CN1208349C - 川牛膝果聚糖、制备方法和用途 - Google Patents

川牛膝果聚糖、制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从中药材川牛膝中提取的果聚糖的生产方法和用途。本发明采用水浸泡获得川牛膝水提液，用有机溶剂沉淀、沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离，浓缩干燥获得总多糖，川牛膝总多糖经柱层析纯化获得川牛膝果聚糖CoPS，其化学结构为：见右式。本发明方法工艺简单、产率高，适于工业化生产。经生物活性试验表明，该果聚糖无毒副作用，可用于制备具有抗肿瘤及增强免疫功能作用的药品和保健品。

Description

川牛膝果聚糖、制备方法和用途
技术领域
本发明涉及从中药川牛膝中提取川牛膝果聚糖及其总多糖、制备方法及用途。
背景技术
川牛膝(Cyathula Officinals Kuan)是一种传统中药材，具有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋的功效。文献报道，[马英等，中草药，31(6)，427(2000)]，其化学成分主要为生物碱和甾酮类，如：杯苋甾酮、头花蒽草甾酮等。而有关川牛膝糖类化合物的研究尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的问题是提供川牛膝果聚糖CoPS及其总多糖、其生产方法及用途。
本发明提供了从中药材川牛膝中提取获得的果聚糖，其化学结构如下：
本发明还提供了所述的川牛膝果聚糖的总多糖，其是由如下方法1)或者2)制备：
1)将干燥后的中药材川牛膝用水浸泡，用有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥获得总多糖；
或者2)将干燥后的中药材川牛膝用水浸泡，浸泡上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥获得总多糖。
推荐的川牛膝果聚糖的总多糖中含有纯度为60～99％的川牛膝果聚糖CoPS，尤其推荐的川牛膝果聚糖的总多糖中含有纯度为95％的川牛膝果聚糖CoPS。
本发明的制备方法是将川牛膝切片用冷水浸泡或热水煮，采用有机溶剂沉淀，透析或膜分离，浓缩干燥获得总多糖。总多糖经离子交换柱和凝胶柱层析得到川牛膝果聚糖纯品CoPS。
该果聚糖经完全酸水解，HPLC分析得知由果糖和葡萄糖组成。由ESI-MS及HPLC测得其数均分子量分布为1000～10000Da。其红外图谱的数据如下：3700～3000cm-1的强宽峰为分子间及分子内羟基吸收，2950～2870cm-1为C-H键伸缩振动，1400～1200cm-1为C-H的变角振动，1000～1200cm-1为糖环上C-O-C醚键不对称伸缩振动，929cm-1为呋喃环的对称伸缩振动，815cm-1为呋喃环的C-H变角振动。
其核磁共振谱图数据如下：δ(ppm)：1H-NMR：5.307为α-Glc(1→。13C-NMR：果糖呋喃环上的化学位移数据δ62.6～63.9、105.8～106.8、78.9～79.8、76.8～77.9或82.9～83.7、64.9～66.0ppm，葡萄糖吡喃环上的碳的化学位移数据δ95.1、73.8、75.0、71.8、73.7、62.6ppm。(其误差为±0.5ppm)
本发明的制备方法包括将川牛膝药材用水浸泡，采用有机溶剂沉淀，透析或膜分离，浓缩干燥获得川牛膝总多糖。川牛膝总多糖经离子交换柱和凝胶柱层析纯化可得川牛膝果聚糖纯品CoPS。
具体来说，将干燥后的川牛膝药材粉碎或切片，用水浸泡，其中川牛膝药材与水浸泡的重量比推荐是川牛膝∶水＝1∶8～15，尤其推荐用10～12倍重量或更多的水，浸泡36～48小时。所述水推荐为无离子水。浸泡液的pH值推荐保持在6.0～8.0。
过滤，滤液经或不经浓缩，用有机溶剂沉淀后离心。离心所得沉淀用水溶解，推荐用1-5倍重量的水溶解。
离心，上清液透析或膜分离，透析时间推荐为24-72小时，透析用透析膜、透析袋，其孔径推荐截留分子量在1000以下，尤其推荐截留分子量为500～1000。
浓缩干燥获得总多糖，其中干燥或减压浓缩温度推荐低于60℃进行，最好采用低温真空浓缩或冷冻干燥，例如在30～60℃干燥或浓缩，压强推荐控制在0.08～0.10MPa。
所述川牛膝总多糖加水溶解，其中推荐1～5倍重量的水溶解。经CM-Sephadex C-50柱层析，纯度可达到95％。再经凝胶柱层析作进一步纯化，用水或稀盐溶液洗脱，收集糖峰，冷冻干燥获得川牛膝果聚糖纯品CoPS，纯度可达99％。凝胶柱层析所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，选用的分离范围为1×102-5.0×104道尔顿。推荐凝胶用Sephadex G-50，用0.1mol/L NaCl洗脱。
前述的用有机溶剂沉淀，所述有机溶剂推荐与水互溶的有机溶剂，可以是低碳链的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推荐丙酮，例如用2～6倍体积的75％～95％的丙酮；沉淀时间推荐为12～36小时。
本发明首次从川牛膝中提取川牛膝果聚糖CoPS。本发明的提取分离方法简便，产率高，适于工业化生产。经生物活性试验，研究结果表明川牛膝果聚糖CoPS具有较好的抑制Lewis肺癌的效果，并具有增强免疫活性的作用。
附图说明
图1是川牛膝果聚糖CoPS的HPLC图。分析柱为TSK，洗脱液：水，流速：1mL/min，检测器：RI，分析得到单一对称峰，表明其具有均一性。
