CN1160084C - 蜈蚣抑癌活性提取物及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蜈蚣抑癌活性提取物及其提取方法。其提取方法为将蜈蚣粗粉经醇提脱脂，所得残渣在4-8℃水提，再减压浓缩后冻干得水提物冻干粉；所述冻干粉经柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干；将D部分的冻干粉经活性碳脱色后，得脱色冻干粉，再经柱层析，蒸馏水洗脱，UV220检测，收集第二峰(主峰)，30-40℃旋转浓缩、冻干，即得抑癌有效部分D-1。该方法简便易行，有利于以蜈蚣为主药的抗癌制剂的研究和开始。
Description
本发明涉动物来源的抗癌物质，尤其涉及从动物中药体内提取活性物质，更具体地说涉及一种蜈蚣抑癌活性提取物及其提取方法。
动物中药体内广泛存在着大量生物活性物质，但对传统动物中药的研究远远落后于植物药，而对传统动物中药的研究，特别是对它们体内活性成分的研究，是维护和增进人类健康，并在阐明某些生命科学的基本规律等方面，均会具有很重要的意义。
蜈蚣是我国常用传统动物中药，为熄风镇疼、攻毒散结、通络止疼之要药。临床用于治疗痉挛、炎症、肿痛等，对肿瘤、肝炎、肾炎的治疗有不少报道，例如，董汉良的《蜈蚣的临床应用》，参见湖北中医杂志，1982.(3)p26；周本宏的《近代蜈蚣的临床应用进展》，参见中医药信息，1991.(8)1 p45-48；和沈丕安的《62例原发性肺癌的中医治疗》，参见上海中医药杂志，1982.(7)p9。这些报道都只是将蜈蚣作为一味药加入药方中，并没有提取蜈蚣的活性物质。国内外对蜈蚣化学及活性成分研究报道甚少，近年来虽对蜈蚣毒的生物活性有一些文献报道，例如，A.H Mohamed等的“Effects of anextract fromthe Centipede Scolopendra moristans on intestine，Uterus andheart contractions and on blod glucose and Liver and muscleglycogen Levels”，参见Toxicon 18(1980 3)581-589；A.H Mohamed等的“Proteins，Lipids，Lipoproteins and some enzymecharacteri-zations of the venom extract from the CentipedeScolopendra Morsitans”，参见Toxicon 21(3)371-377；Wang you等的“Biological activities of centipede crude venom”，参见Kexuemongbao 1985.30(8)1102-1105；和吴刚等的“蜈蚣(ScolopendraSubspinipes mutilans L.Koch)毒的化学组成和生物活性”，参见生物化学杂志1992.8(2)144-149，但这些报道中都没有明确提到从少棘巨蜈蚣复杂的水溶性成分中寻找具有抑癌活性成分，特别是属于肽类性质的化合物成分。例如，许鸣嘀等的“蜈蚣碱性蛋白SSMP-d的分离纯化及其部分理化性质的鉴定”，参见生物化学杂志1997.13(5)586-591，其是从少棘巨蜈蚣水溶性碱性蛋白部分，得到具有明显抑制KB(人口腔上皮鳞癌)及HCT(人结肠癌细胞)人癌细胞的有效组分。从中分离、纯化、鉴定了分子量为5.8kd的多肽SSM-peptide-1和分子量为24.64kd、等电点为9.27的蛋白质SSMP-d，并测定了SSMP-d的N-末端的部分氨基酸序列，但其为蜈蚣水溶性大分子蛋白，抑癌活性远不如本发明提取物D-1。因此非常有必要摸索一整套有针对性的分离、纯化方法及相应的对动物中药的研究、开发技术，从少棘巨蜈蚣体内获得具有抑癌活性的有效部分，并对其进行了较深入的化学和药理研究。
本发明的目的是提供一种蜈蚣活性提取物，该提取物是水溶性的抑癌有效成分，从而避免了用蜈蚣作为一味中药用于抗癌中药方剂中，这样既可以直接将本发明提取物用于抗癌配方中，也可以将其作为主药用于抗癌的复方制剂中。
