EA003301B1 - Method for preparing a medicament from brain tissue of animal embryo and pharmaceutical composition based thereon - Google Patents
Method for preparing a medicament from brain tissue of animal embryo and pharmaceutical composition based thereon Download PDFInfo
- Publication number
- EA003301B1 EA003301B1 EA200000634A EA200000634A EA003301B1 EA 003301 B1 EA003301 B1 EA 003301B1 EA 200000634 A EA200000634 A EA 200000634A EA 200000634 A EA200000634 A EA 200000634A EA 003301 B1 EA003301 B1 EA 003301B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cerebromedin
- solution
- hypoxia
- effect
- brain
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных, которые могут использоваться в медицине как фармакологические средства, способные нормализовать функции головного мозга у больных, имеющих одно или более клиническое проявление нарушения функции головного мозга.The invention relates to the chemical-pharmaceutical industry and relates to the isolation of biologically active substances from animal organs that can be used in medicine as pharmacological agents that can normalize brain function in patients with one or more clinical manifestations of dysfunction of the brain.
Создание новых эффективных лекарственных средств на основе эндогенных физиологически активных веществ, вырабатываемых организмом, является успешным подходом к проблеме восстановления функций мозга, утрачиваемых с возрастом или в результате болезней или травм. С этой целью в настоящее время уже разработан ряд лекарственных препаратов, разработанных на основе пептидных биорегуляторов-цитомединов, способных восстанавливать многие нарушенные функции различных клеток, органов и систем организма, в том числе и функции центральной нервной системы при различных формах неврологической и психиатрической патологии.The creation of new effective drugs based on endogenous physiologically active substances produced by the body is a successful approach to the problem of restoring brain functions that are lost with age or as a result of illness or injury. To this end, a number of drugs have already been developed, developed on the basis of peptide bioregulators-cytomedines, capable of restoring many disturbed functions of various cells, organs and systems of the body, including those of the central nervous system in various forms of neurological and psychiatric pathology.
Поскольку указанные заболевания значительно распространены, а спектр лекарственных средств весьма ограничен, разработка новых лекарственных средств, обладающих нейропротективной активностью, и способов их получения представляет существенный интерес.Since these diseases are widely spread, and the range of drugs is very limited, the development of new drugs with neuroprotective activity and methods for their preparation is of considerable interest.
Известен способ получения препарата [1], обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функции головного мозга, заключающийся в использовании в качестве исходного сырья мозга животных. В известном способе сырье подвергают гомогенизации, после чего проводят экстракцию для извлечения растворимых в воде компонентов, для этого гомогенат обрабатывают раствором уксусной кислоты в течение 48-72 ч при рН 3,5-4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,61,2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8-4). Полученную смесь центрифугируют и осаждают биологически активные вещества ацетоном при температуре от -3 до -5°С при соотношении супернатанта и ацетона 1:(7-5). Проводят ионообменную хроматографию полученного осадка на катионите «Биокарб». В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую щелочные полипептиды, которые обладают стимулирующим (или восстанавливающим при снижении активности мозга) действием на клетки коры головного мозга.A method of obtaining the drug [1], which has a reducing activity in violation of brain function, is to use the brain of animals as a source of raw materials. In the known method, the raw material is subjected to homogenization, followed by extraction to extract water-soluble components, for this the homogenate is treated with a solution of acetic acid for 48-72 h at a pH of 3.5-4.5 in the presence of zinc chloride at a concentration of 0.61, 2 g / l and at a ratio of homogenate and acetic acid solution 1: (8-4). The resulting mixture is centrifuged and the biologically active substances are precipitated with acetone at a temperature of from -3 to -5 ° C with the ratio of supernatant and acetone 1: (7-5). Conduct ion-exchange chromatography of the precipitate on the cation exchanger "Biocarb". As a result of ion-exchange chromatography, a fraction containing alkaline polypeptides is obtained, which have a stimulating (or reducing effect upon a decrease in brain activity) effect on the cells of the cerebral cortex.
Данный способ не позволяет извлечь кислые и нейтральные полипептиды и получить биологически активный препарат с более широким спектром действия.This method does not allow extracting acidic and neutral polypeptides and obtaining a biologically active drug with a wider spectrum of action.
Известен способ получения комплекса биологически активных полипептидов - препарат церебролизин, нормализующий функции головного мозга путем гомогенизации ткани головного мозга животного, экстракции, предназначенной для извлечения растворимых в воде компонентов, освобождения полученного экстракта от белка. Активная фракция препарата - церебролизин представляет собой низкомолекулярные и биологически активные нейропептиды, которые способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и непосредственно поступать к нервным клеткам. Известный способ позволяет получить лечебное средство необходимого действия, однако, природа и сочетание входящих в него активных нейропептидов не обеспечивает достаточно высокой активности средства [2].A method of obtaining a complex of biologically active polypeptides - the drug Cerebrolysin, normalizes brain function by homogenizing the brain tissue of the animal, extraction, designed to extract water-soluble components, freeing the resulting extract from the protein. The active fraction of the drug - Cerebrolysin is a low molecular weight and biologically active neuropeptides that are able to cross the blood-brain barrier and directly go to the nerve cells. The known method allows to obtain a therapeutic agent of the required action, however, the nature and combination of active neuropeptides within it does not provide a sufficiently high activity of the agent [2].
Известен способ получения лечебного средства из ткани мозга эмбрионов животного, применяемого при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, включающий гомогенизацию ткани мозга эмбриона животного, экстракцию гомогенизированной массы физиологическим раствором, выдерживание ее до завершения процессов экстракции, удаление осадка, добавлении к надосадочной жидкости консерванта в количестве не менее 0,5%, стерилизацию раствора фильтрованием и выдерживание его до завершения образования липидного слоя, а после его отделения, выдерживание оставшегося раствора до прекращения процессов агрегации при температуре, не превышающей физиологическую, отделение образовавшихся частиц и дальнейшем взаимодействие раствора с иммобилизованным протеолитическим ферментом в режиме, установленном, исходя из контрольной пробы получаемого средства, с дальнейшим выдерживанием полученного раствора в течение 30 суток при температуре не выше 10°С [3]. Использование в известном способе в качестве исходного сырья мозговой ткани эмбриона крупного рогатого скота связано с наличием в ней регуляторов пептидов пренатального периода, что определяет основные свойства получаемого средства.A method of obtaining a therapeutic agent from the brain tissue of embryos of an animal used in diseases involving dysfunction of the central nervous system, including the homogenization of the brain tissue of the embryo of the animal, extraction of the homogenized mass with saline, maintaining it until the extraction processes are completed, removing the precipitate, adding a preservative to the supernatant in the amount of not less than 0.5%, sterilization of the solution by filtration and keeping it until the formation of the lipid layer is completed I, and after its separation, keeping the remaining solution until termination of the aggregation processes at a temperature not exceeding the physiological, separation of the formed particles and further interaction of the solution with the immobilized proteolytic enzyme in the mode established on the basis of the test sample of the obtained product, with further maintaining the resulting solution in for 30 days at a temperature not higher than 10 ° С [3]. Use in a known method as a source of raw brain tissue of the embryo of cattle is associated with the presence in it of regulators of peptides of the prenatal period, which determines the basic properties of the resulting product.
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в расширении ассортимента лекарственных средств с нейропротективной активностью и повышении биологической активности целевого продукта, а также в создании фармакологического средства, содержащего в качестве активного начала целевой продукт, полученный заявляемым способом, и оказывающего нормализующее действие на функции головного мозга.The problem to which the invention is directed, consists in expanding the range of drugs with neuroprotective activity and increasing the biological activity of the target product, as well as creating a pharmacological agent containing the target product obtained as the active principle and having a normalizing effect on the functions brain.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения средства для лечения клинических проявлений нарушений функций головного мозга, согласно изобретению, в качестве сырья используют ткани мозга эмбрионов животного, поэтапно подвергают их охлаждению, гомогенизации, экстракции, консервации, стерилизации, фильтрации и стабилизируют полученный раствор высокоактивных полипептидов, при этом охлаждение тканей мозга эмбрионов животного перед гомогенизацией проводят до температуры (-5)-(-10)°С и выдерживают их в течение 24 ч при +10°С, экстракцию охлажденного гомогената проводят в два этапа и в качестве экстрагирующего раствора используют 9% раствор сульфата калия, после фильтрации полуфабрикат высокоактивных полипептидов подвергают стабилизации 0,07% спиртовым раствором метилового эфира п-оксибензойной кислоты при значении рН раствора 6,0-7,0.The task is solved by the fact that in the method of obtaining funds for the treatment of clinical manifestations of brain dysfunction, according to the invention, brain tissues of animal embryos are used as raw materials, they are gradually subjected to cooling, homogenization, extraction, preservation, sterilization, filtration and stabilize the resulting highly active solution polypeptides, while cooling the brain tissue of the embryos of the animal before homogenization is carried out to a temperature of (-5) - (- 10) ° C and incubated for 24 hours at + 10 ° C, extract The cooled homogenate is carried out in two stages and a 9% potassium sulfate solution is used as an extracting solution. After filtration, the semi-finished product of highly active polypeptides is stabilized with a 0.07% alcohol solution of p-hydroxybenzoic acid methyl ester at a pH of 6.0-7.0.
