CN1142181C - 大蹼铃蟾多肽在制备抗肿瘤和艾滋病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及大蹼铃蟾多肽在制备抗肿瘤和艾滋病药物中的应用，属于生物医学领域。大蹼铃蟾多肽是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2698.4道尔顿，等电点10.0，多肽全序列一级结构为：NH2-TITTKKLSGLKTALKGAAKELASTYT-COOH。大蹼铃蟾多肽通过收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经离子交换、凝胶过滤、高压液相反相柱层析分离纯化后得到。具有显著的抑制肿瘤细胞生长、和抗艾滋病病毒活性的作用。可作为制备抗肿瘤和艾滋病药物的应用。
Description
技术领域：
本发明涉及大蹼铃蟾多肽在制备抗肿瘤和艾滋病药物中的应用，属于生物医学领域。
背景技术：
肿瘤也是危害人类健康的另一类主要疾病，而且治疗药物匮乏，目前在化疗中所使用的药物，如阿霉素，环磷酰胺等等均具有较大的人体毒性，副作用非常大，因而肿瘤治疗药物的开发是药物研制的热点。
艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的破坏肌体免疫系统的致死疾病。这一被称为“二十世纪瘟疫”的病魔，已蔓延到世界的每个角落，众多的发展中国家正在遭受它的危害。据WHO最新公布的材料，AIDS流行的国家和地区达170多个，全球感染HIV者已达4400多万人，已有1400万人死亡，据专家估计，我国目前实际HIV感染人数超过50万人。由于目前尚无可预防的有效疫苗，抗HIV药物成为防治AIDS的有效手段。另一方面，目前发现HIV病毒易变异及对许多药物会产生耐药性，造成治疗上的巨大困难，从传统药物和天然资源中寻找新的抗AIDS药物和先导化合物的研究，是当前国内外新药研制中的重要研究方面和非常活跃的领域。
两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)等。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用等。从这些传统药物中寻找特定药理活性的单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点，据文献报道从爪蟾(Xenopuslaevis)皮肤分泌液获得的多肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性；国外学者也已报道从东方铃蟾(Bombina orientalis)和花铃蟾(Bombinavariegata)中分离出若干具广谱抗微生物活性的多肽类物质，如Bombinin和BLP-like多肽。在国外，抗菌肽已开始用于抗肿瘤和抗带外壳病毒的研究和治疗，但未见详细的报道。最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究还较少。大蹼铃蟾(Bombina maxima)主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。
发明人经文献检索，未发现有将大蹼铃蟾多肽用作制备抗肿瘤和艾滋病药物的公开报道。
发明内容：
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供大蹼铃蟾多肽在制备抗肿瘤和艾滋病药物中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
大蹼铃蟾多肽，是从两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2698.4道尔顿，等电点10.0，多肽全序列一级结构为：苏氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-苏氨酸(NH2-TITTKKLSGLKTALKGAAKELASTYT-COOH)。
大蹼铃蟾多肽制备的方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后，经DEAE-Sephadex A-50离子交换后，收取所得峰I经Sephadex G-50凝胶过滤后取峰IV，峰IV再经CM-Sephadex C-25离子交换，取第三步柱层析分离出的峰II，再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化，取第四步HPLC反相C18柱层析分离出的峰I即可。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
大蹼铃蟾多肽作为制备抗肿瘤和艾滋病药物的应用。
1、大蹼铃蟾多肽抑制肿瘤细胞生长的作用：
在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常细胞对照。每孔滴加3×105/ml的C8166细胞或Molt-4细胞100μl。置37℃，5％CO2培养箱内培养。72小时(C8166)或48小时(Molt-4)用MTT方法测定待测化合物对细胞的毒性作用。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度。
2、大蹼铃蟾多肽对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用
在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100μl，同时设置正常细胞对照，HIV感染细胞对照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和200 TCID50的HIV-1IIIB，即感染复数为0.007，每孔的总体积为200μl。置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成的合胞体数。EC50为抑制合胞体形成达50％时的药物浓度。CC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(TI)为CC50/EC50的比值