图2是川牛膝果聚糖CoPS的CE图。洗脱液：100mmol/LH3BO3-KOH(pH＝10)，电压：12KV，检测波长：254nm，分析亦得到单一对称峰，表明其具有均一性。
图3是川牛膝果聚糖CoPS的IR图。仪器为Bio-Rad公司的FTS185型红外光谱仪。
图4是川牛膝果聚糖CoPS的1H-核磁共振(NMR)图谱。仪器是Bruker-MX-400核磁共振仪。溶剂为重水。
图5是川牛膝果聚糖CoPS的13C-核磁共振(NMR)图谱。仪器是Bruker-MX-400核磁共振仪。溶剂为重水。
图6是川牛膝果聚糖CoPS单糖组成分析的HPLC图。分析柱为Carbohydrate Analysis，洗脱液：乙腈∶水(82∶18)，检测器：RI。
图7是川牛膝果聚糖CoPS甲基化产物的气相(GC)图谱。仪器是Shimadzu QP5000色质联用仪。
图8、9、10、11、12、13、14、15是川牛膝果聚糖CoPS甲基化产物的质谱(MS)图。其中图8对应于图7中3.22min的峰，表明有末端葡萄糖；图9、10分别对应于图7中3.27min和3.40min的峰，表明有末端果糖；图11、13分别对应于图7中5.41min和5.74min的峰，表明有1，2连接的果糖；图12对应于图7中5.63min的峰，表明有2，6连接的果糖；图14、15分别对应于图7中8.13min和8.58min的峰，表明有支链的果糖。
具体实施方式
                    实施例1
将川牛膝药材100g洗净干燥，切片，用1升无离子水室温浸泡48小时，过滤。残渣用1升无离子水继续浸泡12小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩，然后用5倍体积95％的乙醇沉淀，沉淀静置24小时。离心，沉淀用100毫升水溶解，离心，用截留分子量为1000的膜分离后，冷冻干燥，即获得川牛膝总多糖15～17g。
                     实施例2
将川牛膝药材100g洗净干燥，切片，用1.2升无离子水室温浸泡48小时，过滤。残渣用1升无离子水继续浸泡12小时，过滤，合并滤液，50℃减压浓缩，然后用3倍体积95％的丙酮沉淀，沉淀静置24小时。离心，沉淀用100毫升水溶解，离心，无离子水透析72小时。50℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得川牛膝总多糖13～15g。
                     实施例3
将川牛膝药材100g洗净干燥，切片，用0.8升无离子水室温浸泡48小时，过滤。残渣用0.5升无离子水继续浸泡12小时，过滤，合并滤液，50℃减压浓缩，无离子水透析72小时，离心。50℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得川牛膝总多糖15～17g。
                     实施例4
将川牛膝药材100g洗净干燥，粉碎，用1.5升无离子水沸水煮6小时，过滤。残渣用1升无离子水继续煮6小时，过滤，合并滤液，50℃减压浓缩，然后用2倍体积95％的丙酮沉淀，沉淀静置24小时。离心，沉淀用100毫升水溶解，离心，无离子水透析72小时。50℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得川牛膝总多糖13～15g。
                     实施例5
川牛膝总多糖经CM-Sephadex C-50柱层析精制，纯度为95％，再经Sephadex G-50柱层析，即获得纯度为99％的川牛膝果聚糖CoPS。具体的分离方法：称取川牛膝总多糖100mg，溶于2～3mL蒸馏水中，离心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱(1.5cm×120cm)，用0.1M NaCl洗脱，流速为0.5mL/min，每管收集3～5mL并检测糖峰。收集后脱盐，冷冻干燥，即获得纯果聚糖CoPS 80～90mg。
        实施例6 川牛膝果聚糖CoPS的元素分析
将川牛膝果聚糖CoPS在110℃干燥5小时后，进行碳、氢、氮元素分析。元素分析仪为CARIO-ERBA元素自动分析仪。结果如下：
碳百分含量：41.36％(±0.8％)
氢百分含量：6.63％(±0.3％)
不含氮元素。
        实施例7 川牛膝果聚糖CoPS的生物活性研究
我们对不同剂量的川牛膝果聚糖CoPS送检生物活性测定，其结果如下：
1.川牛膝果聚糖CoPS对小鼠Lewis肺癌足趾接种的疗效试验之一
样品    剂量   给药      动物数   动物体重   瘤重         抑制率
        mg/kg  方案      始/终    始/终      X±SD        ％
CoPS    200    ip×10qd  8/8      20.4/24.1  0.488±0.04  49.17**
对照组  NS     ip×10qd  16/16    20.4/24.3  0.960±0.15  /
**表示试验组与阴性对照组相比p＜0.01
2.川牛膝果聚糖CoPS对小鼠Lewis肺癌足趾接种的疗效试验之二
样品    剂量   给药      动物数   动物体重   瘤重         抑制率
        mg/kg   方案       始/终    始/终      X±SD        ％
CoPS    100     ip×10qd   8/8      20.9/25.1  0.620±0.04  40.95**
对照组  NS      ip×10qd   16/16    21.0/25.5  1.05±0.16   /
**表示试验组与阴性对照组相比p＜0.01