Полученная фармакологическая композиция с нейропротекторной активностью содержит активную субстанцию и стабилизатор. В качестве активной субстанции композиция содержит терапевтически эффективное количество средства из тканей мозга эмбрионов животного по п.1 и стабилизатор, при этом в 100 мл препарата содержится 0,07 г метилового эфира п-оксибензойной кислоты (ФС42-1460-80), до 100 мл препарата - субстанции, при рН от 6,5 до 7,5.The resulting pharmacological composition with neuroprotective activity contains an active substance and a stabilizer. As an active substance, the composition contains a therapeutically effective amount of the agent from the brain tissue of the embryo of the animal according to claim 1 and a stabilizer, while 100 ml of the preparation contain 0.07 g of p-hydroxybenzoic acid methyl ester (FS42-1460-80), up to 100 ml drug - substance, with a pH of 6.5 to 7.5.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Мозг эмбрионов коров замораживают в морозильной камере при температуре (-5)(-10)°С с последующим выдерживанием в холодильной камере 24 ч при температуре +10°С. Сырье подвергают гомогенизации, экстракции гомогената 9% раствором сульфата калия из расчета 0,5 кг раствора на 1 кг гомогената в течение 5 мин при постоянном перемешивании, центрифугируют при скорости 3000 об./мин. Надосадочную жидкость собирают и подвергают второй стадии экстракции 9% раствором сульфата калия в течение 10 мин при постоянном перемешивании.The brain of cow embryos is frozen in a freezer at a temperature of (-5) (- 10) ° C, followed by keeping in a refrigerating chamber for 24 hours at a temperature of + 10 ° C. The raw material is subjected to homogenization, extraction of the homogenate with 9% potassium sulfate solution at the rate of 0.5 kg of solution per 1 kg of homogenate for 5 minutes with constant stirring, centrifuged at a speed of 3000 rpm. The supernatant is collected and subjected to the second stage of extraction with a 9% solution of potassium sulfate for 10 minutes with constant stirring.
Полученный полуфабрикат размораживают при комнатной температуре и центрифугируют при скорости 3000 об./мин. Надосадочную жидкость собирают и охлаждают при температуре +5-10°С. Осадок отделяют.The resulting semi-finished product is thawed at room temperature and centrifuged at a speed of 3000 rpm. The supernatant is collected and cooled at a temperature of + 5-10 ° C. The precipitate is separated.
Полученный после удаления осадка раствор содержит в себе белки, аминокислоты, липиды и представляет собой полуфабрикат для получения целевого продукта.The solution obtained after removing the precipitate contains proteins, amino acids, lipids and is a semi-finished product to obtain the target product.
Для отделения нерастворимых компонентов проводят ультрафильтрацию на установках с мембранами ПС-100 и ПА-10 при поддержании охлаждения. Проводят стерилизующую фильтрацию с добавлением хлорида натрия в качестве стабилизатора и вводят консервант 0,07% метиловый эфир п-оксибензойной кислоты, с целью противовирусного и противогрибкового обеззараживания получаемого лекарственного средства.For the separation of insoluble components, ultrafiltration is performed on installations with PS-100 and PA-10 membranes while maintaining cooling. Sterilizing filtration is carried out with the addition of sodium chloride as a stabilizer and preservative 0.07% p-hydroxybenzoic acid methyl ester is added to antiviral and antifungal disinfection of the resulting drug.
Проводят полный контроль физикохимических параметров полуфабриката на токсичность и апирогенность в соответствии с величинами, установленными в ВФС 42Б на препарат - субстанцию. Проводят осветляющую фильтрацию и стерильный разлив в ампулы и бутылки.Conduct a full control of the physicochemical parameters of the semifinished product for toxicity and apyrogenicity in accordance with the values established in VFS 42B for the preparation - substance. Conduct bleaching filtration and sterile filling into ampoules and bottles.
Полученный согласно изобретению целевой продукт представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом следующего состава.Obtained according to the invention, the target product is a clear yellowish liquid with a specific smell of the following composition.
В 100 мл препарата содержится 0,07 г метилового эфира п-оксибензойной кислоты (ФС42-1460-80), до 100 мл препарата - субстанции ВФС 42Б, рН от 6,5 до 7,5.In 100 ml of the preparation contains 0.07 g of methyl ester of p-hydroxybenzoic acid (FS42-1460-80), up to 100 ml of the preparation contains the substance VFS 42B, pH 6.5 to 7.5.
Полученный предлагаемым способом препарат обладает высокой терапевтической активностью и специфичностью, заключающейся в его положительном влиянии на высшую нервную деятельность при заболеваниях, связанных с нарушением мозговых функций, что подтверждено лабораторными и клиническими испытаниями.Received the proposed method, the drug has a high therapeutic activity and specificity, which consists in its positive effect on higher nervous activity in diseases associated with impaired brain function, which is confirmed by laboratory and clinical trials.
Во время проведения сравнительных исследований ίη νίνο на экспериментальных моделях был обнаружен новый терапевтический эффект препарата, полученного заявляемым способом, такой как антигипоксическое защитное действие.During the comparative studies of ίη νίνο on experimental models, a new therapeutic effect of the preparation obtained by the claimed method, such as an antihypoxic protective effect, was discovered.
Согласно изобретению способ нормализации функции головного мозга заключается в применении посредством введения субъекту, нуждающемуся в данном лечении, терапевтически эффективного количества фармакологического средства, включающего в качестве активного начала целевой продукт, полученный указанным способом, и представляющий собой комплекс свободных аминокислот, пептидов и низкомолекулярных продуктов контролируемого протеолиза белков головного мозга эмбрионов крупного рогатого скота и фармакологически приемлемый носитель. Фармакологическое средство целесообразно применять в дозах от 2 до 50 мг в зависимости от характера течения и тяжести заболевания.According to the invention, the method of normalizing brain function consists in using, by administering to a subject in need of this treatment, a therapeutically effective amount of a pharmacological agent, including the target product obtained by the above method as active principle, which is a complex of free amino acids, peptides and low molecular weight products of controlled proteolysis brain proteins of cattle embryos and a pharmacologically acceptable carrier. Pharmacological agent is advisable to use in doses of 2 to 50 mg, depending on the nature of the course and severity of the disease.
Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа получения биологически активного препарата из ткани мозга и испытания биологической активности продукта, полученного заявляемым способом.The invention is illustrated by an example of a specific implementation of the method of obtaining a biologically active drug from brain tissue and testing the biological activity of the product obtained by the claimed method.
Пример.Example.
Исходное количество головного мозга эмбрионов коров укладывают в полиэтиленовые мешки и замораживают в морозильной камере при температуре (-5)-(-10)°С. Емкость с замороженным мозгом эмбрионов коров достают из морозильной камеры и оставляют в холодильной камере на 24 ч при температуре +10°С.The initial amount of the brain of cow embryos is placed in plastic bags and frozen in a freezer at a temperature of (-5) - (- 10) ° C. A container with frozen brain of cow embryos is taken out of the freezing chamber and left in the refrigerator for 24 hours at a temperature of + 10 ° C.
Сырье подвергают измельчению и гомогенизации.Raw materials are subjected to grinding and homogenization.
