CN113717295A - 一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了医药技术领域的一种杜仲酸性多糖EUP‑A1的提取方法及其在开发治疗脂肪肝药物中的应用,杜仲酸性糖EUP‑A1主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖组成,摩尔比为:8.31:1.73:43.97:3.77:31.56:10.65。杜仲酸性多糖EUP‑A1具有较好的降低脂肪肝中TG含量的功效,且对肝细胞的细胞活力无显著影响。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,特别涉及一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用。
背景技术
随着国家的发展,人们的生活水平不断提高,非酒精性脂肪肝等富贵病在我国的发生比例急剧升高。目前对非酒精性脂肪肝患者的药物治疗多采用西医药疗法,可以使用维生素e、甘草酸制剂、多烯磷脂胆碱等,如有胰岛素抵抗,还可使用胰岛素增敏剂,合并有血脂增高的患者,可以在综合治疗的基础上应用降脂药物。
中医药文化在我国有数千年的发展与积淀,是我们重要的文化宝库,也是药物研发的宝库。杜仲是一味非常重要的中药,为杜仲科植物杜仲的树皮,其味甘,性温,有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任的功效。临床上被广泛用于降血压,利尿等疾病,而在治疗脂肪肝方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明意在提供一种杜仲酸性多糖、提取方法及其在制备治疗脂肪肝药物中的应用。
本方案中的一种杜仲酸性多糖EUP-A1,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖组成,各组分的摩尔比为8.31:1.73:43.97:3.77:31.56:10.65。
本发明所提供的杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法,包括以下步骤:
S1、将杜仲树皮放入蒸馏水浸泡至湿透;
S2、采用水提醇沉的方法得到杜仲树皮的提取物,将提取物冻干得到杜仲总多糖;
所述水提醇沉的步骤是:(1)将浸透后的杜仲树皮煎煮多次,每次1~3h,合并每次的煎煮液;(2)煎煮液离心后留取上清液,再向上清液中加入乙醇进行沉淀,上清液中乙醇的浓度为80%,沉淀组分即为杜仲树皮的提取物,将提取物冻干得到杜仲总多糖;
S3、所得杜仲总多糖经DEAE-cellulose层析,水洗3倍柱体积后,经0.2M NaCl洗脱3倍柱体积得到洗脱液;
S4、将所述洗脱液浓缩、透析、冻干得到所述杜仲酸性多糖EUP-A1。
通过本方法得到纯度较高的杜仲酸性多糖EUP-A1。经分析了解到杜仲酸性多糖EUP-A1的组成结构,进一步探索了EUP-A1在抑制脂肪肝中TG生成方面的作用,结果表面在5mg/mL浓度下EUP-A1对肝细胞无毒副作用,同时可较好的抑制脂肪肝中TG的生成,可以作为治疗脂肪肝疾病的潜在药物研发,在治疗脂肪肝药物中的杜仲酸性多糖EUP-A1的浓度为2mg/mL。
附图说明
图1为杜仲总多糖的梯度洗脱分析结果;
图2为杜仲酸性多糖EUP-A1降脂肪肝TG含量图;
图3为杜仲酸性多糖EUP-A1降低脂肪肝Srebp基因表达图;
图4为杜仲酸性多糖EUP-A1对L02肝细胞活力的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明:
实施例1,杜仲总多糖的提取
取干燥杜仲树皮(重量为985g),剪成小段,加入10L超纯水浸泡过夜。第二天,杜仲树皮经水煮提取3h后用纱布过滤。往残渣中加入10L超纯水继续煮提2h,同法重复。提取过滤后,往过滤后的残渣中加入5L超纯水继续提取1h,过滤、合并3次煮提液。经4000rpm离心20min,上清合并,将沉淀弃用。将95%乙醇加入上清中(乙醇终浓度80%),4℃静置隔夜。
小心倾倒弃去醇沉后的上清液,沉淀部分于4000rpm离心20min,加入适量超纯水溶解。加热挥尽多余的乙醇,静置,待其冷却后分装至塑料杯中,至-80℃冰箱中冷冻成固体,然后取出进行冷冻干燥,干燥后,合并称重,得到杜仲总多糖EUP。
实施例2:杜仲多糖分级分析