表1大蹼铃蟾多肽抑制肿瘤细胞生长的作用：化合物 EC50(μg/ml)
C8166 Molt 4大蹼铃蟾多肽粗品 89 78大蹼铃蟾多肽(批号1) 19.8 24.5大蹼铃蟾多肽(批号2) 24.4 37.3大蹼铃蟾多肽(批号3) 29.5 20.9
目前临床上所用大部分抗生素类药物不具有抑制肿瘤细胞作用。由表1可见，除抑制微生物生长外，大蹼铃蟾多肽粗品及纯化大蹼铃蟾多肽均具有显著的体外抑制人肿瘤细胞生长的作用。
表2大蹼铃蟾多肽对HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用：化合物 EC50 CC50 TI
(μg/ml) (μg/ml)大蹼铃蟾多肽粗品 12.5 89 7大蹼铃蟾多肽(批号1) 3.1 19.8 7大蹼铃蟾多肽(批号2) 2.4 24.4 10大蹼铃蟾多肽(批号3) 4.0 29.5 8
从表2可见，与文献报道的其他来源抗菌多肽和目前目前临床上所用抗生素类药物不同，大蹼铃蟾多肽粗品及不同批号的纯化大蹼铃蟾多肽均有显著的体外抑制HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的作用。
从上述实验结果可得出本发明大蹼铃蟾多肽的有益效果在于：
大蹼铃蟾多肽具有显著地抑制肿瘤细胞生长的作用，对C8166，Molt-4肿瘤细胞的抑制率EC50平均分别为24.6μg/ml，27.6μg/ml；另一方面，大蹼铃蟾多肽具显著的抗艾滋病病毒活性，多肽浓度达到3.0μg/ml时，大蹼铃蟾多肽对病毒复制抑制率达50％。因此，大蹼铃蟾多肽可作为制备抗肿瘤和艾滋病药物的应用。
附图说明：
图1为本发明大蹼铃蟾多肽的DEAE-Sephadex A-50离子交换层析图。
图2为本发明大蹼铃蟾多肽的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。
图3为本发明大蹼铃蟾多肽的CM-Sephadex C-25离子交换层析图。
图4为本发明大蹼铃蟾多肽的HPLC反相C18柱层析图。
具体实施方式：
1、制备大蹼铃蟾多肽：
活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。第一步：DEAE Sephadex A-50离子交换，按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉，冻干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3的缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；DEAE SephadexA-50(Pharmacia产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经0.05M Tris-HCl，
含10mM EDTA，pH7.3缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，经两个柱体积同样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集穿透峰I。
第二步，Sephadex G-50凝胶过滤：第一步得到的活性成分穿透峰I冻干，溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液，上样于Sephadex G-50(Pharmacia产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集峰IV。
第三步，CM Sephadex C-25离子交换：凝胶过滤得到的活性成分峰IV上样品于经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25(Pharmacia产品)阳离子交换柱(300mm长，26mm直径)，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰II。
第四步，反相高压液相层析(RP-HPLC)：CM Sephadex C-25离子交换得到的活性成分峰II以水(含0.1％三氟乙酸)∶乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰I(箭头标记)即为大蹼铃蟾多肽。
2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
3、纯化大蹼铃蟾多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的大蹼铃蟾多肽，是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2698.4道尔顿，等电点10.0，全序列结构为：苏氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-苏氨酸(NH2-TITTKKLSGLKTALKGAAKELASTYT-COOH)。
上述所说的大蹼铃蟾多肽可作为制备抗肿瘤和艾滋病药物的应用。
Claims (1)
1、从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种分子量为2698.4道尔顿，等电点10.0的单链多肽作为制备抗肿瘤和艾滋病治疗药物的应用。
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