本发明的另一个目的是提供一种从蜈蚣体内提取水溶性抗癌活性物的方法，从而从蜈蚣体内获得具有抑癌活性的成分。
本发明提供了一种蜈蚣抑癌活性提取物，所述提取物显示如下物化特性：
1)外观：无色冻干粉；
2)溶解度：极易溶于水；
3)分子量：500-2000；
4)主要组成：赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、 丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸等；
5)元素分析数据：C：27-28％，H：7-8％，N：13-15％；
6)紫外扫描图谱：220nm处有最大吸收；并且所述提取物是采用下述方法提取：
1)将蜈蚣磨成粗粉，取粗粉经醇提脱脂后，将所得残渣在4-8℃水提，再减压浓缩，冻干得冻干粉；
2)将所述冻干粉经第一次柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干，得D部分冻干粉；
3)将D部分的冻干粉经活性碳脱色后冻干，得脱色冻干粉，再经第二次柱层析，蒸馏水洗脱，UV220检测，收集第二峰(主峰)，30-40℃旋转浓缩、冻干，即得D-1提取物。
本发明的提取方法是这样实现的：1)将蜈蚣磨成粗粉，取粗粉经乙醇脱脂，将所得残渣在4-8℃水提，再减压浓缩后冻干得水提物冻干粉；2)所述冻干粉经第一次柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干，得D部分冻干粉；3)将D部分的冻干粉经活性碳脱色后冻干，得脱色冻干粉，再经第二次柱层析，蒸馏水洗脱，UV220检测，收集第二峰(主峰)，30-40℃旋转浓缩、冻干，即得本发明D-1提取物。
本文所用术语“蜈蚣”是指少棘巨蜈蚣。
本发明是根据临床应用的抗癌中药方剂中多有蜈蚣为主要药味这一事实为根据，通过对蜈蚣不同提取物的全面筛选后，对具有抑制癌细胞活性的部分进行了分离、纯化，获得实验动物体内外均具有较明显抑癌作用的有效部分D-1。其分子量范围在500-2000左右。本发明提取物与现有技术中蜈蚣水溶性碱蛋白是不同的物质。本发明的从少棘巨蜈蚣复杂的水溶性成分中寻找出具有抑癌活性成分，特别是属于肽类性质的化合物成分，这尚属首例。要从蜈蚣体内获得具有抑癌活性成分，需要摸索一整套有针对性的分离、纯化方法及相应的对动物中药的研究、开发技术。本发明的工艺方法简便易行，目的性强，有利于今后的开发与利用。
图1是本发明方法的工艺流程图。
图2是本发明提取物D-1的紫外扫描图谱。
图3是本发明的一个实施方案的提取物D-1的高压液相图谱。
图4是本发明的另一个实施方案的提取物D-1的高压液相图谱。
图5是本发明的另一个实施方案的提取物D-1的高压液相图谱。
根据本发明的一个实施方案，1)将少棘巨蜈蚣粗经乙醇脱脂后，在4-8℃低温水提，水提物经旋转浓缩仪减压浓缩后冻干，得冻干粉，其冻干粉的重量为粗粉的10％左右，2)冻干粉经第一次柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分洗脱液减压浓缩后冻干，得D部分的冻干粉，3)D部分经活性碳柱脱色后，再经第二次柱层析，蒸馏水洗脱，收集第二峰(主峰)，30-40℃低温旋转浓缩、冻干，即得提取物D-1，约为粗粉量的0.1％左右(见图1)。所得提取物具有如下物化性质：
1)外观：无色冻干粉；
2)溶解度：极易溶于水；
3)分子量：500-2000；
4)主要组成：赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸等；
5)元素分析数据：C：27-28％，H：7-8％，N：13-15％；
6)紫外扫描图谱：220nm处有最大吸收(见图2)
用于本发明步骤1)的乙醇脱酯是采用常规方法进行的，例如用95％的乙醇进行脱酯。
用于本发明步骤2)的第一次柱层析优选购自瑞典Pharmacia的葡萄糖凝胶Sephadex G-25，其中凝胶柱层析样品与凝胶的比例为1∶100-120，更优为1∶100。
