CN1965894A - 一种具免疫活性的夏枯草多糖组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具免疫活性的夏枯草多糖组合物及其制备方法和应用。本发明公开的夏枯草多糖组合物是由夏枯草(Prunellavulgaris L.)的干燥果穗经水煎煮提取、醇沉、透析截取分子量为大于3000Da的组分，凝胶过滤柱层析纯化后获得。该多糖组合物多糖含量大于50％，多糖分子量均大于5000Da，主要由组分A、B－1、B－2、C、D组成。本发明夏枯草多糖组合物可明显促进淋巴细胞转化增殖，诱生IFN－γ，可作为活性成分用于制备提高哺乳动物免疫力的药物。

Description

一种具免疫活性的夏枯草多糖组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药活性成分及提取分离方法，具体涉及一种具免疫活性的夏枯草多糖组合物及其制备方法和应用。
背景技术
夏枯草属Prunella L.植物，全球约15种，彼此相近，广泛分布于欧亚温带地区及热带山区，非洲北部及北美洲也有分布；我国产4种3变种，其中1种为引种栽培。主产于湖南、安徽、浙江、江苏。中国药典收载的夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，有清火，明目，散结，消肿的功效。夏枯草主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等。生物活性涉及降压、降糖、抗菌、抗炎、抗过敏及抗病毒等作用。在国外夏枯草作为一种自我康复药物，在缓解咽喉疼痛、发热及加速伤口愈合等方面得到广泛的应用，并受到重视。有关夏枯草多糖的相关专利有WO9915566，其中公开了获自夏枯草的分子量为3500Da的组合物。
经查新，未见分子量为5000Da以上的夏枯草多糖组合物的研究报道，也未见夏枯草多糖组合物的免疫活性作用的研究和专利报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于对夏枯草的活性组分进行研究，提供一种具有药用价值的新的夏枯草多糖组合物。
本发明公开的夏枯草多糖组合物是由夏枯草(Prunella vulgarisL.)的干燥果穗经水煎煮提取、醇沉、透析截取分子量大于3000Da的组分，凝胶过滤柱层析纯化后获得。该多糖组合物多糖含量大于50％，多糖分子量均大于5000Da，主要由组分A、B-1、B-2、C、D组成。
本发明采用高效凝胶渗透色谱法检测，结果表明：组分A分子量分布在20000-30000，主要集中在26000左右；组分B-1分子量分布在130000-140000，主要集中在136000左右；组分B-2分子量分布在5000-6000，主要集中在5600左右；组分C分子量分布在8000-2200000，主要为2100000、660000、7000部分；组分D分布在7000-2000000，主要为2000000、150000、7000部分；其中组分A、B-1、B-2均为均一分子量多糖；组分A、B-1均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖六种单糖残基组成；比例分别为0.14∶0.37∶0.53∶1.47∶1.49∶1.00、0.20∶0.46∶1.56∶0.14∶0.50∶0.27；组分A不含蛋白质。
经甲基化分析结果表明，组分A中Ara位于非还原末端，Rha以末端或1，3-连接形式存在，Xyl则主要以1，4-连接形式存在，在部分2位上有分枝，该多糖中主要成份为己糖，它们中Man和Glc主要以1，4-或1，2-连接形式存在，在部分1，4-连接的Man的6位有分枝，Gal则主要位于非还原末端，或以1，6-连接的形式存在；除1，3连接的Rha外，组分A中不含其他1，3-连接的糖残基。过碘酸盐氧化结果表明组分A中存在较多1，4-连接的己糖，存在末端1，2-或1，6-连接的己糖或位于末端的戊糖，结果和甲基化分析结果基本吻合。组分A13CNMR谱分析结果表明该多糖中具有α构型的Araf、Gla p和β构型的Xylp、Manp、Glcp。
当在Ultrahydroge串连柱，以0.003mol/L NaAc为流动相，流速为0.5ml/min洗脱，示差检测，组分A、B-1、B-2分别具有39.20、36.12、42.91分钟的保留时间；ELSD检测组分B-1、B-2分别具有12.80、17.08分钟的保留时间。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述夏枯草多糖组合物的制备方法。
本发明夏枯草多糖组合物的制备方法包括下列步骤：
