CN113603762B - 一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用，以鹿角盘为原料采用酸提醇沉得蛋白粗提物，之后通过Sephadex G‑25凝胶层析柱和反相高效液相色谱等方法分离纯化出花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP。本发明制得的花马杂交鹿鹿角盘活性肽通过对菌体细胞膜和细胞璧的破坏达到对细菌的抑制效果，为新型抗菌药物的研发提供理论依据。

Description

一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及活性肽制备领域，特别是一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
早在20世纪50年代，我国就成功地进行了梅花鹿和马鹿的杂交，杂交鹿表现出明显的杂交优势，普遍适应性强、耐粗饲、抗病力强、性成熟早、生长发育快。目前花马杂交鹿在吉林省的存栏数逐年增加，也越来越受到科研工作者的重视，其产品有着较高的药用价值和良好的应用前景。鹿角盘是雄鹿锯茸后于第二年脱落的圆盘骨化物质。早在《神农本草经》中就有记载，鹿角盘具有“温补肝肾、活血化瘀、乳痈初起、消炎肿痛”等功效。鹿角盘含有蛋白质类、脂类、多肽类、糖类、氨基酸(含机体不能合成的必需氨基酸)以及无机元素等，其中蛋白质类含量尤为丰富。鹿角盘的药理活性主要集中于抗炎镇痛、抗疲劳、抗骨质疏松、抑菌、抗氧化、增强造血等。
近年来，人们愈发重视鹿角盘的研究利用，对于鹿角盘的化学成分有了较为全面的概述和研究。越来越多的实验研究和实践也充分证明，鹿角盘的很多成分具有显著的药理作用。为了更好地对鹿角盘进行研究，结合鹿角盘的生物学特点，对已发现的活性成分进行结构鉴定和功能性研究，寻求科学的理论依据，这不仅会让鹿角盘更好地应用于临床或人们的日常保健中，而且对鹿产品研究领域具有重要的意义和价值。
发明内容
本发明的目的是要为了解决现有技术中存在的不足，提供一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
本发明的第一个目的是要提供一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、取花马杂交鹿鹿角盘磨碎成粉末，得到鹿角盘粉；
S2、配制pH为3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于4℃中充分预冷，将醋酸-醋酸钠缓冲溶液与鹿角盘粉按重量比5：1的比例混合，充分搅拌后离心取上清液，记为溶液A；
S3、向溶液A中加入终浓度为55％的乙醇，于4℃下静置后离心取上清液，记为溶液B；
S4、将溶液B用旋转蒸发仪于40℃下蒸发至合适体积，冷冻干燥得总蛋白粗提物；
S5、将总蛋白粗提物用去离子水溶解，然后用Sephadex G-25层析柱除盐，除盐条件为：上样量为10ml；上样浓度为100mg/ml，洗脱液为去离子水，洗脱流速为1ml/min，检测波长为280nm，收集各组分，冷冻干燥后，获得除盐蛋白；用BCA法检测除盐蛋白中的蛋白含量，用SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白分子量的分布：其大分子蛋白主要集中在116k Da～29.0kDa之间，小分子量蛋白主要集中在20.1kDa以下，其中以20.1kDa和6.5kDa的蛋白尤为明显；
S6、对除盐蛋白进行凝胶过滤色谱分析：将50mg的除盐蛋白溶于2ml的超纯水中，配成终浓度为25mg/ml的上样样品，用Sephadex G-25层析柱以0.5ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为去离子水，检测波长为280nm，收集两个组分S1和S2，冷冻干燥后于-20℃保存，用SDS-PAGE凝胶电泳检测两个组分S1和S2的分子量分布：组分S1主要为116kDa-29kDa的大分子蛋白，组分S2主要在20kDa和6.5kDa有明显的两种蛋白；
S7、反相高效液相色谱分离：取10mg凝胶过滤色谱分离出的组分S2用2ml的15％的乙腈水溶液溶解成终浓度为5mg/ml的上机样品，色谱柱为ZORBAX300SB-C18，流动相A为加有0.1％三氟乙酸的超纯水，流动相B为加有0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，紫外检测波长为220nm，设置流速为1ml/min，梯度洗脱：乙腈浓度10％-18％，0-5min；18％-40％，5-40min；40％-50％，40-50min；多次收集出现的多个色谱峰的峰尖液组分，并用SDS-PAGE凝胶电泳检测分子量：6.5kDa以下的蛋白为目标蛋白，对目标蛋白多次收集，冷冻干燥收集于-20℃保存即得花马杂交鹿鹿角盘活性肽。