К полученной массе добавляют 9% раствор сульфата калия из расчета 0,5 кг раствора на 1 кг гомогената и выдерживают 5 мин при постоянном перемешивании. Полученный экстракт центрифугируют на стаканчатой центрифуге при скорости 3000 об./мин. Надосадочную жидкость (1-я фракция экстракта) собирают в емко5 сти, проводят повторную экстракцию 9% раствором сульфата калия и выдерживают при постоянном перемешивании 10 мин. Полуфабрикат размораживают при комнатной температуре и центрифугируют. Надосадочную жидкость собирают в емкости и охлаждают при температуре 5-10°С (2-я фракция экстракта). Осадок отбрасывают.To the resulting mass is added 9% solution of potassium sulfate at the rate of 0.5 kg of solution per 1 kg of homogenate and incubated for 5 minutes with constant stirring. The extract obtained is centrifuged in a glass centrifuge at a speed of 3000 rpm. The supernatant (1st fraction of the extract) is collected in a container, re-extracted with a 9% solution of potassium sulfate and incubated with constant stirring for 10 minutes. The semi-finished product is thawed at room temperature and centrifuged. The supernatant is collected in a container and cooled at a temperature of 5-10 ° C (2nd fraction of the extract). The precipitate is discarded.
Фильтрат очищают от высокомолекулярных белков с помощью ультрафильтрации на установках с мембранами ПС-100 и ПА-10, соединенных с реакторами, к которым подведено охлаждение. Ультрафильтрацию ведут около 1,5 ч. Ультрафильтрат собирают в емкость и стерилизуют. Для этого в полупродукт вводят стабилизатор хлорид натрия в конечной концентрации 1% при перемешивании. Затем по каплям добавляют стабилизатор 0,07% спиртовой раствор метилового эфира п-оксибензойной кислоты, контролируя рН полуфабриката. Значение рН должна быть 6,0-7,0.The filtrate is purified from high-molecular proteins using ultrafiltration on installations with PS-100 and PA-10 membranes connected to reactors, to which cooling is applied. Ultrafiltration lead about 1.5 hours. Ultrafiltrate is collected in a container and sterilized. To do this, the stabilizer is injected with a stabilizer sodium chloride at a final concentration of 1% with stirring. Then a stabilizer of 0.07% alcoholic solution of p-hydroxybenzoic acid methyl ester is added dropwise, controlling the pH of the semifinished product. The pH value should be 6.0-7.0.
Проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию препарата через фильтры «Ф»-15 и в асептических условиях разливают в ампулы.Spend clarifying and sterilizing filtration of the drug through filters "F" -15 and aseptically poured into ampoules.
Полученное лекарственное средство «Церебромедин» представляет собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом.The obtained drug "Cerebromedin" is a clear liquid of light yellow color with a slight specific smell.
Для изучения биологической активности препарата, полученного заявляемым способом, использовали экспериментальные модели, позволяющие оценить способность биологически активных веществ восстанавливать нарушенные функции головного мозга.To study the biological activity of the preparation obtained by the claimed method, experimental models were used to evaluate the ability of biologically active substances to restore impaired brain functions.
В исследованиях использовали культуры перевиваемых клеток глиомы крысы С6 в норме и экспериментальной гипоксии.In studies, cultures of transplantable C6 glioma cells in normal and experimental hypoxia were used.
Изучение возможного токсического влияния на организм препарата, полученного заявляемым способом, проводилось в соответствии с «Требованиями к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ», 1984 г., изданными Управлением по внедрению новых лекарственных препаратов и медицинской техники МЗ СССР. Цель изучения состояла в определении переносимых доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма и выявлении зависимости токсических эффектов от дозы и длительности препарата.The study of the possible toxic effects on the body of the drug obtained by the claimed method was carried out in accordance with the "Requirements for preclinical study of the general toxic effect of new pharmacological substances", 1984, issued by the Directorate for the introduction of new drugs and medical equipment of the Ministry of Health of the USSR. The purpose of the study was to determine the tolerated doses of the drug, assess the degree and nature of pathological changes in various organs and body systems, and identify the dependence of toxic effects on the dose and duration of the drug.
Влияние церебромедина на структурнофункциональное состояние клеток глиомы Сб в норме и при экспериментальной гипоксической гипоксииThe effect of cerebromedin on the structural and functional state of the cells of glioma C b in normal and experimental hypoxic hypoxia
При изучении действия церебромедина ίη νίΐτο использовали культуры перевиваемых клеток глиомы крысы Сб.When studying the action of cerebromedin ίη νίΐτο, cultures of transplanted rat glioma cells were used . C. b .
Гипоксическое воздействие на культуры осуществляли в герметичной камере с газовой смесью, содержащей 95% Ν2 и 5% СО2. Камеру помещали в термостат при 37°С на 20 ч. Иссле дование протекторного действия церебромедина проводили при его предварительном (за 30 мин до гипоксического воздействия) добавлении в питательную среду.Hypoxic effects on cultures were carried out in a sealed chamber with a gas mixture containing 95% 2 and 5% CO 2 . The chamber was placed in a thermostat at 37 ° С for 20 h. The study of the protective effect of cerebromedin was carried out with its preliminary (30 min before hypoxic exposure) added to the nutrient medium.
Для морфологического изучения культур их фиксировали фиксатором Дюбоск-БразильБуэна, окрашивали гемотоксилином Бемера и 0,5% раствором эозина. Прижизненное изучение культур и препаратов проводили в световом микроскопе, используя увеличение в 100-450 раз.For the morphological study of cultures, they were fixed with the fixer Dubosc-Brazilian Buena, stained with Hemer's Hetoxylin and 0.5% eosin solution. The lifetime study of cultures and preparations was performed under a light microscope, using a magnification of 100-450 times.
Всего было поставлено 4 серии опытов: контроль, контроль + церебромедин, гипоксия, гипоксия+церебромедин.A total of 4 series of experiments were performed: control, control + cerebromedin, hypoxia, hypoxia + cerebromedin.
Церебромедин вносили в культуру в дозах 20, 40, 60 мкг/мл.Cerebromedin was introduced into the culture in doses of 20, 40, 60 μg / ml.
Препараты культур клеток готовили на покровных стеклах при различных условиях культивирования.Cell culture preparations were prepared on cover glasses under various culture conditions.
Изучение токсичности разных серий церебромедина, вносимого в указанных выше дозах, показало, что препарат не токсичен и вызывает дифференцировку (созревание) клеток на 23 суток раньше, чем в контроле. При этом под влиянием церебромедина у большинства астроцитов появлялись длинные ветвящиеся отростки. Тело клеток, по сравнению с контрольными, уменьшалось в размере. В контроле аналогичные клетки появлялись в меньшем количестве и лишь на 5-8 сутки пассирования.The study of the toxicity of different series of cerebromedin, made in the above doses, showed that the drug is non-toxic and causes differentiation (maturation) of cells 23 days earlier than in the control. At the same time, under the influence of cerebromedin, most astrocytes appeared with long branching processes. The body of cells, compared with the control, decreased in size. In the control, similar cells appeared in a smaller number and only on 5-8 days of passage.
Отмеченные эффекты могут свидетельствовать о нейротрофическом действии церебромедина, которое характеризуется повышением переживаемости нейронов, а также способностью приостанавливать или снижать темпы прогрессирования дегенерации нейронов. Препарат проявляет нейротрофическую активность, сходную с таковой у факторов роста нейрональных структур.These effects may indicate a neurotrophic effect of cerebromedin, which is characterized by increased neuronal survival, as well as the ability to suspend or reduce the rate of progression of neuronal degeneration. The drug exhibits neurotrophic activity similar to that of growth factors of neuronal structures.
Изучение воздействия гипоксии на культуру клеток показало, что оно проявлялось замедлением роста, появлением отечных клеток, их вакуолизацией. Предварительное внесение в ростовую среду церебромедина в дозе 60 мкг/мл снижало угнетающий эффект гипоксии на пролиферативную активность клеток и вызывало дифференциацию клеток. В культуре появлялись клетки с длинными ветвящимися отростками, уменьшался размер площади клеток.The study of the effects of hypoxia on cell culture showed that it manifested itself as a growth retardation, the appearance of swollen cells, and their vacuolization. Preliminary introduction of cerebromedin at a dose of 60 µg / ml into the growth medium reduced the inhibitory effect of hypoxia on the proliferative activity of cells and caused cell differentiation. Cells with long branching processes appeared in culture, the size of the cell area decreased.
Таким образом, церебромедин оказывает нейропротекторное и нейротрофическое влияние на культуру глиальных клеток в условиях гипоксической гипоксии.Thus, cerebromedin has a neuroprotective and neurotrophic effect on the culture of glial cells under hypoxic hypoxia.
Действие церебромедина на митотическую активность астроцитов культуры клеток в норме и в условиях гипоксииThe effect of cerebromedin on the mitotic activity of astrocyte cell culture in normal and hypoxic conditions
На чертеже представлены данные о влиянии церебромедина на митотическую активность астроцитов, культивируемых в условиях гипоксии.The drawing presents data on the effect of cerebromedin on the mitotic activity of astrocytes cultured under hypoxic conditions.
