CN112920287A - 具有免疫调节功效的阳春砂多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有免疫调节功效的阳春砂多糖及其制备方法和应用。本发明首次分离得到了阳春砂大分子量酸性多糖AVPG‑2，经高效尺寸排阻色谱联用多角度激光散射仪联用示差检测器（HPSEC‑MALLS‑RID）测定，其重均分子量为1.48×107 Da，经HPLC分析，阳春砂多糖AVPG‑2主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这7种单糖组成。经刚果红分析，有三螺旋结构。AVPG‑2在100‑800μg/mL浓度范围内，可显著促进巨噬细胞RAW 264.7产生NO，分泌细胞因子IL‑6和TNF‑α，提高巨噬细胞RAW 264.7的细胞活力和吞噬能力，有望用于制备免疫调节保健品或药物。

Description

具有免疫调节功效的阳春砂多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然产物及其制备方法和应用，特别涉及具有免疫调节功效的阳春砂多糖及其制备方法和应用。
背景技术
阳春砂(Amomum villosum Lour.)来源于姜科豆蔻属多年生常绿草本植物，入药部位为干燥成熟的果实，又称为春砂仁，是我国著名的“四大南药”之一。该药性温，味辛，具有化湿开胃、温脾止泻和理气安胎等功效，为我国的常用中药，在临床上应用广泛，有着1300多年的应用历史。目前，阳春砂主要分布在广东省、云南省、广西省、海南省、福建省等地，其中又以广东阳春所产的春砂仁药效最佳。
多糖又称多聚糖，是由10个或以上的单糖脱水缩合形成的具有糖苷键的一类高分子化合物，其在生物体内的生命活动中起着至关重要的作用。大量研究表明，许多中药多糖表现出较强的生物活性，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、保肝和降血糖等作用。因其属于非细胞毒性物质，具有毒副作用小的特点，多糖已成为药物、食品添加剂、化妆品及保健品等研发的热点。
目前国内外关于阳春砂研究最多的是其挥发性成分，普遍认为阳春砂的主要有效成分是挥发油。关于阳春砂多糖的研究报道较少，且主要集中于阳春砂多糖提取方法、抗氧化活性、粗多糖的免疫调节活性等方面。鲜少有关于阳春砂多糖新成分、结构研究、纯化多糖活性的研究报道。多糖作为生物体内的一大类物质，应该有更深入的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有免疫调节功效的阳春砂多糖及其制备方法和应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种阳春砂多糖，主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这7种单糖组成，其特征在于：其糖链结构如下：主链由→4)-α-D-Glcp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→构成，支链由-6)-β-D-Glcp、-3)-α-D-Galp-(1-、-4)-α-D-Galp-(1-、α-L-Araf-(1-、-5)-α-L-Araf-(1-、-4)-β-D-Xylp-(1-、α-L-Rhap-(1-、α-D-GlcpA-(1-、-4)-α-D-GalpA构成，多糖含量为64.06％，糖醛酸含量为28.04％，重均分子量为1.48×107Da，具体的糖链结构如下式所示：
具体的糖链结构如下式所示：
Figure BDA0002922714560000021
式中，Ara指阿拉伯糖残基、Glc指葡萄糖残基、Gal指半乳糖残基、Xyl指木糖残基、GlcpA指葡萄糖醛酸残基、Rha指鼠李糖残基、GalpA指半乳糖醛酸残基。
本发明的第二个方面，提供：
一种具有免疫调节功能的组合物，其含有本发明第一个方面所述的阳春砂多糖。
在一些实例中，还包括可接受的辅料。
在一些实例中，所述组合物为保健食品或药物。
本发明的第三个方面，提供：
本发明第一个方面所述的阳春砂多糖在制备免疫调节剂中的应用。
本发明的第四个方面，提供：
本发明第一个方面所述的阳春砂多糖制备方法，包括：
S1)将阳春砂粉碎，脱除其中的脂肪，得阳春砂脱脂粉末；
S2)将阳春砂脱脂粉末加水，90～100℃提取，合并提取液，减压浓缩，得浓缩液；
S3)向浓缩液中加入无水乙醇，于0～10℃静置沉淀多糖并固液分离，得多糖沉淀；
S4)将多糖沉淀重新溶解于水中，得多糖溶液，向多糖溶液中加入Sevage试剂，剧烈震荡后离心，取上清，重复操作去除蛋白，得到无蛋白的多糖上清；
S5)去除多糖上清中的有机溶剂，干燥得到粗多糖；
