一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中脑蛋白水解物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种吡拉西坦脑蛋白水解物片中脑蛋白水解物的制备方法,具体地说,涉及一种由从除人以外的哺乳动物脑组织中提取的含有特异性多肽以及包括游离赖氨酸和游离谷氨酸在内的多种氨基酸的脑蛋白水解物,属于生物制剂领域。
背景技术
脑组织中的游离氨基酸含量以谷氨酸为最高,其次是牛磺酸,再就是天冬氨酸。谷氨酸是大脑内主要兴奋性神经递质。脑损伤可能导致脑组织离子失衡,引起与谷氨酸和其他兴奋性氨基酸相关的兴奋毒性级联反应,并导致最初损伤部位周围脑组织的神经元死亡。赖氨酸是八种必需氨基酸之一,它在生物机体的代谢中起着重要的作用,赖氨酸缺乏会引起蛋白质功能障碍,影响生长发育,导致生长障碍。因植物性蛋白中普遍缺乏赖氨酸,故营养学家称之为“第一必须氨基酸”。赖氨酸在医药上具有特殊的用途,它是合成脑神经及生殖细胞、核蛋白、血红蛋白的必须物质。
随着人口自然增长、结构老龄化以及饮食结构的变化,老年疾病的发生日趋严重,其中脑血管病主要致死病之一。动物脑蛋自水解物类药物作为这类疾病的特效药,近年来得到了广泛关注,它的化学成分、药理作用、临床应用、生产工艺等都得到不同程度的研究。
已面市的脑蛋自水解物类药物主要成分都是动物脑脱脂后再经蛋白酶降解产生的含有游离氨基酸和分子量在10,000以下的小分子肽的混合物,但具体药效成分有差别,如脑蛋白水解物注射液是由猪脑组织中提取的不含蛋白质,约含80%游离氨基酸和20%小分子肽,与进口脑活素为同类产品,在临床上作为脑代谢改善药取的了不错的疗效。脑蛋白水解物能增加脑组织内葡萄糖和氧的利用,从而增加脑组织抗氧能力和机体应激能力,减轻脑组织损伤,促进脑细胞功能恢复,具有良好的健脑、益智、修复脑损伤的功效。但注射剂的应用除了一些不便外,同时也存在不少不良反应。
因此,有必要寻找一种成分更合理、效果更好、服用更方便的脑代谢改善药物。本发明的脑蛋白水解物能与吡拉西坦合理配伍,且使成分产生良好的协同作用,可以用于制备吡拉西坦脑蛋白水解物片。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脑蛋白水解物,由除人以外的哺乳动物脑组织中提取得到。
本发明的另一目的在于提供上述脑蛋白水解物的制备方法。
本发明的最后一目的是提供上述脑蛋白水解物在制备治疗急慢性脑血管疾病、由脑血管疾病或脑外伤所引起的脑代谢障碍等后遗症、先天性脑发育不全、中枢神经系统感染、闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿药物方面的用途。
本发明所述的脑蛋白水解物由从除人以外的哺乳动物脑组织中提取得到,含有特异性多肽以及包括游离赖氨酸和游离谷氨酸在内的多种氨基酸,所有组分分子量为5000~10000道尔顿以下。
所述的除人以外的哺乳动物为猪、狗、牛、羊、鹿、马或兔,从生产成本、生产工艺、产品质量稳定性、临床疗效等因素考虑,上述除人以外的哺乳动物优选猪。
所述的脑蛋白水解物中多肽∶游离赖氨酸∶游离谷氨酸的重量份比为1~200∶0.1~100∶01~80。
该脑蛋白水解物中多肽∶游离赖氨酸∶游离谷氨酸的重量份比进一步优选为3~40∶0.3~30∶0.3~20;同时所有组分分子量优选为6000~8000道尔顿;
该脑蛋白水解物中多肽∶游离赖氨酸∶游离谷氨酸的重量份比更优选为15~30∶3~15∶2~6;并且所有组分分子量优选为8000道尔顿。
本发明所述的脑蛋白水解物的制备方法为:
取除人以外的哺乳动物脑组织,加0.5~2.5倍重量注射用水,高压匀浆,在-30℃~-40℃下冷冻,冻实后在10~40℃融化后,加热至80~95℃,保持15~30分钟,然后自然降温至常温,在0~5℃下以10000~12000转/分的速度在高速冷冻离心机上离心15~30分钟,然后分离上清液和沉淀,上清液备用;
向沉淀中加入0.1~1.5%沉淀重量的蛋白水解酶,在35~50℃下酶解2~8小时,酶解PH值控制为7.5~8.5,然后加入前述上清液,调节pH值至3.0~4.0,加热至80~95℃,保持15~30分钟后,自然降温至常温后,在0~5℃下以3500~4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心20~30分钟,然后将上清液过滤,滤液调pH值为6.5~7.5,加热至80~95℃,保持15~30分钟后,自然降温至常温,在0~5℃下以3500~4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心20~30分钟,离心后的上清液在-15℃~-20℃冷冻,冻实后在室温下融化,过滤,滤液用截留分子量为5000~10000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物。