Обозначения: 1 - контроль; 2 - гипоксия; 3 - гипоксия + церебромедин; 4 - контроль + церебромедин.Legend: 1 - control; 2 - hypoxia; 3 - hypoxia + cerebromedin; 4 - control + cerebromedin.
Для исследований была использована культура глиомы крысы Сб на 4 сутки роста ίη νίίτο. Культуру помещали в гипоксические условия на 24 ч. Для определения митотической активности подсчитывали в поле зрения микроскопа по 3000 клеток, выделяя среди них клетки, находящихся на различных стадиях деления. Полученные результаты показали, что гипоксия снижает митотическую активность культуры указанного вида клеток на 59,6%. При этом снижается количество делящихся клеток во всех фазах деления и особенно это проявляется в профазе (число делящихся клеток снижается на 94,3%).For research was used culture of glioma rats With b on the 4th day of growth ίη νίίτο. The culture was placed in hypoxic conditions for 24 hours. To determine mitotic activity, 3000 cells were counted in the field of view of the microscope, identifying cells in various stages of division among them. The results showed that hypoxia reduces the mitotic activity of the culture of the specified type of cells by 59.6%. This reduces the number of dividing cells in all phases of division, and this is especially evident in prophase (the number of dividing cells decreases by 94.3%).
Внесение в ростовую среду церебромедина в дозе 20 мкг/мл активирует митотическую активность в глиальных клетках на 45,2%. Число митотически делящихся клеток во всех фазах деления увеличивается, а в профазе и телофазе приближается к контрольным величинам.The introduction of cerebromedin at a dose of 20 µg / ml into the growth medium activates mitotic activity in glial cells by 45.2%. The number of mitotic dividing cells in all phases of division increases, while in prophase and telophase it approaches control values.
Влияние церебромедина на выживаемость лабораторных животных в условиях гипобарической гипоксииThe effect of cerebromedin on the survival of laboratory animals under hypobaric hypoxia
Следует отметить, что проблема резистентности организма к гипоксии требует учета индивидуальной чувствительности и особенностей реактивности, поэтому оценку антигипоксической активности лекарственных соединений проводили на сформированных группах высокои низкоустойчивых животных.It should be noted that the problem of resistance of the organism to hypoxia requires consideration of individual sensitivity and reactivity, therefore, the antihypoxic activity of medicinal compounds was evaluated on the formed groups of highly resistant animals.
Высотную гипоксию создавали, поднимая крыс на высоту 12000 м в барокамере с подогревом и приточно-вытяжной вентиляцией. На этой высоте животных выдерживали до гибели. Эффект исследуемых препаратов оценивали по продолжительности жизни крыс.High-altitude hypoxia was created by raising rats to an altitude of 12,000 m in a heated chamber with forced-air and forced-air ventilation. At this height, the animals were kept until death. The effect of the studied drugs was evaluated by the life expectancy of rats.
Протекторное (антигипоксическое) действие церебромедина исследовали при внутрибрюшинном (за 3 ч до подъема) введении его крысам-самцам массой 250-360 г. Препарат вводили в дозе 108 и 216 мг/кг. Оценку протекторных свойств церебромедина проводили в сравнении с препаратом церебролизат (ОАО Белмедпрепараты) и церебролизином фирмы Эбеве.The protector (antihypoxic) effect of cerebromedin was studied with an intraperitoneal (3 hours before lifting) administration to male rats weighing 250-360 g. The preparation was administered at a dose of 108 and 216 mg / kg. Evaluation of the protective properties of cerebromedin was carried out in comparison with the drug Cerebrolizat (Belmedpreparaty OJSC) and Erebe Cerebrolysin.
Как видно из данных, приведенных в табл. 1, при внутрибрюшинном введении церебромедина в дозе 108 мг/кг массы тела за 3 ч до подъема время выживания крыс увеличивается в среднем на 28%.As can be seen from the data given in table. 1, with intraperitoneal administration of cerebromedin at a dose of 108 mg / kg of body weight 3 hours prior to recovery, the survival time of rats increases on average by 28%.
При однократном введении церебромедина за 3 ч до подъема в дозе 216 мг/кг массы тела наблюдалось еще более значительное (до 70%, по сравнению с контролем) увеличение времени выживания крыс (табл. 2).With a single administration of cerebromedin 3 hours before the rise in a dose of 216 mg / kg of body weight, an even more significant (up to 70%, compared to control) increase in the survival time of rats was observed (Table 2).
Внутрибрюшинное введение препарата не оказывало существенного влияния на увеличение продолжительности жизни крыс в условиях гипоксии, церебролизин вызывал значительно меньший эффект, чем церебромедин (табл. 3, 4, 5).Intraperitoneal administration of the drug did not have a significant effect on the increase in the lifespan of rats under hypoxic conditions; cerebrolysin caused a much smaller effect than cerebromedin (Tables 3, 4, 5).
Таким образом, в условиях моделирования гипобарической гипоксии препарат церебромедин оказывает выраженное дозозависимое антигипоксическое действие. Сравнительное исследование действия церебролизата в условиях гипобарической гипоксии не выявило у него защитного эффекта. По сравнению с церебромедином церебролизин оказывал менее выраженное антигипоксическое действие.Thus, in terms of modeling hypobaric hypoxia, the drug cerebromedin has a pronounced dose-dependent antihypoxic effect. A comparative study of the effect of cerebrolysate under hypobaric hypoxia did not reveal a protective effect. Compared with cerebromedin, cerebrolysin had a less pronounced antihypoxic effect.
Таблица 1Table 1
Влияние однократного внутрибрюшинного введения церебромедина в дозе 108 мг/кг веса на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксииThe effect of a single intraperitoneal injection of cerebromedin at a dose of 108 mg / kg of weight on the survival time of rats in hypobaric hypoxia
Таблица 2table 2
Влияние однократного внутрибрюшинного введения церебромедина в дозе 216 мг/кг веса на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксииThe effect of a single intraperitoneal injection of cerebromedin at a dose of 216 mg / kg of weight on the survival time of rats in hypobaric hypoxia
Таблица 3Table 3
Влияние пятикратного внутрибрюшинного введения церебромедина в дозе 108 мг/кг (серия 1) за 3 ч до подъема на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксииThe effect of five-fold intraperitoneal administration of cerebromedin at a dose of 108 mg / kg (series 1) 3 hours before the rise in the time of survival of rats in hypobaric hypoxia
Таблица 4 Влияние внутрибрюшинного введения церебромедина (серия 1) в дозе 216 мг/кг в течение 5 дней на время выживания крыс в условиях гипоксической гипоксииTable 4 The effect of intraperitoneal administration of cerebromedin (series 1) at a dose of 216 mg / kg for 5 days for the survival time of rats under hypoxic hypoxia
Как видно из табл. 3-4, при внутрибрюшинном введении церебромедина (серии 1) в дозе 108-216 мг/кг веса в течение 5 дней наблюдается увеличение времени выживания лабораторных крыс на 97-147%.As can be seen from the table. 3-4, with intraperitoneal administration of cerebromedin (series 1) at a dose of 108-216 mg / kg of body weight for 5 days, an increase in the survival time of laboratory rats by 97-147% is observed.
Таблица 5 Влияние однократного внутрибрюшинного введения церебролизата (216 мг/кг массы тела) на время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксииTable 5 The effect of a single intraperitoneal injection of cerebrolysate (216 mg / kg body weight) on the survival time of rats in conditions of hypobaric hypoxia
Таблица 6Table 6
Влияние внутрибрюшинного введения церебролизата за 3 ч до подъемана время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксииEffect of intraperitoneal administration of cerebrolysate 3 h before the survival time of rats in conditions of hypobaric hypoxia
Как видно из данных в табл. 6, при внутрибрюшинном введении церебролизата в дозе 250 мг/кг веса за 3 ч до подъема увеличение времени выживания лабораторных крыс не наблюдается.As can be seen from the data in the table. 6, upon intraperitoneal administration of cerebrolysate at a dose of 250 mg / kg of body weight 3 h before the rise, no increase in the survival time of laboratory rats is observed.