(1)粗多糖的制备
将夏枯草每次用15～25倍重量的水，煎煮两次，过滤，滤液40～60℃减压浓缩，加沉淀剂乙醇至含量达60％～85％(v/v)，静置过夜；弃去上清液，冷冻离心10～20分钟，沉淀40～50℃真空干燥得粗多糖。提取流程图见图1。
(2)多糖的纯化
取粗多糖，加14-16倍重量的水，加热并搅拌使充分溶解，冷却，用截留值为3000～5000Da的透析袋流水透析48小时，透析内液离心，上清液浓缩，冷冻离心10～20分钟，冷冻干燥，得夏枯草水溶性多糖初步纯化物。
通过凝胶过滤柱层析可进一步分离纯化本发明组合物。将夏枯草多糖初步纯化物水溶液上样于DEAE-sepharose柱，依次用0～1.0mol/LNacl溶液阶梯式洗脱，分管收集，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖；将各种溶剂洗脱的糖反应阳性收集液分别合并，40℃旋转蒸发浓缩，用截留值3000～5000Da透析袋蒸馏水透析48小时，透析内液40℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，分别得到四个多糖部位A、B、C、D。
取组分B加入沸水中充分溶解后用截留值10000～20000Da透析袋对蒸馏水透析48小时，首次透析5小时，外液备用；透析结束后，透析内液及首次透析外液分别40℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到两个多糖部位组分B-1、组分B-2。A、B-1、B-2、C、D各部位纯度均大于60％，合并此五部位即得夏枯草多糖组合物。夏枯草多糖分离纯化流程图见图2。
本发明所要解决的再一技术问题在于公开上述夏枯草多糖组合物在制备提高哺乳动物免疫力药物中的应用。
毒性试验显示，本发明夏枯草多糖组合物在20mg/ml浓度以下无细胞毒性；淋巴细胞增殖转化试验结果表明，该组合物体外能明显促进淋巴细胞转化增殖，且有明显的剂量依赖性；细胞因子诱生试验结果表明，该组合物能明显诱生IFN-γ。提示本发明夏枯草多糖组合物可作为活性成分用于制备提高哺乳动物免疫力的药物。
当本发明的组合物给予病人时，优选以纯化的形式给予。当由夏枯草的干燥果穗提取获得本发明组合物时，理想的是通过上述制备方式从提取物中分离纯化出较纯的可溶性的组合物，以促进本发明组合物作为治疗剂的用途，降低给药剂量。
本发明组合物可以口服给药、局部给药等等。根据采用的给药方式，上述组合物能以不同的药学上可接受的形式给予。例如，上述组合物能以固体、溶液、凝胶、微囊、脂质体等形式给予。
含有本发明的组合物的制剂可以是适合口服使用的形式，如，片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂、溶液、乳剂、混悬剂等，按照药用制剂生产领域中任何已知的方法可以制备口服使用的所需制剂。
含有本发明的组合物的制剂也可以是适合外用的形式，如，凝胶剂、膏剂、膜剂、喷雾剂等，按照药用制剂生产领域中任何已知的方法可以制备外用的所需制剂。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
附图说明
图1夏枯草多糖粗提物提取流程图
图2夏枯草多糖分离纯化流程图
图3夏枯草多糖各组分HPSEC图
其中A为组分A，B为组分B，C为组分C，D为组分D
分析条件：
层析柱：Ultrahydrogel串联柱  洗脱剂：3mM NaAc
流速：0.5ml/min              检测器：RID
图4夏枯草多糖组分B-1HPSEC图
图5夏枯草多糖组分B-2HPSEC图
层析柱：Ultrahydrogel  洗脱剂：water
流速：0.5ml/min        检测器：ELSD
图6夏枯草多糖各组分对刺激指数的影响图
图7多糖浓度对刺激指数的影响图
图8夏枯草多糖各组分对IFN-γ诱生的影响图
具体实施方式
实施例1  夏枯草多糖组合物的制备
5.0kg夏枯草，煎煮两次，每次加水20倍量，每次1小时，提取液过滤，滤液40～60℃减压浓缩，浓缩至约5000ml，加沉淀剂(乙醇)至含量达70％，静置过夜。弃去上清液，3000～5000转/分钟，冷冻离心15分钟分离沉淀，沉淀40～50℃真空干燥得粗多糖约300g。
取水1500ml，加入粗多糖100g，煎煮并搅拌使充分溶解，冷却，用玻璃纸(截留值约3000～5000Da)流水透析48小时，透析内液3000～5000转/分钟离心，上清液40℃旋转蒸发浓缩，至约1600ml，冷冻离心(10000～20000转/分钟)10～20分钟，冷冻干燥，得夏枯草水溶性多糖初步纯化物。提取流程图见图1。
实施例2  夏枯草多糖组合物的分离纯化
