CN113559240A - 珍珠多肽液、分离提取工艺及其促进伤口愈合的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种珍珠提取物，特别涉及一种珍珠多肽液、分离提取工艺及其促进伤口愈合的应用，属于生物技术领域。一种珍珠多肽液的分离提取工艺，该工艺包括如下步骤：将珍珠超细粉与1±0.5wt％PBS溶液混合，珍珠超细粉与PBS溶液的用量比为1∶(4±0.5)g/mL，采用超临界二氧化碳萃取仪进行珍珠粉中小分子肽提取，收集萃取后混合液，于5000±1000rpm高速离心机离心10‑15min，收集上层液体，即为珍珠多肽液。本发明提供的珍珠多肽液，该珍珠多肽液经特殊的处理工艺，去除了珍珠粉中主要物质碳酸钙，保留了具有生物活性的蛋白原液，避免了珍珠粉在后续应用中由碳酸钙和钙离子带来的不利影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种珍珠提取物，特别涉及一种珍珠多肽液、分离提取工艺及其促进伤口愈合的应用，属于生物技术领域。
背景技术
珍珠是由沙子等外来异物刺激蚌的外套膜，促使其分泌大量珍珠质再把异物一层层地包裹起来形成地。珍珠既是一种高档的首饰装饰用品，还是一种名贵的中药材、化妆品和营养保健品，其药用保健及美容功效早在明代李时珍所著《本草纲目》卷四六和其他医药典籍中就有记载。
珍珠主要成分为文石结构的碳酸钙，约占82-93％，主要活性成分为蛋白质(水解后可得到18种氨基酸，其中7种是人体必需氨基酸)，并含有20多种微量元素及维生素B。珍珠粉含有多种微量元素，是参与机体代谢的重要营养素。丰富的Ca含量可以维持钙吸收处高水平的细胞代谢活性，它对维持细胞生物膜生理功能、酶功能的控制、激素分泌均具有调节作用，维持细胞膜内外跨膜活性状态，组织间充足的Ca含量保证了细胞间信息的传递，维持细胞间正常的代谢状态。诱导血液蛋白纤维生成而促进血液凝固，并能控制毛细血管在组织间的渗透性。实现皮肤组织高效率修复。
传统的珍珠粉给药方法是将珍珠碾碎成粉内服或外用，由于技术限制，珍珠粉研磨不充分，机体较难吸收，药效较差。现代科学技术采用不同加工方法区别出非水溶性珍珠粉和水溶性珍珠粉两种类型，非水溶性珍珠粉通常通过各种工艺粉碎珍珠粉，粒径越小，药效越强，但是由于珍珠坚硬的结构，粉碎工艺难度大，成本高；而水溶性珍珠粉通常由水解方法而得，水溶性珍珠粉中的钙与微量元素为离子状态，应用于人体后，较大的分散度增强了在人体接触处的吸收，极大提升了利用率。有研究表明水溶性珍珠粉中的蛋白质、氨基酸、钙、锰、锌等无机元素含量均高于普通珍珠粉，且水溶性珍珠粉可划分为无毒级别，无遗传毒性，可长期服用，故临床上推荐使用水溶性珍珠粉。目前工业上实现高效率水溶性珍珠粉的提取方法有乳酸水解法、酶水解法、酸-酶水解法、酶-酸水解法，通过酸或酶水解将珍珠中文石结构不可溶碳酸钙、蛋白质水解成可溶的钙离子，多肽、游离氨基酸以及无机元素，提高人体吸收率但是酸或酶水解可能将蛋白质水解成多肽，而非其原型蛋白，影响其活性的发挥。
在护肤品或化妆品应用中，珍珠粉中的碳酸钙不利于产品的制备，原因主要有两点：第一，碳酸钙属于弱酸强碱盐，pH比较高，化妆品配方pH一般控制在4.0-8.5，所以对产品pH影响比较大，影响产品质量；第二，碳酸钙属于离子型化合物，会电离出部分钙离子，与化妆品很多原料有配伍冲突，影响产品的稳定性。因此，需要对珍珠粉进一步处理，在保留珍珠粉活性成分的基础上有效去除碳酸钙和钙离子成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种珍珠多肽液，该珍珠多肽液经特殊的处理工艺，去除了珍珠粉中主要物质碳酸钙，保留了具有生物活性的蛋白原液，避免了珍珠粉在后续应用中由碳酸钙和钙离子带来的不利影响。
