.

Фармакологическое действие препаратов на основе депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров основано на способности улучшать аэробный энергообмен клетки. Препарат повышает поглощение и утилизацию кислорода, а также транспорт и утилизацию глюкозы, увеличивает резервы АТФ, активизирует естественные процессы ранозаживления и регенерации. Полученный препарат обладает также антигипоксической и иммуномодулирующей активностью.

Предметом изобретения является также фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество биологически активного препарата из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов крупного рогатого скота, консервант и, по меньшей мере, один нетоксичный инертный фармацевтический приемлемый носитель.

Предлагаемая фармацевтическая композиция может представлять собой любую стандартную лекарственную форму, такую как, например, раствор, гель, суппозиторий, которые изготавливают с применением инертных при5 годных нетоксичных фармацевтических растворителей или носителей.

Фармацевтическая композиция может также содержать и другие активные вещества.

Получение фармацевтической композиции осуществляется известными способами, например при смешении, перемешивании, суспендировании, диспергировании, эмульгировании и тому подобных операциях биологически активного препарата с фармацевтическими приемлемыми веществами и в переработке в лекарственные формы для различных способов введения.

Пример 1. Выполнение способа получения препарата субстанции.

1. Подготовка сырья.

1.1. Забор селезенки.

Забор селезенки эмбрионов коров проводят на мясокомбинате путем вскрытия грудной и брюшной полости эмбриона. Забранные органы укладывают в полиэтиленовые мешки.

1.2. Замораживание селезенки.

Селезенку, упакованную в полиэтиленовые мешки, собирают в емкость Е-1 и замораживают в морозильной камере при температуре (-18)-(-20)°С.

1.3. Получение экстракта и автолиз селезенки.

Емкость Е-1 с замороженной селезенкой достают из морозильной камеры и оставляют в холодовой камере на 72 ч при температуре 10°С.

1.3.1. Гомогенизация селезенки.

Селезенку взвешивают на весах и гомогенизируют на мясорубке РМ-5, используя для сбора гомогената эмалированную емкость Е-4.

1.3.2. Экстракция.

1.3.2.1. Гомогенат помещают в реактор Р-5, приливают 0,9%-ный раствор натрия хлорида из расчета 2 кг раствора на 1 кг гомогената и выдерживают 20 мин при постоянном перемешивании. Затем содержимое реактора сливают в емкость Е-1 и помещают в морозильную камеру при температуре (-18)-(-20)°С на 24 ч. (Приготовление 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Натрия хлорид растворяют в очищенной воде из расчета 9 г натрия хлорида на 1 л очищенной воды.)

1.3.2.2. Центрифугирование.

Полуфабрикат (1.3.1.) размораживают при комнатной температуре и центрифугируют на стаканчатой центрифуге Ф-6 при скорости 3000 об./мин. Надосадок собирают в емкости Е-1 и замораживают в морозильной камере при температуре (-18)-(-20)°С (I фракция экстракта).

1.3.3. II стадия экстракции.

Осадок после центрифугирования (1.3.2.2) помещают в реактор Р-5, приливают 0,9%-ный раствор натрия хлорида из расчета 1,5 кг раствора на 1 кг исходного гомогената и выдерживают при постоянном перемешивании 20 мин. Затем содержимое реактора сливают в емкость

Е-1 и помещают в морозильную камеру при температуре (-18)-(-20)°С на 24 ч.

1.3.4. Центрифугирование.

Полуфабрикат (1.3.3.) размораживают при комнатной температуре и центрифугируют на стаканчатой центрифуге Ф-6 при скорости 3000 об./мин. Надосадок собирают в емкости Е-1 и замораживают в морозильной камере при температуре (-18)-(-20)°С (II фракция экстракта). Осадок отбрасывают.

2. Получение ультрафильтрата.

Ультрафильтрацию проводят на установках с мембранами ПС-50 (Ф-7) и ПА-5 (Ф-10), соединенными с реакторами (Сб-7, Сб-10), к которым подведено охлаждение. Ультрафильтрацию проводят на мембранном модуле. В сборник Сб-7 заливают 50 л дистиллированной воды и добавляют 250 г натрия гидрооксида. Растворяют при перемешивании. Включают установку для обработки мембран на 15 мин. Сливают щелочной раствор в приемник отходов.

I и II фракции экстракта селезенки размораживают при комнатной температуре и заливают в чистый сухой сборник емкостью 100 л перистальтическим насосом. Включают охлаждение. Температура экстракта должна быть 510°С. Ультрафильтрат собирают в сборник с охлаждением.

Далее проводят ультрафильтрацию экстракта на волоконном аппарате марки УВА-2-5ПА с полыми волокнами типа ВПУ-50-ПА. Для этого в сборник заливают 50 л очищенной воды и добавляют 250 г натрия гидроксида. Растворяют при перемешивании. Включают аппарат на 15 мин для обработки волокон, затем сливают щелочной раствор. Промывают сборник 15 мин очищенной водой.

Загружают полученный после фильтрации на установке с мембранами ПС-50 полуфабрикат, включают охлаждение. Температура полуфабриката не должна превышать +5-10°С. Ультрафильтрацию ведут 2,5 ч. Скорость ультрафильтрации - 10 л/ч. Ультрафильтрат собирают и передают на стадию стерилизации, розлива или замораживания при температуре (-18)(-20)°С. Вносят в продукт в качестве стабилизатора натрия хлорид в конечной концентрации 1%. Навеску натрия хлорида, рассчитанную на полученный объем, растворяют в полупродукте при перемешивании.

Затем добавляют метиловый эфир поксибензойной кислоты. Навеску, рассчитанную на полученный объем, растворяют в минимальном количестве (35-50 мл) спирта ректификата. Значение рН должна быть 6,0-7,0.

Проводят полный контроль физикохимических параметров полуфабриката, контроль на токсичность и апирогенность. Все показатели должны соответствовать величинам, установленным в ВФС 426. Проводят осветляющую фильтрацию.

Ί

В результате, получали биологически активный препарат из депротеинизированного экстракта селезенки. Выход активной субстанции - 60-65%.

