CN115894731B

CN115894731B - 一种金线莲均一多糖及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN115894731B
Application number: CN202211363563.8A
Authority: CN
Inventors: 张勋; 林羽; 徐伟; 许文; 林舒; 陈艳成; 吕贵杰
Original assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-11-02
Filing date: 2022-11-02
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-11-02
Also published as: CN115894731A

Abstract

本发明提供了一种金线莲均一多糖及其制备方法和用途，属于医药技术领域。本发明金线莲均一多糖主要包含葡萄糖和半乳糖组分；所述金线莲均一多糖的相对分子量为6000‑60000Da。本发明从金线莲中提取得到多种金线莲均一多糖，得到的均一多糖具有抗氧化、抗炎活性，可用于治疗药物性急性肝损伤。其中，金线莲均一多糖ARPP‑2的抗氧化、抗炎活性和治疗药物性急性肝损伤效果最优异。本发明对金线莲多糖中有效成分进行了提取、分析，得到针对抗氧化、抗炎、治疗药物性急性肝损伤的均一多糖，为金线莲的开发和应用提供科学依据，具有良好的应用前景。

Description

一种金线莲均一多糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种金线莲均一多糖及其制备方法和用途。

背景技术

对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是常用的解热镇痛药，但长期或过量服用APAP可导致急性肝损伤，这已成为常见的药物性肝损伤原因和广泛关注的公共健康问题。APAP诱导的肝损伤临床治疗方法非常有限。目前，主要采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸来应对APAP诱导的肝损伤。但是，其治疗效果差强人意，且治疗过程中容易引发如胃肠道不适、恶心、呕吐，中枢神经系统受影响导致发冷、头晕以及呼吸道支气管痉挛、咯血等副作用。中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、保肝护肝等药理活性，成为预防和改善APAP肝损伤的热点。多糖(polysaccharide)是一类由10个以上单糖通过糖苷键连接而成，具有广泛生物活性的高分子碳水化合物。但多糖活性与其结构特征，如分子量、构型、单糖组成和糖苷键链接类型等密切相关。找到针对预防和改善APAP肝损伤的多糖，对于临床上APAP诱导的肝损伤的治疗具有重要意义。

金线莲为兰科植物金线兰Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl的新鲜或干燥全草，性平、甘，归肺、肝、肾、膀胱经，具有清热凉血、祛风利湿的功效，既能清热解毒，又能滋补强壮，补肾益肺清肝，临床上用于治疗肝胆湿热、肝阳上亢、肝风内动等证，多糖为其主要活性成分群。专利CN108456259A公开了金线莲多糖在急性酒精性肝损伤药物中的应用。文献《福建金线莲提取物对CCl₄所致小鼠急慢性肝损伤的保护作用》公开了金线莲提取物可以抑制化学性肝损伤，而金线莲提取物中主要有效成分为粗多糖。可见金线莲多糖有望用于治疗APAP诱导的肝损伤。

但是，金线莲多糖组成复杂，目前对金线莲多糖结构的研究尚处于起步阶段，现有研究大都集中在不同产地、不同栽培方式金线莲多糖含量、金线莲多糖及其组分分子量和单糖组成等方面，对金线莲均一多糖结构的表征以及生物活性研究较少。尚不清楚金线莲粗多糖以及纯化后的均一多糖是否能缓解APAP诱导的急性肝损伤。如果能找到对APAP诱导的急性肝损伤具有相应预防和改善功效的金线莲均一多糖，将为金线莲的开发和应用提供科学依据，对于金线莲产业的发展将具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种金线莲均一多糖及其制备方法和用途。

本发明提供了一种金线莲均一多糖，所述金线莲均一多糖主要包含葡萄糖和半乳糖组分；所述金线莲均一多糖的相对分子量为6000-60000Da。

进一步地，所述金线莲均一多糖ARPP-1主要由葡萄糖和半乳糖组成；

优选地，所述金线莲均一多糖中葡萄糖和半乳糖的摩尔比为(0.1～0.5)：(0.1～0.5)；

更优选地，所述金线莲均一多糖的相对分子量为6000-20000Da；优选为11658 Da。

进一步地，所述金线莲均一多糖中葡萄糖和半乳糖的摩尔比为0.754:0.246；

优选地，所述金线莲均一多糖的糖苷键主要链接方式为(1→4)、(1→6)和(1→4,6)链接的葡萄糖，以及(1→4)、(1→6)链接的半乳糖。

进一步地，所述金线莲均一多糖ARPP-2主要由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成；

优选地，所述金线莲均一多糖中鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为(0.1～0.3)：(0.01～0.05)：(0.2～0.6)：(0.01～0.15)：(0.01～0.03)：(0.1～0.5)：(0.2～0.5)；

更优选地，所述金线莲均一多糖的相对分子量为20000-60000Da；优选为40103Da。

进一步地，所述金线莲均一多糖中鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为0.199:0.019:0.307:0.053:0.017:0.106:0.299；

优选地，所述金线莲均一多糖的糖苷键主要连接方式为：以(1→4)链接的半乳糖和(1→2)、(1→2,4)链接的鼠李糖为主链；支链主要存在(1→3)、(1→3,6)链接的半乳糖，(1→3)链接的鼠李糖，(1→4)、(1→3,4)、(1→4,6)链接的葡萄糖、(1→2)、(1→2,6)链接的甘露糖。

本发明还提供了前述的金线莲均一多糖的制备方法，它包括如下步骤：

(1)金线莲粗多糖的提取：取金线莲药材，加入水超声提取，提取液静置离心后取上清液，加入Savage试剂萃取，取上层水相，加入乙醇静置离心后取沉淀，沉淀加水溶解、透析、浓缩、冷冻干燥，即得金线莲粗多糖；

(2)金线莲粗多糖极性分离：取金线莲粗多糖使用水溶解，离心取上清液，使用纤维素交换柱纯化，上样后，依次用三倍柱体积的水、0.2 mol/L、0.5 mol/L和2.0 mol/LNaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液，将水相和0.5 mol/L盐相洗脱液透析、浓缩、冷冻干燥，分别得到多糖ARP-1和ARP-2；

(3)金线莲均一多糖的制备：称取多糖ARP-1和ARP-2，用水溶解，离心后取上清液，将上清液过滤，滤液经过凝胶渗透色谱柱，收集对称峰，浓缩、冷冻干燥，即得金线莲均一多糖ARPP-1和ARPP-2。