进一步地，所述步骤S2中，离心的条件为：于4℃、5000g离心力下离心20min。
进一步地，所述步骤S3中，离心的条件为：于4℃、5000g离心力下离心20min。
本发明的第二个目的是要提供一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽，使用前述花马杂交鹿鹿角盘活性肽的制备方法制得。
本发明的第三个目的是要提供一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽在抑菌药物中的应用，所述花马杂交鹿鹿角盘活性肽通过对菌体细胞膜和细胞璧的破坏达到对细菌的抑制效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
选用冷提法对鹿角盘粉进行提取，是因为稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，具有保护蛋白不易变性的优点。因此选择PH为3.6在4℃下充分预冷的醋酸-醋酸钠缓冲溶液避免了蛋白的变性，保证小分子蛋白不易被降解，加入终浓度为55％的乙醇其目的在于沉淀大分子蛋白，因此严格控制乙醇浓度和提取温度对蛋白的稳定性尤为重要。根据电泳结果显示目的蛋白的分子量在5kDa左右，所以选择了分离范围为3000-5000Da的Sephadex G-25填料。分离过程中层析柱的选择也尤为重要，层析柱的粗细和长短会影响凝胶填料的分离效率，所以在除盐和分离分级的过程中选用了不同的层析柱，在反相高效液相分离的过程中，流动相的选择、流动相的配置、分离柱的选择、分离温度、流速、和洗脱梯度都会影响分离度，因此经过多次对分离条件的调整，从而确定了对目的蛋白分离的最佳条件，经检测，目的蛋白为纯度93.70％，分子量4543.14Da，序列与Bactenecin(A8Qj91)相似的新小分子肽，并将其命名为花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP(Sika AntlerDisk Bioactive Peptide)。
本发明制得的花马杂交鹿鹿角盘活性肽通过对菌体细胞膜和细胞璧的破坏达到对细菌的抑制效果，为抗菌药物的研发和改造提供新的依据和理论。
附图说明
图1为除盐蛋白的SDS-PAGE电泳图：图1中1为标准蛋白；2蛋白除盐品。
图2为Sephadex G-25凝胶层析图：图2中1为组分S1；2为组分S2
图3为除盐蛋白进行凝胶过滤色谱分析后的SDS-PAGE电泳图：图3中1为组分S1；2为组分S2。
图4为除盐蛋白的反相高效液相色谱图：图4中1为S2-1；2为S2-2；3为S2-3；4为S2-4；5为S2-5。
图5为除盐蛋白的反相高效液相色谱分析后的SDS-PAGE电泳检测结果：图5中，1为S2-1；2为S2-2；3为S2-3；4为S2-4；5为S2-5。
图6为目标蛋白纯度鉴定图。
图7为目标蛋白质谱图。
图8为EAVLRAVDQFNKR的二级质谱图。
图9为花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对菌种生长曲线的影响：a是花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对Staphylococcus aureus生长曲线的影响；b为花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对Escherichia coli生长曲线的影响。
图10为Escherichia coli倒置显微镜图：A为阴性对照；B为1/2MIC组；C为1MIC组；D为2MIC组。
图11为Staphylococcus aureus倒置显微镜图：E为阴性对照；F为1/2MIC组；G为1MIC组；H为2MIC组。
图12为花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对菌种生长曲线的影响：a为花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对Staphylococcus aureus胞内AKP活性释放的影响；b为花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对Escherichia coli胞内AKP活性释放的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1
如图1所示，本实施例提供了一种花马杂交鹿鹿角盘活性肽的制备方法，所使用材料与试剂如下：