用于本发明步骤3)的第二次柱层析优选购自瑞典Pharmacia的葡萄糖凝胶Sephadex G-15，其中凝胶柱层析样品与凝胶的比例为1∶80-100，更优为1∶80。
本发明的低温水提温度优选为4-8℃，更优为4℃。本发明的低温减压浓缩的温度优选为30-40℃，更优为30℃，并且减压浓缩是采用常规工艺进行。
用于本发明步骤3)的活性碳优选使用北京光华木材厂的GH-15活性碳，其中活性碳脱色柱样品与活性碳的比例为1∶16左右。
根据本发明的另一个实施方案，对提取物的抗癌活性进行了测试。
试验结果表明：无论是采用集落形成法或MTT法检测，大分子A部分对KB细胞(人口腔上皮鳞癌)的IC50在10-25μg/ml；小分子D部分，对KB、HCT(人结肠癌)、Bel7402(人肝癌)及A2780(人卵巢癌)细胞的IC50分别为19.5、19.7、20.6及13.7μg/ml；D部分经进一步脱色，分离纯化等手段，得到的小分子化合物D-1组份，在KB、HCT、Bel7402及A2780细胞的IC50分别为3.7、8.4、6.6及1.2μg/ml，本试验经多次重复，结果一致。因此，认为少棘巨蜈蚣粗粉水提物，经分离纯化后，大分子A部分及小分子D部分对多株人癌细胞均有一定抗癌活性。再经过进一步纯化之后，得到的D-1组份较D部分的活性更强，其活性可提高3-10倍。
给小鼠接种移植性肿瘤、肝癌H22及Lewis肺癌后，以D-180-160mg/kg/日连续腹腔注射9-10天，其抑制率可达25-56％(P＜0.05-0.01)，说明D-1在体内注射也有较明显的抑癌作用。
下面将参考以下非限定性实施例对本发明进行更加详细的说明。
实施例1
少棘巨蜈蚣粗粉600克，经95％乙醇脱脂后，低温4℃水提，水提物低温30℃减压浓缩后冻干，得冻干粉70克。冻干粉经Sephadex G-25柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干，得冻干粉16克。D部分经活性碳脱色后，得脱色冻干粉2.6克。再经Sephadex G-15柱层析，蒸馏水洗脱，UV220检测，收集第二峰(主峰)，减压浓缩、冻干，即得D-1。得量为634毫克。其HPLC(高效液相色谱)层析图谱如图2所示。其中HPLC层析工艺为：柱：C18300A(φ4.6×250mm)；洗脱液：0.1％ TFA；紫外检测：220nm(紫外220nm)。紫外吸收显示6个峰，其中保留时间为6分钟左右处为主峰，含量在50％左右。
实施例2
少棘巨蜈蚣粗粉600克，经95％乙醇脱脂后，低温8℃水提，水提物低温40℃减压浓缩后冻干，得冻干粉60克。冻干粉经Sephadex G-25柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻于，得冻干粉15克，D部分经活性碳脱色后，得脱色冻干粉2.5克。再经Sephadex G-15柱层析，用实施例1的方法进行HPLC层析，UV220检测(紫外220)，蒸馏水洗脱，收集第二峰(主峰)，减压浓缩、冻干，即得D-1。得量为587毫克。其HPLC(高效液相色谱)层析图谱如图3所示。
实施例3
少棘巨蜈蚣粗粉600克，经95％乙醇脱脂后，低温6℃水提，水提物低温30℃减压浓缩后冻干，得冻干粉60克。冻干粉经Sephadex G-25柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干，得冻干粉15克，D部分经活性碳脱色后，得脱色冻干粉2.5克。再经Sephadex G-15柱层析，用实施例1的方法进行HPLC层析，UV220检测，蒸馏水洗脱，收集第二峰(主峰)，减压浓缩、冻干，即得D-1。得量为610毫克。其HPLC(高效液相色谱)层析图谱如图3所示。
实施例4
将本发明的蜈蚣提取物进行以下试验：
体外试验—
①MTT法：将各种对数生长期的人癌细胞，接种于96孔板，每孔800-1500个细胞，24小时后加药，在RPMI1640(GIBCO)(含10％小牛血清)培养基、37℃、5％CO2条件下培养4天，加MTT，用伯乐450酶标仪，450和570nm双波长检测，计算细胞生长抑制率，并求出IC50。