将夏枯草多糖初步纯化物水溶液(体积约为200ml，固体含量约为5.0g)上样于DEAE-sepharose柱，依次用0～1.0mol/LNacl溶液阶梯式洗脱，分管收集，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖。
将各种溶剂洗脱的糖反应阳性收集液分别合并，40℃旋转蒸发浓缩，用透析袋(截留值3000～5000Da)蒸馏水透析48小时，透析内液40℃旋转蒸发浓缩至小于50ml，冷冻干燥，分别得到四个多糖部位A、B、C、D。分别对这四个多糖部位进行分子量及纯度测定，色谱图显示组分A为一个对称峰，组分B为两个对称峰，组分C为多重峰，组分D为部分重叠的三个峰。(见图3)
称取组分B0.6g，加入100ml沸水中，充分溶解后用透析袋(截留值10000～20000Da)对蒸馏水透析48小时，首次透析5小时，外液2500ml备用。透析结束后，透析内液及首次透析外液分别40℃旋转蒸发浓缩，至体积小于50ml，冷冻干燥，得到两个多糖部位组分B-1、组分B-2，色谱图显示两者均为一个对称峰(见图4、5)。夏枯草多糖分离纯化流程图见图2。
实施例3  夏枯草多糖组合物纯度鉴定
采用HPSEC对分离纯化得到的多糖进行纯度测定。具体测试条件和方法如下：Waters高效液相系统，Ultrahydroge串连柱(有效测试分子量范围为两千～二百万)，Waters 2410示差检测器，Waters 2487双波长紫外检测器(215和280nm)，蒸发光散色检测器，在线脱气装置，Millennium32GPC数据处理软件，流动相为0.003mol/L NaAc，流速为0.5ml/min。取测试样品少许(约2mg)用流动相溶解，配制成约1％的样品溶液，10000转/分钟离心十分钟后，手动进样20ml，根据色谱图判定该多糖组分的纯度。结果显示组合物中组分A、B-1、B-2均为均一分子量多糖。(见图3、4、5)
实施例4  夏枯草多糖组合物的结构鉴定
本发明组合物中组分A、B-1、B-2经高效排阻色谱检测，纯度均达到鉴定结构的要求，因组分B-2量极少，主要对组分A、B-1进行结构鉴定。
组分A用Lowry法测定，结果显示其不含蛋白质。水解产物薄层色谱分析，结果表明其中不含糖醛酸，为中性多糖。糖醇乙酸酯气相测定结果表明组分A、B-1均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖六种单糖残基组成；比例分别为0.14∶0.37∶0.53∶1.47∶1.49∶1.00、0.20∶0.46∶1.56∶0.14∶0.50∶0.27；
甲基化分析结果表明，组分A中Ara位于非还原末端，Rha以末端或1，3-连接形式存在，Xyl则主要以1，4-连接形式存在，在部分2位上有分枝，该多糖中主要成份为己糖，它们中Man和Glc主要以1，4-或1，2-连接形式存在，在部分1，4-连接的Man的6位有分枝，Gal则主要位于非还原末端，或以1，6-连接的形式存在；除1，3连接的Rha外，组分A中不含其他1，3-连接的糖残基。过碘酸盐氧化结果表明组分A中存在较多1，4-连接的己糖，存在末端1，2-或1，6-连接的己糖或位于末端的戊糖，结果和甲基化分析结果基本吻合。组分A13CNMR谱分析结果表明该多糖中具有α构型的Araf、Gla p和β构型的Xylp、Manp、Glcp。
实施例5  夏枯草多糖组合物免疫活性试验
(1)、淋巴细胞增殖转化实验
采用3H-TdR掺入试验。小鼠脾细胞悬液(5×106/ml)，加入96孔圆底细胞培养板内，100μl/孔，5×105细胞/孔。分别加入刀豆蛋白A(ConA)10ug/孔，对照组以1640营养液补足体积至200μl，将多糖样品稀释成至终浓度依次为100ug/mL、50ug/mL、10ug/mL和1ug/mL，置37℃，5％CO2培养箱培养72小时。终止试验前16小时加入3H-TdR1uCi/孔。用细胞收集仪将细胞吸附在玻璃纤维滤纸上，β闪烁仪测得cpm值并计算刺激指数(stimulating index)SI＝实验组cpm均值/对照组cpm均值。试验结果表明，供试的夏枯草多糖组合物体外能明显促进淋巴细胞转化增殖，且有明显的剂量依赖性。试验结果见表1和图6、7。
           表1淋巴细胞转化增殖实验结果
  100μg/mL   50μg/mL   10μg/mL   1μg/mL
  B-1   10.554328   4.926949   1.7857581   1.8035605
  B-2   107.93677   68.672805   4.4395335   2.3879681
  A   6.0748926   3.1012891   1.9987723   1.3314917