После контроля на соответствие требованиям временной фармакопейной статьи к полученной субстанции добавляли стабилизатор (1% №1С1) и консервант (0,02-0,1%).

Состав на 100 мл:

Натрия хлорида (ФС 42-2572- 1 г

88)

Эфира метилового поксибензой-ной кислоты (ФС 0,07 г

42-1460-80)

Препарат-субстанция (ВФС До 100 мл

42РБ)

Препарат фильтруют через стерилизующий фильтр и разливают в ампулы из нейтрального стекла по ОСТ 64-2-485-8П5 тип ШП, марка НС-1, или в бутылки стеклянные для крови, кровезаменителей и инфузионных препаратов по ГОСТ 10782-85, или во флаконы ФО-1-10-НС-1 по ТУ 64-2-10-87. Полученный препарат - прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом. Содержит высокоактивные низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, фрагменты нуклеиновых кислот и другие компоненты.

Исследования фармакологического действия препарата показали, что препарат обладает репаративными свойствами, усиливая клеточное дыхание и снижая последствия гипоксии.

Препарат для инъекций представляет собой депротеинизированный экстракт селезенки эмбрионов коров.

Состав.

В 100 мл препарата содержится:

Натрия хлорида 0,5-1 г

Метилового эфира поксибензой-ной кислоты 0,02-0,1 г

Биологически активного препарата из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров До 100 мл

При получении препарата для инъекций в препарат-субстанцию добавляют вспомогательные ингредиенты в соответствии с требованиями ВФС, доводят рН до нормы, заложенной в ВФС, и производят стерильный розлив в ампулы по 2 мл, 5 мл или флаконы по 50 мл.

Описание. Прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом.

Гель.

Состав.

В 100 г препарата содержится, г: Биологически активный препарат из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров 0,4

Очищенная натрийкарбоксиметилцеллюлоза 100%4,5

Глицерин18

Метиловый эфир п-оксибензойной кислоты0,2

Спирт этиловый 4 мл

Вода для инъекций До 100

Описание.

Гель представляет собой однородную массу желтоватого цвета со специфическим запахом.

Суппозиторий 1.

1. Состав.

100 г препарата содержат:

Биологически активного препарата из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров (по сухому весу)2,5 г

Масло какао30 г

Кулинарный жир 52,5 г

Парафин нефтяной15 г

2. Состав.

Биологически активного препарата из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров (по сухому весу) 2,5 г

Желатин медицинский12 г

Глицерин60 г

Вода До 100г

Описание: суппозиторий имеет цилиндрическую форму с заостренным концом с максимальным диаметром 1,5 см, желтоватого цвета со специфическим запахом.

Технология получения препаратов основана на использовании отечественного сырья, реактивов, оборудования.

Все реактивы допущены Государственной Фармакопеей СССР к производству препаратов медицинского назначения.

Подлинность.

В качестве теста на подлинность рекомендован метод спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра. Ультрафиолетовый спектр препарата должен иметь минимум поглощения при 230±5 нм и максимум при 260±5 нм, что свидетельствует о наличии нуклеотидов. Для снятия спектра препарат разводят водой, очищенной в 100 раз. В качестве контроля используется вода очищенная.

В качестве второго теста на подлинность рекомендован метод тонкослойной хроматографии, основанный на разной подвижности низкомолекулярных компонентов, входящих в состав диасплена. В препарате на хроматографических пластинках после окраски кадмийнингидриновым реактивом выявляется 4 основных пятна, имеющих соответственно Кд=0,075±0,015, В(2=0,190±0,040,

К.£₃=0,370±0,050, В_и=0,490±0,050.

В качестве третьего теста на подлинность предложен полярографический метод, основанный на электрохимической реакции восстановления растворенного кислорода до перекиси водорода и воды:

О₂+2е+2Н⁺ Н₂О₂

О₂+4е+4Н⁺ 2Н₂О

Таким образом, полярограф регистрирует величину тока, которая имеет линейную зави9 симость от концентрации кислорода в ячейке. Уменьшение концентрации кислорода, вызванное добавкой через гидравлическую пробку ячейки 100 мкл суспензии гепатоцитов, сопровождается уменьшением тока, которое регистрируется в виде полярографической кривой. По изменению тангенса угла наклона этой кривой рассчитывается скорость поглощения кислорода за 1 мин или за любой другой отрезок времени. При дополнительном введении в ячейку биологически активного препарата из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров наблюдаемое изменение тангенса наклона отражает стимулирующую активность препарата.

В соответствии с изобретением приводятся также примеры фармацевтической композиции в виде различных лекарственных форм, полученных известными способами.

Пример 2.

Изучение антигипоксической активности препарата проведено на культуре нервной ткани. Для этого культуру астроцитов подвергали 20-часовому гипоксическому воздействию (95% Ν₂ и 5% СО₂) с помощью смесителя-дозатора газов.

Цитоморфометрические измерения проводили с использованием устройства компьютерного анализа изображения «ΒΙΟ80ΑΝ ΌΧ» методом контурных измерений.

Известно, что проникновение фармакологических препаратов через клеточные мембраны зависит от особенностей их строения и физикохимических свойств, а также, естественно, от структуры и физико-химических свойств самого препарата.

Поскольку активация свободнорадикального перекисного окисления липидов, которая сопровождает гипоксию тканей, является мощным модулятором проницаемости биологических мембран, была проведена оценка модифицирующего действия препарата на проницаемость клеточных мембран.

В качестве косвенного критерия состояния проницаемости клеточных мембран культуры астроцитов оценивали площадь клеток в монослое, то есть степень выраженности интрацеллюлярного отека.

На окрашенных препаратах первичной культуры мозга новорожденной крысы проведено морфометрическое исследование (оценивали размеры ядра и цитоплазмы астроцитов) защитного эффекта препарата при 20-часовой гипоксии. Препарат вносили в дозе 20 мкг/мл ростовой среды.