Claims (7)

1、一种川牛膝果聚糖CoPS，其特征结构如下：
Figure C031154290002C1
其数均分子量范围为1000～10000。
2、如权利要求1所述的川牛膝果聚糖的生产方法，其特征是由如下的方法1)、3)或者2)、3)制备：
1)将干燥后的中药材川牛膝用水浸泡，用有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥获得总多糖，；
或者2)将干燥后的中药材川牛膝用水浸泡，浸泡上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥获得总多糖。
3)川牛膝总多糖加水溶解后，柱层析纯化得川牛膝果聚糖纯品CoPS。
3、如权利要求2所述的生产方法，其特征是所述的柱层析所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，选用的分离范围为1×102-5.0×104道尔顿。
4、如权利要求1所述的川牛膝果聚糖的用途，其特征在于所述的川牛膝果聚糖用于制备具有抗肿瘤和增强免疫功能的药物或保健品。
5、如权利要求1所述的川牛膝果聚糖的总多糖的生产方法，其特征是由如下的方法1)或2)制备：
1)将干燥后的中药材川牛膝用水浸泡，用有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥获得总多糖，；
或者2)将干燥后的中药材川牛膝用水浸泡，浸泡上清液经透析或膜分离后，浓缩干燥获得总多糖。
6、如权利要求5所述的生产方法，其特征是药材川牛膝与水浸泡的重量比川牛膝∶水＝1∶5～15，水浸泡时间24～48小时，浸泡液的pH＝6～8。
7、如权利要求5所述的生产方法，其特征是所述的有机溶剂是与水互溶的有机溶剂。
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