②集落形成法：将各种对数生长期的人癌细胞，接种于直径6cm的培养皿中，50个细胞/ml，每血5ml，6小时后加药，在RPMI1640培养基、37℃、5％CO2条件下培养8天后，以Giemsa染色，计数集落(50个细胞/集落)，计算抑制率及IC50。
体内实验—
取生长良好的小鼠移植性肿瘤Lewis肺癌及肝癌H22，按抗癌药药效字学要求，常规接种于小鼠。于接种24小时分组给药，每组10只小鼠，同时设对照组及抑癌有效部分D-1的不同剂量组。空腹注射，连续9-10天，停药后24小时处死动物，剥瘤称重并计算抑瘤率，进行统计学t检验处理数据。
以上所用的材料为：
细胞株—①KB：人口腔上皮鳞癌细胞②Bel7402：人肝癌细胞
③HCT：人结肠癌细胞④A2780：人卵巢癌细胞
移植性肿瘤—小鼠肝癌H22及LeWis肺癌。
以上瘤株均为本实验室保存。
实验动物—采用昆明和纯系C57/BL小鼠，体重18-23克，由中国医学科学院动物中心提供，北京市动物委员会发合格证号(昆明鼠：01-3001，C57/BL：01-3004。
具体实验结果如下：
1、少棘巨蜈蚣中各组分对人癌细胞的细胞毒作用
从少棘巨蜈蚣水溶性蛋白部分分离出的各组分，无论是用集落形成法或MTT法检测，大分子A组分对kB细胞的IC50均在10-25μg/ml；小分子D组分对KB、HCT、Bel7402及A2780的IC50分别为119.5、19.7、20.6及13.7μg，重复实验结果近似；D组分再经近一步纯化得到D-1，在KB、HCT、Bel7402及A2780人癌细胞株的IC50，分别为3.7、8.4、6.6及1.2μg/ml(见表-1)。D-1水溶性好、理化性质稳定、细胞毒活性明显提高，值得进入体内抗癌活性的观察。
表-1 少棘巨蜈蚣各组分对人癌细胞株的细胞毒作用
| 组分 | IC50(μg/ml) | |||
| KB | HCT | Bel7402 | A2780 | |
| ADD-1 | 10-2519.519.63.7 | 19.721.18.4 | 20.622.86.4 | 13.71.2 |
2、D-1对移植性肿瘤的抗癌作用观察
①对小鼠肝癌H22的疗效试验：小鼠于接种后24小时，给小鼠i.P D-1 100或150mg/kg，连续给药10天，结果与对照组比较，其肿瘤抑制率分别为32％及25％(P＜0.05)(见表-2)。
表-2 D-1对小鼠肝癌H22的疗效观察
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(始/末) | 体重(g) | 瘤重(g) | 抑制率(％) | P值 |
| 对照D-1 | /100×10 | 10/1010/10 | 19.8/+6.119.9/+4.6 | 2.45±0.851.66±1.11 | /32.0 | ＜0.05 |
| 对照D-1 | /150×10 | 10/1010/10 | 20.1/+7.119.9/+5.6 | 4.06±1.053.05±0.69 | /25.0 | ＜0.05 |
②对小鼠Lewis肺癌的疗效观察：小鼠于接种后24小时给小鼠i.pD-1 150mg/kg或80、120及160mg/kg，连续给药9天，结果与对照组比较，其瘤种抑制率分别为49.1％及50.2％(P＜0.01)、39.9％(P＜0.05)、55.5％(P＜0.01)。见表-3
表-3 D-1对小鼠Lewis肺癌的疗效观察
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(始/末) | 体重(始/末) | 瘤重(g) | 抑制率(％) | P值 |
| 对照D-1 | /150×9 | 10/1010/10 | 18.9/+1.420.3/+0.5 | 2.67±0.571.36±0.85 | /49.1 | /＜0.05 |
| 对照D-1 | /80×9120×9160×9 | 10/1010/1010/1010/10 | 22.0/+1.521.1/+3.722.1/+2.822.6/+2.3 | 2.8±1.101.40±0.421.69±0.921.25±0.70 | /50.239.955.5 | /＜0.01＜0.05＜0.01 |
