CN1044856C - 果聚糖同系混合物的药物、生产方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种由葡萄糖和果糖组成的果聚糖的同系混合物，分子量为666-2124，平均分子量为1300-1500，推荐分子量为666-1962，平均分子量为1300-1400的白色或微黄色固体。系从植物牛膝中提取而成，生产方法简便。该药物具有增强机体免疫功能，抑制肿瘤生长和转移，提升白细胞，保护和恢复肝脏功能等作用。可作为一种免疫治疗药物用于肿瘤、肝炎以及爱滋病等疾病。

Description

果聚糖同系混合物的药物、生产方法及其用途

本发明是一种能增强机体免疫功能、治疗肝炎和提高白血球的药物，这种药物作为肿瘤病人的辅助治疗尤佳，该药物可以从中药牛膝中分离、提取出来。

人们对多糖在免疫学中作用的认识起于1917年，Dochez和Avery发现肺炎球菌在其生长过程中分泌一种特别的可溶性物质，这个物质能作为免疫原来诱导一个免疫反应而产生特殊的抗体(血清球蛋白)。后来，Heidelberger,Avery和Goebel证明了这是一个多糖(pneumococcal polysaccharide)物质，这也是第一个被发现的非蛋白类的抗原性物质。

以后的研究证明多糖链中只有相对很小的决定性部位是对抗体专一性的，不同的多糖链中如果具有相同的决定性部位，就可以产生相同的免疫反应。而从本世纪五十年代初开始，人们惊喜地发现了大量的糖链组份带着主要的生物信息与蛋白质，脂，磷脂和核酸结合在一起参与着免疫过程及其它生命过程，更使人们对糖链在免疫反应中的重要作用有了越来越深刻的印象。

近年来对多糖作为抗原和免疫原的研究，在对细菌的识别和分类，在对免疫反应的更深了解，在确定抗体-抗原反应中的活性部位，及在检测和抵抗微生物引起的人体疫病中发挥了巨大的作用。

自然，人们对人体免疫有更浓厚的兴趣。近二十年来，用免疫疗法治疗癌症正在被世界各国所公认，免疫疗法就是刺激人体非特异性防御机能，特别是在机体的免疫功能受损伤的情况下刺激患者的免疫糸统来达到治疗疾病的目的。其优越性比之外科手术，放射疗法和化学疗法是不言而喻的。提高抗体的免疫功能对健康者同样十分必要，能帮助抵御疾病，延缓衰老。爱滋病(AID8)危害，使人们对免疫缺损的严重后果有了更深刻的认识，因此，寻找具有良好免疫调节作用的药物是当代医学的迫切需要。科学家们首先从微生物和细菌的代谢产物中寻找免疫促进剂，相继发现了胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide)，短小棒状杆菌菌苗(Corybacterium parvum)，及溶血性链球菌制剂(OK-432)等有效药物，但由于细菌及其代谢产物具有抗原性强和副作用大等缺点，科学家们又转向植物中发掘免疫治疗药物，特别是西德，日本，澳大利亚及印度等国学者都努力从本国的传统医学中重点研究具有抗菌，解毒，扶正等植物药对免疫功能的影响。而最受重视的免疫促进剂是从中草药中提取的多糖类化合物。

牛膝(Achyranthes bldentata BI)是我国的一种传统中药，据古代医书记载具有“补肝肾，强筋骨，止腰膝酸麻，散恶血，破症结，治痈疽恶疮”的功效，这些功效与近代临床上增强免疫功能是一致的。人们曾从牛膝中分离出了皂苷，生物碱和甾酮等成份，并进行了初步的药理研究。田庚元(CN 88105524.7)等从生药牛膝中分离提取得到了一种牛膝多糖，对100％纯度的据组份进行的药理研究表明它具有增强体液免疫，细胞免疫的作用，并能保护小鼠肝细胞免受四氯化碳毒害和抗小鼠S-180内癌的作用，这种牛膝多糖数均分子量小于10000，是由葡萄糖和甘露糖克分子比为1.0∶0.66所组成的多糖。因为具有显著增加免疫功能的小分子量多糖并不多见，所以从牛膝中进一步提取有效成份，尤其是小分子量多糖的药物仍是人们所关注的。

本发明提供一种属于果聚糖类具有能增强机体免疫功能和提高白血球的药物，该药物不仅对治疗肝炎病有效，而且尤其适于作为肿瘤病人的辅助药物，可以提高患者的免疫功能和白血球。也适合于防止老年病的发生和发展，从而以延缓衰老。同时也可用于爱滋病的治疗。本发明的药物是一种具有如下结构的化合物：