S6)将粗多糖配制成浓度为20mg/mL的溶液，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1M的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为10min/管，使用全自动馏分收集器收集，收集0.1M NaCl溶液洗脱下的组分，浓缩，使用截止分子量为3500Da的透析袋透析，透析留存物干燥得到阳春砂多糖AVPD-2；
S7)取阳春砂多糖AVPD-2配制成5mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3mL/10min，洗脱时间为10min/管，使用全自动馏分收集器收集，得到目标阳春砂多糖AVPG-2。
在一些实例中，所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇体积比＝4:1的溶剂。
在一些实例中，按200g粉碎后的阳春砂粉末，加入4L 95％乙醇的比例将阳春砂粉末和95％乙醇混合，80℃提取3h，重复操作三次，最后将阳春砂粉末烘干，得阳春砂脱脂粉末。
在一些实例中，按200g阳春砂脱脂粉末加4L水的比例配料，95℃提取3h，重复操作3次，再将水提液于60℃下减压浓缩，得浓缩液。
在一些实例中，向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，于4℃下静置12h，沉淀多糖，然后离心收集沉淀，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，得多糖沉淀。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例，首次分离得到了阳春砂大分子量酸性多糖AVPG-2，经高效尺寸排阻色谱联用多角度激光散射仪联用示差检测器(HPSEC-MALLS-RID)测定，其重均分子量为1.48×107Da，经HPLC分析，阳春砂多糖AVPG-2主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这7种单糖组成。经刚果红分析，有三螺旋结构。
本发明一些实例的阳春砂多糖AVPG-2，在100-800μg/mL浓度范围内，可显著促进巨噬细胞RAW 264.7产生NO，分泌细胞因子IL-6和TNF-α，提高巨噬细胞RAW 264.7的细胞活力和吞噬能力，有望用于制备免疫调节保健品或药物。
附图说明
图1是阳春砂多糖AVPG-2的DEAE纤维柱层析洗脱图；
图2是阳春砂多糖AVPG-2的Sephadex G-100分子筛洗脱图；
图3是阳春砂多糖AVPG-2的HPSEC-MALLS-RID图；
图4是阳春砂多糖AVPG-2的单糖组成图；
图5是阳春砂多糖AVPG-2的红外光谱图；
图6是阳春砂多糖AVPG-2的1H NMR图谱；
图7是阳春砂多糖AVPG-2的13C NMR图谱；
图8是阳春砂多糖AVPG-2的1H-1H COSY图谱；
图9是阳春砂多糖AVPG-2的HSQC图谱；
图10是阳春砂多糖AVPG-2的HMBC图谱；
图11是阳春砂多糖AVPG-2的刚果红实验图谱；
图12是阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞细胞的影响，其中，A是阳春砂多糖AVPG-2提高巨噬细胞细胞活力图；B是阳春砂多糖AVPG-2促进巨噬细胞产生NO图；C是阳春砂多糖AVPG-2促进巨噬细胞分泌IL-6图；D是阳春砂多糖AVPG-2促进巨噬细胞分泌TNF-α图；E表示阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞分泌IL-10的影响；
图13是阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞吞噬能力的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1：
一)阳春砂多糖AVPG-2的制备
阳春砂种子去壳取种子团，粉碎，取200g粉碎后的阳春砂粉末，加入4L 95％乙醇，提取温度80℃，提取3h，重复操作三次，最后将阳春砂粉末烘干，得阳春砂脱脂粉末；往阳春砂脱脂粉末中加水，200g阳春砂脱脂粉末加4L水，提取温度95℃提取3h，重复操作3次，再将水提液于60℃下减压浓缩，得浓缩液；
向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，于4℃下静置12h，沉淀多糖，然后离心收集沉淀，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，再将沉淀物溶解于蒸馏水中，得到多糖溶液；
向多糖溶液中加入4倍体积的Sevage试剂，所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇＝4:1(体积比)的溶剂，剧烈震荡后离心，离心转速为5000rpm，离心时间为10min，取上清液，重复操作，直至完全去除蛋白；随后将去除蛋白的多糖溶液在50℃下浓缩至无有机试剂味，之后冷冻干燥，得到粗多糖。