以上初步试验结果表明，从少棘巨蜈蚣水溶性部分分离得到的D-1组分对几种人癌细胞的细胞毒作用明显。在整体抑瘤实验中，对小鼠肝癌H2及Lewis肺癌的抗癌作用也得到较满意的证实。
本发明虽然对特定实施方案进行了详细的描述，但是，本领域技术人员能够理解到，这些技术方案只是举例说明而并不构成限制，本发明范围所附权利要求所限定。
Claims (16)
1、蜈蚣抑癌活性提取物，其特征在于所述提取物采用下述方法提取：
1)将少棘巨蜈蚣磨成粗粉，取粗粉经乙醇脱脂，将所得残渣在4-8℃水提，再减压浓缩后冻干得水提物冻干粉；
2)所述冻干粉经Sephadex G-25第一次柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干，得D部分冻干粉；
3)将D部分的冻干粉经活性碳脱色后冻干，得脱色冻干粉，再经Sephadex G-25第二次柱层析，蒸馏水洗脱，UV220检测，收集第二峰(主峰)，30-40℃旋转浓缩、冻干，即得D-1提取物，该提取物显示如下物化特性：
1)外观：五色冻干粉；
2)溶解度：极易溶于水：
3)分子量：500-2000；
4)主要组成：赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸等；
5)分析数据：C：27-28％，H：7-8％，N：13-15％：
6)紫外扫描图谱：220nm处有最大吸收。
2、如权利要求1所述的提取物，其特征在于所述步骤1)的水提温度为4℃。
3、如权利要求1所述的提取物，其特征在于所述第一次柱层析是葡萄糖凝胶Sephadex G-25柱层析，其中冻干粉∶凝胶＝1∶100-120。
4、如权利要求3所述的提取物，其特征在于所述Sephadex G-25柱层析的冻干粉∶凝胶＝1∶100。
5、如权利要求1所述的提取物，其特征在于所述第二次柱层析是葡萄糖凝胶Sephadex G-15柱层析，其中冻干粉∶凝胶＝1∶80-100。
6、如权利要求5所述的提取物，其特征在于所述SephadexG-15柱层析的冻干粉∶凝胶二1∶80。
7、如权利要求1所述的提取物，其特征在于所述活性碳脱色过程中，D部分冻干粉∶活性碳＝1∶16。
8、如权利要求1所述的提取物，其特征在于所述低温旋转浓缩温度是30℃。
9、一种从蜈蚣中提取抑癌活性物的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)少棘巨蜈蚣磨成粗粉，取粗粉经醇提脱脂，将所得残渣在4-8℃水提，再减压浓缩后冻干得水提物冻干粉；
2)所述冻干粉经Sephadex G-25第一次柱层析，蒸馏水洗脱，收集色带D，将D部分减压浓缩后冻干，得D部分冻干粉：
3)将D部分的冻干粉经活性碳脱色后冻干，得脱色冻干粉，再经Sephadex G-25第二次柱层析，蒸馏水洗脱，UV220检测，收集第二峰(主峰)，30-40℃旋转浓缩、冻干，即得D-1提取物。
10、如权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤1)的水提温度为4℃。
11、如权利要求9所述的方法，其特征在于所述第一次柱层析是葡萄糖凝胶S即hadex G-25柱层析，其中冻干粉∶凝胶＝1∶100-120。
12、如权利要求11所述的方法，其特征在于所述SephadexG-25柱层析的冻干粉∶凝胶＝1∶100。
13、如权利要求9所述的方法，其特征在于所述第二次柱层析是葡萄糖凝胶Sephadex G-15柱层析，其中冻干粉∶凝胶＝1∶80-100。
14、如权利要求13所述的方法，其特征在于所述Sephadex G-15柱层析的冻干粉∶凝胶＝1∶80。
15、如权利要求11所述的提取物，其特征在于所述活性碳脱色过程中，D部分冻干粉∶活性碳＝1∶16。
16、如权利要求1所述的提取物，其特征在于所述的低温旋转浓缩温度是30℃。
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