进一步地，

步骤(1)中，所述金线莲药材和水的料液比1kg:20～50L；

和/或，步骤(1)中，所述上清液和Savage试剂的体积比为(1～5)：1；

和/或，步骤(2)中，所述纤维素交换柱为DE52；

和/或，步骤(3)中，所述多糖ARP-1和ARP-2用水溶解后浓度为0.05～0.5g/mL；

和/或，步骤(3)中，所述经过凝胶渗透色谱柱的条件如下：流动相为超纯水；流速为1.5mL/min；柱温为30℃；进样量为20μL；

优选地，所述凝胶渗透色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱。

本发明还提供了前述的金线莲均一多糖在制备抗氧化、抗炎的药物中的用途。

本发明还提供了前述的金线莲均一多糖在制备预防和/或治疗肝损伤的药物中的用途；

优选地，所述肝损伤为药物性肝损伤；优选地，所述药物性肝损伤为乙酰氨基酚诱导的肝损伤；

更优选地，所述肝损伤为药物性急性肝损伤。

本发明还提供了一种药物，它是以前述的金线莲均一多糖为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

本发明开展金线莲多糖化学物质基础研究及其清肝效应活性，为进一步完善金线莲药效物质基础和质量评价体系提供科学依据。

本发明从金线莲中提取得到多种金线莲均一多糖，得到的均一多糖具有抗氧化、抗炎活性，可用于治疗药物性急性肝损伤。其中，金线莲均一多糖ARPP-2的抗氧化、抗炎活性和治疗药物性急性肝损伤效果最优异。本发明对金线莲多糖中有效成分进行了提取、分析，得到针对抗氧化、抗炎、治疗药物性急性肝损伤的均一多糖，为金线莲的开发和应用提供科学依据，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为不同极分金线莲多糖洗脱曲线。

图2为金线莲多糖ARP-1、ARPP-1、ARP-2和ARPP-2的高效凝胶渗透色谱图：(A)为ARP-1；(B)为ARPP-1；(C)为ARP-2；(D)为ARPP-2。

图3为APR-1凝胶纯化色谱图。

图4为APR-2凝胶纯化色谱图。

图5为ARPP-1红外吸收光谱图。

图6为ARPP-2红外吸收光谱图。

图7为单糖混合对照品、ARPP-1和ARPP-2均一多糖气相色谱图；(A)为单糖混合对照品和ARPP-1；(B)为单糖混合对照品和ARPP-2；图中，1为鼠李糖；2为岩藻糖；3为阿拉伯糖；4为木糖；5为甘露糖；6为葡萄糖；7为半乳糖。

图8为ARPP-1和ARPP-2乙酰化物气相色谱图：(A)为ARPP-1；(B)为ARPP-2。

图9为ARPP-1的氢谱(¹H NMR)图。

图10为ARPP-1的碳谱(¹³C NMR)图。

图11为ARPP-1的Dept135图谱。

图12为ARPP-1的¹H-¹H-COSY图谱。

图13为ARPP-1的HSQC图谱。

图14为ARPP-1的HMBC图谱。

图15为ARPP-1的NOESY图谱。

图16为ARPP-2的氢谱(¹H NMR)图。

图17为ARPP-2的碳谱(¹³C NMR)图。

图18为ARPP-2的Dept135图谱。

图19为ARPP-2的¹H-¹H-COSY图谱。

图20为ARPP-2的HSQC图谱。

图21为ARPP-2的HMBC图谱。

图22为ARPP-2的NOESY图谱。

图23为金线莲多糖ARP、ARPP-1和ARPP-2对APAP诱导肝损伤小鼠血清ALT和AST水平的影响：A为ALT；B为AST；图中，与空白组对比，*表示P<0.05，“**”表示P<0.01；与模型组相比，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01。

图24为金线莲多糖ARP、ARPP-1和ARPP-2对肝损伤小鼠肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响：A为TNF-α；B为IL-1β；C为IL-6；图中，与空白组对比，*表示P<0.05，“**”表示P<0.01；与模型组相比，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01。

图25为金线莲多糖ARP、ARPP-1和ARPP-2对肝损伤小鼠肝脏GSH和SOD水平的影响：A为GSH；B为SOD；图中，与空白组对比，*表示P<0.05，“**”表示P<0.01；与模型组相比，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01。

图26为ARP、ARPP-1和ARPP-2对小鼠肝脏组织病理变化的影响的HE染色图(200×)：A为对照组；B为模型组；C为ARP组(400mg/kg)；D为ARPP-1组(80mg/kg)；E为ARPP-2组(20mg/kg)。

图27为ARP、ARPP-1和ARPP-2对小鼠肝脏组织病理变化的影响的TUNEL染色图(200×)：A为对照组；B为模型组；C为ARP组；D为ARPP-1组；E为ARPP-2组。

图28为ARP、ARPP-1和ARPP-2的体外抗氧化结果(A)为DPPH自由基清除能力；(B)为ABTS自由基清除能力。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。金线莲来源于福建中医药大学药学院金线莲林下种植基地，栽培方式为林下种植4个月，经福建中医药大学药学院黄泽豪教授鉴别为Anoectochilus roburghii(Wall.)Lindl的新鲜全草，低温烘干，粉碎后避光保存。

金线莲多糖含量的测定方法

取D-葡萄糖对照品50mg，精密称定，加蒸馏水制成每1mL中含葡萄糖0.05mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。取5mg多糖粉末溶解在10ml水中，即得浓度为0.5mg/mL的金线莲多糖水溶液。分别精密吸取对照品溶液与金线莲多糖水溶液各0.5mL，加水补足至1mL，混匀，加入5mL硫酸，室温放置60min，加入4％苯酚溶液1mL，摇匀，置30℃水浴加热40min。以蒸馏水为空白(1mL)，自“加入5mL硫酸”起，同法操作，490nm下测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算金线莲多糖含量。

实施例1、本发明金线莲多糖的提取

采用水提醇沉法经除蛋白、透析获得金线莲粗多糖ARP，并应用纤维素阴离子交换柱色谱和高效凝胶渗透色谱法分离、纯化制备得到金线莲均一多糖ARPP-1和ARPP-2。

一、金线莲粗多糖的提取

取金线莲药材1kg，以料液比1:20(kg/L)加入蒸馏水，超声提取30min，分别提取2次，合并提取液，过滤，静置过夜，3600rpm离心15min，取上清液。溶液中加入Savage试剂萃取(溶液和Savage试剂的体积比为4:1)，振摇20min，4000rpm离心5min。重复萃取3次。上层水相添加4倍体积无水乙醇，静置过夜，4000rpm离心10min，弃去上清液，得多糖沉淀物。沉淀物加水溶解，浓缩，冷冻干燥，即得金线莲粗多糖ARP。

