EA003301B1 - Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения лекарственного средства из тканей мозга эмбрионов животного, включающему охлаждение сырья, гомогенизацию, экстракцию высокоактивных полипептидов из гомогената, консервацию, стерилизацию и фильтрацию, стабилизацию полученного раствора полипептидов, при этом охлаждение сырья перед гомогенизацией проводят до температуры от -5 до -10°С и выдерживают в течение 24 ч при +10°С, а экстракцию гомогената проводят в два этапа, причем в качестве экстрагирующего раствора используют 9%-ный раствор сульфата калия. После фильтрации раствор полипептидов подвергают стабилизации 0,07%-ным спиртовым раствором метилового эфира п-оксибензойной кислоты при значении рН раствора 6,0-7,0. Предметом изобретения является также фармакологическая композиция с нейропротекторной активностью, содержащая активную субстанцию и стабилизатор, в которой в качестве активной субстанции композиции содержится терапевтически эффективное количество средства, полученного из тканей мозга эмбрионов животного и стабилизатор, при этом в 100 мл композиции содержится 0,07 г метилового эфира п-оксибензойной кислоты (ФС42-1460-80), до 100 мл активной субстанции, а рН композиции составляет 6,5-7,5.

Description

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных, которые могут использоваться в медицине как фармакологические средства, способные нормализовать функции головного мозга у больных, имеющих одно или более клиническое проявление нарушения функции головного мозга.

Создание новых эффективных лекарственных средств на основе эндогенных физиологически активных веществ, вырабатываемых организмом, является успешным подходом к проблеме восстановления функций мозга, утрачиваемых с возрастом или в результате болезней или травм. С этой целью в настоящее время уже разработан ряд лекарственных препаратов, разработанных на основе пептидных биорегуляторов-цитомединов, способных восстанавливать многие нарушенные функции различных клеток, органов и систем организма, в том числе и функции центральной нервной системы при различных формах неврологической и психиатрической патологии.

Поскольку указанные заболевания значительно распространены, а спектр лекарственных средств весьма ограничен, разработка новых лекарственных средств, обладающих нейропротективной активностью, и способов их получения представляет существенный интерес.

Известен способ получения препарата [1], обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функции головного мозга, заключающийся в использовании в качестве исходного сырья мозга животных. В известном способе сырье подвергают гомогенизации, после чего проводят экстракцию для извлечения растворимых в воде компонентов, для этого гомогенат обрабатывают раствором уксусной кислоты в течение 48-72 ч при рН 3,5-4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,61,2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8-4). Полученную смесь центрифугируют и осаждают биологически активные вещества ацетоном при температуре от -3 до -5°С при соотношении супернатанта и ацетона 1:(7-5). Проводят ионообменную хроматографию полученного осадка на катионите «Биокарб». В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую щелочные полипептиды, которые обладают стимулирующим (или восстанавливающим при снижении активности мозга) действием на клетки коры головного мозга.

Данный способ не позволяет извлечь кислые и нейтральные полипептиды и получить биологически активный препарат с более широким спектром действия.

Известен способ получения комплекса биологически активных полипептидов - препарат церебролизин, нормализующий функции головного мозга путем гомогенизации ткани головного мозга животного, экстракции, предназначенной для извлечения растворимых в воде компонентов, освобождения полученного экстракта от белка. Активная фракция препарата - церебролизин представляет собой низкомолекулярные и биологически активные нейропептиды, которые способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и непосредственно поступать к нервным клеткам. Известный способ позволяет получить лечебное средство необходимого действия, однако, природа и сочетание входящих в него активных нейропептидов не обеспечивает достаточно высокой активности средства [2].

Известен способ получения лечебного средства из ткани мозга эмбрионов животного, применяемого при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, включающий гомогенизацию ткани мозга эмбриона животного, экстракцию гомогенизированной массы физиологическим раствором, выдерживание ее до завершения процессов экстракции, удаление осадка, добавлении к надосадочной жидкости консерванта в количестве не менее 0,5%, стерилизацию раствора фильтрованием и выдерживание его до завершения образования липидного слоя, а после его отделения, выдерживание оставшегося раствора до прекращения процессов агрегации при температуре, не превышающей физиологическую, отделение образовавшихся частиц и дальнейшем взаимодействие раствора с иммобилизованным протеолитическим ферментом в режиме, установленном, исходя из контрольной пробы получаемого средства, с дальнейшим выдерживанием полученного раствора в течение 30 суток при температуре не выше 10°С [3]. Использование в известном способе в качестве исходного сырья мозговой ткани эмбриона крупного рогатого скота связано с наличием в ней регуляторов пептидов пренатального периода, что определяет основные свойства получаемого средства.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в расширении ассортимента лекарственных средств с нейропротективной активностью и повышении биологической активности целевого продукта, а также в создании фармакологического средства, содержащего в качестве активного начала целевой продукт, полученный заявляемым способом, и оказывающего нормализующее действие на функции головного мозга.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения средства для лечения клинических проявлений нарушений функций головного мозга, согласно изобретению, в качестве сырья используют ткани мозга эмбрионов животного, поэтапно подвергают их охлаждению, гомогенизации, экстракции, консервации, стерилизации, фильтрации и стабилизируют полученный раствор высокоактивных полипептидов, при этом охлаждение тканей мозга эмбрионов животного перед гомогенизацией проводят до температуры (-5)-(-10)°С и выдерживают их в течение 24 ч при +10°С, экстракцию охлажденного гомогената проводят в два этапа и в качестве экстрагирующего раствора используют 9% раствор сульфата калия, после фильтрации полуфабрикат высокоактивных полипептидов подвергают стабилизации 0,07% спиртовым раствором метилового эфира п-оксибензойной кислоты при значении рН раствора 6,0-7,0.