所述的高压匀浆优选使用GRB1500-4S高压匀浆泵(上海东华高压匀浆厂)。
动物脑组织应为新鲜健康。
所述蛋白水解酶可以是胃蛋白酶或胰蛋白酶;优选使用胰蛋白酶;所述胰蛋白酶常用规格为1∶250(上海伯奥生物科技有限公司)。
酶解适合温度为35~50℃,优选为37~42℃;为保持温度稳定,可采取夹层水浴保温的方法。
酶解适合pH值为7.5~8.5,优选为7.8~8.2。
为使本发明生产工艺、产品质量稳定,使用的酶应尽可能由固定生产商提供。
所述的过滤为现有技术中通用的纸浆过滤或澄清板过滤。
上述过程调pH值使用盐酸和/或氢氧化钠。
上述超滤膜优选为截留分子量为6000~10000的超滤膜,更优选截留分子量为8000的超滤膜。使用的超滤膜为市售产品,其生产商应为行业认可的生产单位,使用的滤膜型号与尺寸可根据具体的生产量、选用的超滤器尺寸来确定。
本发明所述的脑蛋白水解物中氨基氮含量达到总氮含量的40%~50%,可用于制备复方吡拉西坦脑蛋白水解物片。
本发明所述的脑蛋白水解物的制备方法优选为:
取新鲜健康的哺乳动物脑组织,加0.8~1.2倍重量注射用水,用高压匀浆泵匀浆,-30℃~-40℃速冻,在10~20℃下融化;加热至80~85℃,保持15~20分钟,冷却至常温后在高速冷冻离心机上离心,0~5℃条件下以10000~12000转/分离心25~30分钟,上清液备用;沉淀加入按重量加入0.4~0.8%的胰蛋白酶,在37~42℃酶解3~5小时,酶解pH值控制为7.8~8.2,酶解结束将前述上清液加入,调节pH值至3.3~3.7,加热至80~90℃,保持15~20分钟,冷却至常温后在低速冷冻离心机上离心,0~5℃条件下以4000转/分的速度离心25~30分钟。上清液过滤,滤液调PH值为6.8~7.2,加热至80~90℃,保持15~20分钟,冷却至常温后在低速冷冻离心机上离心,0~5℃条件下以4000转/分的速度离心25~30分钟,上清液-15℃~-20℃冷冻,冷冻后融化,再经过滤处理,滤液用截留分子量为8000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物。
本发明所述脑蛋白水解物含有一种大脑所特有的肽能神经营养物,能以多种方式作用于中枢神经,调节和改善神经元的代谢,促进突触的形成,诱导神经元的分化,并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。
所述脑蛋白水解物可通过血脑屏障,促进脑内蛋白质的合成,影响呼吸链,具有抗缺氧的保护能力,改善脑内能量代谢,可激活腺苷酸环化酶和催化其他激素系统,提供神经递质,肽类激素及辅酶前体;可用于老年痴呆、脑供血不足,老年脑力退化及抑郁症;帕金森氏综合症的支持治疗;脑神经功能障碍、精神分裂症;神经衰弱,神经性头痛;先天性大脑发育迟缓、发育不全、智力低下,记忆障碍等;脑外伤急性期及其后遗症;各类型脑炎、脑膜炎急性期及其后遗症;促进神经外科手术(脑肿瘤、颅脑外伤、脑血管炎症等)脑神经组织修复;对脑代谢不全有辅助改善作用,也用于蛋白质缺乏、神经衰弱病人以及对一般蛋白质消化吸收障碍的病例;可用于制备治疗脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病,颅脑外伤及脑血管疾病、脑供血不全、脑梗塞所引起的脑代谢障碍及后遗症,闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿,先天性脑发育不全、中枢神经系统感染、老年性痴呆,周围神经损伤疾病药物。
本发明在现有工艺上进行了多年的研究,出人意料的发现,将一般生化实验室中应用的低温高速离心应用到制备脑蛋白水解物中,可以收集到更多的低分子量活性多肽和重要的氨基酸,同时也将大分子的蛋白酶沉淀下来,避免了对活性物质的降解;本发明经过多次试验,发现其中氨基酸以赖氨酸、谷氨酸为主,较一般工艺富集,同时在药理、临床试验中也发现了积极的效果。
本发明所述的药物组合物含有治疗脑血管疾病及其引起的脑代谢障碍后遗症的活性物质,该活性物质能调节和改善脑代谢。
本发明所述的药物组合物含有治疗脑血管疾病及其引起的脑代谢障碍后遗症的活性物质,包括大量活性多肽和多种氨基酸。脑提取液所含的大量活性多肽、多种氨基酸等能透过血脑屏障,以多种形式作用于中枢神经,调整和改善神经元代谢,并影响其呼吸链,具有激活、改善脑内神经递质和酶的活性,保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。能增加脑组织对葡萄糖的利用,改善脑细胞缺氧状态,对缺氧的脑组织具保护作用。可应用于制备治疗脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病药物方面的用途,可用于治疗颅脑外伤及脑血管疾病(脑供血不全、脑梗塞)所引起脑代谢障碍等后遗症,以及作为治疗闭塞综合症、动脉硬化、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿与先天性脑发育不全、中枢神经系统感染、老年性痴呆等药物中的应用。