Таблица 7Table 7
Влияние внутрибрюшинного введения церебролизина за 3 ч до подъемана время выживания крыс в условиях гипобарической гипоксииInfluence of intraperitoneal administration of cerebrolysin 3 h before the survival time of rats in conditions of hypobaric hypoxia is raised
Как видно из табл. 7, при внутрибрюшинном введении церебролизина в дозе 340 мг/кг веса за 3 ч до подъема увеличения времени выживания лабораторных крыс не наблюдается.As can be seen from the table. 7, with intraperitoneal administration of cerebrolysin at a dose of 340 mg / kg of body weight 3 hours before the increase, the increase in the survival time of laboratory rats is not observed.
Действие церебромедина на состояние нейрорегуляторных систем мозга крыс в норме и в условиях гипоксии Изучение уровня нейрональной активности проводили по показателям захвата меченных по 14С или 3Н-нейромедиаторов в синаптосомальной фракции коры мозга и гипоталамуса крыс, подвергнутых действию гипоксии с предварительным введением в течение 5 суток терапевтических доз церебромедина. Исследования показали, что через сутки после воздействия гипоксии в (ТК) экспериментальных животных обнаружено повышение на (15%) активности ГАМК-ергических процессов и резкое снижение процесса связывания 3Н-кортикостерона - до 25% от исходного. В гипоталамусе в этот же период уровень рецепции 3Н-кортикостерона, как и в ТК, находился ниже контрольного. Наблюдалось также снижение нейронального захвата холина и тормозных нейромедиаторов: ГАМК- и глицина. Полученные данные представлены в табл. 8-11.The effect of cerebromedin on the state of the neuroregulatory systems of the rat brain in normal and hypoxic conditions The study of the level of neuronal activity was carried out according to the rates of capture of 14 C labeled or 3 H neurotransmitters in the synaptosomal fraction of the cerebral cortex and hypothalamus of rats subjected to hypoxia with prior administration for 5 days therapeutic doses of cerebromedin. Studies have shown that a day after exposure to hypoxia in (TK) experimental animals, an increase of (15%) in the activity of GABA-ergic processes and a sharp decrease in the binding process of 3 H-corticosterone was found - up to 25% from the initial. In the hypothalamus in the same period, the level of reception of 3 H-corticosterone, as in TC, was below the control. There was also a decrease in the neuronal uptake of choline and inhibitory neurotransmitters: GABA- and glycine. The data obtained are presented in Table. 8-11.
Важно подчеркнуть, что в контрольной серии через 2 ч после гипоксического воздействия в этой структуре мозга отмечена активизация холинергических процессов, при одновременном резком падении интенсивности обратного захвата ГАМК и значительном снижении рецепторного связывания кортикостерона.It is important to emphasize that in the control series 2 h after hypoxic exposure in this structure of the brain marked activation of cholinergic processes, with a simultaneous sharp drop in the intensity of GABA reuptake and a significant decrease in receptor binding of corticosterone.
Исследования показали, что уже через сутки межмедиаторные взаимоотношения в коре мозга, нарушенные при гипоксии, в основном, восстанавливаются, однако, при этом сохраняется низкий уровень глюкокортикоидного связывания рецепторными системами мозга.Studies have shown that within a day the intermediary relationships in the cerebral cortex, disturbed during hypoxia, are mostly restored, however, at the same time, the level of glucocorticoid binding by the receptor systems of the brain remains low.
Выявленные изменения нейромедиаторных процессов, индуцированные введением церебромедина, происходят также при пониженном уровне кокортикоидной рецепции как в коре мозга, так и гипоталамусе. Как уже указывалось, это может косвенно характеризовать вы11 сокий уровень гормонов в периферической крови при сохранности обратной связи в системе гипоталамус-кора надпочечников.The revealed changes in neurotransmitter processes induced by cerebromedin also occur with a reduced level of cocorticoid reception in both the cortex and hypothalamus. As already mentioned, this can indirectly characterize a high level of hormones in the peripheral blood with the preservation of feedback in the hypothalamus-adrenal cortex system.
Пятидневное введение церебромедина интактным животным подтвердило высокий эффект данного препарата. В ТК - на фоне пониженного уровня глюкокортикоидной рецепции отмечено повышение активности холин- и ГАМК-ергических процессов на 99 и 72% соответственно. В ГТ - отмечена иная картина снижение активности ГАМК- и, незначительно, глицинергических процессов, а также повышение активности обратного захвата холина и рецепции кортикостерона на 42 и 62% соответственно. Обнаруженные изменения нейромедиаторных взаимоотношений свидетельствуют о выраженном нейротропном эффекте изучаемого препарата.The five-day administration of cerebromedin intact animals confirmed the high effect of this drug. In TC, against the background of a reduced level of glucocorticoid reception, an increase in the activity of choline and GABA-ergic processes was noted by 99 and 72%, respectively. In GT, a different picture was noted of a decrease in the activity of GABA-and, slightly, glycinergic processes, as well as an increase in the activity of choline reuptake and corticosterone reception by 42 and 62%, respectively. The detected changes in neurotransmitter relationships indicate a pronounced neurotropic effect of the studied drug.
Изучение эффектов биорегулирующей терапии с помощью церебромедина, введенного до и сразу после гипоксического воздействия, выявило у экспериментальных животных повышение активности холинергических процессов в теменной зоне коры больших полушарий головного мозга, некоторое снижение ГАМКергической активности и повышение (на 30%) рецепции кортикостерона, правда не достигающей исходного контрольного уровня.Studying the effects of bioregulatory therapy using cerebromedin, introduced before and immediately after the hypoxic exposure, revealed in experimental animals an increase in the activity of cholinergic processes in the parietal zone of the cerebral cortex, a slight decrease in GABAergic activity and an increase (by 30%) in the reception of corticosterone, though not reaching original control level.
В гипоталамусе отмечена тенденция к смягчению эффекта гипоксии. К этому сроку сохранена несколько повышенная глицинергическая активность. Наблюдается повышение процесса накопления ГК-гормонов при пониженом уровне холин- и глицинергических процессов. Кроме того, повышенный уровень ГКсвязывания рецепторами гипоталамуса свидетельствует о тенденции к нормализации уровня и этих гормонов, адаптации их содержания в периферической крови.In the hypothalamus there is a tendency to mitigate the effect of hypoxia. By this time, a slightly increased glycinergic activity was preserved. An increase in the accumulation of GK hormones is observed with a decreased level of choline and glycinergic processes. In addition, an increased level of GK-binding by the receptors of the hypothalamus indicates a tendency to normalize the level of these hormones, the adaptation of their content in peripheral blood.
Выявленные элементы нормализации нейромедиаторных процессов, реализуемые на уровне структур ЦНС, свидетельствуют о гомеостатических эффектах церебромедина. Возможно, более значимые эффекты могут иметь место при длительной биорегулирующей терапии.The identified elements of the normalization of neurotransmitter processes, implemented at the level of the structures of the central nervous system, indicate the homeostatic effects of cerebromedin. Perhaps more significant effects may occur with prolonged bioregulatory therapy.
Таким образом, в условиях нашего эксперимента выявлено протективное влияние церебромедина на нервную ткань, проявляющееся в сглаживании характерных для гипоксического воздействия нарушений нейромедиаторных взаимоотношений в структурах ЦНС.Thus, under the conditions of our experiment, the protective effect of cerebromedin on nervous tissue was revealed, which is manifested in smoothing the disturbances in neurotransmitter relationships characteristic of the hypoxic effect in the structures of the central nervous system.
Обнаруженное угнетение ГАМКергической активности в области ГТ сопровождается интенсификацией иных тормозных механизмов, в частности, глицинергических, обеспечивающих высокий компенсаторный уровень тормозной нейромедиаторной синаптической активности, что способствует снижению метаболической активности нервных клеток.The observed inhibition of GABAergic activity in the field of HT is accompanied by the intensification of other inhibitory mechanisms, in particular, glycinergic, providing a high compensatory level of inhibitory neurotransmitter synaptic activity, which contributes to a decrease in the metabolic activity of nerve cells.
