CN104987359B - 一种鹿茸蛋白提取物及其应用、药物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白提取技术领域，特别涉及一种鹿茸蛋白提取物及其应用、药物制剂。该鹿茸蛋白提取物的制备方法包括：将新鲜鹿茸抽血、冻干、粉碎，获得鹿茸粉末；将鹿茸粉末与缓冲溶液混合，超声提取，离心，收集上清液，真空冷冻干燥，获得鹿茸蛋白提取物；缓冲溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～50mM。本发明最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性和提取效率；本发明制得的鹿茸蛋白提取物具有促进血管细胞生长或增殖作用，特别是对人脐静脉上皮细胞(HUVEC)生长的增殖率达到200％。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取技术领域，特别涉及一种鹿茸蛋白提取物及其应用、药物制剂。
背景技术
鹿茸为我国传统名贵中药，已有2000多年的入药历史。李时珍在《本草纲目》上称鹿茸“善于补肾壮阳、生精益血、补髓健骨”。古典医籍《神农本草经》对其功能和主治也有详细记载：“味甘、性温，主漏下恶血、寒热惊痫、益气强志、生齿不老”。鹿茸性温而不燥，具有振奋和提高机体功能，对全身虚弱、久病之后患者，有较好的强身作用。现代药物化学分析表明，鹿茸中含有多种生理活性成分，具有抗衰老、抗氧化、提高机体免疫力、促进伤口愈合等多种功效。鹿茸作为鹿体最活跃的生长点，每年周期性地生长、骨化与脱落，在骨化之前贮存了大量调节生长的生长因子及相关蛋白。研究表明鹿茸中含有脂类、多糖、多胺、蛋白质及多肽、激素样物质、生物碱等多种化学成分，其中蛋白质、多肽类物质占总重量的50％以上，这是鹿茸具有广泛生物活性的基础。
霍玉书等(鹿茸生长因子制剂及工艺，CN 1104095A)公开了一种鹿茸中生长因子制剂的生产工艺，该制备方法是将鹿茸粉碎浸提，浸提液经过滤除菌，再经层析分离出含有神经生长因子、上皮细胞生长因子等多肽的制剂。该制剂具有安全性，无副作用，无异种蛋白抗原反应。但国内外对鹿茸提取物中的大分子蛋白的提取及功效研究鲜有报道。
研究表明鹿茸的提取工艺对鹿茸中生理活性成分的保留有很大的影响。虽然对鹿茸的研究历史悠久，但传统的加工技术以反复水煮、烘烤和风干为主，活性物质的提取率低，并且对蛋白质等成分的破坏显著影响了鹿茸的功效。因此，如何更好地保留鹿茸中活性蛋白的成分成为了中药提取领域研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种鹿茸蛋白提取物及其应用、药物制剂。该发明在提取过程中采用接近生理pH和生理渗透压的缓冲溶液作为提取剂，且在提取过程中保持低温环境，最后阶段使用真空冷冻干燥制备鹿茸蛋白提取物，整个制备工艺最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性和提取效率；本发明制得的鹿茸蛋白提取物具有促进血管细胞生长或增殖作用，特别是对人脐静脉上皮细胞(HUVEC)生长的增殖率达到200％。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种鹿茸蛋白提取物，其制备方法包括如下步骤：
将新鲜鹿茸抽血、冻干、粉碎，获得鹿茸粉末；
将鹿茸粉末与缓冲溶液混合，超声提取，离心，收集上清液，真空冷冻干燥，获得鹿茸蛋白提取物；
缓冲溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～50mM。
本发明选用不同生长时期新鲜鹿茸，在提取过程中采用接近生理pH和生理渗透压的缓冲溶液作为提取剂，且在提取过程中保持低温环境，最后阶段使用真空冷冻干燥制备鹿茸蛋白提取物，整个制备工艺最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性和提取效率。本发明工艺简单，提取效率高，能够对鹿茸药用价值充分利用。
作为优选，鹿茸为毛桃、鞍子、二杠、挂角、三岔、花砍茸或莲花中的一种或两者以上的混合物。
优选地，鹿茸为毛桃、二杠或三岔中的一种或两者以上的混合物。
更优选地，鹿茸为毛桃。
