CN101062895A

CN101062895A - 异菊苣酸及其提取分离方法和在药物中的用途

Info

Publication number: CN101062895A
Application number: CN 200710055679
Authority: CN
Inventors: 陈英红; 罗浩铭; 高阳; 姜瑞芝; 高其品
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-05-25
Filing date: 2007-05-25
Publication date: 2007-10-31

Abstract

本发明提供了一种新化合物－－异菊苣酸，将抱茎苦荬菜进行水提取乙醇沉淀，离心，上清液加氧化钙沉淀，pH为9－12，离心，沉淀加乙醇至悬浮，加硫酸调pH＝1－4，离心，回收乙醇部分，浓缩液经聚酰胺或大孔树脂柱层析，经水洗、不同浓度的乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，浓缩，用丙酮、乙酸乙酯、甲醇处理，反复重结晶，得到本发明。本发明还公开了异菊苣酸在制备治疗抗衰老、增强免疫功能和抗肿瘤药物中的用途。

Description

异菊苣酸及其提取分离方法和在药物中的用途

技术领域：

本发明提供了由抱茎苦荬菜中分离的新化合物--异菊苣酸，同时还公开了其提取方法和医药用途，属于中药有效部位提取分离方法和医药用途技术领域。

技术背景

抱茎苦荬菜为多年生草本，高30-50厘米，性状全草无毛，根呈长圆锥形，表面棕色至棕褐色，具纵皱纹及须根；全草入药，治头痛，牙痛，吐血，衄血，痢疾，泄泻，肠痈，胸腹痛，痈疮肿毒，外伤肿痛。本发明所涉及的异菊苣酸(学名：二-3，5-二羟基肉桂酰基酒石酸)是从菊科植物抱茎苦荬菜中提取分离的新化合物，经CA检索，异菊苣酸为一种新的化合物，目前，尚未见有关在提取分离及医疗用途方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的化合物--异菊苣酸，用于制备药物。

本发明的另一个目的是提供了从菊科植物抱茎苦荬菜中提取分离异菊苣酸单体化合物的方法。

本发明还公开了异菊苣酸在制备治疗抗衰老、增强免疫功能和抗肿瘤药物中的用途。

本发明所涉及的异菊苣酸是从菊科植物抱茎苦荬菜中提取分离的类化合物具有下列通式：

其中，-R₁，-R₂和-R₃可以相同或不同。

-R₁＝-R₂＝--R₃＝H

-R₁＝-R₂＝--R₃＝-CH₃(或-CH₂CH_3，)

-R₁＝-R₂＝-CH₃(或-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₃)，-R₃＝H

-R₁＝-R₂＝-H，-R₃＝K⁺(Na⁺)

-R₁＝-R₂＝-CH₃(或-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₃)，-R₃＝K⁺(Na⁺)

所有化合物同分异构体包括：D型(左旋)、L型(右旋)和ness型(内消旋)。

上述单体化合物的共性为有其相同的基本母核为二-3，5-二羟基肉桂酰基酒石酸。不同点为母核上的取代基-R₁、-R₂和-R₃可以相同，也可以不同。

本发明的二-3，5-二羟基肉桂酰基酒石酸具有以下结构式：

分子量：474.08

分子式：C₂₂H₁₈O₁₂

本发明的技术解决方案如下：将抱茎苦荬菜进行水提取乙醇沉淀，离心，上清液加氧化钙沉淀(PH＝9-12)，离心，沉淀加乙醇至悬浮，加硫酸调PH＝1-4，离心，回收乙醇部分，浓缩液经聚酰胺或大孔树脂柱层析，经水洗、不同浓度的乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，浓缩，用丙酮、乙酸乙酯、甲醇处理，反复重结晶，得到二-3，5-二羟基肉桂酰基酒石酸单体化合物。

本品为绿色粉末，易溶于水，微溶于乙醇、甲醇、二甲基亚砜，不溶于丙酮、氯仿等有机溶媒。mp：290-292℃.[a]²⁰ _D-257°(H₂O)，

光谱分析确定结构：

UV：最大吸收值202、250、260、348

IR(KBr)λcm^-1：3600～3400(OH)，1697，1280，1186(O＝C-O)，

1645(＞C＝C＜＝)

NMR分析结果：

表二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸的NMR谱分析(D₂O)