Таблица 8Table 8
Интенсивность нейронального захвата 3Н-холина в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных (ΌΡΜ/шд сырой ткани/мин)Intensity of neuronal uptake of 3 N-choline in brain structures of white rats during hypoxia, cerebromedin administration, hypoxia on the background of pre-administration of cerebromedine and a control animal series (ш / sd of raw tissue / min)
Таблица 9Table 9
Рецепторное связывание 3Н-кортикостерона в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных ( РМ/ сырой ткани/мин)Receptor binding of 3 H-corticosterone in the structures of the brain of white rats during hypoxia, administration of cerebromedin, hypoxia on the background of prior administration of cerebromedin and the control series of animals (PM / raw tissue / min)
Таблица 10Table 10
Интенсивность нейронального захвата 14С-ГАМК в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных (ΌΡΜ/тд сырой ткани/мин)Intensity of neuronal uptake of 14 C-GABA in brain structures of white rats during hypoxia, cerebromedin, hypoxia with prior administration of cerebromedin and control animals (ΌΡΜ / etc raw tissue / min)
Таблица 11Table 11
Интенсивность нейронального захвата 14С-глицина в структурах мозга белых крыс при гипоксии, введении церебромедина, гипоксии на фоне предварительного введения церебромедина и контрольной серии животных (ΌΡΜ/тд сырой ткани/мин)The intensity of neuronal uptake of 14 C-glycine in the brain structures of white rats during hypoxia, cerebromedin administration, hypoxia on the background of pre-administration of cerebromedin and the control animal series (ΌΡΜ / etc raw tissue / min)
Действие церебромедина на содержание и индуцированное аминолевулиновой кислотой накопление эндогенных порфиринов в структурах головного мозга крыс в норме и после воздействия гипоксии В данном разделе представлены результаты индуцируемого аминолевулиновой кислотой (АЛК) накопления безметальных порфиринов в культуре нейрональных клеток С6 после гипоксического воздействия на фоне введения церебромедина. Установлено, что при внесении в ростовую среду АЛК в культуре клеток С6 наблюдается увеличение количества эндогенных пигментов. Наиболее выражено накопление НН: его содержание в среднем составляет 65% от общего количества синтезированных порфиринов. Исследования показали, что процесс накопления порфиринов в контрольной культуре (не подвергавшейся воздействию гипоксии) стимулируется церебромедином. Наибольшее увеличение концентрации пигментов в глиальных клетках зарегистрировано нами при использовании церебромедина в концентрации 60 мкг/мл. Культивирование клеток в условиях дефицита кислорода в данной серии эксперимента приводило к ингибированию (в 1,3 раза) АЛК-индуцированного накопления клеточных пигментов. Внесение в среду инкубации перед помещением образцов в гипоксическую камеру церебромедина в концентрации 60 мкг/мл уменьшало, а в концентрации 120 мкг/мл полностью снимало гипоксииндуцированные изменения.The effect of cerebromedin on the content and induced by aminolevulinic acid accumulation of endogenous porphyrins in the brain structures of rats in normal conditions and after exposure to hypoxia It has been established that when ALA is introduced into the growth medium in C6 cell culture, an increase in the number of endogenous pigments is observed. HH accumulation is most pronounced: its content averages 65% of the total number of synthesized porphyrins. Studies have shown that the process of porphyrin accumulation in a control culture (not exposed to hypoxia) is stimulated by cerebromedin. The greatest increase in the concentration of pigments in glial cells was registered by us when using cerebromedin at a concentration of 60 μg / ml. Cultivation of cells under conditions of oxygen deficiency in this series of experiments led to inhibition (1.3 times) of ALA-induced accumulation of cellular pigments. Introduction to the incubation medium before placing the samples in the hypoxic chamber of cerebromedin at a concentration of 60 μg / ml decreased, and at a concentration of 120 μg / ml completely removed the hypoxia-induced changes.
Основой всех функциональных нарушений, возникающих при гипоксии, является недостаточность клеточных энергообразующих систем. Известно, что непременными участниками протекающих в клетках энергетических процессов являются гемопротеиды, темы и свободные порфирины. Дефицит кислорода перестраивает метаболические процессы и это может проявляться в изменении биосинтеза многих важных биологических субстратов, в том числе таких, как порфирины. Общие представления об особенностях порфиринового обмена могут быть получены из анализа показателей, характеризующих количественное содержание отдельных пигментов - НН, КН, УН и скорость их АЛК-индуцированного образования. Нами показано, что в ранние сроки (2 ч) после острого гипоксического воздействия в коре мозга крыс наблюдается увеличение количества НН и УП. Исследование содержания отдельных порфиринов на 2-е сутки постгипоксического периода позволило обнаружить пролонгированный эффект действия гипоксии на концентрацию порфиринов в данной структуре мозга. Выявленные изменения имели ту же направленность, что и в ранний постгипоксический период, и выражались в некотором увеличении количества ПП и достоверном возрастании УП (в 1,6 раза).The basis of all functional disorders arising during hypoxia is the insufficiency of cellular energy-generating systems. It is known that hemoproteins, themes and free porphyrins are indispensable participants of the energy processes occurring in the cells. Oxygen deficiency rebuilds metabolic processes and this can manifest itself in a change in the biosynthesis of many important biological substrates, including such as porphyrins. General ideas about the features of porphyrin metabolism can be obtained from the analysis of indicators characterizing the quantitative content of individual pigments - LV, CN, CN, and the rate of their ALA-induced formation. We have shown that in the early stages (2 h), after an acute hypoxic effect, an increase in the number of NN and UE is observed in the cortex of the rats. The study of the content of individual porphyrins on the 2nd day of the post-hypoxic period allowed us to detect a prolonged effect of hypoxia on the concentration of porphyrins in this brain structure. The revealed changes had the same direction as in the early post-hypoxic period, and were expressed in a slight increase in the number of PP and a significant increase in UE (1.6 times).
Исследование влияния церебромедина на метаболизм порфиринов в коре мозга здоровых крыс свидетельствует об увеличении концентрации пигментов после ежедневного введения препарата в течение 5 дней.The study of the effect of cerebromedin on the metabolism of porphyrins in the cerebral cortex of healthy rats indicates an increase in the concentration of pigments after daily administration of the drug for 5 days.
При введении церебромедина крысам, перенесшим кислородную недостаточность, уровень НП в коре мозга возвращался к контрольному.When cerebromedine was administered to rats that had oxygen deficiency, the NP level in the cerebral cortex returned to the control.
Еще более наглядно действие препарата на порфиринообразование проявляется при анализе кинетических характеристик АЛК-индуцированного накопления эндогенных пигментов. Введение церебромедина крысам приводит к увеличению скорости синтеза порфиринов в коре мозга как контрольных животных, так и подвергнутых гипоксическому воздействию. Установлено, что через 17 ч инкубации гомогенатов ткани мозга с АЛК (0,8 мМ, 37°С) количество образуемых ПП и УП в образцах, полученных от крыс с введенным церебромедином, превышало накопление порфиринов в коре мозга в норме в 2,2 и 3,5 раз соответственно. Резкое увеличение АЛК-индуцированного синтеза пигментов выявлено и в коре мозга гипоксических крыс, которым вводился препарат.Even more clearly, the effect of the drug on porphyrin formation is manifested in the analysis of the kinetic characteristics of ALA-induced accumulation of endogenous pigments. The administration of cerebromedin to rats leads to an increase in the rate of porphyrin synthesis in the cerebral cortex of both control animals and those subjected to hypoxic exposure. It was established that after 17 hours of incubation of brain tissue homogenates with ALA (0.8 mM, 37 ° C), the number of formed PP and UE in samples obtained from rats with cerebromedin administered exceeded the accumulation of porphyrins in the cerebral cortex in a normal 2.2 and 3.5 times respectively. A sharp increase in ALK-induced pigment synthesis was also detected in the cortex of the hypoxic rats to which the drug was injected.
В стволе мозга контрольных животных церебромедин также вызывал увеличение суммарного содержания порфиринов в 1,2 раза. В группе опытных крыс введение препарата восстанавливало количество порфиринов, сниженное после гипоксии. Препарат вызывал увеличение индуцированного АЛК накопления порфиринов в стволе мозга «гипоксических» крыс.In the brain stem of control animals, cerebromedin also caused an increase in the total content of porphyrins by a factor of 1.2. In the group of experienced rats, administration of the drug restored the amount of porphyrins, which was reduced after hypoxia. The drug caused an increase in ALK-induced accumulation of porphyrins in the brainstem of “hypoxic” rats.
Приведенные данные свидетельствуют о выраженном влиянии церебромедина на биосинтетические процессы в коре мозга животных в норме и при гипоксии. В стволе мозга эффекты церебромедина менее выражены, что может быть связано с избирательной чувствительностью структур мозга к данному препарату.These data indicate a pronounced effect of cerebromedin on biosynthetic processes in the cerebral cortex of animals in normal conditions and during hypoxia. In the brain stem, the effects of cerebromedin are less pronounced, which may be due to the selective sensitivity of brain structures to this drug.