作为优选，缓冲溶液为Tris-base溶液、PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
优选地，缓冲溶液为Tris-base溶液或PBS缓冲液。
作为优选，缓冲溶液的pH值为7.4。
在本发明提供的一些实施例中，PBS缓冲液的浓度为10mM。
在本发明提供的另一些实施例中，Tris-base溶液的浓度为50mM。
作为优选，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：(5～100)。
优选地，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：10。
作为优选，超声的温度为-5℃～10℃，超声的时间为10～60min。
优选地，超声的温度为0～4℃，超声的时间为30min。
作为优选，超声的程序为：超声5～10s，间隔15～40s。
优选地，超声的程序为：超声5s，间隔15s。
作为优选，离心的温度≤4℃，转速为5000～15000rpm，时间为10～20min。
优选地，离心的温度为4℃，转速为12000rpm，时间为15min。
作为优选，真空冷冻干燥的温度≤-50℃，时间为24～36h。
优选地，真空冷冻干燥的温度为-50℃，时间为30h。
作为优选，粉碎的目数为10～300目。
优选地，粉碎的目数为200目。
本发明还提供了该鹿茸蛋白提取物在促进血管细胞生长或增殖中的应用；该鹿茸蛋白提取物的制备方法包括：将新鲜鹿茸抽血、冻干、粉碎，获得鹿茸粉末；将鹿茸粉末与缓冲溶液混合，超声提取，离心，收集上清液，真空冷冻干燥，获得鹿茸蛋白提取物；缓冲溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～50mM；作为优选，鹿茸为毛桃、鞍子、二杠、挂角、三岔、花砍茸或莲花中的一种或两者以上的混合物；优选地，鹿茸为毛桃、二杠或三岔中的一种或两者以上的混合物；更优选地，鹿茸为毛桃；作为优选，缓冲溶液为Tris-base溶液、PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液；优选地，缓冲溶液为Tris-base溶液或PBS缓冲液；作为优选，缓冲溶液的pH值为7.4；在本发明提供的一些实施例中，PBS缓冲液的浓度为10mM；在本发明提供的另一些实施例中，Tris-base溶液的浓度为50mM；作为优选，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：(5～100)；优选地，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：10；作为优选，超声的温度为-5℃～10℃，超声的时间为10～60min；优选地，超声的温度为0～4℃，超声的时间为30min；作为优选，超声的程序为：超声5～10s，间隔15～40s；优选地，超声的程序为：超声5s，间隔15s；作为优选，离心的温度≤4℃，转速为5000～15000rpm，时间为10～20min；优选地，离心的温度为4℃，转速为12000rpm，时间为15min；作为优选，真空冷冻干燥的温度≤-50℃，时间为24～36h；优选地，真空冷冻干燥的温度为-50℃，时间为30h；作为优选，粉碎的目数为10～300目；优选地，粉碎的目数为200目。
作为优选，血管细胞为人脐静脉内皮细胞。
本发明还提供了该鹿茸蛋白提取物在制备防治心脑血管疾病以及治疗外伤损害药物中的应用。
在本发明提供的一些实施例中，心脑血管疾病为心肌损伤或心肌缺血。
本发明还提供了一种中药制剂，包括本发明提供的鹿茸蛋白提取物；该鹿茸蛋白提取物的制备方法包括：将新鲜鹿茸抽血、冻干、粉碎，获得鹿茸粉末；将鹿茸粉末与缓冲溶液混合，超声提取，离心，收集上清液，真空冷冻干燥，获得鹿茸蛋白提取物；缓冲溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～50mM；作为优选，鹿茸为毛桃、鞍子、二杠、挂角、三岔、花砍茸或莲花中的一种或两者以上的混合物；优选地，鹿茸为毛桃、二杠或三岔中的一种或两者以上的混合物；更优选地，鹿茸为毛桃；作为优选，缓冲溶液为Tris-base溶液、PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