二、金线莲粗多糖极性分离

取1g金线莲粗多糖ARP冻干粉，加冻干粉4倍量的蒸馏水复溶，12000rpm离心10min，取上清液，置纤维素交换柱(DE52)纯化。上样后，依次用三倍柱体积的蒸馏水、0.2mol/L、0.5mol/L和2.0mol/LNaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液。每管收集20mL，隔管按“金线莲多糖含量的测定方法”测定490nm处洗脱液吸光度。以管数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制洗脱曲线(图1)。根据洗脱曲线图，合并各洗脱峰样品，透析(透析液为蒸馏水，透析袋截留分子量为3500Da，透析时间为48h)、浓缩、冷冻干燥，得不同极分金线莲多糖，并计算得率。其中，水相和0.5mol/L盐相得率最高，分别为19.5％和5.2％，两相所得的多糖分别命名为ARP-1和ARP-2。

三、金线莲均一多糖的制备

1、色谱条件

色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱；流动相：超纯水；流速：1.5mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

2、金线莲多糖极分的纯化

称取ARP-1和ARP-2金线莲多糖适量，精密称定，分别用超纯水溶解，制成每1mL含100mg供试品溶液，12000rpm离心10min，取上清液，0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液。按上述“1、色谱条件”进样，在线检测收集对称峰，每管收集10mL，浓缩、冷冻干燥，即得金线莲均一多糖，分别为ARPP-1、ARPP-2。

四、金线莲多糖的分子量测定

1、色谱条件

色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱；流动相：0.05mol/LNaCl溶液；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

2、对照品溶液的制备

取不同相对分子质量右旋糖苷对照品适量，精密称定，加水溶解，分别制成每1mL含5mg的单一对照品储备液。

3、供试品溶液的制备

分别取金线莲多糖适量，精密称定，用水溶解，12000rpm离心10min，取上清液，分别制成每1mL含5mg多糖溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。

4、结果

ARP-1和ARP-2分子量：以峰位分子量(Mp)、重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)对数为横坐标，保留时间为纵坐标(RT)，绘制lgMp-RT、lgMw-RT和lgMn-RT标准曲线。lgMp-RT标准曲线方程为：Y＝-0.1878X+12.16，r＝0.9963；lgMw-RT标准曲线方程为：Y＝-0.2002X+12.75，r＝0.9974；lgMn-RT标准曲线方程为：Y＝-0.1855X+11.99，r＝0.9962。高效凝胶渗透色谱图分别见图2(A)和2(C)。由图2(A)和2(C)可知，ARP-1和ARP-2多糖溶液出峰时间分别为43.99min和40.79min，且色谱峰峰型相对对称。根据色谱峰保留时间，按上述标准曲线计算得到ARP-1和ARP-2金线莲多糖极分分子量，结果如表1所示。

表1.ARP-1和ARP-2多糖保留时间与分子量

ARPP-1均一多糖的分子量：将制备得到中性多糖ARP-1，采用多糖凝胶色谱分离系统纯化，结合示差折光检测器在线监测，收集对称峰(98-99管)，合并，浓缩，冷冻干燥，即得水相均一多糖ARPP-1。ARP-1凝胶纯化色谱图见图3。

制备不同相对分子质量的葡聚糖对照品溶液，绘制标准曲线，测定ARPP-1的纯度及相对分子质量。其中lgMp-RT校正曲线方程为：Y＝-0.513X+12.78，r＝0.998；lgMw-RT校正曲线方程为：Y＝-0.535X+13.20，r＝0.998；lgMn-RT校正曲线方程为Y＝-0.504X+12.55，r＝0.996。ARPP-1高效凝胶渗透色谱图见图2(B)。由图2(B)可知，ARPP-1多糖溶液出峰时间为43.072min，样品峰单一对称，表明其为高纯度均一多糖。根据色谱峰保留时间，按标准曲线计算得到ARPP-1金线莲均一多糖峰位分子量Mp为11643，重均分子量Mw为13396，数均分子量Mn为9934。

ARPP-2均一多糖的分子量：将制备得到酸性多糖ARP-2，采用多糖凝胶色谱分离系统纯化，结合示差折光检测器在线监测，收集对称峰(26-29管)，合并，浓缩，冷冻干燥，即得盐相均一多糖ARPP-2。ARP-2凝胶纯化色谱图见图4。

ARPP-2高效凝胶渗透色谱图见2(D)。由图2(D)可知，ARPP-2多糖溶液出峰时间为40.278min，样品峰为单一对称峰，表明其为纯度较高均一多糖。根据色谱峰保留时间，按标准曲线计算得到金线莲均一多糖ARPP-2峰位分子量Mp为38975，重均分子量Mw为48567，数均分子量Mn为32767。

实施例2、本发明金线莲多糖的相关表征

1、相关表征方法

综合应用甲基化化学方法，结合紫外分光光度法(UV-vis)、红外光谱法(IR)、高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、气相色谱联用技术(GC-MS)和核磁共振技术(NMR)等分析方法解析ARPP-1和ARPP-2一级结构。

1.1红外光谱分析

分别精密称取2mg冻干的均一多糖ARPP-1或ARPP-2和200mg溴化钾，压制成片，置傅里叶变换红外光谱仪扫描记录，波长扫描范围为400-4000cm^-1。

ARPP-1官能团分析：ARPP-1红外吸收光谱如图5所示。其中，3390cm^-1为较宽较强烈吸收峰，为多糖及水-OH伸缩振动吸收峰，是糖类特征峰；2929cm^-1是甲基C-H伸缩振动吸收峰；1637cm^-1是多糖C＝O不对称伸缩振动吸收峰。以上峰归属证明ARPP-1为多糖类物质。1419cm^-1归属于C-H变角振动引起的吸收峰；1155cm^-1和1020cm^-1处出现的1组吸收峰对应多糖骨架C-O-C和C-O-H伸缩振动，由糖骨架中的吡喃环的羟基和醚键产生。925cm^-1处的出现的吸收峰可能是β-端基差向异构的特征吸收，但β-端构型推断并不能完全确定，需要做核磁氢谱碳谱进一步确定。