Исследования показали, что предварительное внесение в среду культивирования препарата способствует предотвращению гипоксического повреждения астроцитов. Это проявлялось в том, что показатели распределения клеток по площадям приближались к таковым в контроле. Так, количество отечных клеток при добавлении препарата уменьшилось на 10-15% по отношению к размерам клеток при гипоксии.

Таким образом, препарат обладал протективным действием в культуре астроцитов мозга новорожденной крысы при 20-часовой гипоксии.

Пример 3.

Щитовидная железа в силу специфики регуляции энергетического и кислородного обмена в условиях гипоксического состояния представляет особый интерес.

Известный факт первоначального усиления основного обмена при гипоксии связывают с функцией щитовидной железы.

Функциональное состояние щитовидной железы половозрелых крыс-самцов массой 250360 г, подвергнутых острой гипоксии (гипоксическую гипоксию создавали, поднимая крыс в барокамере с приточно-вытяжной вентиляцией и подогревом на «высоту» 8000 м и выдерживали на этой «площадке» в течение 1 ч с последующей 2-часовой реоксигенацией), оценивали с помощью РИА-наборов по содержанию трийодтиронина (Т-3) и тироксина (Т-4) в сыворотке крови. Группе животных за 1 ч до помещения их в барокамеру внутрибрюшинно вводили препарат в дозе 30 мг/кг. Контролем служили крысы аналогичной массы с введением такого же объема физиологического раствора. Интенсивность излучения проб замеряли на гаммасчетчике «ТРАКОВ» («Апа1уйс», США). Всего использовано 30 крыс, из которых 6 погибло в барокамере.

Как видно из табл. 1, эффект препарата отмечен как у интактных животных, так и у подвергнутых гипоксии при сравнении с контрольными крысами и проявляется в снижении в сыворотке крови концентрации трийодтиронина и повышении тиротоксина. Сама гипоксия вызывает подобный эффект.

Таблица 1

Показатели	Контроль	Интактные и введение препарата	Гипоксия и введение физиологии. раствора	Гипоксия и введение препарата
Трийодтиронин	0,7227 п=6	0,5990 п=6 60%	0,4339 п=6 82%	0,3635 п=6 50%
Тироксин	13,7543 п=5	31,996 п=6 142%	19,5389 п=6 232%	46,0911 п=8 335%

Полученные результаты указывают на центральные механизмы нарушений гуморальной регуляции, и в частности функции гипоталамус-гипофиз-щитовидная железа, и возможность их фармакологической коррекции при введении препарата.

Пример 4. Влияние гипоксии на обмен порфиринов в структурах головного мозга крыс и эффекты препарата.

Проведен флуоресцентный анализ содержания эндогенных порфиринов в коре левого полушария головного мозга, гипоталамусе и тимусе крыс в норме, при гипоксическом стрессе и введении животным препарата (30 мг/кг).

Уровень уро- (УП), копро - (КП) и протопорфирина (ПП) определяли по интенсивности флуоресценции солянокислых экстрактов из гомогената ткани головного мозга крыс на спектрофлуориметре «Ινοη 1оЬш» (Франция).

Установлено, что наиболее высокая концентрация ПП имеет место в коре мозга, в 3,8 раза меньше в ней содержится КП и в 13,0 раз УП. Выдерживание животных в условиях гипоксии в течение 2 ч не вызывает изменения суммарного содержания клеточных пигментов (табл. 2), однако, ведет к достоверному уменьшению отношения содержания КП и УП и увеличению отношения содержания ПП и КП, что очевидно связано с ингибированием активности кислородзависимых ферментов копропорфириногеназы и протопорфириногеноксидазы, а второе - компенсаторной активацией образования протопорфириногена из копропорфириногена.

Введение крысам перед помещением их в гипоксическую камеру препарата восстанавливает отношения отдельных видов порфиринов. В то же время у контрольных животных препарат вызывает выраженное снижение уровня ПП и КП в коре мозга и исчезновение УП, что свидетельствует об увеличении эффективности использования свободных порфиринов под действием этого препарата.

Содержание и в отношении клеточных пигментов в гипоталамусе существенно отличается от значений, характерных для коры мозга. В гипоталамусе УП не определяется, а содержание ПП и КП в 3 раза больше, чем в коре больших полушарий мозга.

При гипоксии наблюдается выраженное снижение обоих типов порфиринов. Биологически активный препарат из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров вызывает значительное накопление свободных ПП и КП как в гипоталамусе контрольных, так и гипоксических крыс.

Таблица 2

	ПП	КП	УП
Контроль	19,53±2,36	5,19±0,51	1,49±0,28
Гипоксия	20,48±0,23	4,87±0,20	1,89±0,17
Гипоксия+препарат	23,39±5,65	6,19±1,28	1,70±0,65
Контроль+препарат	12,45±0,66	3,89±0,22	-

В ткани тимуса содержание 43,4±5,0 нмоль/г ткани ПП, 7,9±1,2 нмоль/г ткани КП и 2,0±0,8 нмоль/г ткани УП.

Влияние гипоксии на тимоциты проявляется в снижении уровня УП до следовых количеств и изменении отношения содержания ПП к КП.

Введение животным до гипоксического стресса препарата восстанавливает данный параметр до значений нормы. У контрольных животных препарат не вызывает достоверных изменений.

Пример 4. Влияние препарата на миелопероксидазную активность нейтрофилов.

Нейтрофилы выделяли из крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколлверографина. МПО-активность изучали методом хемилюминесценции (ХЛ) в системе «люминол (1,25-10⁵ моль/л) - перекись водорода (2-10⁵ моль/л)». Перед определением активности фермента клетки инкубировали с исследуемым препаратом (100 мкл раствора препарата + 2 мл суспензии клеток (1,6-10⁶ клеток/мл)) в течение часа при комнатной температуре. Затем клетки отмывали в среде Эрла и разрушали при помощи 4-кратного замораживания-размораживания от -18 до +50°С.

Полученные данные показывают, что препарат значительно снижает МПО-активность по сравнению с контролем и значительно усиливает функциональную активность клеток путем действия не редокс-системы плазматических мембран.