液；优选地，缓冲溶液为Tris-base溶液或PBS缓冲液；作为优选，缓冲溶液的pH值为7.4；在本发明提供的一些实施例中，PBS缓冲液的浓度为10mM；在本发明提供的另一些实施例中，Tris-base溶液的浓度为50mM；作为优选，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：(5～100)；优选地，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：10；作为优选，超声的温度为-5℃～10℃，超声的时间为10～60min；优选地，超声的温度为0～4℃，超声的时间为30min；作为优选，超声的程序为：超声5～10s，间隔15～40s；优选地，超声的程序为：超声5s，间隔15s；作为优选，离心的温度≤4℃，转速为5000～15000rpm，时间为10～20min；优选地，离心的温度为4℃，转速为12000rpm，时间为15min；作为优选，真空冷冻干燥的温度≤-50℃，时间为24～36h；优选地，真空冷冻干燥的温度为-50℃，时间为30h；作为优选，粉碎的目数为10～300目；优选地，粉碎的目数为200目。
在本发明提供的一些实施例中，中药制剂的剂型为粉剂、片剂、贴剂、乳膏剂或注射剂。
本发明提供了一种鹿茸蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：
将新鲜鹿茸抽血、冻干、粉碎，获得鹿茸粉末；
将鹿茸粉末与缓冲溶液混合，超声提取，离心，收集上清液，真空冷冻干燥，获得鹿茸蛋白提取物；
缓冲溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～50mM。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，鹿茸为毛桃、鞍子、二杠、挂角、三岔、花砍茸或莲花中的一种或两者以上的混合物。
优选地，鹿茸为毛桃、二杠或三岔中的一种或两者以上的混合物。
更优选地，鹿茸为毛桃。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，缓冲溶液为Tris-base溶液、PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
优选地，缓冲溶液为Tris-base溶液或PBS缓冲液。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，缓冲溶液的pH值为7.4。
在本发明提供的一些实施例中，PBS缓冲液的浓度为10mM。
在本发明提供的另一些实施例中，Tris-base溶液的浓度为50mM。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：(5～100)。
优选地，以g/mL计，鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：10。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，超声的温度为-5℃～10℃，超声的时间为10～60min。
优选地，超声的温度为0～4℃，超声的时间为30min。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，超声的程序为：超声5～10s，间隔15～40s。
优选地，超声的程序为：超声5s，间隔15s。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，离心的温度≤4℃，转速为5000～15000rpm，时间为10～20min。
优选地，离心的温度为4℃，转速为12000rpm，时间为15min。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，真空冷冻干燥的温度≤-50℃，时间为24～36h。
优选地，真空冷冻干燥的温度为-50℃，时间为30h。
在本发明提供的制备方法中，作为优选，粉碎的目数为10～300目。
优选地，粉碎的目数为200目。