No.	¹³C NMR	¹H NMR	HMQC	HMBC
No.	¹³C NMR	¹H NMR	HMQC	HMBC	1234567891011	121.9120.0153.2112.4158.5110.0148.2109.0168.974.0173.4	6.8(1H，s)6.5(1H，s)6.9(1H，s)7.62(1H，d，J＝15.6Hz)6.29(1H，d，J＝15.6Hz)5.35(1H，s)	6.86.56.97.626.295.35	6.3(8-H)7.6(7-H)6.8(2-H)7.6(7-H)，6.8(2-H)6.8(2-H)7.6(7-H)，6.29(8-H)，5.35(10-H)5.35(10-H)

对上述二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸单体化合物进行了抗衰老，增强免疫功能和抗肿瘤实验研究，结果表明，本发明进一步提供了对上述单体化合物的纯度在50％-98％之间均具有抗衰老，增强免疫功能和抗肿瘤活性，且纯度越高活性越强，并显示出量效关系。

本发明可以纯化的形式与药学上适当的载体一起被使用。一般，这些载体包括水或醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸林格氏溶液。

本发明可用作单独施用的化合物，或用作与其它类化合物及其它药联合施用的组合物。

根据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员普遍知道的任何一种。

可以通过任何适当的方式给药，包括非肠道、静脉内、肌内、腹腔内给药，或者也可以通过用导管直接灌注给药。给药的剂量和频率依据年龄、性别、病人状态、同时服用其它药物、不良反应和临床医师考虑到的其它因素而定。

本发明具有抗衰老，增强免疫功能和抗肿瘤的作用，是通过以下的药效实验得到证实。

实验例1：

异菊苣酸的抗衰老作用

(1)对果蝇飞翔能力的影响

取刚羽化尚未交配的果蝇成虫，乙醚麻醉后按雌雄分组、每组50只，对照组置基础培养基中饲养，给药组培养基中另加异菊苣酸，含量分别为0.1％和0.2％，均在25±1℃相对密度65％的暗箱中培养。每2d更换一次培养基，40d后观察尚存果蝇的飞翔情况，计算飞翔百分率，结果见表，表明：与对照组比较，给药组果蝇飞翔能力均有不同程度的提高，其中0.2％异菊苣酸组对雄果蝇飞翔能力的提高较为显著，最高可达120％，对剂量的影响，有的随剂量增加而提高，有的则无显著性差异。

表对果蝇飞翔能力的影响

组别	剂量(g/kg)	性别	动物数(只)	存活数(只)	存活率(％)	飞翔率(％)
组别	剂量(g/kg)	性别	动物数(只)	存活数(只)	存活率(％)	飞翔率(％)	对照组		雌性	27	12	44.44

异菊苣酸	0.10.2	雌性雌性	3632	2521	69.44*65.67*	62.858.3
异菊苣酸	0.10.2	雌性雌性	3632	2521	69.44*65.67*	62.858.3	对照组异菊苣酸	0.20.5	雄性雄性雄性	373828	122318	32.4360.52*64.28*	84.7117.8

***P＜0.01

(2)对小鼠脑和肝脏中SOD含量的影响

取健康雄性小鼠，分组和给药同前，ip异菊苣酸(10，20mg/kg)13d后将小鼠处死，立即取出脑和肝脏，用生理盐水洗净、吸干、称重，以0.5mol/L pH 7.8磷酸盐缓冲液5ml制成匀浆，2000r/min离心5min，取上清液，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活力，Folin-酚法测蛋白质含量，结果见表，表明：给药组小鼠脑和肝脏中SOD和比活力均明显增加。

表对小鼠脑和肝脏中SOD含量的影响

组别	剂量(mg/kg)	动物数(只)	SOD含量
			SOD含量				脑	高％	肝	增高％
			对照组异菊苣酸	10mg20mg	888	64.22±8.01101.54±10.18*118.56±24.87*	脑	高％	肝	增高％	58.1184.62	57.32±8.4582.34±4.01*89.87±20.11*	43.6556.79

***P＜0.01

实验例2.