Проведенные сравнительные исследования действия близких аналогов церебромедина церебролизата (ОАО Белмедпрепараты) и цереброкурина (Украина) на биосинтез порфиринов в суспензионной культуре иммунокомпетентных клеток показали, что все исследуемые лекарственные формы - церебромедин, цереброкурин и церебролизат обладают выраженным влиянием на АЛК-индуцированное накопление порфиринов в спленоцитах. Однако эффект цереброкурина отличается направленностью действия от двух других препаратов. В то время как церебромедин (60 мкг/мл) и церебролизат (120 мкг/мл) характеризуются резко выраженным увеличением накопления пигментов, цереброкурин (60 мкг/мл) вызывает угнетение АЛКидуцированного синтеза более чем в 1,5 раза. В условиях гипоксии действие цереброкурина, в отличие от церебромедина и церебролизата, проявляется в еще большем угнетении биосинтетических процессов, приводящем к гибели клеток мозговой ткани. Важным фактором, определяющим степень гипоксического поражения клеток, является состояние клеточных мембран.Comparative studies of the action of close analogues of cerebromedin cerebrolisate (Belmedpreparaty OJSC) and cerebrocurin (Ukraine) on porphyrin biosynthesis in suspension culture of immunocompetent cells showed that all of the studied dosage forms - cerebromedin, cerebrocurin, and the same program that is provided by the program is also applied to the list of the programs provided by the program is also applied to the list of the 108 programs is also applied to the list of the 108 programs that are provided by the 108 subtracts is also a part of the 108 programs is also applied to the list of the 108 programs that are provided by the 108 subtracts is the same program that is also used by the 17 However, the effect of cerebrocurin is different direction of action from the other two drugs. While cerebromedin (60 µg / ml) and cerebrolizat (120 µg / ml) are characterized by a pronounced increase in the accumulation of pigments, cerebrocurin (60 µg / ml) inhibits ALK-induced synthesis by more than 1.5 times. Under hypoxic conditions, the action of cerebrocurin, in contrast to cerebromedin and cerebrolysate, is manifested in an even greater inhibition of biosynthetic processes, leading to the death of brain tissue cells. An important factor determining the degree of hypoxic cell damage is the state of the cell membranes.
На вторые сутки постгипоксического периода нами обнаружено увеличение связывания Мц 540 со спленоцитами и тимоцитами крыс на 48 и 40% соответственно, в то же время различий в связывании отрицательно заряженного зонда АНС не установлено. Такие изменения мембран при неизменном поверхностном заряде могут быть обусловлены увеличением количества жидкокристаллических липидных доменов, а также модификацией белкового окружения, в результате которого гидрофобные области белка становятся более доступными для Мц54о. Исследования, проведенные с помощью флуоресцентного зонда пирена, не противоречат этим выводам. Действительно, наблюдается тенденция к «разжижению» липидного бислоя и уменьшение вязкости анулярного липида.On the second day of the posthypoxic period, we found an increase in binding of Mc 540 with splenocytes and rat thymocytes by 48 and 40%, respectively, while the differences in binding of the negatively charged ANS probe were not established. Such changes in membranes with a constant surface charge may be due to an increase in the number of liquid crystalline lipid domains, as well as modification of the protein environment, as a result of which the hydrophobic regions of the protein become more accessible to Mc 54o . Studies conducted with a pyrene fluorescent probe do not contradict these findings. Indeed, there is a tendency to “dilute” the lipid bilayer and a decrease in viscosity of the anular lipid.
Введение животным церебромедина после гипоксии приводит к норме все тестируемые флуоресцентные параметры спленоцитов, не изменяя аналогичные параметры в контроле. В суспензии тимоцитов влияние церебромедина проявлялось в уменьшении по сравнению с контролем вязкости липидного бислоя.The introduction of cerebromedin to animals after hypoxia leads to the normalization of all tested fluorescent parameters of splenocytes, without changing the same parameters in the control. In the suspension of thymocytes, the effect of cerebromedin was manifested in a decrease in lipid bilayer viscosity compared to control.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о чувствительности клеток иммунной системы к исследуемым препаратам и выраженном влиянии цитомединов на метаболизм эндогенных порфиринов в условиях гипоксии. Показана высокая активность церебромедина в отношении спленоцитов как ίη νίΐτο, так и ίη νίνο. Обнаружена стимуляция церебролизатом и ингибирование цереброкурином синтеза клеточных пигментов. Установлено, что предварительное введение крысам церебромедина в течение 5 суток до острого гипоксического воздействия предотвращает изменения в клеточных мембранах спленоцитов и сглаживает реакцию тимоцитов на гипоксию.Thus, the results obtained indicate the sensitivity of immune cells to the studied drugs and the pronounced effect of cytomedines on the metabolism of endogenous porphyrins under hypoxic conditions. High activity of cerebromedine was shown in relation to splenocytes as ίη νίΐτο, and ίη νίνο. Cerebrolysate stimulation and cerebrourine inhibition of the synthesis of cellular pigments have been found. It was established that prior administration of cerebromedin to rats for 5 days prior to acute hypoxic exposure prevents changes in the cell membranes of splenocytes and smoothes the response of thymocytes to hypoxia.
Таким образом в результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что препарат церебромедин обладает нейропротективными свойствами как ίη νίνο на культуре клеток, так и ίη νίΐτο на уровне целостного организма животных.Thus, as a result of experimental studies, it has been established that the drug cerebromedin has neuroprotective properties both on cell culture and on the level of the whole animal organism.
Церебромедин, вносимый в ростовую среду, не оказывает токсического воздействия и вызывает глиотрофический эффект в культуре глиальных клеток.Cerebromedin, introduced into the growth medium, does not have a toxic effect and causes a gliotrophic effect in the culture of glial cells.
Являясь пептидергическим нейромодулятором, препарат оказывает высокоспецифическое действие на мозг за счет взаимодействия с биологически активными пептидами.Being a peptidergic neuromodulator, the drug has a highly specific effect on the brain due to its interaction with biologically active peptides.
На основании экспериментальных можно выделить три тесно взаимосвязанных и взаимно дополняющих компонента нейропротективной активности церебромедина - метаболическая регуляция, нейромодуляция и нейротрофическое действие.Based on the experimental data, three closely interrelated and mutually complementary components of the cerebromedin neuroprotective activity can be distinguished: metabolic regulation, neuromodulation and neurotrophic action.
Благодаря комплексу перечисленных фармакологических эффектов церебромедин повышает переживаемость нейронов в условиях ишемии (гипоксии) и в определенной мере предупреждает их гибель.Due to the complex of the listed pharmacological effects, cerebromedin increases the survival rate of neurons in conditions of ischemia (hypoxia) and, to a certain extent, prevents their death.
Исследования, проведенные с целью установления характера и выраженности повреждающего действия церебромедина на организм экспериментальных животных и оценки его безопасности, показали следующее:Studies conducted to determine the nature and severity of the damaging effect of cerebromedin on the organism of experimental animals and assess its safety showed the following:
1. При изучении острой токсичности установлено, что препарат в изученных дозах практически нетоксичен (ЛД50 определить не удалось).1. In the study of acute toxicity found that the drug in the studied doses is practically non-toxic (LD 50 could not be determined).
Максимальная доза, которая была введена мышам, составляла 25,0 мл/кг, крысам - 25,0 мл/кг.The maximum dose that was administered to mice was 25.0 ml / kg, to rats - 25.0 ml / kg.
2. При изучении ряда специфических видов токсичности установлено: церебромедин не обладает мутагенным, эмбриотоксическим, кожно-раздражающим, токсическим кожнорезорбтивным, аллергенным, анафилактогенным действием, а также не оказывает токсического влияния на иммуннитет.2. In the study of a number of specific types of toxicity, it has been established: cerebromedin does not have mutagenic, embryotoxic, skin-irritating, toxic skin-resorptive, allergenic, anaphylactogenic effects, and also has no toxic effect on immunity.
3. Изучение препарата в хроническом эксперименте при ежедневном внутрибрюшинном или внутривенном введении не выявило какихлибо существенных функциональных и структурных нарушений со стороны жизненно важных систем организма животных.3. The study of the drug in a chronic experiment with daily intraperitoneal or intravenous administration did not reveal any significant functional and structural impairments of the vital systems of the animals.
4. Контроль исходного материала, субстанции и экспериментальных серий препарата, проводимый нами в течение 4 лет изготовления и изучения церебромедина, подтверждает отсутствие прионов как в исходном сырье, так и в готовом препарате.4. The control of the starting material, substance and experimental batches of the preparation, carried out by us during 4 years of manufacture and study of cerebromedin, confirms the absence of prions both in the raw materials and in the finished preparation.