本发明提供了一种鹿茸蛋白提取物及其应用、药物制剂。该鹿茸蛋白提取物的制备方法包括：将新鲜鹿茸抽血、冻干、粉碎，获得鹿茸粉末；将鹿茸粉末与缓冲溶液混合，超声提取，离心，收集上清液，真空冷冻干燥，获得鹿茸蛋白提取物；缓冲溶液的pH值为7.0～8.0，浓度为10～50mM。本发明至少具有如下优势之一：
本发明在提取过程中采用接近生理pH和生理渗透压的缓冲溶液作为提取剂，且在提取过程中保持低温环境，最后阶段使用真空冷冻干燥制备鹿茸蛋白提取物，整个制备工艺最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性和提取效率；
本发明制得的鹿茸蛋白提取物具有促进血管细胞生长或增殖作用，特别是对人脐静脉上皮细胞(HUVEC)生长的增殖率达到200％；
本发明制得的鹿茸蛋白提取物可用于心肌损伤、心肌缺血等心脑血管疾病患者的保健与辅助治疗，以及各种外伤损害的恢复治疗的应用；
本发明工艺简单，提取效率高，能够对鹿茸药用价值充分利用；
本发明在提取过程中不产生任何污染，具有绿色环保的特点。
附图说明
图1示Tris-base缓冲液提取的不同时期鹿茸蛋白作用HUVEC细胞的增殖结果；其中，1-1示实施例1制得的鹿茸蛋白提取物对HUVEC细胞的增殖结果(原材料为毛桃)，1-2示实施例2制得的鹿茸蛋白提取物对HUVEC细胞的增殖结果(原材料为二杠)，1-3示实施例3制得的鹿茸蛋白提取物对HUVEC细胞的增殖结果(原材料为三岔)；
图2示PBS缓冲液提取的不同时期鹿茸蛋白作用HUVEC细胞的增殖结果；其中，2-1示实施例4制得的鹿茸蛋白提取物对HUVEC细胞的增殖结果(原材料为毛桃)，2-2示实施例5制得的鹿茸蛋白提取物对HUVEC细胞的增殖结果(原材料为二杠)，2-3示实施例6制得的鹿茸蛋白提取物对HUVEC细胞的增殖结果(原材料为三岔)；
图3示实施例1至3制得的鹿茸蛋白提取物的SDS-PAGE分析结果；其中，1-2、1-3、1-4示实施例1制得的鹿茸蛋白提取物的SDS-PAGE电泳图(原材料为毛桃)，2-1、2-2、2-3、2-4示实施例2制得的鹿茸蛋白提取物的SDS-PAGE电泳图(原材料为二杠)，3-1、3-2示实施例3制得的鹿茸蛋白提取物的SDS-PAGE电泳图(原材料为三岔)，M示标准marker；
图4示LC/MS分析鹿茸蛋白组的流程图；
图5示实施例1至3制得的鹿茸蛋白提取物(毛桃、二杠、三岔)的LC/MS谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种鹿茸蛋白提取物及其应用、药物制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的鹿茸蛋白提取物及其应用、药物制剂中所用鹿茸、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1鹿茸蛋白提取物的制备
以特定生长时期的鹿茸(毛桃)为原料，按照以下工艺制备鹿茸蛋白提取液：
1)取初始生长期的鹿茸(毛桃)，抽血6小时后，去除表面毛发，切成薄片，放入冷冻干燥机中冷冻，至两次称量质量变化小于0.1g后取出。将冻干后的鹿茸放入适量液氮中，研钵研碎，过200目筛，得到鹿茸粉末。
2)称取1g鹿茸粉末，加入10mL浓度为50mM的Tris-base溶液，pH值为7.4。震荡30分钟后，冰浴下用匀浆机匀浆1min。
3)用超声细胞粉碎仪进行提取，超声5秒，间隔15秒，在冰浴(0～4℃)下进行。超声30min后，在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，上清液即为鹿茸蛋白提取液，真空冷冻干燥机温度设置为-50℃，冷冻干燥30小时，获得鹿茸蛋白提取物。
实施例2鹿茸蛋白提取物的制备
以特定生长时期的鹿茸(二杠)为原料，按照以下工艺制备鹿茸蛋白提取液：
1)取初始生长期的鹿茸(二杠)，抽血6小时后，去除表面毛发，切成薄片，放入冷冻干燥机中冷冻，至两次称量质量变化小于0.1g后取出。将冻干后的鹿茸放入适量液氮中，研钵研碎，过200目筛，得到鹿茸粉末。
2)称取1g鹿茸粉末，加入10mL浓度为50mM的Tris-base溶液，pH值为7.4。震荡30分钟后，冰浴下用匀浆机匀浆1min。
3)用超声细胞粉碎仪进行提取，超声5秒，间隔15秒，在冰浴(0～4℃)下进行。超声30min后，在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，上清液即为鹿茸蛋白提取液，真空冷冻干燥机温度设置为-50℃，冷冻干燥30小时，获得鹿茸蛋白提取物。