材料：花马杂交鹿鹿角盘磨碎成鹿角盘粉于-20℃低温保存；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus BNCC 186335)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC133264)均购于菌种保藏中心。
试剂：BCA法蛋白定量试剂盒，北京百泰克生物技术有限公司；Trifluoroaceticacid，北京迈瑞达科技有限公司；乙腈，美国FISHER公司；Tris，上海蓝季生物公司；Tricine，上海蓝季生物公司；Nacl，北京试剂；冰乙酸，北京试剂；盐酸，西陇科学股份有限公司；去离子水，吉林娃哈哈有限公司；考马斯亮蓝R-250，广州赛国生物科技有限公司；无水乙酸钠，西陇科学股份有限公司。
上述材料准备好后，即可进行制备，具体步骤如下：
配制pH为3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于4℃中充分预冷，将醋酸-醋酸钠缓冲溶液与鹿角盘粉按重量比5：1的比例混合，充分搅拌后于4℃、5000g离心力下离心20min，取上清液，记为溶液A；
向溶液A中加入终浓度为55％的乙醇，于4℃下静置后于4℃、5000g离心力下离心20min，取上清液，记为溶液B；
将溶液B用旋转蒸发仪于40℃下蒸发至合适体积，冷冻干燥得总蛋白粗提物；
将总蛋白粗提物用去离子水溶解，然后用Sephadex G-25层析柱除盐，除盐条件为：上样量为10ml；上样浓度为100mg/ml，洗脱液为去离子水，洗脱流速为1ml/min，检测波长为280nm，收集各组分，冷冻干燥后，获得除盐蛋白，冷冻干燥后的除盐品为白色絮状，极轻，并极易溶于水；用BCA法检测除盐蛋白中的蛋白含量为90.8％，说明除盐品中主要成分为蛋白质；用SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白分子量的分布(如图1所示)：其大分子蛋白主要集中在116kDa～29.0kDa之间，小分子量蛋白主要集中在20.1kDa以下，其中以20.1kDa和6.5kDa的蛋白尤为明显；
对除盐蛋白进行凝胶过滤色谱分析：将50mg的除盐蛋白溶于2ml的超纯水中，配成终浓度为25mg/ml的上样样品，用Sephadex G-25层析柱以0.5ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为去离子水，检测波长为280nm，收集两个组分S1和S2，冷冻干燥后于-20℃保存，Sephadex G-25凝胶层析图如图2所示(图2中1为组分S1；2为组分S2)；用SDS-PAGE凝胶电泳检测两个组分S1和S2的分子量分布(如图3所示，图3中，1表示组分S1；2表示组分S2)：组分S1主要为116kDa-29kDa的大分子蛋白，组分S2主要在20kDa和6.5kDa有明显的两种蛋白；
反相高效液相色谱分离：取10mg凝胶过滤色谱分离出的组分S2用2ml乙腈水溶液溶解成终浓度为5mg/ml的上机样品，色谱柱为ZORBAX 300SB-C18，流动相A为加有0.1％三氟乙酸的超纯水，流动相B为加有0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，紫外检测波长为220nm，设置流速为1ml/min，梯度洗脱：乙腈浓度10％-18％，0-5min；18％-40％，5-40min；40％-50％，40-50min；分别收取如图3中的5个色谱峰，S 2-1(13.57min)、S 2-2(41.98min)、S 2-3(46.89min)、S 2-4(47.95min)、S 2-5(49.72min)峰的峰尖液，峰的高度和该物质的丰度呈正相关；用SDS-PAGE凝胶电泳检测分子量：如图4所示，S 2-1为6.5kDa以下的蛋白，S2-2为大分子蛋白，S2-4和S2-5为20kDa以下的蛋白，所以S2-1为目标蛋白，对目标蛋白S2-1多次收集，冷冻干燥收集于-20℃保存即得花马杂交鹿鹿角盘活性肽。
花马杂交鹿鹿角盘活性肽鉴定方法如下：
纯化蛋白的纯度鉴定
检测条件：色谱柱型号为ZORBAX 300SB-C18 5μm；流动相A为去离子水加0.1％TFA，流动相B为乙腈加0.085％TFA；流速为0.2ml/min；洗脱梯度，乙腈浓度5％，0-3min；5％-20％，3-5min；20％-38％，5-20min；38％-95％，20-25min；95％，25-45min；95％-5％，45-50min，此条件下得单一对称的单峰。如图5可知，在25.625min为单一对称的峰，其面积为89.03％，所以纯化蛋白的纯度为89.03％.