Анализ результатов, полученных при токсикологическом исследовании, позволяет сделать заключение о том, что препарат характеризуется низкой токсичностью и в изученных концентрациях является безвредным для организма подопытных животных. В процессе исследования препарата не выявлены какие-либо побочные эффекты.Analysis of the results obtained in toxicological studies, allows to conclude that the drug is characterized by low toxicity and in the studied concentrations is harmless to the body of experimental animals. During the study of the drug, no side effects were identified.
Использованная литератураReferences
1. Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологичекая композиция и ее применение. Патент РФ № 2104702, 1998.02.20, Бюл. № 5.1. The method of obtaining from the animal stock a complex of biologically active polypeptides that normalize brain function, a pharmacological composition and its use. The patent of the Russian Federation № 2104702, 1998.02.20, Bull. No. 5
2. Рекламный проспект фирмы «Эбеве», Австрия, «Церебролизин».2. Advertising brochure of the company "Ebeve", Austria, "Cerebrolysin".
3. Способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции центральной нервной системы. Патент РФ № 2128511, 1997.02.28.3. A method of obtaining a therapeutic agent for diseases involving dysfunction of the central nervous system. The patent of the Russian Federation № 2128511, 1997.02.28.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200000634A EA003301B1 (en) | 2000-04-28 | 2000-04-28 | Method for preparing a medicament from brain tissue of animal embryo and pharmaceutical composition based thereon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200000634A EA003301B1 (en) | 2000-04-28 | 2000-04-28 | Method for preparing a medicament from brain tissue of animal embryo and pharmaceutical composition based thereon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200000634A1 EA200000634A1 (en) | 2001-10-22 |
| EA003301B1 true EA003301B1 (en) | 2003-04-24 |
Family
ID=28051671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200000634A EA003301B1 (en) | 2000-04-28 | 2000-04-28 | Method for preparing a medicament from brain tissue of animal embryo and pharmaceutical composition based thereon |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA003301B1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012002840A1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-01-05 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin |
| WO2012166004A1 (en) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex with a specific activity on the nervous system, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2485133C2 (en) * | 2011-05-30 | 2013-06-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex possessing tissue-specific regenerative-reparative and rejuvenating action on skin tissue, method for preparing it, and pharmaceutical composition thereof |
| RU2460736C1 (en) * | 2011-05-30 | 2012-09-10 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex (ppc) possessing tissue specific repair and rejuvenating action on skin tissue, method for preparing protein-polypeptide complex possessing tissue specific repair and rejuvenating action on skin tissue, and pharmaceutical composition of ppc possessing antihypoxic, immunomodulatory, tissue specific repair and rejuvenating action on skin tissue and mucous membranes, with rejuvenating effect |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2413912A1 (en) * | 1978-01-10 | 1979-08-03 | Bontemps Raymond | Frozen biogenic foetal material in normal saline - for regeneration and re-organisation of cells |
| EP0249563A1 (en) * | 1986-06-12 | 1987-12-16 | Gérard Laumond | Embryonic animal organ tissue extracts useful as stimulating agents for human organic metabolic functions |
| WO1998011905A1 (en) * | 1996-09-20 | 1998-03-26 | Adriana Carluccio | Pharmaceutical composition containing an embryonic or gravid uterus extract as an active substance and relative preparation process |
| RU2116793C1 (en) * | 1995-05-17 | 1998-08-10 | Зозуля Андрей Александрович | Method of preparing substances complex showing antiinflammatory, wound-healing effect, inhibiting lipids peroxidation, optimizing functional state of thymus in old animals |
| RU2128510C1 (en) * | 1997-06-23 | 1999-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "НИР" | Method of preparing agent for treatment of patients with brain neoplasms |
-
2000
- 2000-04-28 EA EA200000634A patent/EA003301B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2413912A1 (en) * | 1978-01-10 | 1979-08-03 | Bontemps Raymond | Frozen biogenic foetal material in normal saline - for regeneration and re-organisation of cells |
| EP0249563A1 (en) * | 1986-06-12 | 1987-12-16 | Gérard Laumond | Embryonic animal organ tissue extracts useful as stimulating agents for human organic metabolic functions |
| RU2116793C1 (en) * | 1995-05-17 | 1998-08-10 | Зозуля Андрей Александрович | Method of preparing substances complex showing antiinflammatory, wound-healing effect, inhibiting lipids peroxidation, optimizing functional state of thymus in old animals |
| WO1998011905A1 (en) * | 1996-09-20 | 1998-03-26 | Adriana Carluccio | Pharmaceutical composition containing an embryonic or gravid uterus extract as an active substance and relative preparation process |
| RU2128510C1 (en) * | 1997-06-23 | 1999-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "НИР" | Method of preparing agent for treatment of patients with brain neoplasms |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012002840A1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-01-05 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin |
| RU2445106C1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-03-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system disorders of cardiovascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis |
| EA024732B1 (en) * | 2010-07-01 | 2016-10-31 | Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin |
| WO2012166004A1 (en) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex with a specific activity on the nervous system, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
| EP2730584A1 (en) * | 2011-05-30 | 2014-05-14 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" | Protein-polypeptide complex with a specific activity on the nervous system, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
| EP2730584A4 (en) * | 2011-05-30 | 2014-12-03 | Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo Pharm Sintez | Protein-polypeptide complex with a specific activity on the nervous system, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200000634A1 (en) | 2001-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | L‐leucine promotes axonal outgrowth and regeneration via mTOR activation | |
| EP2589390B1 (en) | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin | |
| Garcia-Alvarez et al. | Inhibition of glial proliferation, promotion of axonal growth and myelin production by synthetic glycolipid: A new approach for spinal cord injury treatment | |
| CN103028110A (en) | Novel use of antisecretory factor | |
| WO2009088314A1 (en) | Method for producing a biologically active complex exhibiting neuroregenerative and neuroprotective activity | |
| US20090252786A1 (en) | Use of a Biologically Active Blood Serum for the Treatment of a Disorder Characterized in a Reduced Function of a GABA Receptor | |
| BR112020020318A2 (en) | COMPOSITIONS FOR SKIN TREATMENT | |
| EA003301B1 (en) | Method for preparing a medicament from brain tissue of animal embryo and pharmaceutical composition based thereon | |
| US20100303887A1 (en) | DHA and PEDF, a Therapeutic Composition for Nerve and Retinal Pigment Epithelial Cells | |
| RU2275924C2 (en) | Method for preparing complex of biologically active polypeptides for normalization of brain function and pharmaceutical agent based on thereof | |
| EP2730584B1 (en) | Protein-polypeptide complex obtained from nervous tissue of hoofed livestock embryos, process for preparing same and pharmaceutical composition | |
| WO2012087180A1 (en) | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature | |
| GB2568928A (en) | Neuroprotective composition, preparation process thereof and medical uses thereof | |
| RU2701566C1 (en) | Protein-peptide complex having a protective action on the state of tissues of the posterior eye - scleral shell, retina, pigment epithelium, choroid | |
| Stelmashook et al. | GK-2 reduces death of cultured granule neurons in cerebellum induced by the toxic effects of zinc ions | |
| CN102188447A (en) | Preparation method for cerebroprotein hydrolysate in piracetam cerebroprotein hydrolysate tablets | |
| Wang et al. | In vitro study of the effects of lens extract on rat retinal neuron survival and neurite outgrowth | |
| EA010735B1 (en) | Medicament normalising reproductive male function and method for preparing thereof | |
| RU2771678C1 (en) | Biologically active substance and pharmaceutical composition in the form of sterile aqueous dispersion for conjunctival in the form of drops and subjunctival, para -, retrobulbar injection administration in the conducted therapies of vascular and dysmetabolic ophthalmological diseases | |
| US20190167724A1 (en) | Neuroprotective composition, preparation process thereof and medical uses thereof | |
| RU2787479C1 (en) | Kit of a pharmacological agent intended for improving the blood flow in the cerebral cortex and restoring motor and cognitive functions of the body | |
| Petrenko et al. | The role of dysmetabolic mechanisms in the development of neurodegenerative processes in an experimental metabolic-cognitive syndrome model | |
| RU2716819C1 (en) | Protein-peptide complex and drug preparation agent, which is protein-peptide complex | |
| Gergin et al. | The effects of melatonin on the striatum. | |
| RU2744411C1 (en) | Method for reducing alcoholic motivation in mice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): BY RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): BY RU |