其中：R-OH; a,b,c,d,o,p,q-0    →9；

              a+b+c+d+o+p+q-1    →9

本发明的药物也可以是下述结构的化合物：

本发明的药物是由葡萄糖和果糖这二种单糖组成的果聚糖的同系物的混合物，我们简称为Abps。

本发明的药物分子量范围为666-2124，平均分子量为1300-1500。推荐分子量范围为666-1962，平均分子量为1300-1400。外观为白色或微黄色疏松状固体，易吸湿,在紫外区202nm有一吸收蜂。

用蒽酮法测定其糖含量为100％，元素分析结果不含氮，磷,硫,表明无氨基酸，肽，磷脂和硫酸脂。用电导滴定法测定表明不含羧基。因而是一个中性糖。

该药物经纯化后冷冻干燥，做TLC分析。薄板是：aluminiumsheets silica gel 60F254(MERCK),2*10cm2；展开剂：正丁醇∶吡啶∶水(1∶1∶1)。薄板先经展开剂展开，放在空气中吹干，重复三次后再点样，用硫酸甲醇溶液显色，呈很好的一点，Rf=0.50。

本发明的药物用C-18反相柱(μBONDAPAKTM，水)分析，流动相为15％ MecN-H₂,流速1ml/min，柱温20℃，用示差检测器进行高效液相色谱分析呈尖锐的单峰(图1)。当洗脱剂中增加乙晴的比例时，如乙晴占15％体积时，还是呈一单峰，而再增加乙晴的比例时，保留时间变长，峰型加宽。从图中我们还可以看到经Sephadex G-50纯化的Abps还含有极少量的非糖组份，所以我们用C-18反相制备柱来再一次纯化Abps。将50mg的Abps使用Kaseisorb LC NH₂ Suger,Waters(4.6mm I.D.250mm)柱，以乙腈∶水(65∶35)为洗脱，流速0.7me/min，柱湿20℃，示差检测器进行高效液相色谱分析，对Apbs呈一个很宽的包。经sephahex G-50按流出顺序分成十管，可以看到Abps为长段不同的寡糖的混合物(图2)。用Spherisorb NH₂柱(ID4.6mm,30cm.5μ大连化物所)，淋洗剂为乙晴∶水(50∶50)，流速1ml/min，示差检测器，Abps呈一包峰(图3)，当在上述洗脱剂500ml中加入2克聚乙二醇(W.M.3,000-4,500)时，有了较好的分辨(图4)，可以看出Abps确实是一个混合物，在图中分成九个成分。

本发明的药物经快原子轰击电离质谱(FAB-MS)分析，选用甘油和硫代甘油混合基质，分子量侧定范围达4.000，图谱上出现最大分子准离子峰2095 M[12糖+133(Cs⁺)]，及一系列质量数相差162(一个六碳糖)的碎片离子峰1933,1771,1609,1448(M+1),1285,1124(M+1),961等(图5)。

将Abps在100C,1N硫酸封管两小时，用碳酸钡中和，离心除去固体，减压浓缩。用TLC检测已水解完全条件：薄板：silica gel 60F254,MERCK；展开剂：正丁醇∶吡啶∶水(6∶4∶3)。作HPLC分析，使用Carbohydrate Analysis柱(3.9mm×30cm)，洗脱剂：乙晴∶水(65∶35)，流速0.5ml/min，时Abps的完全水解产物的高效液相色谱图(图6)和葡萄糖、甘露糖及果糖的标准样品作对照(图7)，看出Abps是由果糖和葡萄糖基组成。

我们用HPLC(条件同上)对这两种糖基的比例进行定量。由于果糖在酸水解的条件下远比葡萄糖不稳定，选择了相对比较温和的条件，0.2N的硫酸，50℃水解0.5小时。经TLC(条件如上)检测已水解完全。配制一系列标准浓度的葡萄糖和果糖水溶液，以峰面积对注射量(μg)作标准曲线，测得蔗糖的糖基比例：葡萄糖∶果糖(1.0∶1.0).以检验此方法的正确性。对Abps及经Sephadex G-50分成的三管Abps，分别做定量糖基分析和FAB-MS分析，结果列成下表(表1)：

    表1．Abps及Abps经Sephadex G-50分得的三个组份

           的糖基摩尔比和FAB-MS的最大m/z值经Sephadex G-50           HPLC定量分析         FAB-MS分析分离的组分                Glc∶Fru           M+133(Cs+)