实施例3鹿茸蛋白提取物的制备
以特定生长时期的鹿茸(三岔)为原料，按照以下工艺制备鹿茸蛋白提取液：
1)取初始生长期的鹿茸(三岔)，抽血6小时后，去除表面毛发，切成薄片，放入冷冻干燥机中冷冻，至两次称量质量变化小于0.1g后取出。将冻干后的鹿茸放入适量液氮中，研钵研碎，过200目筛，得到鹿茸粉末。
2)称取1g鹿茸粉末，加入10mL浓度为50mM的Tris-base溶液，pH值为7.4。震荡30分钟后，冰浴下用匀浆机匀浆1min。
3)用超声细胞粉碎仪进行提取，超声5秒，间隔15秒，在冰浴(0～4℃)下进行。超声30min后，在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，上清液即为鹿茸蛋白提取液，真空冷冻干燥机温度设置为-50℃，冷冻干燥30小时，获得鹿茸蛋白提取物。
实施例4鹿茸蛋白提取物的制备
以特定生长时期的鹿茸(毛桃)为原料，按照以下工艺制备鹿茸蛋白提取液：
1)取初始生长期的鹿茸(毛桃)，抽血6小时后，去除表面毛发，切成薄片，放入冷冻干燥机中冷冻，至两次称量质量变化小于0.1g后取出。将冻干后的鹿茸放入适量液氮中，研钵研碎，过200目筛，得到鹿茸粉末。
2)称取1g鹿茸粉末，加入10mL浓度为10mM的PBS缓冲溶液，pH值为7.4。震荡30分钟后，冰浴下用匀浆机匀浆1min。
3)用超声细胞粉碎仪进行提取，超声5秒，间隔15秒，在冰浴(0～4℃)下进行。超声30min后，在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，上清液即为鹿茸蛋白提取液，真空冷冻干燥机温度设置为-50℃，冷冻干燥30小时，获得鹿茸蛋白提取物。
实施例5鹿茸蛋白提取物的制备
以特定生长时期的鹿茸(二杠)为原料，按照以下工艺制备鹿茸蛋白提取液：
1)取初始生长期的鹿茸(二杠)，抽血6小时后，去除表面毛发，切成薄片，放入冷冻干燥机中冷冻，至两次称量质量变化小于0.1g后取出。将冻干后的鹿茸放入适量液氮中，研钵研碎，过200目筛，得到鹿茸粉末。
2)称取1g鹿茸粉末，加入10mL浓度为10mM的PBS缓冲溶液，pH值为7.4。震荡30分钟后，冰浴下用匀浆机匀浆1min。
3)用超声细胞粉碎仪进行提取，超声5秒，间隔15秒，在冰浴(0～4℃)下进行。超声30min后，在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，上清液即为鹿茸蛋白提取液，真空冷冻干燥机温度设置为-50℃，冷冻干燥30小时，获得鹿茸蛋白提取物。
实施例6鹿茸蛋白提取物的制备
以特定生长时期的鹿茸(三岔)为原料，按照以下工艺制备鹿茸蛋白提取液：
1)取初始生长期的鹿茸(三岔)，抽血6小时后，去除表面毛发，切成薄片，放入冷冻干燥机中冷冻，至两次称量质量变化小于0.1g后取出。将冻干后的鹿茸放入适量液氮中，研钵研碎，过200目筛，得到鹿茸粉末。
2)称取1g鹿茸粉末，加入10mL浓度为10mM的PBS缓冲溶液，pH值为7.4。震荡30分钟后，冰浴下用匀浆机匀浆1min。
3)用超声细胞粉碎仪进行提取，超声5秒，间隔15秒，在冰浴(0～4℃)下进行。超声30min后，在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，上清液即为鹿茸蛋白提取液，真空冷冻干燥机温度设置为-50℃，冷冻干燥30小时，获得鹿茸蛋白提取物。
实施例7鹿茸蛋白提取物的蛋白定量
采用BCA法对实施例1至6制得的鹿茸蛋白提取物进行蛋白定量：按照说明书配制标准曲线溶液、BCA工作液；取96孔板，向测样品孔和蛋白标准品孔中加入样品或者标准品溶液24μL，再加入200μL BCA工作液，混匀；37℃恒温30min后，取出冷却至室温；酶标仪562nm波长下测定吸光度；制作标准曲线，从标准曲线中求出样品浓度。试验结果显示，实施例1至6制得的鹿茸蛋白提取物中蛋白的浓度分别为16.2mg/mL、14.8mg/mL、15.6mg/mL、15.4mg/mL、13.2mg/mL、15.1mg/mL。
实施例8鹿茸蛋白提取物对人脐静脉上皮细胞(HUVEC)生长的影响