ARPP-2官能团分析：ARPP-2红外吸收光谱如图6所示。其中3403cm^-1是-OH伸缩振动吸收峰，该吸收峰为糖类特征峰；2940cm^-1和1604cm^-1强吸收峰分别是多糖C-H伸缩振动和C＝O不对称伸缩振动。以上峰归属证明ARPP-2为多糖类物质。1440cm^-1～1382cm^-1处的强吸收峰是羧基的C＝O非对称伸缩振动，1421cm^-1处吸收峰为C-OH变角振动引起。1101～1012cm^-1吸收带是由两种C-O伸缩振动引起的，分别是吡喃糖环的振动重叠C-OH的侧支的伸缩振动和C–O–C糖苷键的振动。1035cm^-1处出现吸收峰表明该均一多糖具有吡喃糖环骨架。

1.2GC-MS法测定金线莲多糖单糖组成

(1)GC-MS条件

色谱柱RXI-5SIL MS(30cm×0.25cm×0.25cm)；程序升温，起始温度为120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min；进样口温度：250℃；载气：氦气；流速：1mL/min；进样量：1μL。

(2)金线莲多糖乙酰化衍生物的制备

混合标准溶液的衍生化：分别取单糖对照品鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖适量，精密称定，加水溶解，制成每1mL含100mg的单一对照品溶液。分别精密量取单一对照品溶液各1.0mL至5mL容量瓶，加水稀释，定容，制成每1mL含2mg单糖对照品混合溶液。取混合溶液适量，加入1mL乙酸酐，100℃反应1h，冷却。反应液中加入3mL甲苯，减压浓缩，蒸干，重复4次。残渣用3mL氯仿溶解，加入少量蒸馏水充分震荡，除去上层水溶液，重复5次，收集氯仿层溶液，浓缩，定容，0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

均一多糖衍生化：精密称取均一多糖ARPP-12mg，置具塞玻璃管，精密加入1mL2mol/L的三氟乙酸，110℃油浴水解90min，冷却，N₂吹干，残渣加入2mL双蒸水复溶，100mg硼氢化钠，加入冰醋酸中和，N₂吹干。取残渣适量，加入1mL乙酸酐，100℃反应1h，冷却至室温。反应液中加入3mL甲苯，减压浓缩，蒸干，重复4次。残渣用3mL氯仿溶解，加入少量蒸馏水充分震荡，除去上层水溶液，重复5次，收集氯仿层溶液，浓缩，定容，0.22μm微孔滤膜过滤，即得。ARPP-2衍生化同法操作。

均一多糖甲基化：称取干燥后均一多糖ARPP-1样品10mg，置于反应瓶，加入2mLDMSO，25mg磨制的NaOH粉末，水浴超声避光反应30min，加入1mL碘甲烷，反应1h，最后加入0.5mL水淬灭，终止反应。二氧化碳等体积萃取，收集萃取液，N₂吹干，得甲基化后样品。ARPP-2甲基化反应同法操作。

(3)单糖组成分析结果

ARPP-1单糖组成分析：单糖混合对照气相色谱图和ARPP-1气相色谱图见图7(A)。ARPP-1GC色谱图中显示2个色谱峰，与标准单糖混合溶液相比，这两个单糖被鉴定为葡萄糖和半乳糖，物质的量比为0.754:0.246。ARPP-1均一多糖主为葡萄糖和半乳糖。

ARPP-2单糖组成分析：单糖混合对照气相色谱图和ARPP-2气相色谱图见图7(B)。ARPP-2GC色谱图中分别显示7个色谱峰，与标准单糖混合溶液各单一成分一一对应。ARPP-2含有7个单糖，分别为为鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为0.199:0.019:0.307:0.053:0.017:0.106:0.299。ARPP-2为杂多糖，且各单糖含量差异较大。其中，阿拉伯和半乳糖含量较高；甘露糖和岩藻糖的含量较低。

此外，对比ARPP-1和ARPP-2单糖组成发现，ARPP-2单糖种类较为丰富；两种均一多糖均含有葡萄糖和半乳糖组分，但ARPP-1葡萄糖含量高于ARPP-2，而ARPP-2(29.9％)半乳糖含量略高于ARPP-1。

(4)甲基化分析结果

ARPP-1糖苷键连接：ARPP-1甲基化分析结果如图8(A)和表2所示。由色谱如可知：ARPP-1含有5种甲基化糖醇衍生物，按碎片离子质核比经鉴定分别为2,3,4,6-O-Me₄-Galp；2,3,6-O-Me₃-Galp；2,3,6-O-Me₃-Glcp；2,3,4-O-Me₃-Glcp；2,3-O-Me₂-Glcp。(1→4)连接的甲基化葡萄糖醇乙酰酯相对摩尔含量为57.1％，(1→4)连接的甲基化半乳糖糖醇乙酰酯相对摩尔含量为16.5％；(1→6)连接的甲基化葡萄糖醇乙酰酯相对摩尔含量为13.0％，(1→4,6)连接的甲基化葡萄糖糖醇乙酰酯相对摩尔含量为6.7％，1→末端的半乳糖醇衍生物相对摩尔含量为6.7％。推断ARPP-1均一多糖存在(1→4)、(1→6)、(1→4,6)葡萄糖糖苷键链接，(1→4)半乳糖糖苷键链接和半乳糖端基等。该结果与单糖组成结果一致。

表2.ARPP-1甲基化类型和糖苷键连接结果

ARPP-2糖苷键连接：ARPP-2甲基化分析结果如图8(B)和表3所示。由色谱图可知，ARPP-2含有17种甲基化糖醇衍生物，是由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖等组成的杂多糖。由衍生化后乙酰化物摩尔比可知，(1→4)连接的甲基化半乳糖醇乙酰酯和(1→2)连接、(1→2,4)连接的甲基化鼠李糖醇乙酰酯相对摩尔含量最高，分别为39.26％，10.54％、4.69％。(1→4)、(1→3,4)、(1→4,6)连接的甲基化葡萄糖糖醇乙酰酯，(1→3)连接的甲基化鼠李糖糖醇乙酰酯以及(1→3)、(1→3,6)连接的甲基化半乳糖糖醇乙酰酯相对摩尔含量较高，分别为4.67％、4.33％和1％，2.6％以及1.95％、1.33％。此外，在色谱图18min前检测到1→末端连接的半乳糖醇衍生物、阿拉伯糖醇衍生物、葡萄糖醇衍生物、甘露糖醇衍生物、鼠李糖醇衍生物和岩藻糖醇衍生物，其中1→末端连接的半乳糖醇衍生物相对摩尔含量最高，为13.4％。综上，推断ARPP-2的糖苷键连接方式：以(1→4)链接的半乳糖和(1→2)、(1→2,4)链接的鼠李糖为主链；支链主要存在(1→3)、(1→3,6)链接的半乳糖，(1→3)链接的鼠李糖，(1→4)、(1→3,4)、(1→4,6)链接的葡萄糖、(1→2)、(1→2,6)链接的甘露糖等。