取阳春砂粗多糖100mg，配制成浓度为20mg/mL的溶液，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1M的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为10min/管，洗脱曲线如图1所示；使用全自动馏分收集器收集，采用苯酚-硫酸法测多糖含量，收集0.1M NaCl溶液洗脱下的组分，60℃浓缩，3500Da的透析袋透析，冷冻干燥后得到阳春砂多糖AVPD-2；取AVPD-2 20mg，配制成5mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3mL/10min，洗脱时间为10min/管，洗脱曲线如图2所示；使用全自动馏分收集器收集，采用苯酚-硫酸法测多糖含量，合并含有多糖的组分，经浓缩、冷冻干燥后得到阳春砂多糖AVPG-2。
二)阳春砂多糖AVPG-2的分子量测定
AVPG-2的重均分子量通过HPSEC-MALLS-RID系统测得，该系统配备DAWN HELEOS-II激光散射仪，Waters e2695的分离系统和Optilab T-rEX的示差检测器，其中分离系统使用TSK-Gel G4000SWXL柱(300mm×7.8mm)，柱温为35℃，流动相为0.9％NaCl溶液，流速为0.5mL/min，使用Astra software(Version 7.1.3)对分子量数据进行获取和分析，结果如图3所示。由结果可知，阳春砂多糖AVPG-2的重均分子量为1.48×107Da。
三)阳春砂多糖AVPG-2的单糖组成分析
取8mg多糖，用2mL的3M三氟乙酸于120℃温度下水解6h，水解后的多糖用0.5M PMP(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮)进行衍生。分析采用Shimadzu高效液相色谱系统测定衍生产物样品。
HPLC条件：安捷伦XDB-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，柱温35℃，检测波长250nm，流速1.0mL/min，流动相为磷酸盐缓冲液(A)(0.05M,pH 6.7)和乙腈(B)，洗脱梯度为：0-40min保持16.0％B,40-41min由16.0％B降至14.0％B并保持14.0％B 13min，54-55min由14.0％B升至16.0％B并保持16.0％B 15min。
其中标准品顺序(1-9)依次为：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖，结果如图4所示。
由HPLC结果可知，阳春砂多糖AVPG-2的单糖组成及比例为：鼠李糖：葡萄糖醛酸：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖＝3.11:3.99:6.51:40.23:17.82:12.53:15.81。
四)阳春砂多糖AVPG-2的红外光谱分析
取多糖AVPG-2，使用傅里叶变换红外分光光度计(FTIR)，在4000-400cm-1的范围内进行红外光谱扫描，结果如图5所示，可以看出：出现了多糖的特征吸收峰。在3335.97cm-1处的特征峰是由O-H基团的拉伸振动引起的，在2926.40cm-1处的峰值是由C-H吸收引起的，包括CH、CH2和CH3的拉伸振动；在1732.13cm-1和1605.88cm-1处的吸收峰是由游离羧基和甲酯化羧基的C＝O拉伸振动引起的，表明AVPG-2中含有糖醛酸；在895.80cm-1,853.91cm-1和835.77cm-1处的特征吸收表明AVPG-2中存在α和β型糖苷键。
五)阳春砂多糖AVPG-2的核磁共振分析
将AVPG-2以60mg/mL的浓度溶于D2O中使用Bruker Avance-600进行检测。阳春砂多糖AVPG-2核磁共振分析：结果如图6～10所示，根据图6～10的核磁图谱对各残基的各个碳和氢的化学位移值进行归属，归属结果如下表1所示。
表1-阳春砂多糖AVPG-2中各糖残基的氢、碳信号归属
Figure BDA0002922714560000061
结合单糖组成、红外光谱和核磁共振分析可知AVPG-2的糖链结构如下：
主链由→4)-α-D-Glcp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→构成，支链由-6)-β-D-Glcp、-3)-α-D-Galp-(1-、-4)-α-D-Galp-(1-、α-L-Araf-(1-、-5)-α-L-Araf-(1-、-4)-β-D-Xylp-(1-、α-L-Rhap-(1-、α-D-GlcpA-(1-、-4)-α-D-GalpA构成。具体连接方式如下式所示：
Figure BDA0002922714560000071