分子量的测定
仪器为U3000纳升级液相，Q-Exactive质谱仪，色谱柱为自制的Nano色谱柱液相条件：流动相A，98％H2O，2％CAN，0.1％FA；流动相B，98％CAN，2％H2O，0.1％FA流速为400nL/min；梯度洗脱，(B相浓度5％-8％，0-6min；8％-10％，6-6.5min；10％-24％，6.5-45；24％-40％，45-51min；40％-80％，51-54min；80％，54-59；80％-5％，59-59.9min；5％，59.9-65min)。质谱条件：喷射电压，2.0kV；毛细管加热温度，280℃；一级扫描分辨率，70000；一级质量扫描范围，250-2000m/z；二级扫描分辨率，17500；一级AGC Target，3e6；二级AGCTarget，1e5；一级Maximum IT，50ms；二级Maximum IT，100ms。如图6所示，根据公式(分子量＝质荷比*电荷-电荷)可知其分子质量为4543.14Da。
氨基酸序列的鉴定
质谱检测条件：Type of search，MS/MS Ion Search；Enzyme，Trypsin；Fixedmodifications，Carbamidomethyl(C)；Variable modifications，Gln-pyro-Glu(N-termQ),Oxidation(M)；Mass values，Monoisotopic；Protein mass，UnrestrictedPeptidemass，tolerance-/+15ppm；Fragment mass tolerance-/+20mmu；Max missed，cleavages2；Instrument type，Default；Number of queries，10822；Database，23143；如图7所示，根据所鉴定到的二级质谱图可得序列EAVLRAVDQFNKR，数据库搜索匹配蛋白为Bactenecin(A8Qj91)，所以该蛋白为与A8Qj91序列相似的新蛋白，将其命名为花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP(Sika Antler Disk Bioactive Peptide)。
实施例2
实施例1制得的花马杂交鹿鹿角盘活性肽在抑菌药物中的应用，所述花马杂交鹿鹿角盘活性肽通过对菌体细胞膜和细胞璧的破坏达到对细菌的抑制效果。为了验证其抑菌效果，以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus BNCC186335)、大肠杆菌(Escherichiacoli ATCC 133264)作为实验菌种进行抑菌测试，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus BNCC 186335)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 133264)均购于菌种保藏中心。
菌悬液的制备
将保存的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus BNCC 186335)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 133264)菌株分别于37℃，180r/min培养24h活化后，接种于固体LB培养基上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落，37℃，180r/h震荡培养至生长对数期至OD600＝0.5～0.6，2000g离心收集菌体，用0.01MPB清洗三次，并重新悬于新鲜的LB培养基中调至OD600为0.4，为后续实验用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus BNCC 186335)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 133264)。
最小抑菌浓度的测定(MIC)
采用二倍稀释96孔板法来测定花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus BNCC 186335)和大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 133264)的MIC，37℃培养24小时后，于OD600处测量吸光值，以没有菌体生长所对应的最低浓度为SAPBP的MIC值。如表1所示，花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对金黄色葡萄球菌的MIC为1mg/ml，对大肠杆菌的MIC为0.5mg/ml。
表1
Figure BDA0003222032060000091
对生长曲线的影响
将重悬的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus BNCC 186335)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 133264)菌液，分别加入花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP至终浓度为1/2MIC、1MIC、2MIC。取200μl加入至96孔板中，于37℃恒温培养箱下培养24h，每2h测定其在600nm处的吸光值，未加花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP的一组为对照组。以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对Staphylococcus aureus和Escherichia coli的生长曲线如图8。可见在1MIC和2MIC下均能对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有显著的抑制。
对细胞膜的通透性的影响
使用荧光探针(PI)探究花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对菌体细胞膜的完整性，取重悬的菌液(OD600＝0.4)分别加入终浓度为1/2MIC、1MIC、2MIC的花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP，37℃，180r/min培养2h，加入菌液体积1/10的稀释后的PI溶液(浓度为10μg/ml)于37℃恒温培养箱中孵育30min，之后用PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察。如图9、10阴性对照组无荧光出现，随着剂量的升高可见荧光明显升高，PI沾染率也逐渐升高，在2倍的MIC下荧光出现的最多，说明随着剂量的升高花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对细胞膜的影响也会加强。