表3.ARPP-2甲基化类型和糖苷键位置

1.3核磁共振分析

分别精密称取50mgARPP-1和ARPP-2，溶于0.5mL D₂O中，12000rpm离心10min，取上清液置于核磁管内，测定均一多糖核磁共振信息。

ARPP-1核磁分析：ARPP-1的¹H NMR、¹³C NMR、Dept135、H-H-COSY、HSQC、HMBC和NOESY核磁光谱图如图9～15所示。图9为ARPP-1多糖的氢谱信号，可知信号主要集中在δ3.0～5.5ppm。其中δ3.2～4.0ppm的信号代表糖苷环上的H-2到H-5(或H-6)质子信号。在多糖氢谱中，化学位移δ5～6ppm为α端基质子信号(H-1)，δ4.4～5ppm为β端基质子信号(H-1)。由¹HNMR光谱图可推断，分布在δ4.3～5.5ppm区域内的信号为端基质子信号，其中δ5.32ppm、δ5.17ppm、δ4.91ppm归属为α端基质子信号；δ4.58ppm、δ4.40ppm化学位移处归属为β端基质子信号。因此，ARPP-1的糖苷键中既有α-键，也有β键。由图10¹³C NMR可知，核磁碳谱信号主要集中在δ60-11ppm之间。δ170ppm处为酸性多糖糖醛酸特征化学位移，但¹³C谱中未观察到170ppm左右的糖醛酸特征化学信号，进一步表明ARPP-1是中性多糖。此外，C-1信号主要位于δ105.79ppm、δ101.38ppm、δ101.14ppm和δ99.10ppm。C-2、C-3、C-4和C-5信号峰主要分布于δ60～80ppm区域，其中δ72.53ppm处归属于C-5信号。从Dept135图谱(图11)可知，在δ66.73ppm、δ61.91ppm和δ61.68ppm化学位移处存在倒峰(CH₂取代)，为C-6的特征信号峰，且δ66.73ppm处的峰存在向低场迁移现象，表明存在取代。

从HSQC图谱(图13)可知，δ101.14ppm C-1信号，对应的H-1位于δ5.32ppm。通过H-H-COSY光谱图(图12)可知，δ5.32/3.56ppm为H-1/H-2信号；δ3.56/3.89ppm为H-2/H-3信号；δ3.89/3.58ppm为H-3/H-4信号；δ3.89/3.58ppm为H-5/H-6信号。结合氢谱，推断δ5.32ppm、δ3.56ppm、δ3.89ppm和δ3.58ppm处的H信号分别为H-1、H-2、H-3、H-4和H-5。由单糖组成结果、¹³C NMR和HSQC可知δ5.32/101.14ppm，δ5.17/99.10ppm，δ4.91/99.87ppm是葡萄糖α端C-H相关信号α-D-Glcp-(1→)；δ4.58/105.67ppm、δ4.40/103.57ppm是半乳糖β端C-H相关信号。HSQC二维图谱中，δ101.14ppm处观察C-1信号，对应的δ3.58ppm处存在H-4信号，表明存在1→4链接方式。图14为HMBC光谱图，用于多糖糖苷键信号归属，可知δ101.14ppm处的C-1与δ3.58ppm处H-4信号有相关，表明存在糖苷键→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→的链接方式。糖苷键→4)-α-D-Glcp-(1→的δ5.32ppmH-1与其→4,6)-α-D-Glcp-(1→的δ78.22ppmC-4有相关信号峰；表明存在→4)-α-D-Glcp-(1→的链接方式。对ARPP-1所有糖苷键信号进行归属，如表4所示。

表4.ARPP-1糖苷键C-H信号信息

ARPP-2核磁分析：ARPP-2的¹H NMR、¹³C NMR、Dept135、H-H-COSY、HSQC、HMBC和NOESY核磁光谱图如图16～22所示。由图16¹H NMR可知，H信号主要集中在δ3.0～5.5ppm间，其中δ3.2～4.0ppm的信号代表糖环上的H-2到H-5(或H-6)质子信号。在多糖氢谱中，化学位移δ5～6ppm为α端基质子信号(H-1)，δ4.4～5ppm为β端基质子信号(H-1)。端基存在5个质子峰信号，分别位于δ5.20ppm、δ5.04ppm、δ4.97ppm、δ4.96ppm和δ4.37ppm，其中δ4.37ppm为β端基信号，其余为α端基信号。表明ARPP-2的糖苷键中既有α键，也有β键。由图17ARPP-2¹³CNMR图谱可知，ARPP-2存在5个主要C-1信号峰，分别位于δ101.64ppm、δ100.89ppm、δ100.27ppm、δ99.70ppm和δ98.88ppm。δ176.24ppm和δ172.14ppm信号为糖醛酸的羧基的主要信号峰，表明ARPP-2是一种酸性多糖组分。其他C信号峰主要分布于δ60～85ppm。结合单糖组成结果，¹³CNMR和HSQC可知，δ5.20/99.72ppm，δ5.04/101.87ppm，δ4.97/107.87ppm，δ4.96/99.14ppm分别是鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖α端基的C-H相关信号；δ4.37/101.87ppm是半乳糖β端基C-H相关信号。δ18.07ppm信号归属于鼠李糖C6。图18为Dept135图谱，该图谱显示在δ67.65ppm、δ62.20ppm、δ61.01ppm和δ60.18ppm处有正峰，表明存在CH和CH₃取代。

在NOESY图谱(图22)中可推断出5种糖苷键连接，分别是(1)：→4)-α-D-GalpAce-(1→的H1与→4)-α-D-GalpMe-(1→的H4有相关峰，该多糖存在→4)-α-D-GalpAce-(1→4)-α-D-GalpMe-(1→的糖链；(2)→4)-α-D-GalpMe-(1→的H1与→2)-α-L-Rhap-(1→的H2有相关峰，该多糖存在→4)-α-D-GalpMe-(1→2)-α-L-Rhap-(1→的糖链；(3)→2)-α-L-Rhap-(1→的H1与→2,4)-α-L-Rhap-(1→的H2有相关峰，该多糖存在→2)-α-L-Rhap-(1→2,4)-α-L-Rhap-(1→的糖链；(4)→3,4)-α-D-Glcp-(1→的H1与→2,4)-α-L-Rhap-(1→的H4有相关峰，推断出该多糖存在在→3,4)-a-D-Glcp-(1→2,4)-α-L-Rhap-(1→的糖链；(5)Araf-α-L-(1→与→3,4)-α-D-Glcp-(1→的H4有相关峰，推断出该多糖存在→3,4)-α-D-Glcp-(1→的糖链。由于其他糖苷键含量少，在核磁图谱无法显示。ARPP-2糖苷键C-H信号信息如表5所示。