分别取实施例1至6制得的鹿茸蛋白提取物，用培养基稀释为250.0μg/mL、125.0μg/mL、25.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL，PBS溶液作为对照。取对数生长期的人脐静脉上皮细胞，倒出培养基后用胰蛋白酶消化细胞。将细胞以5×104/mL密度接种于用96孔培养板中，每孔体积为100μL，37℃、5％CO2条件下培养至细胞贴壁。然后更换新培养基并加入鹿茸蛋白提取物，使鹿茸蛋白提取物的浓度分别稀释为250.0μg/mL、125.0μg/mL、25.0μg/mL、5.0μg/mL、2.5μg/mL，PBS溶液作为对照。每一浓度重复4-5孔。在37℃、5％CO2培养箱中培养处理时间为24h、48h和72h，并设对照组。
采用MTT法测定鹿茸蛋白提取物对HUVEC增殖作用的影响。MTT分析法(凯基MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒)以代谢还原噻唑蓝3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)为基础，其检测原理为：活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲臜(Formazan)，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在550nm波长处检测光密度。HUVEC经上述处理结束后，每孔加50μL 1×MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲臜。吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。酶标仪在550nm波长处检测每孔的光密度。检测结果如图1、图2所示。其中，图1显示的是经Tris-base蛋白提取液提取的不同生长时期(实施例1毛桃，实施例2二杠，实施例3三岔)的鹿茸蛋白提取物，在不同的培养时间及不同处理浓度下的HUVEC增殖率；图2显示的是经PBS缓冲液提取的不同生长时期(实施例4毛桃，实施例5二杠，实施例6三岔)的鹿茸蛋白提取物，在不同的培养时间及不同处理浓度下的HUVEC增殖率。
检测结果显示，在24小时内，毛桃、二杠、三岔的Tris-base蛋白提取液在所有的5个剂量下都对HUVEC细胞增殖产生了轻微抑制作用，但是培养48小时后，所有的5个剂量下都对HUVEC细胞增殖产生了促进作用，特别是高剂量的两个处理组，促进作用非常明显。培养72小时后，两个高剂量毛桃提取液处理组的细胞增殖率达到200％以上，两个高剂量二杠和三岔提取液处理组的细胞增殖率达到150％以上(图1所示)。
PBS缓冲液提取鹿茸蛋白提取物与Tris-base缓冲液提取的鹿茸蛋白提取物对HUVEC细胞的增殖作用相当，无明显差别(图2所示)。说明PBS缓冲液与Tris-base缓冲液都能够较好的提取并保留鹿茸蛋白提取物的生理活性。
此外，研究结果还表明，鹿茸毛桃时期的蛋白提取物的促进HUVEC细胞增殖活性高于二杠和三岔时期的蛋白提取物。
实施例9鹿茸蛋白提取物SDS-PAGE分析
对实施例1至3制得的鹿茸蛋白提取物进行SDS-PAGE分析，具体操作步骤如下：
配制SDS-PAGE胶(分离胶T＝12％，浓缩胶T＝5％)。上样之前，样品加入同体积SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min后低速离心30s，集中样品。上样(总蛋白量为50μg)选用微量移液枪准确量取，并加上合适的预染蛋白marker，未上样品的孔，加入同体积的稀释后的样品缓冲液，降低边缘效应。恒压电泳80V，1h后调至120V，溴酚兰跑至离下端0.5cm左右，停止电泳。SDS-PAGE分析的结果如图3所示。
结果显示：毛桃、二杠、三岔三种不同生长时期鹿茸蛋白质在SDS-PAGE的分析结果中差别不大。可能是由于SDS-PAGE的分离性能较差。图3中孔道从左至右依次为毛桃(1-2、1-3、1-4)、二杠(2-1、2-2、2-3、2-4)、三岔(3-1、3-2)和标准marker。
实施例10鹿茸蛋白提取物蛋白组学分析