取250mg DEAE-纤维素(DEAE-Cellulose),分多次加入,使其充分溶胀10L蒸馏水中(加入时边加边搅拌),用纱布过滤,尽可能除去水分。浸泡至0.5M的HCl中1h,纱布过滤,用蒸馏水浸泡清洗,使其成中性,再浸泡至0.5M的NaOH中1h,纱布过滤,用蒸馏水浸泡清洗,使其成中性。其中的气泡经真空泵减压脱气除去,浸泡于蒸馏水中,置于4℃环境中备用。
填料装柱前处理:从4℃冰箱中取出适量填料,经减压脱气处理后即可装柱,采用2.6X50cm层析柱,用两倍柱体积的高纯水平衡后即可上样。
样品前处理:取75mg杜仲总多糖EUP样品加入3mL超纯水,配成25mg/mL的溶液,10000rpm离心10min,用移液枪小心吸出上清,使用微孔滤膜(0.45μm)过滤即可。(上样体积/上样量:2mL/50mg)
用连续梯度洗脱的方法,使用DEAE-纤维素柱对杜仲水提总糖进行分级。水洗240mL、梯度盐(氯化钠)洗456mL(盐浓度从0梯度增至1M)、1M盐洗240mL,(层析柱型号:2.6cm×50cm)。洗脱液按试管顺序被依次收集(流速:0.4mL/min,4mL/管,10min/管)。
采用硫酸-苯酚法测定收集部分的糖含量:从每管中取200μL洗脱液,加入400μL的5%的苯酚溶液,摇匀,迅速加入2mL浓硫酸混匀。静置使其冷却,在波长为492nm条件下测定吸光度值。以横坐标洗脱液体积、纵坐标吸光度值和盐浓度绘图。
结果如图1所示,杜仲多糖共计分为5个多糖级分,分别是杜仲中性多糖EUP-N,杜仲酸性糖EUP-A1,杜仲酸性糖EUP-A2,杜仲酸性糖EUP-A3,杜仲酸性糖EUP-A4。
实施例3:杜仲多糖分级制备
采用实施例2中方法,DEAE-Cellulose装柱,6X50cm层析柱,取杜仲总多糖EUP,1g,分别经水洗,0.0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、1mol/L NaCl洗脱,每个洗脱条件洗脱3倍柱体积,水洗级分浓缩后冻干,得到EUP-N级分,各NaCl洗脱部分,透析后浓缩,冻干,分别得到EUP-A1,EUP-A2,EUP-A3,EUP-A4。
表1杜仲多糖各级分收率
名称 | 缩写 | 收率 |
杜仲总糖 | EUP | 3.56% |
杜仲中性糖 | EUP-N | 28.1% |
杜仲酸性糖级分1 | EUP-A1 | 10.8% |
杜仲酸性糖级分2 | EUP-A2 | 8.54% |
杜仲酸性糖级分3 | EUP-A3 | 5.34% |
杜仲酸性糖级分4 | EUP-A4 | 6.32% |
实施例4:杜仲酸性多糖EUP-A1的单糖组成分析
HPLC条件:流动相组成为乙腈:磷酸缓冲盐=18.2:81.8。检测器型号:VarianProstar325,检测波长:245nm。色谱柱型号:Thermo ScientificODS-2(c18)Hypersil Dim.(mm)150×4.6;柱温:30℃。进样量:15μL,流速:1mL/min。
样品前处理:(1)酸水解:称取2mg杜仲酸性多糖EUP-A1样品置于棕色小瓶中,使其溶于2mL 4M的三氟乙酸(TFA),加盖密封。在110℃的条件下加热水解4h,取出冷却至室温,使用甲醇减压浓缩,重复操作直至除尽TFA。蒸干后,残渣溶解200μL蒸馏水中。
(2)PMP衍生化:取100μL(1)中的完全酸水解溶液,加入浓度为0.6M的NaOH溶液100μL混匀,再加入200μL现配置的浓度为0.5M的PMP甲醇溶液,密封后涡漩混匀。水浴温度为70℃条件下反应100min后,冷却至室温,用浓度为0.3M的HCl 200μL进行中和,加蒸馏水补足至1mL。再加入1mL三氯甲烷萃取,取出上层水相,多次重复萃取,尽量除尽PMP。涡旋后取15μL上清液进样分析。
(3)取100μL 1mg/mL单糖标准品(Man,Rha,Gal,GalA,Glc,GlcA,Xyl,Ara,Fuc)混合液,按样品PMP衍生同法处理,然后进样分析。
结果显示杜仲酸性糖EUP-A1主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖组成,含量比为:8.31:1.73:43.97:3.77:31.56:10.65。
实施例5:杜仲酸性多糖降脂肪肝TG活性实验