具体实施方式
实施例1
取新鲜健康的猪脑10Kg,加10L注射用水,使用高压匀浆泵(GRB1500-4S,上海东华高压匀浆)匀浆,在-35℃下冷冻,冻实后在15℃融化后,加热至80℃,保持15分钟,然后自然降温至常温,在4℃下以10000转/分的速度在高速冷冻离心机上离心30分钟,然后分离上清液和沉淀,上清液备用;
向沉淀中加入0.5%沉淀重量的胰蛋白酶[Trypsin,1∶250,Amresco 0458],在37℃下酶解4小时,酶解pH值控制为8.0,然后加入前述上清液,调节pH值至3.5,加热至80℃,保持15分钟后,自然降温至常温后,在4℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心25分钟,然后将上清液过滤,滤液调pH值为7.0,加热至85℃,保持15分钟后,自然降温至常温,在4℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心25分钟,离心后的上清液在-15℃冷冻,冻实后在室温下融化,过滤,滤液用截留分子量为8000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物,其特异性多肽含量为20mg/ml,游离赖氨酸含量为10mg/ml、游离谷氨酸含量为5mg/ml。
实施例2
取新鲜健康的狗脑10Kg,加10L注射用水,高压匀浆,在-35℃下冷冻,冻实后在20℃融化后,加热至85℃,保持15分钟,然后自然降温至常温,在1℃下以10000转/分的速度在高速冷冻离心机上离心25分钟,然后分离上清液和沉淀,上清液备用;
向沉淀中加入0.3%沉淀重量的胰蛋白酶[Trypsin,1∶250,Amresco 0458],在40℃下酶解4小时,酶解pH值控制为8.0,然后加入前述上清液,调节pH值至3.0,加热至85℃,保持20分钟后,自然降温至常温后,在2℃下以3500转/分的速度在低速冷冻离心机上离心30分钟,然后将上清液过滤,滤液调pH值为7.0,加热至85℃,保持30分钟后,自然降温至常温,在2℃下以3500转/分的速度在低速冷冻离心机上离心30分钟,离心后的上清液在-20℃冷冻,冻实后在室温下融化,过滤,滤液用截留分子量为6000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物,其特异性多肽含量为15mg/ml,游离赖氨酸含量为10mg/ml、游离谷氨酸含量为2mg/ml。
实施例3
取新鲜健康的牛脑10Kg,加15L注射用水,高压匀浆,在-30℃下冷冻,冻实后在30℃融化后,加热至90℃,保持30分钟,然后自然降温至常温,在2℃下以11000转/分的速度在高速冷冻离心机上离心20分钟,然后分离上清液和沉淀,上清液备用;
向沉淀中加入0.1%沉淀重量的胰蛋白酶[Trypsin,1∶250,Amresco 0458],在45℃下酶解6小时,酶解pH值控制为7.5,然后加入前述上清液,调节pH值至3.5,加热至90℃,保持25分钟后,自然降温至常温后,在1℃下以3500转/分的速度在低速冷冻离心机上离心25分钟,然后将上清液过滤,滤液调pH值为7.5,加热至90℃,保持20分钟后,自然降温至常温,在1℃下以3500转/分的速度在低速冷冻离心机上离心25分钟,离心后的上清液在-20℃冷冻,冻实后在室温下融化,过滤,滤液用截留分子量为10000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物,其特异性多肽含量为3mg/ml,游离赖氨酸含量为15mg/ml、游离谷氨酸含量为15mg/ml。
实施例4
取新鲜健康的羊脑10Kg,加20L注射用水,高压匀浆,在-35℃下冷冻,冻实后在35℃融化后,加热至95℃,保持20分钟,然后自然降温至常温,在3℃下以12000转/分的速度在高速冷冻离心机上离心15分钟,然后分离上清液和沉淀,上清液备用;
向沉淀中加入0.8%沉淀重量的胃蛋白酶,在50℃下酶解2小时,酶解pH值控制为8.5,然后加入前述上清液,调节pH值至4.0,加热至95℃,保持30分钟后,自然降温至常温后,在5℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心25分钟,然后将上清液过滤,滤液调pH值为7.5,加热至80℃,保持25分钟后,自然降温至常温,在5℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心25分钟,离心后的上清液在-15℃冷冻,冻实后在室温下融化,过滤,滤液用截留分子量为5000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物,其特异性多肽含量为40mg/ml,游离赖氨酸含量为5mg/ml、游离谷氨酸含量为10mg/ml。