综上，ARPP-2的主链连接方式为→4)-α-D-GalApAce-(1→4)-α-D-GalApMe-(1→2)-α-L-Rhap-(1→2,4)-α-L-Rhap-(1→；支链通过→2,4)-α-L-Rhap-(1→的O-4连接在主链上。该多糖可能为果胶多糖，主链为半乳糖醛酸和鼠李糖组成，其他糖存在于支链。

表5.ARPP-2糖苷键C-H信号信息

2、表征结果

结果表明：ARPP-1为葡萄半乳聚糖，主要含有葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)，摩尔比为0.754:0.246，相对分子量为11658Da；存在(A)→4)-α-D-Glcp-(1→、(B)→6)-α-D-Glcp-(1→、(C)→4,6)-α-D-Glcp-(1→、(D)→4)-β-D-Galp-(1→和(E)β-D-Galp-(1→等糖苷键链接。该均一多糖主链为主链为：D→D→A→A→C→，支链B→B→C通过C的O-6链接到主链上。

ARPP-2为果胶多糖，主要含鼠李糖(Rha)、岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)等7种单糖，摩尔比为0.199:0.019:0.307:0.053:0.017:0.106:0.299，相对分子量为40103Da；主要存在糖苷键有(A)→4)-α-D-GalAp-(1→；(A’)→4)-α-D-GalApAce-(1→；(B)→2,4)-α-L-Rhap-(1→；(C)→2,4)-α-L-Rhap-(1→；(D)→3,4)-α-D-Glcp-(1→；(E)Araf-α-L-(1→；(F)→4)-β-D-Galp(G)β-D-Galp-(1→。该多糖的主链连接方式为→4)-α-D-GalApAce-(1→4)-α-D-GalApMe-(1→2)-α-L-Rhap-(1→2,4)-α-L-Rhap-(1→(A’→A→B→C→)，支链Araf-α-L-(1→3,4)-α-D-Glcp-(1→(E→D→)通过→2,4)-α-L-Rhap-(1→的O-4连接在主链上。

以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。

试验例1、金线莲多糖对对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤保护作用

研究金线莲粗多糖ARP、ARPP-1和ARPP-2对乙酰氨基酚(APAP)引起的急性肝损伤的缓解作用。

1、实验方法

1.1实验动物

SPF级ICR小鼠，雄性，6-8周龄鼠，体重20±2g，购自杭州医学院，合格证号：SCXK(浙)2019-0002。动物饲养于SPF级动物房内，温度21～23℃，相对湿度65％～70％，12h循环光照，自由饮水进食，适应性喂养3d后用于实验。

1.2分组

90只SPF级ICR小鼠随机分为空白对照组(正常组)、APAP模型组、N-乙酰半胱氨酸阳性药物对照组(NAC，0.6g/kg)、ARP低剂量组(200mg/kg)、ARP高剂量组(400mg/kg)，ARPP-1低剂量组(40mg/kg)、ARPP-1高剂量组(80mg/kg)、ARPP-2低剂量组(10mg/kg)和ARPP-2高剂量组(20mg/kg)。每组10只。

1.3模型建立及给药

持续灌胃给药7d，每日1次，灌胃给药的溶剂为生理盐水。最后一次给药2h后，除空白对照组(灌胃生理盐水纯溶剂)外，其余各组腹腔注射APAP(300mg/kg)建立急性肝损伤模型。各组分别于注射APAP后16h处死，眼眶取血，取小鼠肝脏，分出肝大叶，立即液氮冻存备用固定。

1.4检测指标

HE染色和TUNEL染色检测肝脏病理变化；酶联免疫吸附法测定各组小鼠血清中ALT、AST水平，肝脏炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，抗氧化酶GSH、SOD水平。探究金线莲多糖对APAP诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。

实验所得数据均以平均值+标准差表示，采用单因素方差分析(One-wayANOVA)对各组结果进行比较。应用SPSS21.0统计学分析，P<0.05具有统计学意义。采用GraphPadPrism8.0软件作图。

2、实验结果

2.1对APAP诱导急性肝损伤小鼠血清转氨酶水平的影响

血清ALT、AST水平均是肝损伤的敏感指标。金线莲多糖APR、ARPP-1和ARPP-2对APAP诱导肝损伤小鼠血清ALT和AST水平的影响如图23A和23B所示。与空白组相比，模型组小鼠血清中的ALT和AST水平均显著升高(P<0.01)，表明APAP诱导的急性肝损伤模型建立成功。阳性药物干预模型小鼠后，小鼠血清中ALT和AST水平较模型组均显著降低(P<0.01)。

与模型组比较，ARP低剂量(200mg/kg)和ARP高剂量(400mg/kg)可显著降低小鼠血清中ALT和AST水平含量(P<0.01)。ARPP-1低剂量组(40mg/kg)小鼠血清ALT和AST水平有所降低，ALT从模型组69.63±1.68U/L降到干预组63.10±4.22U/L，AST水平由模型组66.89±4.79U/L降到52.55±0.85U/L，但数据不具有统计学意义；ARPP-1高剂量(80mg/kg)小鼠血清中转氨酶水平较模型组显著下降(P<0.05)。酸性糖ARPP-2低高剂量均可明显降低小鼠血清中的ALT水平和AST水平(P＜0.01，P＜0.01)，且下降幅度高于ARPP-1高剂量组。研究结果提示低高剂量ARP，高剂量中性多糖ARPP-1以及低高剂量酸性多糖ARPP-2可通过显著降低小鼠血清转氨酶水平缓解APAP诱导的急性肝损伤平(P＜0.05，P＜0.01)。但是ARPP-1缓解急性肝损伤的效果相比ARP和ARPP-2更差。

2.2对APAP诱导急性肝损伤小鼠肝脏炎症因子的影响

ARP、ARPP-1和ARPP-2对APAP诱导肝损伤小鼠肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6结果如图24A、24B和24C所示。模型组小鼠中TNF-α、IL-1β和IL-6水平较正常小鼠均有显著上升(P<0.01)，表明APAP诱导的急性肝损伤小鼠发生了明显的炎症反应。与APAP模型组相比，阳性药NAC预处理后可显著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子水平升高的趋势(P<0.01)。