Полученная фармакологическая композиция с нейропротекторной активностью содержит активную субстанцию и стабилизатор. В качестве активной субстанции композиция содержит терапевтически эффективное количество средства из тканей мозга эмбрионов животного по п.1 и стабилизатор, при этом в 100 мл препарата содержится 0,07 г метилового эфира п-оксибензойной кислоты (ФС42-1460-80), до 100 мл препарата - субстанции, при рН от 6,5 до 7,5.

Способ осуществляется следующим образом.

Мозг эмбрионов коров замораживают в морозильной камере при температуре (-5)(-10)°С с последующим выдерживанием в холодильной камере 24 ч при температуре +10°С. Сырье подвергают гомогенизации, экстракции гомогената 9% раствором сульфата калия из расчета 0,5 кг раствора на 1 кг гомогената в течение 5 мин при постоянном перемешивании, центрифугируют при скорости 3000 об./мин. Надосадочную жидкость собирают и подвергают второй стадии экстракции 9% раствором сульфата калия в течение 10 мин при постоянном перемешивании.

Полученный полуфабрикат размораживают при комнатной температуре и центрифугируют при скорости 3000 об./мин. Надосадочную жидкость собирают и охлаждают при температуре +5-10°С. Осадок отделяют.

Полученный после удаления осадка раствор содержит в себе белки, аминокислоты, липиды и представляет собой полуфабрикат для получения целевого продукта.

Для отделения нерастворимых компонентов проводят ультрафильтрацию на установках с мембранами ПС-100 и ПА-10 при поддержании охлаждения. Проводят стерилизующую фильтрацию с добавлением хлорида натрия в качестве стабилизатора и вводят консервант 0,07% метиловый эфир п-оксибензойной кислоты, с целью противовирусного и противогрибкового обеззараживания получаемого лекарственного средства.

Проводят полный контроль физикохимических параметров полуфабриката на токсичность и апирогенность в соответствии с величинами, установленными в ВФС 42Б на препарат - субстанцию. Проводят осветляющую фильтрацию и стерильный разлив в ампулы и бутылки.

Полученный согласно изобретению целевой продукт представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом следующего состава.

В 100 мл препарата содержится 0,07 г метилового эфира п-оксибензойной кислоты (ФС42-1460-80), до 100 мл препарата - субстанции ВФС 42Б, рН от 6,5 до 7,5.

Полученный предлагаемым способом препарат обладает высокой терапевтической активностью и специфичностью, заключающейся в его положительном влиянии на высшую нервную деятельность при заболеваниях, связанных с нарушением мозговых функций, что подтверждено лабораторными и клиническими испытаниями.

Во время проведения сравнительных исследований ίη νίνο на экспериментальных моделях был обнаружен новый терапевтический эффект препарата, полученного заявляемым способом, такой как антигипоксическое защитное действие.

Согласно изобретению способ нормализации функции головного мозга заключается в применении посредством введения субъекту, нуждающемуся в данном лечении, терапевтически эффективного количества фармакологического средства, включающего в качестве активного начала целевой продукт, полученный указанным способом, и представляющий собой комплекс свободных аминокислот, пептидов и низкомолекулярных продуктов контролируемого протеолиза белков головного мозга эмбрионов крупного рогатого скота и фармакологически приемлемый носитель. Фармакологическое средство целесообразно применять в дозах от 2 до 50 мг в зависимости от характера течения и тяжести заболевания.

Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа получения биологически активного препарата из ткани мозга и испытания биологической активности продукта, полученного заявляемым способом.

Пример.

Исходное количество головного мозга эмбрионов коров укладывают в полиэтиленовые мешки и замораживают в морозильной камере при температуре (-5)-(-10)°С. Емкость с замороженным мозгом эмбрионов коров достают из морозильной камеры и оставляют в холодильной камере на 24 ч при температуре +10°С.