Part1                    1∶8.7            2095(12糖)

Part2                    1∶6.0            1609(9糖)

Part3                    1∶4.6            1125(6糖)

Abps                     1∶7.0            2095(12糖)从上表可以看出Abps是一聚合度不同的果聚糖

根据上面的分析，我们知道了Abps为一链的长短不同的果聚糖混合物。而果聚糖的13C核磁共振非常特征。最明显的是集中在103.80-104.80 ppm的β-呋喃果糖基C-2的共振峰和位于末端的α-吡喃葡萄糖基糖环的六个碳原子的共振峰。果糖基以β-(2-1)方式连接的菊糖型和果糖基以β-(6-1)方式连接的果聚糖型相比，糖基上相应各个碳的化学位移都有小的差别。

菊糖随聚合度的增加，末端葡萄糖基上碳原子的共振信号强度减小，直到消失，而化学位移几乎没有变化，只是C-1+略向低场移动；而果糖基随着远离蔗糖基，相应的各个碳的化学位移变化也不大，只是跟接葡萄糖基的果糖基相比，相应各个碳的化学位移有微小的变化，C-3,C-5,C-6的变化不大；C-2,C-1略移向高场，C-4略移向低场。

Abps的13C核磁共振谱图具有明显的果聚糖特征(图8)，按照文献可以归属其各个类型碳原子的化学位移(表2)。

跟长链型的果聚糖相比，Abps的葡萄糖基糖环碳原子的信号很强烈，表明Abps是短链型的。跟直链型的果聚糖相比，Abps果糖基碳原子的共振信号比较复杂，既有2,1连接的菊糖型又有(6-1)连接的果聚糖型的果糖基糖环碳的共振信号，表明Abps是分支型的。我们还发现Abps的13C核磁共振谱和Bromegrass中的果聚糖组份(Acta chem.Scand,44,158,1990)，(带或不带-1,6-)-Fru-(2-支链的2,6连接的短片段果聚糖混合物)的谱图

   表2．Abps的13C核磁共振的化学位移(ppm)

碳原子                     化学位移

 C-1        60.99       61.92      62.06

 C-2        103.82      103.96     104.12      104.31

            104.42      104.61     104.81      105.16

 C-3        77.02       77.12      77.28       77.62

 C-4        74.88       74.99      75.23       75.54

            75.81       76.00

 C-5        80.91       81.77

 C-6        62.89       63.11      63.83       63.9 7

 C-1*       92.75       93.13

 C-2*       71.75

 C-3*       73.29

 C-4*       69.85

 C-5*       73.24

 C-6*       60.63

*号表示吡喃葡萄糖基糖环的碳原子十分相似。只是从果糖基的C-5,C-3等的信号可以明显地看出各自的两组信号(呋喃果糖基的1位取代型和6位取代型)的强度对比正好相反，因此可以推测Abps的主链是1,2连接的果聚糖型。

经典的甲基化分析是迄今为止分析多糖糖苷键连接位置的最有效方法。多糖的完全甲基化有数种方法(Carbohydr Res.,131,209。1984)。Hakomori法是最常用的方法，在干燥的二甲亚砜中加入一定量的氢化钠，50℃保持几小时直到没有氢气放出，得到二甲亚磺酰阴离子的二甲亚砜溶液。加入经很好干燥的Abps的无水二甲亚砜溶液，氮气保护，浴式超声处理一小时，使得糖上的羟基全部变成醇钠，再加入碘甲烷得到甲基化的多糖。用红外检测羟基，如果还没有完全甲基化，样品干燥后，重复上述步骤，直到红外检测已没有羟基，关键是无水条件，全甲基化的Abps先用甲酸部分水解，然后用硫酸彻底水解，因为全甲基化的多糖往往不溶于无机酸而溶于甲酸。然后用钠硼氢还原，再用醋酐-吡啶乙酰化，最后得到部分甲基化部分乙酰化的糖醇的衍生物。用气相色谱-质谱分析。用OV-18填充柱分析时，出现A,B,C,D四个峰；各个峰经EI质谱分析(图9-12)，与标准谱图对照，得到下面结果(表3)。