与模型组相比，ARP 200mg/kg低剂量和400mg/kg高剂量组中，肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子水平显著降低(P<0.01)。本研究结果表明低、高剂量ARP预处理后能明显抑制APAP诱导的急性肝损伤小鼠肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平(P<0.05)，进而缓解APAP诱导的肝脏炎症反应。以上结果均提示ARP在肝脏活性保护中，对抗肝脏炎症反应起到了重要作用。

与APAP模型组相比，ARPP-1低、高剂量预处理后抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子水平升高的趋势并不明显(P>0.05)。在ARPP-2低剂量组(10mg/kg)中，肝脏TNF-α水平较模型组虽由492.36pg/mL降至445.24pg/mL，IL-6水平由567.96pg/mL降至499.82pg/mL，但差异不具有统计学意义(P>0.05)。ARPP-2高剂量组(20mg/kg)中，小鼠肝脏肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子水平显著降低(P<0.01)。研究结果提示低、高剂量ARP，高剂量酸性性多糖ARPP-2可通过显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子水平，缓解APAP诱导的急性肝损伤。

2.3对APAP诱导急性肝损伤小鼠肝脏GSH和SOD的影响

ARP、ARPP-1和ARPP-2对APAP诱导肝损伤小鼠肝脏GSH和SOD结果如图25A和25B所示。与空白组相比，模型组小鼠肝组织中GSH和SOD水平显著降低(P<0.01)，说明造模成功。NAC阳性药物预处理后，小鼠肝脏中GSH和SOD的水平较模型组变化极显著(P<0.01)。

ARP 200mg/kg剂量处理后，小鼠肝脏中GSH和SOD的水平较模型组有所升高，有统计学意义(P<0.01)；ARP 400mg/kg剂量处理后，小鼠肝脏中GSH和SOD的水平较模型组均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，ARPP-1低、高剂量组可提高模型小鼠肝脏中GSH、SOD水平，但不显著，没有统计学差异。ARPP-2低剂量组和高剂量组可明显提高模型小鼠肝脏中GSH、SOD水平(P<0.05，P<0.01)，保护APAP诱导的急性肝损伤，升高水平高于ARPP-1高剂量组。金线莲多糖ARP、ARPP-1和ARPP-2对小鼠药物性肝损伤的保护作用与其提高机体抗氧化能力有关。

2.4对APAP肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响

HE染色：ARP对APAP肝损伤小鼠肝组织HE病理切片结果见图26。正常组小鼠肝组织结构正常、肝小叶结构完整清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝血窦结构规整、排列规则，细胞核染色较深，细胞核圆形，中央位，核质分布均匀，肝细胞无坏死、肝组织无炎性浸润等现象；模型组小鼠肝组织损伤严重，肝细胞排列紊乱，肝细胞索排列紊乱，细胞间无明显分界，肝细胞灶性或片状坏死，伴炎性细胞浸润等病理改变，细胞核被挤向一侧，证明药物性肝损伤造模成功。ARP(400mg/kg)肝组织形态出现明显的好转，肝索排列较整齐，胞浆疏松透亮，细胞核清晰完整，细胞完整性明显好转。ARPP-2(20mg/kg)预处理治疗后，肝细胞出现细胞坏死的现象减少，肝组织炎症浸润现象变轻微，没有大片炎症和坏死灶。ARPP-1(80mg/kg)预处理治疗后，较模型组细胞坏死面积变小，炎症和坏死灶改善并不明显。

TUNEL染色：APAP过量会导致体内活性氧含量增加，细胞内产生内质网应激以及线粒体功能破坏，肝细胞发生凋亡。为进一步研究ARP、ARPP-2对APAP诱导的肝损伤状况的影响，应用TUNEL染色对肝组织切片开展细胞凋亡检测，结果见图27。空白对照组未发现细胞凋亡情况，但APAP诱导后，APAP组出现明显的肝脏细胞凋亡现象，而ARP(400mg/kg)和ARPP-2(20mg/kg)分别干预后细胞凋亡情况有所缓解，凋亡数量明显减少。ARPP-1(80mg/kg)干预后虽细胞凋亡数量较模型组有所减少，肝细胞凋亡情况仍比ARP(400mg/kg)和ARPP-2(20mg/kg)剂量组严重。结果提示，ARP(400mg/kg)和ARPP-2(20mg/kg)可能是通过减少APAP诱导的肝细胞凋亡数量，减轻肝细胞受损程度，进而实现缓解APAP造成的肝组织损伤。

综上，在连续7天灌胃分别给予金线莲粗多糖和ARPP-2后，肝脏病理变化明显缓解，能显著降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST及肝脏组织炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平(P<0.05，P<0.01)，显著上调肝组织中GSH和SOD水平(P<0.05，P<0.01)。高剂量ARPP-1(80mg/kg)能通过降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST水平(P＜0.05)，明显上调模型小鼠肝组织中GSH、SOD水平(P＜0.05)，轻微改善小鼠肝组织病变发挥肝保护作用，但是作用效果不如ARPP-2。

研究结果提示ARP、ARPP-2能更有效保护APAP诱导的小鼠急性肝损伤，这可能与增强肝脏抗氧化能力，抑制肝脏炎症反应，缓解氧化应激，改善肝组织损伤有关。

试验例2、金线莲多糖体外抗氧化结果

采用Excel 2019和SPSS 25.0统计分析软件对实验数据进行处理，结果表示为平均值±标准偏差。使用Origin 2020软件对实验数据进行作图。

一、多糖对DPPH自由基清除能力结果

1、实验方法

将1.0mL不同浓度多糖液0.1～4mg/mL、维生素C溶液(阳性对照)、乙醇溶液(空白组)与1.0mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液混合，摇匀，避光孵育30min，517nm处测量吸光值，平行测定3次，以清除率表示清除能力，计算公式如下：