Сырье подвергают измельчению и гомогенизации.

К полученной массе добавляют 9% раствор сульфата калия из расчета 0,5 кг раствора на 1 кг гомогената и выдерживают 5 мин при постоянном перемешивании. Полученный экстракт центрифугируют на стаканчатой центрифуге при скорости 3000 об./мин. Надосадочную жидкость (1-я фракция экстракта) собирают в емко5 сти, проводят повторную экстракцию 9% раствором сульфата калия и выдерживают при постоянном перемешивании 10 мин. Полуфабрикат размораживают при комнатной температуре и центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают в емкости и охлаждают при температуре 5-10°С (2-я фракция экстракта). Осадок отбрасывают.

Фильтрат очищают от высокомолекулярных белков с помощью ультрафильтрации на установках с мембранами ПС-100 и ПА-10, соединенных с реакторами, к которым подведено охлаждение. Ультрафильтрацию ведут около 1,5 ч. Ультрафильтрат собирают в емкость и стерилизуют. Для этого в полупродукт вводят стабилизатор хлорид натрия в конечной концентрации 1% при перемешивании. Затем по каплям добавляют стабилизатор 0,07% спиртовой раствор метилового эфира п-оксибензойной кислоты, контролируя рН полуфабриката. Значение рН должна быть 6,0-7,0.

Проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию препарата через фильтры «Ф»-15 и в асептических условиях разливают в ампулы.

Полученное лекарственное средство «Церебромедин» представляет собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом.

Для изучения биологической активности препарата, полученного заявляемым способом, использовали экспериментальные модели, позволяющие оценить способность биологически активных веществ восстанавливать нарушенные функции головного мозга.

В исследованиях использовали культуры перевиваемых клеток глиомы крысы С6 в норме и экспериментальной гипоксии.

Изучение возможного токсического влияния на организм препарата, полученного заявляемым способом, проводилось в соответствии с «Требованиями к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ», 1984 г., изданными Управлением по внедрению новых лекарственных препаратов и медицинской техники МЗ СССР. Цель изучения состояла в определении переносимых доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма и выявлении зависимости токсических эффектов от дозы и длительности препарата.

Влияние церебромедина на структурнофункциональное состояние клеток глиомы С_б в норме и при экспериментальной гипоксической гипоксии

При изучении действия церебромедина ίη νίΐτο использовали культуры перевиваемых клеток глиомы крысы С_б.

Гипоксическое воздействие на культуры осуществляли в герметичной камере с газовой смесью, содержащей 95% Ν₂ и 5% СО₂. Камеру помещали в термостат при 37°С на 20 ч. Иссле дование протекторного действия церебромедина проводили при его предварительном (за 30 мин до гипоксического воздействия) добавлении в питательную среду.

Для морфологического изучения культур их фиксировали фиксатором Дюбоск-БразильБуэна, окрашивали гемотоксилином Бемера и 0,5% раствором эозина. Прижизненное изучение культур и препаратов проводили в световом микроскопе, используя увеличение в 100-450 раз.

Всего было поставлено 4 серии опытов: контроль, контроль + церебромедин, гипоксия, гипоксия+церебромедин.

Церебромедин вносили в культуру в дозах 20, 40, 60 мкг/мл.

Препараты культур клеток готовили на покровных стеклах при различных условиях культивирования.

Изучение токсичности разных серий церебромедина, вносимого в указанных выше дозах, показало, что препарат не токсичен и вызывает дифференцировку (созревание) клеток на 23 суток раньше, чем в контроле. При этом под влиянием церебромедина у большинства астроцитов появлялись длинные ветвящиеся отростки. Тело клеток, по сравнению с контрольными, уменьшалось в размере. В контроле аналогичные клетки появлялись в меньшем количестве и лишь на 5-8 сутки пассирования.

Отмеченные эффекты могут свидетельствовать о нейротрофическом действии церебромедина, которое характеризуется повышением переживаемости нейронов, а также способностью приостанавливать или снижать темпы прогрессирования дегенерации нейронов. Препарат проявляет нейротрофическую активность, сходную с таковой у факторов роста нейрональных структур.

Изучение воздействия гипоксии на культуру клеток показало, что оно проявлялось замедлением роста, появлением отечных клеток, их вакуолизацией. Предварительное внесение в ростовую среду церебромедина в дозе 60 мкг/мл снижало угнетающий эффект гипоксии на пролиферативную активность клеток и вызывало дифференциацию клеток. В культуре появлялись клетки с длинными ветвящимися отростками, уменьшался размер площади клеток.

Таким образом, церебромедин оказывает нейропротекторное и нейротрофическое влияние на культуру глиальных клеток в условиях гипоксической гипоксии.