本发明还提供一种所述珍珠多肽液的制备方法。
本发明还提供一种所述珍珠多肽液的促进伤口愈合的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种珍珠多肽液的分离提取工艺，该工艺包括如下步骤：将珍珠超细粉与1±0.5wt％PBS溶液混合，珍珠超细粉与PBS溶液的用量比为1：(4±0.5)g/mL，采用超临界二氧化碳萃取仪进行珍珠粉中小分子肽提取，收集萃取后混合液，于5000±1000rpm高速离心机离心10-15min，收集上层液体，即为珍珠多肽液。
本发明方法中，PBS溶液使珍珠粉溶解，进行后续萃取工艺，PBS溶液代替了常规处理工艺中的水(一般是水溶即可)这是因为：在水与珍珠粉体系中，水会使部分碳酸钙溶解成可溶的钙离子，而钙离子会破坏珍珠粉中蛋白质的结构，进而使制得的产品中含有部分非珍珠粉原型蛋白。
超临界流体(SCF)指物质在所处环境中，压力与温度超过特定值时呈现出存在于液体与气体之间的状态。这种流体具有类气体扩散系数和粘度、类液体密度以及压力依赖性溶剂能力的特性。通过调节压力和温度两个参数可改变SCF的溶剂能力，使得目标化合物在特定参数下溶于SCF，又在另一参数下析出，实现各种性质物质的提取。
二氧化碳(CO2)是最流行的超临界流体萃取(SFE)溶剂，价格便宜，环保，允许在相对较低的压力和近室温下进行超临界操作。目前CO2超临界提取技术在天然产品萃取方面应用十分广泛，研究较为完善的主要是脂溶性物质的萃取，当目标萃取物是极性化合物时，通过补充极性溶剂，可以大大提高提取率。
所述超临界二氧化碳萃取仪的设置参数为：温度：37±2℃；压力：25±2MPa；时间：2-3h。
作为优选，所述的珍珠超细粉满足：粒径≥1μm的珍珠粉≥55％(体积)，粒径≤5μm的珍珠粉≥90％(体积)。
一种珍珠多肽液，其是由所述的珍珠多肽液的分离提取工制得。
一种珍珠多肽液在促进伤口愈合及皮肤修护方面的应用。
一种珍珠多肽液在护肤品、化妆品或药品制备中的应用。
一种护肤品、化妆品或药品，含有本发明所述的珍珠多肽液。
作为优选，以蛋白质总重量计，每mL护肤品、化妆品或药品中，珍珠多肽液的添加量为5mg/mL至15mg/mL。
作为优选，以蛋白质总重量计，每mL护肤品、化妆品或药品中，珍珠多肽液的添加量为5mg/mL至10mg/mL。
一种珍珠多肽组合物，其主要是由以下29种蛋白组成：ARG42316.1、ALK87063.1、AWN56485.1、ARG42317.1、ASQ40997.1、ADG26659.1、QAV56625.1、AHY35316.1、AKN91188.1、ABW86313.1、AEB70965.1、ARH52598.1、QDQ19191.1、AKE25951.1、QDF82057.1、AWM99734.1、AFO53263.1、QJF53848.1、ADU57251.1、QAV56624.1、ASN79565.1、QOQ50640.1、ABO93627.2、ABJ89824.1、QCR63936.1、AFS33112.1、AHK22785.1、AIG62900.1、QBG58751.1。该珍珠多肽组合物可促进伤口愈合及皮肤修护，可用于护肤品、化妆品或药品的制备用。
本发明的有益效果是：
1、本发明经特殊的超临界二氧化碳萃取工艺得到一种具有生物活性的珍珠多肽液，去除了珍珠粉中主要物质碳酸钙，保留了具有生物活性的蛋白原液，避免了珍珠粉在后续应用中由碳酸钙带来的不利影响；