              表3．Ahps甲基化分析结果

GC峰            O-甲基糖                键型

 A              1,3,4,6              果糖，呋喃型-(2-

 B              2,3,4,6-             葡萄糖，吡喃型-(1-

 C              3,4,6-               -1)果糖，呋喃型-(2-

 D              3,4-                 -1,6)果糖，呋喃型-(2-

气相色谱上A,B,C,D四个峰的面积比为3.7∶2.6∶4.5∶1。由于，如果是直链型的果聚糖，即D峰的面积为零，那么A的面积等于B的面积；如果是带一条支链的果聚糖，即D峰的面积为1，那么需要2个面积的A峰和1个面积的B峰。所以，我们可以推断，Abps中既有直链型的果聚糖又含有支链型的果聚糖，而直链型果聚糖的含量约为：1.6/2.6=61％，则支链型约为39％。

红外光谱也用于多糖的结构分析，糖类结构中的一些特殊功能基团都呈现一些特异的红外吸收，也被用来研究糖苷键的构型和一些多糖和糖的缀合物的结构和构象。从Abps的红外光谱(图13)中，我们仅可以得知Abps中没有特殊取代的基团。

植物中的果聚糖溶液都呈左旋性，旋光度在-19到-55之间。我们测得Abps的旋光度为-18°--35°之间，如-31.2°(C1.00,H₂O)，-18.3°(C1.5,H₂O)正处于上述范围。

本发明目的还提供一种制备上述药物的方法。

本发明的方法是将生药牛膝用水浸泡，浸泡液经水透析，透析液离心分离，浓缩和干燥；或透析液再经干水互溶的有机溶剂二级分级沉淀，干燥；也可以将浸泡液用与水互溶的有机溶剂二级分级沉淀，沉淀物用水溶介后，进行透析分离。其中所述的与水互溶的有机溶剂可以是低碳链的醇或酮，如甲醇、乙醇、丙醇、丙酮。所述的与水互溶的有机溶剂与牛膝浸泡液或透析液的体积比第一级为0.3-3∶1，第二级为0.5-5∶1。

本发明中所述的浓缩和干燥，最好采用低温浓缩或干燥，如真空干燥、真空浓缩、冷冻干燥，低温喷雾干燥等，以保持药物的活性。

采用本发明的上述三种方法，药物的得率为生药重量的4-10份。

为了获得纯的药，还可以用常规的柱层析方法加以提纯。如采用葡萄聚糖凝胶Sephadex G-50柱层析，以水为洗脱剂进行分离，收集单一糖峰，再经浓缩即可。

本发明的药物是一果聚糖同系物的混合物，平均分子量为1300-1500,FAB-MS显示的最大分子量为1962(12糖)，经典的甲基化分析及对完全甲基化彻底水解后糖基的甲苷的分析，证明它具有上面通式的结构，从13C核磁共振及旋光分析数据也能证实。

本发明的药物对人身具有提高白血球的功能，由于治疗肿瘤往往使用太剂量的化疗药物，因而常常出现骨髓造血功能被抑制，尤其白细胞的减少，影响治疗的进行，由AbE临床证明，无论对恶性肿瘤患者，白血病，还是病毒性肝炎，急性肝炎和慢迁肝均有明显升白作用，临床症状改善、精神、食欲、乏力和睡眠均明显好转。不需要靠输血或输白细胞来提高血象。使用本发明药物，慢性肝炎患者HBsAg和HBeAg能转阴性，中毒性肝炎患者GPT可以恢复。且具有增强机体免疫功能的促使脾脏内抗体细胞数增加，提高血清免疫球蛋白，激活网状内皮系统的吞噬功能，增加血清补体C_a的含量，促进白细胞介素-Ⅰ和白细胞介素Ⅱ的生成，促进T细胞和B细胞的作用，可以保护和恢复肝脏功能，可以作为一种免疫治疗药物用于肿瘤、肝炎及爱滋病等疾病。

本发明的药物不仅具有免疫活性，而且具有分子量小，水溶性好，人体易吸收，不但可用于口服，也可用于注射。本发明的药物生产方法简便，原料易得，便于工业化生产。

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明的方法。

本说明书中所用的仪器和分析方法简述如下。

1．13C-核磁共振：使用Brucker-AMX-600仪器。样品以重水为溶剂，20℃，以1,4-二恶唑作外标(δ67.64ppm)。

2．FAB-质谱：使用VG QUATTRO MS/MS仪器。样品溶于甘油和硫代甘油的的混合基质，用铯离子轰击。

3．旋光：使用Perkin-Elmer 241MC仪器。

4．红外光谱：使用Shimadzu IR-440仪器。

5．紫外吸收光谱(间苯二酚法)：使用Perkin Elmer Lambda 5仪器。

6．GC/MS(甲基化分析)：使用VG QUATTRO MS/MS质谱仪，HP5890ⅡGC系统，毛细管柱：SE-54(0.25mm I.D.*15m)，柱温：160-190℃/6min。