Действие церебромедина на митотическую активность астроцитов культуры клеток в норме и в условиях гипоксии

На чертеже представлены данные о влиянии церебромедина на митотическую активность астроцитов, культивируемых в условиях гипоксии.

Обозначения: 1 - контроль; 2 - гипоксия; 3 - гипоксия + церебромедин; 4 - контроль + церебромедин.

Для исследований была использована культура глиомы крысы С_б на 4 сутки роста ίη νίίτο. Культуру помещали в гипоксические условия на 24 ч. Для определения митотической активности подсчитывали в поле зрения микроскопа по 3000 клеток, выделяя среди них клетки, находящихся на различных стадиях деления. Полученные результаты показали, что гипоксия снижает митотическую активность культуры указанного вида клеток на 59,6%. При этом снижается количество делящихся клеток во всех фазах деления и особенно это проявляется в профазе (число делящихся клеток снижается на 94,3%).

Внесение в ростовую среду церебромедина в дозе 20 мкг/мл активирует митотическую активность в глиальных клетках на 45,2%. Число митотически делящихся клеток во всех фазах деления увеличивается, а в профазе и телофазе приближается к контрольным величинам.

Влияние церебромедина на выживаемость лабораторных животных в условиях гипобарической гипоксии

Следует отметить, что проблема резистентности организма к гипоксии требует учета индивидуальной чувствительности и особенностей реактивности, поэтому оценку антигипоксической активности лекарственных соединений проводили на сформированных группах высокои низкоустойчивых животных.

Высотную гипоксию создавали, поднимая крыс на высоту 12000 м в барокамере с подогревом и приточно-вытяжной вентиляцией. На этой высоте животных выдерживали до гибели. Эффект исследуемых препаратов оценивали по продолжительности жизни крыс.

Протекторное (антигипоксическое) действие церебромедина исследовали при внутрибрюшинном (за 3 ч до подъема) введении его крысам-самцам массой 250-360 г. Препарат вводили в дозе 108 и 216 мг/кг. Оценку протекторных свойств церебромедина проводили в сравнении с препаратом церебролизат (ОАО Белмедпрепараты) и церебролизином фирмы Эбеве.

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, при внутрибрюшинном введении церебромедина в дозе 108 мг/кг массы тела за 3 ч до подъема время выживания крыс увеличивается в среднем на 28%.

При однократном введении церебромедина за 3 ч до подъема в дозе 216 мг/кг массы тела наблюдалось еще более значительное (до 70%, по сравнению с контролем) увеличение времени выживания крыс (табл. 2).

Внутрибрюшинное введение препарата не оказывало существенного влияния на увеличение продолжительности жизни крыс в условиях гипоксии, церебролизин вызывал значительно меньший эффект, чем церебромедин (табл. 3, 4, 5).

Таким образом, в условиях моделирования гипобарической гипоксии препарат церебромедин оказывает выраженное дозозависимое антигипоксическое действие. Сравнительное исследование действия церебролизата в условиях гипобарической гипоксии не выявило у него защитного эффекта. По сравнению с церебромедином церебролизин оказывал менее выраженное антигипоксическое действие.

Таблица 1

Влияние однократного внутрибрюшинного введения церебромедина в дозе 108 мг/кг веса на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксии

Время выживания крыс, мин
№ пп	Опыт	Контроль
1	10	6
2	11	7
3	13	10,5
4	15	12
5	-	12,5
М±т	12,3±1,3 Р< 0,05	9,6±1,5

Таблица 2

Влияние однократного внутрибрюшинного введения церебромедина в дозе 216 мг/кг веса на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксии

Время выживания крыс, мин
№ пп	Опыт	Контроль
1	5,3	1,5
2	8	5
3	8,15	5,5
4	14,5	5,5
5	16	25
М±т	14,8±2,3 Р<0,05	8,7±3,6

Таблица 3

Влияние пятикратного внутрибрюшинного введения церебромедина в дозе 108 мг/кг (серия 1) за 3 ч до подъема на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксии

Время выживания крыс, мин
№ пп	Опыт	Контроль
1	10	6
2	11	7
3	13	10,5
4	15	12
5	-	12,5
6	0,5	0,5
7	4,2	4
8	22	6
9	36,5	7
10	45	10
М±т	17,5±5,2 Р<0,05	7,6±1,3

Таблица 4 Влияние внутрибрюшинного введения церебромедина (серия 1) в дозе 216 мг/кг в течение 5 дней на время выживания крыс в условиях гипоксической гипоксии

Время выживания крыс, мин
№ пп	Опыт	Контроль
1	1	0,5
2	2	1,3
3	2,5	1
4	3,6	4,5
5	9	-
М±т	3,62±1,57 Р>0,5	1,83±1,05

Как видно из табл. 3-4, при внутрибрюшинном введении церебромедина (серии 1) в дозе 108-216 мг/кг веса в течение 5 дней наблюдается увеличение времени выживания лабораторных крыс на 97-147%.