1、相对于传统水提取法，本发明的提取工艺得到了珍珠粉中的原型蛋白，蛋白提取率较高，材料、时间等成本花费上具有优势；
2、经试验证明，本发明的珍珠多肽液能够促进成纤维细胞的迁移，对细胞L929、MEF，其迁移能力最强的浓度为25ug/mL，且表现出加速伤口愈合的能力；对细胞基本无毒性；
3、珍珠多肽液在促进伤口愈合及皮肤修护方面的功效显著，伤口修复快。试验中，5mg/mL至15mg/mL浓度的珍珠多肽液均具有促进创面愈合的能力，而10mg/mL珍珠多肽液组创面愈合效果显著，愈合率为99.91±0.16，并非浓度越高越好。珍珠多肽液组的再上皮化效率更高，胶原纤维更丰富，表皮更完整。
4、本发明还提供了一组可实现上述促进伤口愈合及皮肤修护效果的29种蛋白的多肽组合物。
附图说明
图1是蛋白质浓度标准曲线；
图2是不同处理方法得到的珍珠粉粒径对比图:(a)珍珠粗粉，(b)珍珠常规水提取粉，(c)超临界流体萃取珍珠粉(SFE)，(d)三种珍珠的粒径比较粉末，(e)两种提取方法提取2小时后蛋白质提取率的比较速率＝萃取质量/珍珠粉原始质量；
图3是不同蛋白质浓度的珍珠多肽液对L929，MEF细胞存活率的对比图；
图4是不同蛋白质浓度的珍珠多肽液对L929，MEF细胞迁移率的对比图，其中，
(a)和(b)是不同成分分别处理L929细胞(a)、MEF细胞(b)的照片，分别是阴性组、5ug/mL、25ug/mL和50ug/mL的珍珠多肽液、阳性组，其中阴性组是不含任何其他成分的空白培养基，阳性组是2ng/mL的生长因子；
(c)和(d)是不同成分分别处理L929细胞(c)、MEF细胞(d)引起细胞迁移程度的定量数据比较图，分别是阴性对照组、5ug/mL、25ug/mL和50ug/mL的珍珠多肽液、2ng/mL的生长因子；
图5是Wistar小鼠全层皮肤切除创面模型体内创面愈合情况。(a)伤口形成时及两周后的图像采集，(b)于创面形成后2、7、9天量化创面愈合率(***，p<0.0001；**，p<0.001；*，p<0.05)；
图6是伤后9天masson三色染色的组织切片图像，其中放大5倍(a)和10倍(b)；
图7是细胞划痕试验2的细胞迁移率的检测结果；
图8是细胞活性试验的细胞存活率的检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实验仪器与材料
珍珠粉(浙江长生鸟珍珠生物科技有限公司)；PBS(赛默飞世尔科技有限公司)；BCA试剂(上海源叶生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(赛默飞世尔科技有限公司)；
超临界流体萃取仪(Waters SFE 100沃特世科技有限公司)；台式高速冷冻离心机(D3024R青岛弗瑞德实验设备有限公司)；低速震荡仪(MH-1海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；多功能酶标仪(Victor3V美国PerkinElmer)；冻干机(FD-1000上海爱朗仪器有限公司)。
DMEM培养基(赛默飞世尔科技有限公司)；抗生素(上海麦克林生化科技有限公司)；牛血清白蛋白(赛默飞世尔科技有限公司)；MTT试剂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；DMSO(北京百奥莱博科技有限公司)；胰蛋白酶(上海翊圣生物科技有限公司)；
细胞培养箱(CLM-170B-8-NF新加坡艺思高科技有限公司)；倒置显微镜(DMi1徕卡)；台式高速冷冻离心机(D3024R青岛弗瑞德实验设备有限公司)；细胞划痕插件(上海臻和生物科技有限公司)；多功能酶标仪(Victor3V美国PerkinElmer)；倒置荧光显微镜(AXIOOBSERVER A1德国)。