Пример 5.

Для оценки иммуномодулирующей активности препарата, полученного предлагаемым способом, выполнены экспериментальные исследования по изучению возможностей радиозащитного действия препарата на организм лабораторных животных (белых беспородных крыс).

В исследованиях использовано 160 белых беспородных крыс - самок, весом 150-170 г, разводки питомника «Рапполово». Острая лучевая болезнь у животных создавалась путем однократного тотального равномерного облучения на ЛУЭ-25 (20 МзВ). Учитывая, что между величиной поглощенной дозы жизненно важными органами или системами и средней продолжительностью жизни существует строгая зависимость, животные были облучены в дозах, вызывающих костно-мозговую гибель (В Гр) или необратимое поражение желудочно-кишечного тракта.

Эксперименты выполнены в двух сериях опытов по 4 группы в каждой. Число животных в каждой группе - 20.

Препарат вводился внутрибрюшинно, по 0,5 мл/100 г массы крысы при следующих временных интервалах:

серия (8 Гр) гр. - только облучение (контроль);

гр. - препарат в течение 5 дней + 8 Гр;

гр. - 8 Гр + препарат ежедневно, до дня гибели животного;

гр. - препарат в течение 5 дней +8 Гр + препарат до дня гибели животного.

2серия (10 Гр) гр. - только облучение (контроль);

гр. - препарат в течение 5 дней +10 Гр;

гр. - 10 Гр + препарат ежедневно, до дня гибели животного;

гр. - препарат в течение 5 дней +10 Гр + препарат до дня гибели животного.

Критерий оценки: средняя продолжительность жизни павших животных и процент излеченности.

Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

1 гр. контроль	2 гр. препарат + 8 Гр	3 гр. 8 Гр + препарат	4 гр. препарат +8 Гр+препарат
Продолжительность жизни после облучения, сутки
3	6	4	8
8	8	5	9
8	9	7	10
8	9	9	10
9	10	9	11
9	10	9	11
9	10	10	11
10	11	10	12
10	11	10	13
10	12	11	14
10	12	11	14
11	13	12	17
11	17	13	19
11	18	17	21
11	23	20	25
14	26	29	29
14	29	32	32
N=20	п=17	п=17	п=17
СПЖ павших животных после облучения
11,05+0,88	13,76+1,6	12,82+1,86	15,64+1,74*
Излеченность
-	3 (15%)	3 (15%)	3 (15%)

* р<0,05 по сравнению с контролем

Анализ полученных данных показывает, что препарат обладает определенным радиопротекторным действием, наиболее выраженным при введении его животным до и после облучения (4 гр.) с одновременным ослаблением непосредственных проявлений острого радиационного поражения организма.

Пример 6.

Репаративная активность препарата исследовалась при клинических испытаниях по оценке ранозаживляющего действия препарата.

Оценка эффективности ранозаживляющего действия препарата проведена у больных с гнойно-некротическими заболеваниями и восстановительными операциями челюстнолицевой области и шеи. Она решалась путем клинического наблюдения за больными с учетом общей динамики патологического процесса, оценки данных цитологических исследований и данных реофациограмм.

В процессе исследований решались следующие задачи:

изучить ранозаживляющий эффект гнойно-некротических ран при использовании препарата-геля в фазе регенерации и провести сравнительный анализ ранозаживляющего эффекта гнойных ран с использованием препаратагеля в сравнении с традиционными методами лечения;

изучить динамику цитограмм у больных с гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области и шеи при использовании препарата-геля;

изучить динамику реофациограмм у больных с острыми гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области и шеи при использовании препарата в виде инъекций;

изучить лечебную эффективность препарата у больных с восстановительными операциями челюстно-лицевой области, для пластики которых использовался метод механической дермообразии, провести сравнительный анализ ранозаживляющего эффекта у пациентов с келоидными рубцами при использовании препаратагеля в сравнении с традиционными методами лечения.

Объектом исследования являлись 63 пациента с гнойно-некротическими заболеваниями и восстановительными операциями челюстнолицевой области и шеи.

1.1. Цитологически исследовались мазки из ран 16 больных с гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области в динамике до применения препарата на 3, 5, 7 сутки после применения препарата-геля.

Для цитологического исследования материал забирался с поверхности раны. Предварительно с поверхности раны удаляли некротический слой или лекарственные примеси, причем при повторных исследованиях забор материала осуществляли с этих же участков раневой поверхности хирургической ложкой, помещали на стекло тонким слоем, последовательно делали 2-3 мазка, высушивали на воздухе и затем проводилась окраска препаратов по Паппенгейму.

1.2. С целью изучения состояния сосудов, участвующих в кровоснабжении патологического очага в челюстно-лицевой области, был применен метод реофациографии (Н.Б. Ласкова, 1973; Г.И. Эния, 1973). В качестве измерительного и регистрирующего устройства использовался реоплетизмограф РПГ-2-02 с синхронной регистрацией ЭКГ на аппарате НЭК-3 (ГДР).

Запись реофациограмм проводили по тетраполярной методике, используя электроды из алюминиевой фольги размером 0,3х3,5 см. Расстояние между измерительными электродами составляло 1,5 см, между токовыми и измерительными электродами - 0,5 см. Кожу предварительно обрабатывали 96°-ным спиртом. На рабочую поверхность электрода наносили электропроводную пасту. Запись реофациограмм проводили с учетом расположения магистральных сосудов, участвующих в кровоснабжении патологического очага. Регистрация реограмм у больных проводилась в одних и тех же условиях в положении лежа. При повторных исследованиях соблюдались межэлектродные расстояния.

При оценке реофациограмм из количественных характеристик определяли реографический систолический индекс (РИ, относительные единицы), амплитудно-частотный показатель (АЧП, 1/с), показатель тонуса сосудов (ПТС, %), индекс периферического сопротивления (ИПС,

%). Контролем служили реофациограммы на симметричном участке лица.