Таблица 5 Влияние однократного внутрибрюшинного введения церебролизата (216 мг/кг массы тела) на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксии

Время выживания крыс, мин
№ пп	Опыт	Контроль
1	4	2,3
2	5,5	5,5
3	6	5,5
4	6,3	7,5
5	12	15
М±т	6,8±1,3 Р>0,5	7,1±1,8

Таблица 6

Влияние внутрибрюшинного введения церебролизата за 3 ч до подъемана время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксии

Время выживания крыс, мин
№ пп	Опыт Доза введения: 250 мг/кг веса	Контроль
1	4	2,2
2	5,5	7,5
3	6	5,5
4	6,2	15
5	12	-
М±т	6,74±1,53 Р>0,5	7,55±3,13

Как видно из данных в табл. 6, при внутрибрюшинном введении церебролизата в дозе 250 мг/кг веса за 3 ч до подъема увеличение времени выживания лабораторных крыс не наблюдается.

Таблица 7

Влияние внутрибрюшинного введения церебролизина за 3 ч до подъемана время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксии

Время выживания крыс, мин
№ пп	Опыт Доза введения: 340 мг/кг веса	Контроль
1	0,5	3,5
2	2	23
3	4	19,5
4	5	36
5	19	45
М±т	6,1±3,7 Р>0,5	25,4±7,9

Как видно из табл. 7, при внутрибрюшинном введении церебролизина в дозе 340 мг/кг веса за 3 ч до подъема увеличения времени выживания лабораторных крыс не наблюдается.

Действие церебромедина на состояние нейрорегуляторных систем мозга крыс в норме и в условиях гипоксии Изучение уровня нейрональной активности проводили по показателям захвата меченных по ¹⁴С или ³Н-нейромедиаторов в синаптосомальной фракции коры мозга и гипоталамуса крыс, подвергнутых действию гипоксии с предварительным введением в течение 5 суток терапевтических доз церебромедина. Исследования показали, что через сутки после воздействия гипоксии в (ТК) экспериментальных животных обнаружено повышение на (15%) активности ГАМК-ергических процессов и резкое снижение процесса связывания ³Н-кортикостерона - до 25% от исходного. В гипоталамусе в этот же период уровень рецепции ³Н-кортикостерона, как и в ТК, находился ниже контрольного. Наблюдалось также снижение нейронального захвата холина и тормозных нейромедиаторов: ГАМК- и глицина. Полученные данные представлены в табл. 8-11.

Важно подчеркнуть, что в контрольной серии через 2 ч после гипоксического воздействия в этой структуре мозга отмечена активизация холинергических процессов, при одновременном резком падении интенсивности обратного захвата ГАМК и значительном снижении рецепторного связывания кортикостерона.

Исследования показали, что уже через сутки межмедиаторные взаимоотношения в коре мозга, нарушенные при гипоксии, в основном, восстанавливаются, однако, при этом сохраняется низкий уровень глюкокортикоидного связывания рецепторными системами мозга.

Выявленные изменения нейромедиаторных процессов, индуцированные введением церебромедина, происходят также при пониженном уровне кокортикоидной рецепции как в коре мозга, так и гипоталамусе. Как уже указывалось, это может косвенно характеризовать вы11 сокий уровень гормонов в периферической крови при сохранности обратной связи в системе гипоталамус-кора надпочечников.

Пятидневное введение церебромедина интактным животным подтвердило высокий эффект данного препарата. В ТК - на фоне пониженного уровня глюкокортикоидной рецепции отмечено повышение активности холин- и ГАМК-ергических процессов на 99 и 72% соответственно. В ГТ - отмечена иная картина снижение активности ГАМК- и, незначительно, глицинергических процессов, а также повышение активности обратного захвата холина и рецепции кортикостерона на 42 и 62% соответственно. Обнаруженные изменения нейромедиаторных взаимоотношений свидетельствуют о выраженном нейротропном эффекте изучаемого препарата.

Изучение эффектов биорегулирующей терапии с помощью церебромедина, введенного до и сразу после гипоксического воздействия, выявило у экспериментальных животных повышение активности холинергических процессов в теменной зоне коры больших полушарий головного мозга, некоторое снижение ГАМКергической активности и повышение (на 30%) рецепции кортикостерона, правда не достигающей исходного контрольного уровня.

В гипоталамусе отмечена тенденция к смягчению эффекта гипоксии. К этому сроку сохранена несколько повышенная глицинергическая активность. Наблюдается повышение процесса накопления ГК-гормонов при пониженом уровне холин- и глицинергических процессов. Кроме того, повышенный уровень ГКсвязывания рецепторами гипоталамуса свидетельствует о тенденции к нормализации уровня и этих гормонов, адаптации их содержания в периферической крови.