对实施例1至3制得的鹿茸蛋白提取物(毛桃、二杠、三岔)进行蛋白组学分析，其流程如图4所示：LC/MS系统为Bruker nano-advance LC(Auburn,CA,USA)-an impact HDUHR-time-of-flight(TOF)mass spectrometer(Bruker,Bremen,Germany)。色谱柱为C18analytical column(50cm×75×3μm,Bruker-Michrom,Auburn,CA,USA)。梯度洗脱条件：A(含0.1甲酸的2％乙腈)和B(含0.1％甲酸的98％乙腈)，0-5min,5％B；5-235min,5-25％B；235-250min,25-80％B；流速300nl per min。进样量2μL。采集的数据提交到mascot数据库进行蛋白质鉴定。搜索参数为：
表1搜索参数
| Type of search | MS/MS Ion Search |
| Enzyme | Trypsin |
| Variable modifications | Oxidation(M) |
| Mass values | Monoisotopic |
| Protein mass | Unrestricted |
| Peptide mass tolerance | ±0.03 Da |
| Fragment mass tolerance | ±0.03 Da |
| Max missed cleavages | 2 |
| Instrument type | ESI-QUAD-TOF |
鉴定图谱见图5：
从毛桃、二杠和三岔中分别鉴定出1390、1241和1427种蛋白质。三组共有的蛋白质有857种。毛桃特有蛋白262种，二杠特有蛋白136种，三岔特有蛋白253种。不同成长时期蛋白质的差异可能与其特有的生长特征有关。鹿茸蛋白质组表现出独特的特征，含有大量的各种功能蛋白质，这些蛋白质包括结构组成蛋白质、代谢酶、细胞外间质蛋白、信号蛋白、细胞增殖相关蛋白和代谢作用的蛋白质、复制、转录和转位调节作用等众多通路和功能的蛋白质。
毛桃特有若干蛋白具有表皮生长因子的功能。表皮生长因子最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。在化妆品和保健品中的应用：表皮生长因子能促进皮肤细胞增殖、分化，加速新陈代谢，提高新细胞皮肤所占比例，降低皮肤平均年龄，使皮肤始终处于年轻状态。
二杠特有若干与脂肪酸、胆固醇等能量代谢紧密联系的蛋白质，而且还有与细胞内核酸的合成代谢及其所介导的生物学功能紧密相关的蛋白质，而这一时期是鹿茸的快速生长期，需要大量的能量供应。
三岔特有蛋白主要涉及细胞骨架组构、细胞凋亡、细胞周期机密联系的蛋白质。而在三岔末期，鹿茸的脱落必须大量细胞凋亡因子的参与。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种鹿茸蛋白提取物，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
将新鲜鹿茸抽血、冻干、粉碎，获得鹿茸粉末；
将所述鹿茸粉末与缓冲溶液混合，超声提取，离心，收集上清液，真空冷冻干燥，获得鹿茸蛋白提取物；
所述缓冲溶液的pH值为7.4，浓度为10～50mM；
所述超声的温度为-5℃～10℃，超声的时间为10～60min。
2.根据权利要求1所述的鹿茸蛋白提取物，其特征在于，所述鹿茸为毛桃、鞍子、二杠、挂角、三岔、花砍茸或莲花中的一种或两者以上的混合物。
3.根据权利要求1所述的鹿茸蛋白提取物，其特征在于，所述缓冲溶液为Tris-base溶液、PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求1所述的鹿茸蛋白提取物，其特征在于，以g/mL计，所述鹿茸粉末与缓冲溶液的质量体积比为1：(5～100)。
5.根据权利要求1所述的鹿茸蛋白提取物，其特征在于，所述超声的程序为：超声5～10s，间隔15～40s。
6.一种中药制剂，其特征在于，包括如权利要求1至5中任一项所述的鹿茸蛋白提取物。
7.根据权利要求6所述的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂的剂型为粉剂、片剂、贴剂、乳膏剂或注射剂。
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