Расшифровку реограмм проводили по методике А. А. Прохончукова с соавт. (1980), оценивая показатели разности исследуемых величин по И.А. Ойвину (1960) и П.Ф. Рокитскому (1978). Исследование кровотока проводили в динамике до применения биологически активного препарата из депротеинизированного экстракта селезенки эмбрионов коров и после курсового лечения препаратом. У больных с острыми воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области первичная запись реофациограмм проводилась дважды: сразу после вскрытия гнойного очага и после курсового лечения препаратом.

По показаниям проводилось рентгенографическое исследование челюстей в динамике.

1.3. Анализ результатов комплексного клинического обследования 63 пациентов с острыми гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области и шеи, больные с восстановительными операциями челюстнолицевой области. Все пациенты были условно разделены на 2 клинические группы.

Первую клиническую группу составили 57 пациентов с острыми гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области и шеи, в том числе 35 - с острыми или хроническими в стадии обострения одонтогенными или травматическими остеомиелитами, осложненными флегмонами различной локализации; 2 - с хроническими остеорадионекрозами нижней челюсти; 1 - с хроническим рарифицирующим остеомиелитом нижней челюсти; 15 - с абсцессами и флегмонами мягких тканей челюстнолицевой области различной локализации; 2 - с нагноившимися ранами челюстно-лицевой области (в том числе с одной огнестрельной); 2 - с гнойничковыми заболеваниями кожи лица (с пиодермией лица - 1; с фурункулезом - 1).

Вторую клиническую группу составили 6 пациентов с восстановительными операциями челюстно-лицевой области и шеи (келоидными рубцами различной этиологии), которым гель препарата был применен в виде аппликаций под повязки после хирургической дермообразии (3 пациентам из этого числа применен сочетанный метод лечения частичного иссечения рубцовой ткани и механической дермообразии).

1.4. Препарат назначали пациентам внутривенно, внутримышечно и местно (в виде 20%ного геля).

Курсовая доза препарата внутривенно в среднем составила 2800 мг препарата. Препарат внутривенно назначали наиболее тяжелым по общему статусу пациентам, находящимся на лечении в отделении челюстно-лицевой хирургии.

Местно 20%-ный препарат-гель больным с острыми гнойно-некротическими процессами челюстно-лицевой области применяли после очищения гнойных ран в среднем с 3-4 суток после хирургической обработки гнойных очагов.

После туалета ран растворами антисептиков гель вводили в рану на марлевых дренажах или наносили на рану тонким слоем. Количество геля на одну перевязку определялось размерами, площадью и глубиной раны. Перевязки проводились ежедневно со сменой дренажей, пропитанных гелем, с предварительной обработкой ран растворами антисептиков. Число перевязок у каждого пациента колебалось индивидуально от 2-3 дней до 10 и более в зависимости от тяжести и обширности поражения.

Из 57 больных первой группы препарат был применен 27 пациентам внутривенно или внутримышечно; 30 пациентам местно в рану на дренажах, пропитанных 20%-ным гелем; 6 пациентам второй клинической группы на раневую поверхность в виде аппликаций под повязки.

2.1. Оценка эффективности применения препарата у больных с гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области и шеи.

Внутримышечные инъекции препарата получили 16 пациентов 1 клинической группы с гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области в комплексе с традиционными методами лечения. Препарат назначали внутримышечно 2 раза в день в течение 10 суток по 5,0 или 10,0 мл ежедневно, не позднее 2 суток со дня госпитализации. По нозологическим формам пациенты были распределены следующим образом: с острыми или хроническими в стадии обострения процесса одонтогенными или травматическими остеомиелитами, осложненными флегмонами мягких тканей, - 11; с остеорадионекрозом нижней челюсти - 1; хроническим рарифицирующим остеомиелитом Гарре - 1; гнойничковыми заболеваниями кожи лица - 2 (пиодермией лица - 1; фурункулезом - 1); острыми гнойным одонтогенным синуситом - 1. Контролем служила группа пациентов с традиционными методами лечения.

Реографические исследования проведены у 10 пациентов, получавших препарат только внутримышечно с острыми или хроническими в стадии обострения процесса одонтогенными или травматическими остеомиелитами челюстей, осложненными флегмонами мягких тканей.

При анализе данных реограмм в динамике до введения препарата выявлено снижение реографического индекса РИ на больной стороне по отношению к здоровой (0,508 ± 0,111 на здоровой и 0,170 ± 0,041 на больной), разница показателей индивидуальных различий на здоровой стороне по отношению к больной была достоверна р<0,05. Отмечалась так же достоверная разница показателей индивидуальных различий АЧП на здоровой стороне по отношение к больной р<0,005. Периферический тонус сосудов на больной стороне был высокий (23,1 ± 5,1%), но достоверных различий показателей по отношению к здоровой стороне не было (р>0,2). Индекс периферического сопротивления ИПС был высокий на больной стороне и составил 106,44 ± 6,1%.

После проведенного курса лечения спустя 10 суток наблюдалась нормализация показателей реографического индекса на больной стороне и приближение его к показателям РИ здоровой стороны (0,284 ± 0,049 на больной и 0,320 ± 0,126 на здоровой, р>0,2), но все же он оставался на довольно низком уровне, что говорит о наличии остаточных воспалительных изменений в зоне патологического очага. Положительная динамика отмечена во всех показателях реофациограмм. Средняя величина индивидуальных различий ПТС и ИПС после применения курса препарата уже к 10 суткам была не достоверна (см. табл. 3).

Все пациенты хорошо переносили препарат. Побочных явлений и аллергических реакций не отмечалось. Субъективно пациенты отмечали улучшение общего состояния, снижение температуры тела через 2-3 дня после начала лечения, наблюдалась нормализация показателей морфограмм крови уже к 5-6 суткам болезни. К 5 суткам лечения значительно уменьшалось гноетечение из ран.

Положительные результаты лечения отмечены у 9 из 11 пациентов с острыми и хроническими остеомиелитами челюстей в стадии обострения процесса. Наиболее эффективным оказалось внутримышечное введение препарата по 10,0 мл 2 раза в сутки. При анализе рентгенограмм в динамике у этой группы больных по сравнению с группой пациентов, получавших традиционные методы лечения, быстрее купировался процесс в костной ткани, что позволило сократить сроки реабилитации у этой группы пациентов.