Выявленные элементы нормализации нейромедиаторных процессов, реализуемые на уровне структур ЦНС, свидетельствуют о гомеостатических эффектах церебромедина. Возможно, более значимые эффекты могут иметь место при длительной биорегулирующей терапии.

Таким образом, в условиях нашего эксперимента выявлено протективное влияние церебромедина на нервную ткань, проявляющееся в сглаживании характерных для гипоксического воздействия нарушений нейромедиаторных взаимоотношений в структурах ЦНС.

Обнаруженное угнетение ГАМКергической активности в области ГТ сопровождается интенсификацией иных тормозных механизмов, в частности, глицинергических, обеспечивающих высокий компенсаторный уровень тормозной нейромедиаторной синаптической активности, что способствует снижению метаболической активности нервных клеток.

Таблица 8

Интенсивность нейронального захвата ³Н-холина в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных (ΌΡΜ/шд сырой ткани/мин)

Серия/ткань	Контроль	Г ипоксия	Церебромедин	Церебромедин + гипоксия
	п=6	п=6	п=6	п=5
	х=208477	х=240461	х=414350	х=381,674
Кора мозга	8х=34670	8х=85222	5х=62078	5х=72958
σ=84925	σ=20875	σ=152060	σ=163139
		1=0.348	1=2,895	1=2,273
		115%	199%	183%
	п=4	п=4	п=4	п=5
	х=284993	х=281942	х=271842	х=201549
Гипоталамус	8х=97687	8х=51731	8х=76508	8х=24048
σ= 195374	σ=103463	σ=153016	σ=53774
		1=0,028	1=0,106	1=0,927
		99%	95%	71%

Таблица 9

Рецепторное связывание ³Н-кортикостерона в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных ( РМ/ сырой ткани/мин)

Серия/ткань	Контроль	Г ипоксия	Церебромедин	Церебромедин + гипоксия
	п=6	п=6	п=6	п=4
	х=4763	х=1196	х=2680	х=1835
Кора мозга	8х=1279	8х=144	8х=707	8х=375
σ=3135	σ=353	σ=1732	σ=750
		1=2,77	1= 1,424	1=1,8
		25%	56%	39%

	п=5	п=5	п=5	п=6
	х=1996	х=1906	х=3243	х=2628
Гипоталамус	8х=643	8х=119	8х=604	8х=608
σ=1437	σ=1350	σ=1340	σ=1488
		1=0,136	1=1,414	1=0,713
		96%	162%	132%

Таблица 10

Интенсивность нейронального захвата ¹⁴С-ГАМК в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных (ΌΡΜ/тд сырой ткани/мин)

Серия/ткань	Контроль	Г ипоксия	Церебромедин	Церебромедин + гипоксия
	п=8	п=8	п=4	п=4
	х=926	х=915	х=1595	х=724
Кора мозга	8х=178	8х=366	8х=57	8х=165
σ=503	σ=1036	σ=115	σ=331
		1=0,028	1=2,5	1=0,723
		99%	172%	78%
	п=4	п=4	п=4	п=4
	х=2617	х=1525	х=726	х=1618
Гипоталамус	8х=848	8х=228	8х=221	8х=362
σ=1696	σ=456	σ=441	σ=810
		1=1,244	1=2,157	1=1,175
		58%	28%	62%

Таблица 11

Интенсивность нейронального захвата ¹⁴С-глицина в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных (ΌΡΜ/тд сырой ткани/мин)

Серия/ткань	Контроль	Г ипоксия	Церебромедин	Церебромедин + гипоксия
	п=10	п=7	п=8	п=5
	х=146415	х= 109073	х=208664	х=197888
Гипоталамус	8х=58823	8х=47007	8х=24608	8х=82465
σ=186015	σ=124369	σ=69603	σ=184398
		1=0,462	1=0,893	1=0,507
		74%	142%	135%

Действие церебромедина на содержание и индуцированное аминолевулиновой кислотой накопление эндогенных порфиринов в структурах головного мозга крыс в норме и после воздействия гипоксии В данном разделе представлены результаты индуцируемого аминолевулиновой кислотой (АЛК) накопления безметальных порфиринов в культуре нейрональных клеток С6 после гипоксического воздействия на фоне введения церебромедина. Установлено, что при внесении в ростовую среду АЛК в культуре клеток С6 наблюдается увеличение количества эндогенных пигментов. Наиболее выражено накопление НН: его содержание в среднем составляет 65% от общего количества синтезированных порфиринов. Исследования показали, что процесс накопления порфиринов в контрольной культуре (не подвергавшейся воздействию гипоксии) стимулируется церебромедином. Наибольшее увеличение концентрации пигментов в глиальных клетках зарегистрировано нами при использовании церебромедина в концентрации 60 мкг/мл. Культивирование клеток в условиях дефицита кислорода в данной серии эксперимента приводило к ингибированию (в 1,3 раза) АЛК-индуцированного накопления клеточных пигментов. Внесение в среду инкубации перед помещением образцов в гипоксическую камеру церебромедина в концентрации 60 мкг/мл уменьшало, а в концентрации 120 мкг/мл полностью снимало гипоксииндуцированные изменения.