DPPH自由基清除率(％)＝(A₀-A_i)/A₀×100％

式中：A₀为空白吸光度，A_i为样品或阳性对照吸光度。

2、实验结果

金线莲粗多糖ARP、2个金线莲均一多糖ARPP-1、ARPP-2和VC对DPPH自由基清除能力结果如图28(A)所示。金线莲粗多糖ARP、金线莲均一多糖ARPP-1和ARPP-2对DPPH自由基均具有清除能力，金线莲粗多糖ARP、金线莲均一多糖ARPP-1和ARPP-2均呈现明显的剂量效应(P<0.05)。当样品质量范围浓度为1～3mg/mL时，对比相同浓度下各组多糖样品清除能力，清除能由强到弱ARPP-2>ARP≈ARPP-1，纯化后的金线莲均一多糖ARPP-2显示出较好的清除能力。当各组多糖样品质量浓度为3mg/mL，ARPP-2对DPPH自由基清除能力最高，为90.04±5.21％，接近同浓度下VC清除能力97.06±3.47％。金线莲粗多糖ARP、均一多糖ARPP-1、ARPP-2对DPPH自由基半数抑制对应的浓度(IC50)分别为0.439mg/mL、0.402mg/mL、0.104mg/mL，其中金线莲粗多糖ARP的IC50与均一多糖ARPP-1较为接近，ARPP-2最低。ARPP-2显示出优异的DPPH自由基清除活性。

二、多糖对ABTS自由基清除能力结果

1、实验方法

用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)将ABTS溶液稀释至734nm处吸光度为0.7±0.02，即得ABTS工作液。取40μL多糖溶液、维生素C(阳性对照)、乙醇溶液(空白)于96孔板中，加入970μLABTS工作液，混匀，避光反应6min，酶标仪测定734nm下吸光度，以清除率表示ABTS自由基清除能力，计算公式如下：

ABTS自由基清除率(％)＝(A₀-A_i)/A₀×100％

式中：A₀为空白吸光度，A_i为样品或阳性对照吸光度。

2、实验结果

图28(B)为金线莲粗多糖ARP、2种纯化金线莲均一多糖ARPP-1、ARPP-2和VC对ABTS自由基的清除能力，ARP、ARPP-1和ARPP-2均具有清除ABTS自由基能力。在质量浓度0.1～4mg/ml范围内，对比相同浓度下各组多糖样品清除能力，清除能力由强到弱为ARPP-2>ARP>ARPP-1，纯化后的酸性均一多糖ARPP-2显示出更好的清除ABTS清除能力。此外，ARP、ARPP-1和ARPP-2对ABTS的清除能力与质量浓度呈正相关(P<0.05)。当各组样品质量浓度分别为4mg/mL，ARP、ARPP-1、ARPP-2和VC清除能力分别为58.78±3.21％、22.01±2.38％、90.83±4.51％和92.74±2.68％，其中分离纯化后的酸性均一多糖ARPP-2对ABTS的清除能力与同质量浓度的Vc相当，中性均一多糖ARPP-1对ABTS的清除能力较弱。ARPP-2对ABTS自由基清除率最高达91.28％。

金线莲粗多糖ARP和金线莲均一多糖ARPP-2对ABTS自由基半数抑制对应浓度(IC50)分别为2.39、1.48mg/mL。在0～4mg/mL浓度范围内，ARPP-1对ABTS自由基清除最高仅为22.01±1.65％，未到50％清除率，说明ARPP-1对ABTS自由基清除能力较弱。以上表明金线莲粗多糖ARP和纯化后的均一多糖ARPP-2均可以作为有效的ABTS自由基清除剂。

以DPPH自由基和ABTS自由基清除能力为指标，评价金线莲粗多糖ARP与纯化后均一多糖ARPP-1、ARPP-2体外抗氧化活性，结果表明ARPP-2具有显著清除DPPH、ABTS自由基清除能力，抗氧化能力总体强于ARP和ARPP-1。ARPP-2是金线莲发挥抗氧化活性的重要药效物质基础。

综上，本发明从金线莲中提取得到多种金线莲均一多糖，得到的均一多糖具有抗氧化、抗炎活性，可用于治疗药物性急性肝损伤。其中，金线莲均一多糖ARPP-2的抗氧化、抗炎活性和治疗药物性急性肝损伤效果最优异。本发明对金线莲多糖中有效成分进行了提取、分析，得到针对抗氧化、抗炎、治疗药物性急性肝损伤的均一多糖，为金线莲的开发和应用提供科学依据，具有良好的应用前景。

Claims

1.一种金线莲均一多糖，其特征在于：所述金线莲均一多糖为ARPP-2，主要由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成；

所述金线莲均一多糖的相对分子量为40103 Da；

所述金线莲均一多糖中鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为0.199: 0.019: 0.307: 0.053: 0.017: 0.106: 0.299；

所述金线莲均一多糖的糖苷键主要连接方式为：以（1→4）链接的半乳糖和（1→2）、（1→2,4）链接的鼠李糖为主链；支链主要存在（1→3）、（1→3,6）链接的半乳糖，（1→3）链接的鼠李糖，（1→4）、（1→3,4）、（1→4,6）链接的葡萄糖、（1→2）、（1→2,6）链接的甘露糖。

2.权利要求1所述的金线莲均一多糖的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）金线莲粗多糖的提取：取金线莲药材，加入水超声提取，提取液静置离心后取上清液，加入Savage试剂萃取，取上层水相，加入乙醇静置离心后取沉淀，沉淀加水溶解、透析、浓缩、冷冻干燥，即得金线莲粗多糖；

（2）金线莲粗多糖极性分离：取金线莲粗多糖使用水溶解，离心取上清液，使用纤维素交换柱纯化，上样后，依次用三倍柱体积的水、0.2 mol/L、0.5 mol/L和2.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱液，将0.5 mol/L盐相洗脱液透析、浓缩、冷冻干燥，得到多糖ARP-2；

（3）金线莲均一多糖的制备：称取多糖ARP-2，用水溶解，离心后取上清液，将上清液过滤，滤液经过凝胶渗透色谱柱，收集对称峰，浓缩、冷冻干燥，即得金线莲均一多糖ARPP-2。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中，所述金线莲药材和水的料液比1kg:20~50L；

和/或，步骤（1）中，所述上清液和Savage试剂的体积比为（1~5）：1；

和/或，步骤（2）中，所述纤维素交换柱为DE52；

和/或，步骤（3）中，所述多糖ARP-2用水溶解后浓度为0.05～0.5g/mL；

和/或，步骤（3）中，所述经过凝胶渗透色谱柱的条件如下：流动相为超纯水；流速为1.5mL/min；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述凝胶渗透色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱。

5.权利要求1所述的金线莲均一多糖在制备抗氧化、抗炎的药物中的用途。

6.权利要求1所述的金线莲均一多糖在制备预防和/或治疗肝损伤的药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述肝损伤为药物性肝损伤。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述肝损伤为药物性急性肝损伤。

9.一种药物，其特征在于：它是以权利要求1所述的金线莲均一多糖为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。