LO2人正常肝细胞,细胞密度为4*104个细胞/mL铺板至12孔板,37℃,5%CO2中培养继续培养过夜。加诱导试剂油酸,终浓度为80μg/mL,培养12小时后,换培养基,加入不同浓度杜仲酸性多糖EUP-A1,多糖药物处理48小时。吸弃细胞培养基,加入PBS洗涤细胞1次(1mL/孔);加入胰酶细胞消化液消化细胞,1000rpm/min,离心10min;吸弃上清,加入PBS洗涤2次,每次12000rpm/min,离心10min,吸弃上清,留细胞沉淀;加入匀浆介质/抽提液无水乙醇,重悬细胞;后续步骤按照甘油三酯(TG)测定试剂盒说明书进行(A110-2-1,南京建成)。结果如图2所示,结果显示杜仲酸性多糖EUP-A1具有较好的抑制脂肪肝中TG的生成的作用。
实施例6:杜仲酸性多糖升高肝脏ChREBP基因表达实验
LO2人正常肝细胞,细胞密度为2*104个细胞/mL铺板至24孔板,放入37℃,5%CO2中培养继续培养过夜,lipo2000转染0.5ug的pGL3-Srebp-luciferase和0.5ug的pCMV-gal质粒,培养10小时后,加诱导试剂油酸,终浓度为80μg/mL,培养12小时后,换培养基,加入不同浓度杜仲酸性多糖EUP-A1,多糖药物处理48小时。吸弃培养基上清,加入细胞裂解液(碧云天),100μl/孔,冰上放置10min。将液体转移至1.5ml离心管,12000rpm/min离心10min,取上清液加入到96孔板中每孔25μl,加入化学发光底物100μl,多功能酶标仪检测发光数值(RLU)。另取离心上清30μl,加入ONPG显色,作为内参质粒数值(beta-gal)。将RLU/beta-gal作为样品的化学发光检测值。结果如附图3所示,杜仲酸性糖EUP-A1级分可以显著降低SREBP-1c的基因表达,且呈浓度梯度依赖性。SREBP-1c是脂肪肝中脂肪代谢的关键酶,SREBP-1c表达降低,表示EUP-A1以SREBP-1c为靶点降低脂肪肝中TG的生成。
实施例7:杜仲酸性多糖EUP-A1对L02肝细胞活力的影响
LO2人正常肝细胞,细胞密度为3*103个细胞/mL铺板至96孔板,放入37℃,5%CO2中培养继续培养过夜,换培养基,加入不同浓度杜仲酸性多糖EUP-A1,多糖药物处理48小时。然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h,弃去上清液。最后,每孔加入150μL的DMSO,在490nm波长处检测吸光值。结果如图4显示,杜仲酸性多糖EUP-A1对L02肝细胞的细胞活力在5mg/mL浓度下无影响。
Claims (7)
1.一种杜仲酸性多糖EUP-A1,其特征在于:主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖组成,各组分的摩尔比为8.31:1.73:43.97:3.77:31.56:10.65。
2.根据权利要求1所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1、将杜仲树皮放入蒸馏水浸泡至湿透;
S2、采用水提醇沉的方法得到杜仲树皮的提取物,将提取物冻干得到杜仲总多糖;
S3、所得杜仲总多糖经DEAE-cellulose层析,水洗后再经0.2M NaCl洗脱得到洗脱液;
S4、将所述洗脱液浓缩、透析、冻干得到所述杜仲酸性多糖EUP-A1。
3.根据权利要求2所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法,其特征在于:所述水提醇沉的步骤为:(1)将浸透后的杜仲树皮煎煮多次,每次1~3h,合并每次的煎煮液;(2)煎煮液中加入一定浓度的乙醇进行沉淀,沉淀组分即为杜仲树皮的提取物。
4.根据权利要求3所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法,其特征在于:进行乙醇沉淀前将所述煎煮液离心,留取上清液,再向上清液中加入乙醇,上清液中乙醇的浓度为80%。
5.根据权利要求4所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1的提取方法,其特征在于:所述S3中,将所得杜仲总多糖经DEAE-cellulose层析,水洗3倍柱体积后,经0.2M NaCl洗脱3倍柱体积得到洗脱液。
6.根据权利要求1所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1在制备治疗脂肪肝药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的一种杜仲酸性多糖EUP-A1在制备治疗脂肪肝药物中的应用,其特征在于:所述治疗脂肪肝药物中的杜仲酸性多糖EUP-A1的浓度为2mg/mL。
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