Основой всех функциональных нарушений, возникающих при гипоксии, является недостаточность клеточных энергообразующих систем. Известно, что непременными участниками протекающих в клетках энергетических процессов являются гемопротеиды, темы и свободные порфирины. Дефицит кислорода перестраивает метаболические процессы и это может проявляться в изменении биосинтеза многих важных биологических субстратов, в том числе таких, как порфирины. Общие представления об особенностях порфиринового обмена могут быть получены из анализа показателей, характеризующих количественное содержание отдельных пигментов - НН, КН, УН и скорость их АЛК-индуцированного образования. Нами показано, что в ранние сроки (2 ч) после острого гипоксического воздействия в коре мозга крыс наблюдается увеличение количества НН и УП. Исследование содержания отдельных порфиринов на 2-е сутки постгипоксического периода позволило обнаружить пролонгированный эффект действия гипоксии на концентрацию порфиринов в данной структуре мозга. Выявленные изменения имели ту же направленность, что и в ранний постгипоксический период, и выражались в некотором увеличении количества ПП и достоверном возрастании УП (в 1,6 раза).

Исследование влияния церебромедина на метаболизм порфиринов в коре мозга здоровых крыс свидетельствует об увеличении концентрации пигментов после ежедневного введения препарата в течение 5 дней.

При введении церебромедина крысам, перенесшим кислородную недостаточность, уровень НП в коре мозга возвращался к контрольному.

Еще более наглядно действие препарата на порфиринообразование проявляется при анализе кинетических характеристик АЛК-индуцированного накопления эндогенных пигментов. Введение церебромедина крысам приводит к увеличению скорости синтеза порфиринов в коре мозга как контрольных животных, так и подвергнутых гипоксическому воздействию. Установлено, что через 17 ч инкубации гомогенатов ткани мозга с АЛК (0,8 мМ, 37°С) количество образуемых ПП и УП в образцах, полученных от крыс с введенным церебромедином, превышало накопление порфиринов в коре мозга в норме в 2,2 и 3,5 раз соответственно. Резкое увеличение АЛК-индуцированного синтеза пигментов выявлено и в коре мозга гипоксических крыс, которым вводился препарат.

В стволе мозга контрольных животных церебромедин также вызывал увеличение суммарного содержания порфиринов в 1,2 раза. В группе опытных крыс введение препарата восстанавливало количество порфиринов, сниженное после гипоксии. Препарат вызывал увеличение индуцированного АЛК накопления порфиринов в стволе мозга «гипоксических» крыс.

Приведенные данные свидетельствуют о выраженном влиянии церебромедина на биосинтетические процессы в коре мозга животных в норме и при гипоксии. В стволе мозга эффекты церебромедина менее выражены, что может быть связано с избирательной чувствительностью структур мозга к данному препарату.

Проведенные сравнительные исследования действия близких аналогов церебромедина церебролизата (ОАО Белмедпрепараты) и цереброкурина (Украина) на биосинтез порфиринов в суспензионной культуре иммунокомпетентных клеток показали, что все исследуемые лекарственные формы - церебромедин, цереброкурин и церебролизат обладают выраженным влиянием на АЛК-индуцированное накопление порфиринов в спленоцитах. Однако эффект цереброкурина отличается направленностью действия от двух других препаратов. В то время как церебромедин (60 мкг/мл) и церебролизат (120 мкг/мл) характеризуются резко выраженным увеличением накопления пигментов, цереброкурин (60 мкг/мл) вызывает угнетение АЛКидуцированного синтеза более чем в 1,5 раза. В условиях гипоксии действие цереброкурина, в отличие от церебромедина и церебролизата, проявляется в еще большем угнетении биосинтетических процессов, приводящем к гибели клеток мозговой ткани. Важным фактором, определяющим степень гипоксического поражения клеток, является состояние клеточных мембран.

На вторые сутки постгипоксического периода нами обнаружено увеличение связывания Мц 540 со спленоцитами и тимоцитами крыс на 48 и 40% соответственно, в то же время различий в связывании отрицательно заряженного зонда АНС не установлено. Такие изменения мембран при неизменном поверхностном заряде могут быть обусловлены увеличением количества жидкокристаллических липидных доменов, а также модификацией белкового окружения, в результате которого гидрофобные области белка становятся более доступными для Мц_54о. Исследования, проведенные с помощью флуоресцентного зонда пирена, не противоречат этим выводам. Действительно, наблюдается тенденция к «разжижению» липидного бислоя и уменьшение вязкости анулярного липида.