У пациентов с пиодермией лица и фурункулезом кожи лицо очистилось от гнойничковых высыпаний, и после завершения курса лечения они были выписаны домой с выздоровлением. У пациента острым гнойным одонтогенным синуситом после назначения препарата гноетечение из пазухи прекратилось, и в дальнейшем ему была проведена операция в плановом порядке.

Таким образом, применение препарата в форме внутримышечных инъекций дало положительные результаты у пациентов с острыми и хроническими в стадии обострения процесса остеомиелитами челюстей при назначении препарата по 10,0 мл внутримышечно 2 раза в день. Препарат оказался также достаточно эффективен при лечении гнойничковых заболеваний кожи лица.

Внутривенно препарат получали 11 пациентов первой клинической группы в комплексе с традиционными методами лечения по 50,0 мл на 200,0 мл физиологического раствора. Внутривенно препарат назначали наиболее тяжелым по общему статусу пациентам. По нозологическим формам больные были распределены следующим образом: 8 пациентов с острыми или хроническими остеомиелитами челюстей в стадии обострения процесса, осложненные флегмонами мягких тканей; 1 - с хроническим остеорадионекрозом нижней челюсти; 2 - с разлитыми аденофлегмонами челюстно-лицевой области. Все пациенты хорошо переносили введение препарата. Побочных явлений и аллергических реакций не отмечалось.

Таким образом, назначение препарата пациентам позволило купировать процесс в костной ткани без перехода в хроническую стадию.

У пациента с хроническим остеорадионекрозом нижней челюсти под действием лечения наблюдалась нормализация общего состояния, снижение уровня болей, значительно уменьшилось гноетечение из свищевых ходов.

пациентки с тяжелыми аденофлегмонами челюстно-лицевой области выписаны на амбулаторное лечение в удовлетворительном состоянии.

пациентам первой клинической группы препарат применяли только местно в виде 20%ного геля в гнойные раны в комплексе с традиционными методами лечения. Препарат-гель у всех пациентов этой группы применяли после очищения ран от некротических тканей и уменьшения раневого отделяемого, в зависимости от тяжести процесса, с 3-6 суток после хирургической обработки гнойного очага, то есть к моменту перехода раневого процесса в фазу регенерации.

Местно в раны препарат-гель был применен 14 пациентам с острыми или хроническими одонтогенными или травматическими остеомиелитами челюстей в стадии обострения процесса, 13 пациентам с абсцессами и флегмонами мягких тканей челюстно-лицевой области различной локализации, 2 - с нагноившимися ранами лица (в том числе одному с огнестрельной раной).

У 12 из 14 пациентов с острыми или хроническими в стадии обострения процесса остеомиелитами челюстей, осложненными флегмонами челюстно-лицевой области, в процессе лечения дренажи из препарата заменены на другие виды дренажей в связи с появлением гнойного экссудата из ран. Появление гноя в ране, по-видимому, связано с незавершенным процессом воспаления в костной ткани челюстей. Применение дренажей с препаратом в этих наблюдениях было назначено несвоевременно.

У 13 больных с флегмонами и абсцессами мягких тканей лица сразу после хирургической обработки гнойных очагов для дренирования ран использовались дренажи с гипертоническими растворами или дренажными устройствами алюмаг 2, препарат-гель для дренирования ран применяли в среднем с 3 суток заболевания. Применение препарата-геля для лечения гнойных ран откладывалось в случаях обильного гнойного отделяемого. При анализе средней продолжительности пребывания пациентов в стационаре койкодень с вышеуказанной патологией составил 13,6 дня. Отмечалось некоторое снижение койкодня по сравнению с больными, леченными традиционными методами лечения, что, по-видимому, связано с преимущественным применением препарата у наиболее тяжелых больных с распространенностью гнойного процесса, захватывающего более одной анатомической области.

Через 2-3 дня лечения препаратом-гелем, а при обширных поражениях через 5-6 дней, у большинства пациентов купировались признаки перифокального воспаления. В среднем клинически на 5 день после лечения гнойных ран с использованием дренажей, пропитанных гелем, в области их дна и с краев раны появлялась грануляционная ткань. В тех случаях, когда после купирования воспаления на рану не накладывали вторичные швы, препарат-гель применяли до эпителизации гнойных ран. Применение препарата-геля позволило в более короткий срок стабилизировать раневой процесс и добиться эпителизации ран.

2.2. Результаты цитологических исследований у больных с гнойно-некротическими заболеваниями челюстно-лицевой области и шеи.

В цитограммах на серии препаратов до применения препарата-геля преобладала картина острого гнойного воспаления с выраженным преобладанием полиморфно-ядерных лейкоцитов. В большинстве полей зрения наблюдался полный клеточный распад. Почти все препараты были представлены детритом и нейтрофилами в той или другой стадии регенерации. Во всех полях зрения массивно отмечена смешанная микрофлора. На третьи сутки после применения препарата в 13 из 16 наблюдений отмечалось быстрое снижение полиморфно-ядерных лейкоцитов и значительное нарастание лимфогистиоцитарных клеток. Микрофлора чаще обнаруживалась в умеренном количестве в состоянии завершенного или незавершенного фагоцитоза. Однако в одном из наблюдений после относительного уменьшения полиморфно-ядерных лейкоцитов (1 сутки исследования) в последующих наблюдениях на 3 и 5 сутки после применения препарата местно в рану отмечалось увеличение полиморфно-ядерных лейкоцитов по отношению к предыдущим исследованиям. У другого пациента при исследовании выявлена слабоположительная динамика нарастания лимфогистиоцитарных клеток. Оба этих пациента были с острым одонтогенным остеомиелитом нижней челюсти, осложненным флегмоной мягких тканей. В обоих наблюдениях препарат был заменен на дренажи, содержащие антибио тики (мазь левомиколь). Клинически у этих пациентов отмечалось разной степени выраженности увеличение экссудата из раны, что, вероятнее всего, связано с продолжающимся воспалительным процессом в костной ткани челюсти. На 5 сутки в препаратах во всех полях зрения преобладают лимфогистиопитарные клетки и эпителиальные клетки. Количество эпителиальных клеток в разных препаратах увеличивалось, полиморфно-ядерные лейкоциты присутствовали, но обнаруживались в небольшом количестве. В препаратах местами встречались лимфогистиоцитарные клетки. Эпителий представлен в большинстве препаратов в виде пластов светлых клеток с широкой цитоплазмой.