对细胞璧的完整性的影响
将培养至对数期(OD600＝0.6)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus BNCC186335)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 133264)菌悬液分别经2000g离心3min后，用PBS洗涤3次并重悬于PBS中，调至OD600为0.5，分别加入花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP至终浓度为1/2MIC、1MIC、2MIC于37℃，160r/min下培养0、1、2、3、4、5、6、7、8小时后经2000g离心3min取上清液，按照碱性磷酸酶(AKP)试剂盒说明书进行操作以检测AKP活性。碱性磷酸酶(AKP)存在于细胞壁和细胞膜之间，正常情况下不会分泌到细胞外。然而，当细胞壁遭到破坏时，AKP泄漏到细胞外环境中，增加了细胞外环境中的AKP活性，因此，通过检测细胞外AKP活性可以反映细胞壁的完整性。由图(11-a、b)可知，对照组的AKP活性无明显变化；AKP的活性随花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP的浓度增加而升高，在前两个小时AKP活性上升最快之后趋于稳定。以上结果说明不同浓度的SAPBP对细胞璧的完整性菌有一定的破坏。(***P≤0.001，0.001＜**P≤0.01，0.01＜*P≤0.05与阴性对照相比)。
本实施例选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为实验菌种，因为它们是生活中常见的细菌，是典型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。细菌的细胞膜位于细胞璧的内侧，细胞璧可以抵御外界环境对细菌的有害刺激，细胞膜是由磷脂双分子层和许多蛋白构成的半透明膜，含有丰富的酶系统，并执行很多重要的代谢功能。花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP对金黄色葡萄球菌的MIC为1mg/ml,对大肠杆菌的MIC为0.5mg/ml，造成抑菌浓度的差异可能是革兰氏阳性菌的细胞璧较阴性菌的厚，革兰氏阳性菌抵御外界刺激的能力较强，碱性磷酸酶(AKP)是存在于细胞璧和细胞膜之间的一种酶，正常情况下是不会释放的，当细胞璧被破坏时，AKP会释放到外环境中，当花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP作用于细菌时，前两个小时AKP活性上升最快，之后趋于稳定，随着剂量的升高AKP的释放量也会升高，呈剂量依赖型。正常情况下荧光染料(PI)不会进入到细胞内，当细胞膜被破坏时，PI进入到细胞里与核酸结合产生荧光，当花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP作用于细胞时随着剂量的升高，与PI结合的细胞也会增加，呈剂量依赖性。综上所述花马杂交鹿鹿角盘活性肽SAPBP是通过对菌体细胞膜和细胞璧的破坏达到对细菌的抑制效果。
本实验通过对花马杂交鹿鹿角盘分离纯化出的活性肽进行鉴定及其抑菌活性的初步研究，旨在更深入的研究活性肽的结构和功能，为日后活性肽的空间改造和抑菌药物的研发，提供新的理论依据和参考。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种6.5kDa以下花马杂交鹿鹿角盘活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取花马杂交鹿鹿角盘磨碎成粉末，得到鹿角盘粉；
S2、配制pH为3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液于4℃中充分预冷，将醋酸-醋酸钠缓冲溶液与鹿角盘粉按重量比5：1的比例混合，充分搅拌后离心取上清液，记为溶液A；
S3、向溶液A中加入终浓度为55％的乙醇，于4℃下静置后离心取上清液，记为溶液B；
S4、将溶液B用旋转蒸发仪于40℃下蒸发至合适体积，冷冻干燥得总蛋白粗提物；
S5、将总蛋白粗提物用去离子水溶解，然后用SephadexG-25层析柱除盐，除盐条件为：上样量为10ml；上样浓度为100mg/ml，洗脱液为去离子水，洗脱流速为1ml/min，检测波长为280nm，收集各组分，冷冻干燥后，获得除盐蛋白；用BCA法检测除盐蛋白中的蛋白含量，用SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白分子量的分布：其大分子蛋白主要集中在116kDa～29.0kDa之间，小分子量蛋白主要集中在20.1kDa以下，其中以20.1kDa和6.5kDa的蛋白尤为明显；
S6、对除盐蛋白进行凝胶过滤色谱分析：将50mg的除盐蛋白溶于2ml的超纯水中，配成终浓度为25mg/ml的上样样品，用SephadexG-25层析柱以0.5ml/min的流速进行洗脱，洗脱液为去离子水，检测波长为280nm，收集两个组分S1和S2，冷冻干燥后于-20℃保存，用SDS-PAGE凝胶电泳检测两个组分S1和S2的分子量分布：组分S1主要为116kDa-29kDa之间的大分子蛋白，组分S2主要在20kDa和6.5kDa有明显的两种蛋白；
S7、反相高效液相色谱分离：取10mg凝胶过滤色谱分离出的组分S2用2ml的乙腈水溶液溶解成终浓度为5mg/ml的上机样品，色谱柱为ZORBAX 300SB-C18，流动相A为加有0.1％三氟乙酸的超纯水，流动相B为加有0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，紫外检测波长为220nm，设置流速为1ml/min，梯度洗脱：乙腈浓度10％-18％，0-5min；18％-40％，5-40min；40％-50％，40-50min；多次收集出现的多个色谱峰的峰尖液组分，并用SDS-PAGE凝胶电泳检测分子量，收集6.5kDa以下氨基酸序列为EAVLRAVDQFNKR的蛋白S2-1为目标蛋白，冷冻干燥收集于-20℃保存即得花马杂交鹿鹿角盘活性肽。
2.根据权利要求1所述的6.5kDa以下花马杂交鹿鹿角盘活性肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，离心的条件为：于4℃、5000g离心力下离心20min。
3.根据权利要求1所述的6.5kDa以下花马杂交鹿鹿角盘活性肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，离心的条件为：于4℃、5000g离心力下离心20min。
4.一种6.5kDa以下花马杂交鹿鹿角盘活性肽，其特征在于，使用如权利要求1-3任一所述的6.5kDa以下花马杂交鹿鹿角盘活性肽的制备方法制得。
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