式中，Ara指阿拉伯糖残基、Glc指葡萄糖残基、Gal指半乳糖残基、Xyl指木糖残基、GlcpA指葡萄糖醛酸残基、Rha指鼠李糖残基、GalpA指半乳糖醛酸残基，式中的数字指其键合的羟基在残基上的位置。
六)阳春砂多糖AVPG-2的刚果红实验
将1.0mL多糖样品(1.0mg/mL)与1.0mL刚果红溶液(80μM)混合。随后，加入NaOH溶液(1.0M)，使氢氧化钠的最终浓度为0.1-0.6M，混合溶液避光放置10min，用Shimadzu UV-2600分光光度计分析其最大吸收波长(λmax)。结果如图11所示，可以看出：AVPG-2有三螺旋结构。
实施例2：
一)阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞RAW 264.7细胞活力的影响
取RAW 264.7细胞(5.0×103个/孔)接种于康宁96孔板，于37℃5％的CO2培养箱中培养24h；弃去旧培养液，加入不同浓度的AVPG-2(100，200，400和800μg/mL)，空白对照和阳性对照分别加入DMEM培养基和LPS(1μg/mL)，培养24h；取出96孔板，每孔加入10μL CCK-8试剂，于37℃5％的CO2培养箱中培养3h，之后使用Epoch酶标仪于450nm下测定吸光值。测定结果如图12A所示。从图中可以看出，AVPG-2在给药剂量下均可以显著提高细胞活力，且呈剂量依赖关系。
二)阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞RAW 264.7NO释放量的影响
NO释放量通过Griess反应进行测定。RAW 264.7细胞(5.0×104cells/well)于96孔板中培养24h后给药，AVPG-2终浓度为100，200，400和800μg/mL，等体积的培养基作为空白对照，等体积的LPS(1μg/mL)作为阳性对照。给药后继续培养24h，按照试剂盒说明书使用Griess反应，通过Epoch酶标仪测定吸光值。测定结果如图12B所示。从图中可以看出，AVPG-2在给药剂量下均可以显著促进巨噬细胞分泌NO，且呈剂量依赖关系。
三)阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞分泌IL-6的影响
IL-6释放量根据ELISA试剂盒说明来操作。RAW 264.7细胞(5.0×104cells/well)于96孔板中培养24h后给药，AVPG-2终浓度为100，200，400和800μg/mL，等体积的培养基作为空白对照，等体积的LPS(1μg/mL)作为阳性对照。给药后继续培养24h，按照试剂盒说明书进行操作，通过Epoch酶标仪测定吸光值。测定结果如图12C所示。从图中可以看出，AVPG-2在给药剂量下均可以显著促进巨噬细胞分泌IL-6，且呈剂量依赖关系。
四)阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞分泌TNF-α的影响
TNF-α释放量根据ELISA试剂盒说明来操作。RAW 264.7细胞(5.0×104cells/well)于96孔板中培养24h后给药，AVPG-2终浓度为100，200，400和800μg/mL，等体积的培养基作为空白对照，等体积的LPS(1μg/mL)作为阳性对照。给药后继续培养24h，按照试剂盒说明书进行操作，通过Epoch酶标仪测定吸光值。测定结果如图12D所示。从图中可以看出，AVPG-2在给药剂量下均可以显著促进巨噬细胞分泌TNF-α，且呈剂量依赖关系。
五)阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞分泌IL-10的影响
IL-10释放量根据ELISA试剂盒说明来操作。RAW 264.7细胞(5.0×104cells/well)于96孔板中培养24h后给药，AVPG-2终浓度为100，200，400和800μg/mL，等体积的培养基作为空白对照，等体积的LPS(1μg/mL)作为阳性对照。给药后继续培养24h，按照试剂盒说明书进行操作，通过Epoch酶标仪测定吸光值。测定结果如图12E所示。从图中可以看出，AVPG-2在给药剂量下对巨噬细胞分泌IL-10没有显著影响。
六)阳春砂多糖AVPG-2对巨噬细胞吞噬能力的影响
RAW 264.7细胞(1.0×105cells/well)于共聚焦玻璃皿中培养24h后给药，AVPG-2终浓度为100，200，400和800μg/mL，等体积的培养基作为空白对照，等体积的LPS(1μg/mL)作为阳性对照。给药后继续培养24h，之后避光加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大肠杆菌与巨噬细胞共孵育30min，细胞和细菌的终浓度比为1:3000(个/个)，使用冷的PBS将胞外荧光信号洗去，加入4％多聚甲醛固定20min，除去多聚甲醛后使用DAPI染料对细胞核进行染色，多余的染料通过PBS除去。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM,FV 3000)对巨噬细胞的吞噬能力进行定性分析。