У основной массы обследованных пациентов (в 13 из 16 наблюдений) эпителизация раны наступала к 5 суткам применения препарата, и дальнейшие цитологические исследования не проводились.

Препараты из экссудата ран больных с воспалительными заболеваниями челюстнолицевой области хорошо отражали клиническую картину течения процесса. Так, например, в первые дни после вскрытия флегмоны и в период отторжения некротических масс в цитограммах можно было обнаружить в большом количестве полиморфно-ядерные нейтрофилы в состоянии усиленного некробиоза и скопления микроорганизмов. К 3 суткам намечалась тенденция роста лимфогистиоцитарных клеток и значительное сокращение микрофлоры в раневом экссудате, появление в препаратах фибробластов, макрофагов, полибластов, увеличение их числа при одновременном сокращении числа сохранных нейтрофилов в цитограммах, что клинически соответствовало процессу очищения ран. К 5 суткам в ранах клинически появлялись сочные грануляции, а в цитограммах отмечалось появление эпителиальных клеток, что соответствовало течению второй фазы раневого процесса и являлось хорошим прогностическим признаком заживления гнойных ран.

Состояние нейтрофилов в ране хорошо демонстрировало эффективность лечебных мероприятий. Значимость лечебного эффекта препарата подтверждена наиболее быстрым появлением обратного соотношения между фагоцитами и микробными клетками: количество активных фагоцитов повышалось, в то время как флора убывала. Явления убыли полиморфноядерных лейкоцитов наблюдались уже к 3 суткам применения препарата, местно в рану одновременно, к этому времени появлялось увеличение количества лимфогистиоцитарных клеток при значительном сокращении количества микрофлоры. Клинически к этому времени раны полностью очищались от гнойного экссудата.

К 5 суткам заболевания раны были покрыты сочными грануляциями, а в цитограммах к 5 суткам в большинстве полей зрения наблюда21 лись отдельные эпителиальные клетки или пласты эпителиальных клеток.

Таким образом, по результатам цитологического исследования гнойных ран в динамике с применением препарата отмечен его положительный эффект ускорения процессов гранулирования и эпителизаций ран по сравнению с контрольными исследованиями при применении традиционных методов лечения.

2.3. Результаты применения препаратагеля у больных с восстановительными операциями.

Методика применения: после механической дермообразии алмазными фрезами поверхности келоидного рубца, до появления капиллярного кровотечения, на раневую поверхность наносился препарат-гель под повязку. У пациентов с небольшой площадью раневой поверхности после дермообразии перевязки осуществлялись ежедневно. У больных с обширными поражениями повязка снималась после полной эпителизации раневой поверхности, т.е. на 1012 сутки. В процессе наблюдения за этой группой пациентов первый слой повязки с раны не снимался, а гель дополнительно наносился на первый слой повязки.

У пациентов с разной степенью выраженности келоидных рубцов, представленных отдельными участками келоидной ткани разной формы и размеров, частично рубцовая ткань удалялась хирургическим путем с наложением отдельных узловатых швов. Эти участки тканей затем подвергались морфологическому изучению. Использовались окраски гематоксилинэозином, эозином, кислым фуксином.

Изучено 20 стекол от 3 пациентов, оперированных сочетанным методом (методом частичного хирургического иссечения рубцов и механической дермообразии).

Морфологический анализ келоидов показал, что в большинстве полей зрения прослеживаются утолщения, зернистый распад, коллагеновые волокна. Коллагеновые волокна фрагментированы, повсеместно наблюдается гиалиноз, сдавление фибробластов, они деформированы, вытянуты, отмечается пролиферация сосудов, вокруг них гистиоцитарная инфильтрация. Местами отмечено разрастание соединительной ткани, сдавление потовых желез и волосяных фолликулов, атрофия покровного эпителия. Лимфатические сосуды присутствуют в большом количестве, патологически расширены, деформированы, отмечается застой лимфы, нервные окончания врастают в сосудистую ткань.

Анализ клинического состояния келоидных рубцов после механической дермообразии показал, что в процессе наблюдения за пациентами у больных с малой площадью келоидного рубца под повязкой струп не образовывался, что способствовало более гладкому заживлению раны с образованием тонкого рубца.

Таким образом, применение препарата для местного лечения келоидных рубцов после механической дермообразии дало положительные результаты. У всех пациентов раневые поверхности, подвергшиеся дермообразии, зажили с образованием тонкого рубца.

Важным резервом улучшения результатов лечения у больных с вышеуказанной патологией является способ восстановления нарушенного гомеостаза в организме при различных патологических состояниях челюстно-лицевой области, сопровождающихся гипоксией тканей.

Нормализация окислительно-восстановительных процессов с помощью антигипоксантов может благоприятно влиять на течение как гнойно-воспалительных заболеваний, так и оказывать эффект при восстановительных операциях.

Анализ результатов клинических исследований позволил выявить особенности клинического течения указанных заболеваний при применении препарата.

Установлено, что применение препарата в комплексе с традиционной медикаментозной терапией и хирургическим лечением у больных с острыми гнойно-некротическими заболеваниями способствовало более быстрому разрешению воспалительных процессов, клинически уменьшало воспалительную инфильтрацию и отек тканей.

Отмечено, что местное применение препарата-геля стимулировало регенеративные процессы в ране: ускорило появление и рост грануляций, а также эпителизацию ран. Установлено, что через 2-3 дня местного применения препарата-геля в гнойные раны, а при обширных поражениях через 5-6 дней, у большинства пациентов купировались признаки перифокального воспаления. В среднем клинически на 5 день после лечения гнойных ран с использованием дренажей, пропитанных гелем, в области их дна и с краев раны появлялась грануляционная ткань.