7．高压液相色谱：

使用高压泵：Model 6000(Waters Assoc.)，检测仪：I.R.(R401 Waters)，记录仪：Waters 730 Data Module.，流动相：两次蒸流水，乙晴(HPLC级)，使用前都经超声脱气和超滤。

8．数均分子量：

根据拉乌尔定律，Abps具有较好的水溶性和合适的分子量，可以用vpo法测定其平均分子量。配制Abps的水溶液(C=12.5245g/kg，读出1/3,1/2,2/3,1C时的ΔT，作图外推，即得0→0时的ΔT，计算得到Abs的数均分子量。

                        实施例1

将洗净牛膝切片10公斤，加30-50公斤水浸泡30-40小时，滤去残渣得浸泡22-30公斤。

取10000毫升浸泡液，在0-15℃时，加入丙酮0.3-3倍，大量沉淀产生，除去沉淀物得上清液，在上清液中再加入5000-50000毫升丙同，产生大量白色沉淀，取出沉淀，用适量水溶解，自来水透析40-50小时后，除去不溶物，冷冻干燥，得微黄色疏松状固体120克，即Abps。平均分子量1300-1400。

                        实施例2

将实施例1的浸泡液1000ml，用水透析30-50小时，透析液在＜80℃时浓缩，干燥，获150克粗Abps。平均分子量1300-1500。

                        实施例3

将实施例2的透析液，加入1500ml的丙酮产生沉淀，取上清液并加入1500ml丙酮，产生白色沉淀，取出沉液，冷冻干燥获10克疏松状固体Abps。平均分子量1300-1400。

                         实施例4

将实施例3的Abps，用蒸馏水溶解，上spehadexG-50层析柱，以水作洗脱液，用硫酸-苯酚法检出糖峰，收集单一峰位的收集液，低温浓缩干燥，获精制Abps的8克。质谱分析结果如图5。

                         实施例5

4例白血病，年龄8-10岁，用药二周后白细胞即回升，1例单核细胞性白血病，放疗51次降至2K/ml，每日0.5克服三次，四周后升至8K/ml，保证化疗的交替进行。另-例急性粒细胞白血病化疗后肝功能异常，白细胞下降，服药四周后肝功能正常，白血球3-5K/ml，临床症状改善，精神，食欲，乏力和睡眠均明显好转。

                         实施例6

急性肝炎22例，慢迁肝14例，用Abps药3-4周后，白细胞均明显升高，由治疗前的平均数4.77K/ml和4.4K/ml升至6.84K/ml和5.45K/ml。10例慢性肝炎治疗中GPT70％下降，4-8周肝功能恢复正常，γ球蛋白下降2％，表明增加肝内蛋白含量，稳定肝细胞膜作用。对2例慢性肝炎长期标志物阳性，服药12周后HBsAg和HBeAg阴转，至今未复发。

Claims (7)

1．一种含果聚糖的同系混合物的药物，其特征是具有如下的结构：

其中：R-OH；a,b,c,d,o,p,q=0    →9:

             a+b+c+d+o+p+q=1    →9

2．如权利要求1所述的药物；其特征是具有如下的结构，

n=1→9

3．如权利要求1或2所述的药物，其特征是分子量范围为666-2124，平均分子量为1300-1500。

4．如权利要求3所述的药物，其特征是分子量范围为666-1962，平均分子量为1300-1400。

5．如权利要求1或2所述的药物的生产方法，其特征是将生药牛膝用水浸泡，浸泡液用水透析，透析液离心分离，浓缩和干燥；或者将上述透析液再经与水互溶的有机溶剂二级分级沉淀，干燥；也可将上述浸泡液用与水互溶的有机溶剂二级分级沉淀；上述沉淀物用水溶解后，用水透析，透析液离心分离，浓缩和干燥；然后用柱层析法提纯，浓缩，其中所述的与水互溶的有机溶剂与牛膝浸泡液或透板液的体积比，第一级为0.3-3∶1，第二级为0.5-5∶1。

6．如权利要求5所述的药物的生产方法，其特征是所述的与水互溶的有机溶剂是低碳链的醇或酮。

7．如权利要求5所述的药物的生产方法，其特征是所述的浓缩或干燥是真空浓缩、真空干燥或冷冻干燥。

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