以相同操作将巨噬细胞和FITC标记的大肠杆菌共孵育，除去细胞外荧光信号后，收集细胞，使用Beckman-Coulter CytoFLEX S流式细胞仪检测细胞内荧光信号强度，对巨噬细胞吞噬能力进行定量分析。
AVPG-2对巨噬细胞吞噬能力影响结果如图13所示，从图中可以看出，AVPG-2可增强巨噬细胞吞噬能力，且增强效果呈剂量依赖性。
综上所述，阳春砂多糖AVPG-2可促进巨噬细胞RAW 264.7产生NO，分泌IL-6和TNF-α，而对IL-10没有显著影响，此外，可以增强巨噬细胞细胞活力和吞噬能力。AVPG-2具有免疫调节活性。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种阳春砂多糖，主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这7种单糖组成，其特征在于：其糖链结构如下：主链由→4)-α-D-Glcp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→构成，支链由-6)-β-D-Glcp、-3)-α-D-Galp-(1-、-4)-α-D-Galp-(1-、α-L-Araf-(1-、-5)-α-L-Araf-(1-、-4)-β-D-Xylp-(1-、α-L-Rhap-(1-、α-D-GlcpA-(1-、-4)-α-D-GalpA构成，多糖含量为64.06％，糖醛酸含量为28.04％，重均分子量为1.48×107Da，具体的糖链结构如下式所示：
Figure FDA0002922714550000011
式中，Ara指阿拉伯糖残基、Glc指葡萄糖残基、Gal指半乳糖残基、Xyl指木糖残基、GlcpA指葡萄糖醛酸残基、Rha指鼠李糖残基、GalpA指半乳糖醛酸残基。
2.一种具有免疫调节功能的组合物，其特征在于：其含有权利要求1所述的阳春砂多糖。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：还包括可接受的辅料。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物为保健食品或药物。
5.权利要求1所述阳春砂多糖在制备免疫调节剂中的应用。
6.权利要求1所述阳春砂多糖的制备方法，包括：
S1)将阳春砂粉碎，脱除其中的脂肪，得阳春砂脱脂粉末；
S2)将阳春砂脱脂粉末加水，90～100℃提取，合并提取液，减压浓缩，得浓缩液；
S3)向浓缩液中加入无水乙醇，于0～10℃静置沉淀多糖并固液分离，得多糖沉淀；
S4)将多糖沉淀重新溶解于水中，得多糖溶液，向多糖溶液中加入Sevage试剂，剧烈震荡后离心，取上清，重复操作去除蛋白，得到无蛋白的多糖上清；
S5)去除多糖上清中的有机溶剂，干燥得到粗多糖；
S6)将粗多糖配制成浓度为20mg/mL的溶液，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1M的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱时间为10min/管，使用全自动馏分收集器收集，收集0.1M NaCl溶液洗脱下的组分，浓缩，使用截止分子量为3500Da的透析袋透析，透析留存物干燥得到阳春砂多糖AVPD-2；
S7)取阳春砂多糖AVPD-2配制成5mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3mL/10min，洗脱时间为10min/管，使用全自动馏分收集器收集，得到目标阳春砂多糖AVPG-2。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇体积比＝4:1的溶剂。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：按200g粉碎后的阳春砂粉末，加入4L 95％乙醇的比例将阳春砂粉末和95％乙醇混合，80℃提取3h，重复操作三次，最后将阳春砂粉末烘干，得阳春砂脱脂粉末。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：按200g阳春砂脱脂粉末加4L水的比例配料，95℃提取3h，重复操作3次，再将水提液于60℃下减压浓缩，得浓缩液。
10.根据权利要求6或9所述的制备方法，其特征在于：向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，于4℃下静置12h，沉淀多糖，然后离心收集沉淀，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，得多糖沉淀。
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