Введение животным церебромедина после гипоксии приводит к норме все тестируемые флуоресцентные параметры спленоцитов, не изменяя аналогичные параметры в контроле. В суспензии тимоцитов влияние церебромедина проявлялось в уменьшении по сравнению с контролем вязкости липидного бислоя.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о чувствительности клеток иммунной системы к исследуемым препаратам и выраженном влиянии цитомединов на метаболизм эндогенных порфиринов в условиях гипоксии. Показана высокая активность церебромедина в отношении спленоцитов как ίη νίΐτο, так и ίη νίνο. Обнаружена стимуляция церебролизатом и ингибирование цереброкурином синтеза клеточных пигментов. Установлено, что предварительное введение крысам церебромедина в течение 5 суток до острого гипоксического воздействия предотвращает изменения в клеточных мембранах спленоцитов и сглаживает реакцию тимоцитов на гипоксию.

Таким образом в результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что препарат церебромедин обладает нейропротективными свойствами как ίη νίνο на культуре клеток, так и ίη νίΐτο на уровне целостного организма животных.

Церебромедин, вносимый в ростовую среду, не оказывает токсического воздействия и вызывает глиотрофический эффект в культуре глиальных клеток.

Являясь пептидергическим нейромодулятором, препарат оказывает высокоспецифическое действие на мозг за счет взаимодействия с биологически активными пептидами.

На основании экспериментальных можно выделить три тесно взаимосвязанных и взаимно дополняющих компонента нейропротективной активности церебромедина - метаболическая регуляция, нейромодуляция и нейротрофическое действие.

Благодаря комплексу перечисленных фармакологических эффектов церебромедин повышает переживаемость нейронов в условиях ишемии (гипоксии) и в определенной мере предупреждает их гибель.

Исследования, проведенные с целью установления характера и выраженности повреждающего действия церебромедина на организм экспериментальных животных и оценки его безопасности, показали следующее:

1. При изучении острой токсичности установлено, что препарат в изученных дозах практически нетоксичен (ЛД₅₀ определить не удалось).

Максимальная доза, которая была введена мышам, составляла 25,0 мл/кг, крысам - 25,0 мл/кг.

2. При изучении ряда специфических видов токсичности установлено: церебромедин не обладает мутагенным, эмбриотоксическим, кожно-раздражающим, токсическим кожнорезорбтивным, аллергенным, анафилактогенным действием, а также не оказывает токсического влияния на иммуннитет.

3. Изучение препарата в хроническом эксперименте при ежедневном внутрибрюшинном или внутривенном введении не выявило какихлибо существенных функциональных и структурных нарушений со стороны жизненно важных систем организма животных.

4. Контроль исходного материала, субстанции и экспериментальных серий препарата, проводимый нами в течение 4 лет изготовления и изучения церебромедина, подтверждает отсутствие прионов как в исходном сырье, так и в готовом препарате.

Анализ результатов, полученных при токсикологическом исследовании, позволяет сделать заключение о том, что препарат характеризуется низкой токсичностью и в изученных концентрациях является безвредным для организма подопытных животных. В процессе исследования препарата не выявлены какие-либо побочные эффекты.

Использованная литература

1. Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологичекая композиция и ее применение. Патент РФ № 2104702, 1998.02.20, Бюл. № 5.

2. Рекламный проспект фирмы «Эбеве», Австрия, «Церебролизин».

3. Способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции центральной нервной системы. Патент РФ № 2128511, 1997.02.28.

Claims (3)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения лекарственного средства из тканей мозга эмбрионов животного, включающий охлаждение сырья, гомогенизацию, экстракцию высокоактивных полипептидов из гомогената, консервацию, стерилизацию, фильтрацию и последующую стабилизацию полученного раствора полипептидов, отличающийся тем, что охлаждение сырья перед гомогенизацией проводят до температуры (-5)(-10)°С и выдерживают в течение 24 ч при +10°С, а экстракцию гомогената проводят в два этапа, причем в качестве экстрагирующего раствора используют 9%-ный раствор сульфата калия.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после фильтрации раствор полипептидов подвергают стабилизации 0,07%-ным спиртовым раствором метилового эфира п-оксибензойной кислоты при значении рН раствора 6,0-7,0.
3. 3. Фармакологическая композиция с нейропротекторной активностью, содержащая активную субстанцию и стабилизатор, отличающаяся тем, что в качестве активной субстанции композиция содержит терапевтически эффективное количество лекарственного средства, полученного способом по п.1, и стабилизатор, при этом в 100 мл композиции содержится 0,07 г метилового эфира п-оксибензойной кислоты (ФС42-1460-80), до 100 мл активной субстанции, а рН композиции составляет 6,5-7,5.