液相色谱(Ultimate 3000HPLC系统，Thermo Fisher Scientific)；质谱(ThermoFisher Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS，Thermo Fisher Scientific产品(检定证书编号：YH2019-17077))；数据采集系统(Thermo Xcalibur 3.0.63)超滤管(Millipore)；C18柱(waters)。
以下实施例中珍珠粗粉与珍珠超细粉粒径的要求：
| 珍珠粗粉 | 珍珠超细粉 | |
| 粒径＞5μm(范围内体积分数)/％ | ≥80 | — |
| 粒径≥1μm(范围内体积分数)/％ | — | ≥55 |
| 粒径≤5μm(范围内体积分数)/％ | — | ≥90 |
实施例
1、珍珠超细粉的超临界流体二氧化碳萃取
称取10g珍珠超细粉，溶解于40mL 1％PBS溶液中，采用超临界二氧化碳萃取仪进行珍珠粉中小分子肽提取，收集萃取后混合液，于5000rpm高速离心机离心10-15min，收集上层液体。
超临界二氧化碳萃取仪的设置参数为：温度：37±2℃；压力：25±2MPa；时间：2-3h。
经二氧化碳超临界流体萃取技术提取到约15mL提取液(珍珠多肽液)，为淡黄色，略澄清液体；固体部分依旧为白色粉末状。
2、蛋白质浓度测定方法
本发明采用BCA试剂检测法检测提取液中蛋白质总量。
(1)标准蛋白浓度测定
配制标准蛋白溶液：准确称取1.0mg牛血清白蛋白于1.5ml离心管，加入1.0mL PBS配为1mg/mL的标准蛋白液，随后稀释成750ug/mL、500ug/mL、250ug/mL、125ug/mL、0ug/mL。
制备标准曲线：将试剂A与试剂B按体积比为50：1混匀，各取25uL蛋白质标准溶液、200uL工作液加到微孔板中，置于低速震荡仪震荡30s，使溶液混合均匀；37℃下孵育30min；用酶标仪检测样品在562nm处的吸光值。通过作图得到吸光值与蛋白质浓度的关系。
如图1所示，为蛋白浓度标准曲线，吸光度与蛋白质浓度在0～1000ug/mL呈线性相关关系，相关度良好。
(2)珍珠多肽液中蛋白质浓度测定
同上述方法，测得样品在562nm处的吸光度，利用标准曲线计算珍珠多肽液中的蛋白质浓度。经检测，步骤1中得到的珍珠多肽液中蛋白质浓度为257.47ug/mL，用超临界二氧化碳技术实现了有效的珍珠粉成分的提取，且提取率较高。
发明人对提取后的珍珠粉末进行动态光散射测定珍珠粉末形态，并比较了3种珍珠粉的粒径：(a)珍珠粗粉，(b)珍珠常规水提取粉，(c)本发明的超临界流体萃取珍珠粉(SFE)，结果如图2所示，其中与原始珍珠粉颗粒，常规法提取物对比，超临界流体提取所剩得的珍珠粉粒径明显减小。
常规水提液：取10g超细珍珠粉，溶于50ml 1％PBS溶液中，在室温下，持续搅拌得到的混悬液，经固液分离后，液相为珍珠常规水提取液(以下简称水提液)，固相为残余珍珠粉，即图2中的(b)珍珠常规水提取粉。
试验证明，本发明所述的超临界CO2提取工艺能够高效提取珍珠肽类成分。
酸水解提取物中只有分子量为5kDa-50kDa的蛋白分子，酶水解提取物中的蛋白分子量则小于14kDa，可见酸水解提取法比较剧烈,将珍珠粉中的蛋白过度水解,导致提取物中蛋白含量较低。酶水解提取法较温和,将珍珠粉中结合蛋白充分水解提取出,而且将提取物中大分子蛋白水解成小分子,导致提取物中蛋白含量较高且分子量都是小于14kDa,因此酸水解和酶水解法珍珠粉提取物中的蛋白均不是珍珠粉中的原型蛋白，传统固液提取法蛋白提取率最低。