  B   6.0908533   3.2154696   1.5856354   1.3898097
  C   3.2842234   2.6267649   2.9846532   1.1976673
  D   7.0626151   3.5930018   1.9306323   1.0810313
ConA阳性对照：SI＝385.143
(2)、细胞因子诱生实验
按照细胞因子检测试剂盒操作手册，采用双抗夹心法分别检测小鼠脾脏细胞经过ConA刺激后的细胞培养上清中多种细胞因子的含量变化。试验结果表明，供试的夏枯草多糖组合物能明显诱生IFN-γ。试验结果见表2和图8。
表2IFN-γ诱生实验结果(单位：pg/ml)                   ConA：1254.4
  100μg/mL   50μg/mL   10μg/mL   1μg/mL
  B-1   23.8125   38.1875   26.3125   8.8125
  B-2   23.1875   11.9375   26.3125   13.8125
  A   7.5625   13.8125   21.9375   0.0625
  B   -6.1875   16.9375   10.0625   8.8125
  C   13.1875   0.0625   -18.0625   1.3125
  D   -24.9375   -8.6875   -6.8125   -3.6875

Claims (5)

1、一种夏枯草多糖组合物，其特征在于该组合物由夏枯草的干燥果穗经水煎煮提取、醇沉、透析截取分子量大于3000Da的组分、凝胶过滤柱层析纯化后获得；该组合物由组分A、B-1、B-2、C、D组成，多糖含量大于50％，多糖分子量均大于5000Da。
2、根据权利要求1所述的夏枯草多糖组合物，其特征在于其中所述的组分A分子量发布在20000-30000；组分B-1分子量分布在130000-140000；组分B-2分子量分布在5000-6000；组分C分子量分布在8000-2200000，组分D分布在7000-2000000。
3、根据权利要求1所述的夏枯草多糖组合物，其特征在于其中所述的组分A、B-1、B-2为均一分子量多糖；组分A、B-1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖六种单糖残基组成；比例分别为0.14∶0.37∶0.53∶1.47∶1.49∶1.00、0.20∶0.46∶1.56∶0.14∶0.50∶0.27；组分A不含蛋白质。
4、权利要求1所述的夏枯草多糖组合物的制备方法，其特征在于所述组合物的制备方法包括下列步骤：
(1)粗多糖的制备
将夏枯草每次用15～25倍重量的水，煎煮两次，过滤，滤液40～60℃减压浓缩，加沉淀剂乙醇至体积含量达60％～85％，静置过夜；弃去上清液，冷冻离心10～20分钟，沉淀40～50℃真空干燥得粗多糖；
(2)多糖的纯化
取粗多糖，加14-16倍重量的水，加热并搅拌使充分溶解，冷却，用截留值为3000～10000Da的透析袋流水透析48小时，透析内液离心，上清液浓缩，冷冻离心10～20分钟，冷冻干燥，得夏枯草水溶性多糖初步纯化物；
将夏枯草多糖初步纯化物水溶液上样于DEAE-sepharose柱，依次用0～1.0mol/LNacl溶液阶梯式洗脱，分管收集，收集液用硫酸-苯酚法检测多糖；将各种溶剂洗脱的糖反应阳性收集液分别合并，40℃旋转蒸发浓缩，用截留值3000～10000Da透析袋蒸馏水透析48小时，透析内液40℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，分别得到四个多糖部位A、B、C、D；
取组分B加入沸水中充分溶解后用透截留值10000～20000Da析袋对蒸馏水透析48小时，首次透析5小时，外液备用；透析结束后，透析内液及首次透析外液分别40℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到两个多糖部位组分B-1、组分B-2；
合并A、B-1、B-2、C、D五部位即得夏枯草多糖组合物。
5、权利要求1所述的夏枯草多糖组合物在制备提高哺乳动物免疫力药物中的应用。
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CN113603801A (zh) * 2021-08-17 2021-11-05 华侨大学 一种获得两种夏天无多糖的提取方法、两种夏天无多糖及其应用

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