Препарат-гель удобен в применении. Легко наносится на раневую поверхность и равномерно распределяется по ней. Введенный в рану на дренажах препарат-гель хорошо смешивается с раневым экссудатом и сохраняет при этом однородность. Не оказывает раздражающего влияния на ткани, не нарушает их физиологических функций.

Высокая лечебная эффективность 20%ного препарата-геля обусловлена его выраженным антигипоксическим действием при использовании его местно у больных на этапах восстановительных операций.

Местные тканевые факторы при формировании рубца оказывают не менее важное участие в формировании нормальной рубцовой ткани. Проведенные морфологические исследования подтверждают ухудшение питания тканей в зоне келоида (местную гипоксию тканей), что, в свою очередь, приводит к ухудшению метабо23 лических процессов и развитию ацидоза, тем самым существенно влияет на ряд процессов, повышающих проницаемость сосудов, снижает их тонус, стимулирует деятельность фибробластов. Назначение антигипоксанов при операции дермообразии способствует образованию гладких тонких рубцов.

Таким образом, препарат является эффективным средством сочетанной терапии различных патологических состояний челюстнолицевой области и шеи. Таким образом, клиническое изучение заявляемого препарата показало его высокую эффективность, отсутствие побочного действия, перспективность его использования как в лечебных целях, так и с целью профилактики и реабилитации многих заболеваний и патологических состояний, в комплексном лечении и в виде монотерапии.

Пример 7.

Результаты изучения острой токсичности препарата свидетельствуют о его низкой токсичности.

Для установления степени и выраженности токсического действия полученного препарата на организм животных использовали физиологические, биохимические, физико-химические, гистологические и гематологические методы исследования.

Цифровой материал, полученный в процессе экспериментов, обрабатывался статистически и сравнивался с данными, полученными у животных контрольной группы.

Изучение острой токсичности препарата проводилось на 3 видах лабораторных животных: белых аутобредных мышах массой 18-20 г (по 10 самок и самцов в каждой группе), крысах линии Вистар массой 240-260 г (по 10 самцов и 10 самок в каждой группе) и беспородных собаках массой 10-12 кг (по 6 особей в каждой группе). Препарат вводили однократно внутрибрюшинно в дозах мышам: от 20,0 до 1000 мг/кг;

крысам: от 20,0 до 320 мг/кг; собакам: от 10,0 до 200 мг/кг.

Дальнейшее повышение концентрации препарата или его объема было невозможно в связи с использованием предельно допустимых объемов вводимой жидкости.

Наблюдение за состоянием и поведением лабораторных животных проводилось в течение 2 недель после введения препарата и не выявило каких-либо отклонений в общем состоянии и поведении животных по сравнению с контрольной группой.

Все животные выжили, были подвижны, имели нормальную реакцию на тактильные, болевые и звуковые раздражители, охотно поедали корм и имели гладкий шерстяной покров.

При визуальном исследовании внутренних органов экспериментальных животных по окончании сроков наблюдения никаких изменений не отмечено.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии токсического действия диасплена на лабораторных животных при однократном внутрибрюшинном введении.

Изучение кумулятивного действия препарата было проведено на 2 видах мелких лабораторных животных - белых аутобредных мышах (массой 18-20 г) и белых крысах линии Вистар (массой 220-240 г) при ежедневном внутрибрюшинном введении препарата в течение 20 суток.

Животные были сгруппированы по полу.

Учитывая, что ЛД₅₀ обнаружить не удалось, для выявления возможных кумуллятивных эффектов препарат вводили ежедневно в следующих дозах:

для мышей : 50 мг/кг в сутки;

для крыс: 161 мг/кг в сутки.

Во время эксперимента каких-либо отклонений во внешнем виде и поведении животных отмечено не было. Все животные выжили. При визуальном морфологическом контроле внутренних органов животных после завершения эксперимента не выявлено каких-либо видимых отклонений от нормы.

В результате исследований, проведенных на мышах и крысах, индекс кумуляции препарата установить не удалось. Полученные результаты подтверждают низкую токсичность препарата и отсутствие кумулятивного действие независимо от пола животного.

Использованная литература

1. Заявка на изобретение РФ № 95110154, А 61К 35/28, опубл. 20.06.97, бюл. № 17.

2. Заявка на изобретение РФ № 95110155, А 61К 35/28, опубл. 20.06.97, бюл. № 17.

3. Патент РФ № 2116793, А 61К 35/30, опубл. 10.08.98, бюл. № 22.

4. Патент РФ № 2033796, А 61К 35/28, опубл. 30.04.95.

5. Государственная фармакопея СССР XI изд., вып. 1, 2, М., Медицина, 1987г.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота, включающий гомогенизацию селезенки эмбрионов животного, воздействие на нее экстрагирующим агентом, отделение экстракта, отличающийся тем, что селезенку эмбрионов крупного рогатого скота перед гомогенизацией подвергают замораживанию и автолизу, а экстракцию охлажденного гомогената проводят путем двукратного воздействия экстрагирующим агентом, замораживания и ультрафильтрации, причем в качестве экстрагирующего агента используют 0,9%-ный раствор хлорида натрия, и к полученному экстракту добавляют консервант - метиловый эфир параоксибензойной кислоты - и собирают целевой продукт.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ультрафильтрацию проводят на ультрафильтра25 ционных установках с последовательным применением мембран, имеющих величины предела задержания по молекулярной массе 50000 и 5000.
3. Фармацевтическая композиция с иммуномодулирующей, антигипоксической и репаративной активностью, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество биологически активного препарата из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота, полученного в соответствии с п.1 формулы, и консервант - метиловый эфир параоксибензойной кислоты - при следующем соотношении компонентов:

Метиловый эфир параоксибензойной кислоты 0,07 г

Биологически активный препарат из селезенки эмбрионов крупного рогатого скота До 100 мл