使用超临界CO2提取工艺的蛋白提取率显著提高,经BCA法测定蛋白质含量验证该工艺确实有效提取出珍珠蛋白，并且同传统方法相比，在材料、时间等成本花费上具有优势。
应用例珍珠多肽液对皮肤愈合活性的效果证明试验
1、基于MTT的细胞存活率试验
MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基溴化四唑鎓)测定法是一种在相对高通量(96孔板)中测量活细胞数量的方法。
MTT分析的原理是：在活细胞中，线粒体得数量与活性几乎是一致的，因此活细胞数量的增加或减少与线粒体活性线性相关。细胞的线粒体可与MTT反应转化为甲臜晶体，通过分析形成甲臜晶体的多少，可以进一步推断活细胞数量。当甲臜晶体溶于DMSO中时液体呈紫色，可通过测量光密度反映甲臜浓度，进而检测出活细胞数。本试验采用MTT法来考察在珍珠多肽液环境下MEF细胞增长程度，同时也可以检测珍珠多肽液对MEF细胞的毒性。
(1)将细胞培养至适当状态，用胰蛋白酶消解，调节合适的细胞数，于培养箱培养适当时间至细胞单层产生。
(2)设置8种不同浓度：50ug/mL、25ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.1ug/mL、0ug/mL 6个平行对照，各组均用含不同浓度珍珠多肽液的无血清培养基，正常条件培养。
(3)24小时后，弃去培养液，加入10uL的5mg/mL MTT溶液，于培养箱培养。
(4)4小时后，小心弃去液体，各加入100uLDMSO溶液至充分溶解。
(5)测定各孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率。
2、细胞划痕试验1
利用细胞划痕插件培养细胞，待细胞铺满后，用镊子小心移去插件，在细胞单层中得到宽度几乎一致的“划痕”，利用倒置荧光显微镜摄取划痕图像；各孔添加500uL不同浓度珍珠多肽液的无血清的培养基，培养箱培养；于12h摄取图像；利用细胞迁移面积来计算迁移率；
3、细胞划痕试验2
创面划痕试验用于体外模拟创面愈合过程中细胞的迁移。使用细胞划痕插入物培养L929细胞，将细胞铺满孔板底部后，用镊子小心取出插入物，在细胞单层内获得均匀宽度的“划痕”，并用倒置荧光显微镜拍摄划痕图像。各孔用含不同浓度(5、25、50μg/mL蛋白浓度)的珍珠粉提取液的DMEM细胞培养基培养。阳性对照组加入2ng/mL生长因子，6个平行孔，37℃，5％CO2孵育24h。24h拍摄图像，利用Image J测量迁移面积计算迁移速率，结果见图8。
4、细胞活性试验
研究珍珠多肽液对细胞活性的影响。将L929细胞培养至适当状态，用胰蛋白酶消化，调整到适当的细胞数量，在培养箱中孵育合适的时间，设置6种不同浓度的超临界提取液和常规水提液(以蛋白质浓度衡量):0μg/mL、0.45μg/mL、0.9μg/mL、1.8μg/mL、3.5μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL。正常条件下，各组用含不同浓度珍珠粉提取液的无血清培养基孵育24h后。加入5mg/mL MTT溶液10μl，在培养箱中孵育4h后，弃去上清液，每孔加入100μL DMSO溶液，直至完全溶解。测定各孔在490nm处的吸光度。
5、动物试验
(1)10％水合氯醛腹腔麻醉：按大鼠0.8mL/100g剂量进行麻醉。确保大鼠的反射被抑制，将小鼠置于俯卧位，对大鼠背部偏后腿处进行脱毛，用酒精棉签擦拭大鼠皮肤，并用10％聚维酮碘消毒两次。