异菊苣酸的免疫调节作用

(1)胸腺细胞(前T细胞)增殖反应

参考Mosmann方法稍加改进。无菌摘取胸腺，剔除周围脂肪，剪碎组织置钢性细胞筛挤压，同时用含有10％FCS(小牛血清)的培养基(RPMI-1640，每毫升含100u的青霉素G和100μg的链霉素以及3μg的二性霉素B，美国GIBCO公司产品)冲洗，制成单个胸腺细胞悬液，洗涤2次(1500r/min，5min)，重悬细胞，将细胞浓度调至1×10⁷/ml，并加入96孔平底培养板，每孔100μl，再加入各样品，使每孔的总体积为200μl，重复3份。置5％CO₂/95％空气(无菌)，37℃细胞培养箱培养72h，在培养结束前4h，加入MTT(pH6.9，磷酸盐缓冲液(PBS)配制)每孔10μl，使终浓度达到0.5mg/ml，继续培养4h。终止培养后，用96孔平板离心机离心(1500r/min，10min)，弃上清，经PBS洗涤1次后，每孔加入100μl含0.04mol/L HCl的酸化异丙醇(50ml异丙醇+浓HCl 0.167ml)，振荡(微型振荡器)约5～10min后，用DG-II型酶联免疫检测仪，测定各样品光密度OD值，选择波长为570nm和630nm(参考波长)。

(2)脾脏淋巴细胞的增殖反应

参考Mosmann方法稍加改进。无菌取脾脏，制成单个细胞悬液，并采用低渗法破坏红细胞，洗涤后，重悬细胞，将细胞浓度调整至5×10⁶/ml。操作步骤与胸腺细胞增殖反应相同。

结果

(1)胸腺细胞(前T细胞)增殖反应异菊苣酸不同剂量与Con A联合使用时，对小鼠胸腺细胞有显著的促进增殖作用。当Con A浓度在2μg/ml时(n＝3，下同)，加入异菊苣酸浓度为0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25μg/ml，胸腺细胞增殖的OD值分别为：0.12±0.01、0.14±0.01、0.17±0.02、0.19±0.01*、0.24±0.02*、0.32±0.03**、0.45±0.01**(与对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01)。

(2)脾脏淋巴细胞的增殖反应单独使用异菊苣酸，对脾脏淋巴细胞有显著的促进增殖的作用。

实验例3

异菊苣酸对S₁₈₀肉瘤和荷瘤小鼠免疫脏器的影响：

1.1材料

1.1.1异菊苣酸：本室制备

1.1.2实验动物：昆明种小鼠，体重18~22g。

1.1.3动物分组与剂量设计：实验动物按体重随机分为4组，1个溶剂对照组，3个剂量的实验组(分别为10、20、40mg/kg体重)。实验组和对照组动物以0.1mL/10g体重灌胃，每天1次，连续15d。

1.2方法

1.2.1抗S₁₈₀肉瘤试验及对荷瘤小鼠免疫脏器的分离称重：无菌操作，取小鼠腹腔传代9d的S₁₈₀腹水瘤(北京市肿瘤防治研究所提供)，调细胞浓度为4×10⁹/L，接种在小鼠右前腋部皮下，每只0.2mL。接种后次日给药，最后一次给药24h后处死动物，取瘤块称重，按下式计算药物的抑瘤率。

肿瘤抑制率＝(C-T)/C×100％(T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重)，处死小鼠后立即分离胸腺和脾脏，剔除周围结缔组织和脂肪，生理盐水漂洗后用滤纸吸去表面水分，扭力天平称重。

2结果

对S₁₈₀肉瘤和荷瘤小鼠免疫脏器的影响：异菊苣酸10、20、40mg/kg体重3个剂量组连续15d经口灌胃均可显著抑制S₁₈₀生长，抑瘤率达50％~61％。与阴性对照组比较P＜0.01，其中40mg/kg组抑瘤率达61％，3个剂量组与对照组比较均可显著增加荷瘤小鼠的胸腺及脾脏重量(P＜0.01)，见表1。3个剂量组两两比较，脾指数、胸腺指数、瘤重各项差异均无显著性。

表1异菊苣酸对S₁₈₀肉瘤及荷瘤小鼠免疫器官的影响( X±S)