实施例5
取新鲜健康的马脑10Kg,加25L注射用水,高压匀浆,在-40℃下冷冻,冻实后在40℃融化后,加热至80℃,保持25分钟,然后自然降温至常温,在4℃下以12000转/分的速度在高速冷冻离心机上离心25分钟,然后分离上清液和沉淀,上清液备用;
向沉淀中加入1.5%沉淀重量的胃蛋白酶,在40℃下酶解4小时,酶解pH值控制为8.0,然后加入前述上清液,调节pH值至3.5,加热至85℃,保持25分钟后,自然降温至常温后,在4℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心20分钟,然后将上清液过滤,滤液调pH值为6.5,加热至85℃,保持15分钟后,自然降温至常温,在4℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心20分钟,离心后的上清液在-15℃冷冻,冻实后在室温下融化,过滤,滤液用截留分子量为8000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物,其特异性多肽含量为65mg/ml,游离赖氨酸含量为20mg/ml、游离谷氨酸含量为4mg/ml。
实施例6
取新鲜健康的兔脑10Kg,加15L注射用水,高压匀浆,在-30℃下冷冻,冻实后在15℃融化后,加热至85℃,保持25分钟,然后自然降温至常温,在5℃下以11000转/分的速度在高速冷冻离心机上离心30分钟,然后分离上清液和沉淀,上清液备用;
向沉淀中加入1.0%沉淀重量的胃蛋白酶,在45℃下酶解5小时,酶解pH值控制为8.5,然后加入前述上清液,调节pH值至3.0,加热至80℃,保持20分钟后,自然降温至常温后,在0℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心30分钟,然后将上清液过滤,滤液调pH值为7.0,加热至90℃,保持30分钟后,自然降温至常温,在0℃下以4000转/分的速度在低速冷冻离心机上离心30分钟,离心后的上清液在-20℃冷冻,冻实后在室温下融化,过滤,滤液用截留分子量为6000超滤膜超滤,超滤液即为脑蛋白水解物,其特异性多肽含量为25mg/ml,游离赖氨酸含量为13mg/ml、游离谷氨酸含量为11mg/ml。
实验例1
本实验例为本发明最优制备方法所得脑蛋白水解物粉末的性状、PH值、蛋白质检查项目的检测。
本品为淡黄色或棕黄色粉末或块状物。
pH值:取本品0.5g,加水50ml溶解,依法测定(中国药典2005年版二部附录VI H),PH在5.0~7.0。
蛋白质:取本品0.2g,加水2ml溶解,加20%磺基水杨酸溶液2ml,混匀,不得发生混浊或沉淀。
实验例2
本实验例为本发明最优制备方法所得脑蛋白水解物粉末的定性测定。
取本品约200mg,加水20ml,充分研磨,滤过,滤液供下述试验:
(1)取供试品溶液5ml,加茚三酮试液数滴,加热,溶液应显蓝紫色。
(2)取供试品溶液5ml,加氢氧化钠溶液(6→10)2ml,至碱性,加数滴0.5%硫酸铜溶液,即显蓝紫色。
以上实验为本发明水解物的定性反应,说明本发明水解物中含有确定的组份。
实验例3
本实验例为脑蛋白水解物中总氮定量测定。
取本品10ml,精密称定,依法测定(中国药典2000年版二部附录VII D第二法)。
实验例4
本实验例为脑蛋白水解物中氨基氮定量测定。
取本品10ml,用0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液,调节PH值至7.0,然后加入预先调节PH值至9.0的甲醛溶液10ml,搅匀,用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液的PH值为9.0,按加入甲醛溶液后所消耗的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)的量(ml)计算。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于1.401mg的氨基酸。
通过三批测定,每g含量结果见表1:
表1
批号 |
总氮 |
氨基氮 |
20101224 |
86mg |
40.5mg |
20101225 |
91mg |
41.8mg |
20101226 |
89mg |
40.7mg |
由以上实验例可知:该脑蛋白水解物符合标准,其中氨基氮达到总氮的40%~50%,可用于制备复方吡拉西坦脑蛋白水解物片。