(2)用4毫米穿刺机在大鼠背部为伤口勾画出圆形图案。使用镊子提起轮廓中间的皮肤，并用虹膜剪刀创建一个贯穿皮下组织的全层创面，包括肌膜，并切除圆形组织。
(3)记录伤口大小。
(4)将珍珠多肽液溶于生理盐水上药，试验组分别涂抹浓度为5mg/mL，10mg/mL和15mg/mL的珍珠粉水溶物；对照组的伤口不做处理为空白对照。
(5)每天测量伤口大小，计算愈合率。
(6)在伤后一定时间，处死大鼠，取下愈合伤口皮肤组织，进行Masson染色。
实验结果与讨论
为了评价珍珠多肽液对成纤维细胞活性的影响，发明人将L929和MEF细胞分别暴露于不同剂量的珍珠多肽液中进行MTT试验。如表1，图3所示，在0ug/mL-50ug/mL浓度下，对L929和MEF无细胞毒性作用。此外，蛋白浓度在0.1ug/mL-5ug/mL之间对L929细胞具有刺激生长的作用，特别是在0.5ug/mL和1ug/mL之间，说明SFEPE可能通过增强成纤维细胞的活性来加速伤口愈合的过程。因此，0ug-50ug/mL的水平被选择性地用于进一步的创面划痕测试在伤口愈合的增殖阶段，成纤维细胞正在迁移和分化，合成胶原纤维等蛋白质形成肉芽组织。
表1珍珠多肽液对L929，MEF细胞存活率的检测
为了评价L929和MEF在创面愈合中的迁移能力，采用单分子细胞的创面划痕模拟创面环境。在珍珠多肽液环境下，成纤维细胞表现出增强的迁移能力。在图4中，在体外测试了L929和MEF的迁移。无论是L929还是MEF，其迁移能力最强的浓度为25ug/mL。对于L929,25ug/mL和50ug/mL的珍珠多肽液蛋白含量较对照组表现出更高的水平增殖和迁移(p<0.001)。MEF组蛋白含量为5ug/mL(p<0.05)和25ug/mL(p<0.01)时均有促进迁移的作用。成纤维细胞迁移速率的定量分析。同时发现含珍珠多肽液组的细胞迁移率高于对照组。这些结果表明，本发明所述珍珠多肽液能够促进成纤维细胞的迁移，这可能表现出加速伤口愈合的能力。
在细胞划痕试验2中，如图7所示，两种珍珠粉提取液均显现出促进细胞迁移的功效，其中两种提取液在25μg/mL浓度下均呈现出最强的细胞迁移作用。在相同蛋白浓度前提下，二者的功效几乎一致，证明了超临界提取物(珍珠多肽液)的安全性。尽管二种提取液对细胞的作用几乎一致，值得一提的是，使用超临界提取法对对珍珠粉活性蛋白具有更高的提取效率，能在更短的时间内萃取出更多的活性成分。
细胞活性试验中，结果如图8，超临界水提液与常规水提液对细胞的毒性基本一致。在0～120μg/mL浓度范围内，两种提取液对细胞基本无毒性。
大鼠全皮切除损伤愈合试验的创面愈合率结果如图5所示，图中分别为对照组，试验组5mg/mL,10mg/mL和15mg/mL的创面愈合结果，试验证明5mg/mL和10mg/mL的珍珠多肽液具有促进创面愈合的能力。10mg/mL珍珠多肽液组创面愈合效果显著，愈合率为99.91±0.16。加5mg/mL组与不加5mg/mL组2d伤口闭合率差为-14.18％，7d差为-5.78％，9d差为-3.54％。10mg/mL珍珠多肽液的创面闭合率较高，第2、7、9天差异分别为17.86％、8.48％、7.15％，意想不到的是，15mg/mL的创面愈合效果较弱。发明人假设该剂量代表对皮肤的细胞毒性。这些观察结果表明，珍珠多肽液具有促进创面愈合的能力。经Masson染色后，各试验组皮肤组织修复过程中可见肉芽组织，正常组织中胶原纤维分布规律，表皮完好无损。有丰富的毛囊，如图6所示。采用珍珠多肽液的试验组的再上皮化效率更高，胶原纤维更丰富，表皮更完整。
实施例珍珠粉潜在活性肽成分鉴定
1、珍珠多肽液样品处理
(1)超滤置换缓冲液