组别	动物数	瘤重g	抑瘤率％	胸腺指数mg/g	脾指数mg/g
组别	动物数	瘤重g	抑瘤率％	胸腺指数mg/g	脾指数mg/g	生理盐水组异菊苣酸10mg/kg异菊苣酸20mg/kg异菊苣酸40mg/kg	10101010	1.8±0.80.9±0.151)1.0±0.7¹⁾0.7±0.6¹⁾	504461	2.4±0.83.8±0.6¹⁾4.7±0.5¹⁾4.5±0.4¹⁾	4.9±1.27.0±1.2¹⁾8.2±0.9¹⁾8.5±0.6¹⁾

本次实验以移植的S₁₈₀肉瘤观察了异菊苣酸的抗肿瘤效果，结果显示3个剂量组都可显著抑制S₁₈₀肉瘤的生长，表明异菊苣酸具有抗肿瘤作用。

具体实施方式：

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸的制备

取药材抱茎苦荬菜100kg，加15倍量的水，煎煮2次，每次2小时，合并滤液，浓缩至每毫升含10克药材，加乙醇至醇浓度60％，离心，上清液加入10％氧化钙乳调至PH＝8-9，得沉淀10kg，将沉淀悬浮到90％乙醇中，用硫酸调pH＝3，离心，醇溶液用40％氢氧化钠溶液调pH＝5-6，离心，回收乙醇，加水稀释成每ml含10g生药的浓度，通过处理好的聚酰胺柱，先后用蒸馏水、60％乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，水洗脱液适当浓缩，经乙酸乙酯萃取，弃去乙酸乙酯部分，水层加入丙酮沉淀，收集沉淀，用甲醇、乙醇反复重结晶，得到纯度达到90％以上的二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸化合物500mg。

实施例2

二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸的制备

取药材抱茎苦荬菜100kg，加10倍量的水，煎煮2次，每次1.5小时，合并滤液，浓缩至每毫升含20克药材，加乙醇至醇浓度700％，离心，上清液加入10％氧化钙乳调至PH＝9-10，得沉淀12kg，离心，醇溶液用40％氢氧化钠溶液调pH＝6-7，离心，回收乙醇，加水稀释成每ml含10g生药的浓度，通过处理好的大孔树脂柱，先后用蒸馏水、60％乙醇洗脱，收集水洗脱液，适当浓缩，浓缩液经丙酮沉淀，沉淀物以水溶解，加甲醇沉淀，沉淀以水和甲醇重结晶，得到纯度达到80％以上的二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸300mg。

实施例3

二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸的制备

取药材抱茎苦荬菜100kg，加20倍量的水，煎煮3次，每次2小时，合并滤液，浓缩至每毫升含10克药材，加乙醇至醇浓度80％，离心，上清液加入10％氧化钙乳调至PH＝10-12，得沉淀8kg，离心，醇溶液用40％氢氧化钠溶液调pH＝6-7，离心，回收乙醇，加水稀释成每ml含15g生药的浓度，拌入硅胶中，装柱，展开剂：正丁醇∶乙酸∶水＝70∶35∶10，展开，按色带切割收集，甲醇溶出，以水和甲醇反复重结晶，得到纯度达到80％以上的二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸化合物360mg。

Claims

1、一种从菊科植物抱茎苦荬菜中提取分离的类化合物具有下列通式：

其中，-R₁，-R₂和-R₃可以相同或不同；

-R₁＝-R₂＝--R₃＝H

-R₁＝-R₂＝--R₃＝-CH₃(或-CH₂CH₃，)

-R₁＝-R₂＝-CH₃(或-CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₃，-CH₂CH₂CH₂CH₃)，-R₃＝H-R₁＝-R₂＝-H，-R₃＝K⁺(Na⁺)

2、二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸，具有以下结构：

分子量：474.08，分子式：C₂₂H₁₈O₁₂。

3、权利要求1所述化合物的制备方法，包括以下步骤：将抱茎苦荬菜进行水提取乙醇沉淀，离心，上清液加氧化钙沉淀，PH为9-12，离心，沉淀加乙醇至悬浮，加硫酸调PH＝1-4，离心，回收乙醇部分，浓缩液经聚酰胺或大孔树脂柱层析，经水洗、不同浓度的乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，浓缩，用丙酮、乙酸乙酯、甲醇处理，反复重结晶，得到二-3，5二羟基肉桂酰基酒石酸单体化合物。

4、权利要求1或2所述化合物在制备治疗抗衰老、增强免疫功能和抗肿瘤药物中的用途。