使用截留分子量为10kDa的millipore超滤管对珍珠多肽液进行超滤实现蛋白的浓缩，缓冲液的置换，超滤条件：4000rpm，60min。
(2)蛋白酶解
取约50ug蛋白质混合物样品，按50：1的质量比用胰蛋白酶分两次进行酶解，各酶解16小时。
(3)蛋白样品除盐
1)活化柱子：用1ml甲醇冲洗3次，1ml的0.1％甲酸-水冲洗5次；
2)除盐：加入1ml样品，用1ml的0.1％甲酸-水冲洗5次；
3)收集目标液体：500ul的80％甲醇-水5次洗脱多肽成分；
4)冻干或氮吹，得到固体多肽混合物。
2、高效液相色谱-质谱联用技术对酶解产物中多肽序列鉴定
样品上质谱前用0.1％的甲酸-水复溶，液相色谱条件为色谱柱C18,上样量：0.8ug，流动相：水相为0.1％甲酸水，有机相为0.1％甲酸乙腈，流速：0.4mL/min。串联质谱数据库，选择帆蚌属库。完成珍珠粉蛋白数据的初步筛选鉴定，鉴定出29个潜在蛋白质，见表2。
表2
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
以上对本发明所提供的珍珠多肽液、分离提取工艺及其促进伤口愈合的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种珍珠多肽液的分离提取工艺，其特征在于该工艺包括如下步骤：
将珍珠超细粉与1±0.5wt％PBS溶液混合，珍珠超细粉与PBS溶液的用量比为1：(4±0.5)g/mL，采用超临界二氧化碳萃取仪进行珍珠粉中小分子肽提取，收集萃取后混合液，于5000±1000rpm高速离心机离心10-15min，收集上层液体，即为珍珠多肽液。
2.根据权利要求1所述的珍珠多肽液的分离提取工艺，其特征在于：所述超临界二氧化碳萃取仪的设置参数为：温度：37±2℃；压力：25±2MPa；时间：2-3h。
3.根据权利要求1所述的珍珠多肽液的分离提取工艺，其特征在于：所述的珍珠超细粉满足：粒径≥1μm的珍珠粉≥55％(体积)，粒径≤5μm的珍珠粉≥90％(体积)。
4.一种珍珠多肽液，其是由权利要求1所述的珍珠多肽液的分离提取工制得。
5.一种珍珠多肽液在促进伤口愈合及皮肤修护方面的应用。
6.一种珍珠多肽液在护肤品、化妆品或药品制备中的应用。
7.一种护肤品、化妆品或药品，其特征在于含有权利要求4所述的珍珠多肽液。
8.权利要求7所述的护肤品、化妆品或药品，其特征在于：以蛋白质总重量计，每mL护肤品、化妆品或药品中，珍珠多肽液的添加量为5mg/mL至15mg/mL。
9.权利要求7所述的护肤品、化妆品或药品，其特征在于：以蛋白质总重量计，每mL护肤品、化妆品或药品中，珍珠多肽液的添加量为5mg/mL至10mg/mL。
10.一种珍珠多肽组合物，其特征在于其主要是由以下29种蛋白组成：ARG42316.1、ALK87063.1、AWN56485.1、ARG42317.1、ASQ40997.1、ADG26659.1、QAV56625.1、AHY35316.1、AKN91188.1、ABW86313.1、AEB70965.1、ARH52598.1、QDQ19191.1、AKE25951.1、QDF82057.1、AWM99734.1、AFO53263.1、QJF53848.1、ADU57251.1、QAV56624.1、ASN79565.1、QOQ50640.1、ABO93627.2、ABJ89824.1、QCR63936.1、AFS33112.1、AHK22785.1、AIG62900.1、QBG58751.1。
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