CN102617745B

CN102617745B - 灵芝多糖f31的制备方法及其降血糖功能

Info

Publication number: CN102617745B
Application number: CN2012100560875A
Authority: CN
Inventors: 吴清平; 肖春; 杨小兵; 谢意珍; 李森柱
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Yuewei Edible Mushroom Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Yuewei Edible Mushroom Technology Co Ltd
Priority date: 2012-03-05
Filing date: 2012-03-05
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2032-03-05
Also published as: CN102617745A

Abstract

本发明公开一种灵芝多糖F31的制备方法及其降血糖功能。灵芝多糖F31其制备方法为：取灵芝(Ganoderma lucidum karst)子实体，粉碎用热水抽提，然后再过滤，在滤液中加入乙醇沉淀，分离沉淀；沉淀上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱，先用Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)平衡，接着用含0.1M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，最后用含0.5M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，分别得到馏分F1、F2和F3；馏分F3上分子筛Sephacryl S300，用H₂O平衡，接着用H₂O洗脱，收集有效峰，减压浓缩，透析，干燥得灵芝多糖F31。本发明从灵芝子实体中分离出一种新的灵芝多糖F31，该灵芝多糖F31具有降血糖活性，可以用于制备治疗糖尿病的药物，尤其是治疗2型糖尿病的药物，为开发治疗糖尿病的新药打下基础，积极推动糖尿病天然药物活性成分的研究开发。

Description

灵芝多糖F31的制备方法及其降血糖功能

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有降血糖作用的灵芝多糖F31及其制备方法和用途。

背景技术：

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢紊乱综合症，全世界糖尿病患者以每年6％的速度增加。预计在2010年至2030年间，发展中国家的成年人总患病者会增加69％，发达国家会增加20％。糖尿病分为1型和2型糖尿病，其中2型糖尿病占整个总数的90％以上。目前的医学尚不能攻克糖尿病，糖尿病的治疗主要以长期服用药物控制和缓解病情，然而目前临床使用药物多为化学药物或生化药物，毒副作用的长期积累对人体的影响很大。这一严峻形势促使对糖尿病药物的新药开发重点转向从自然界中寻找天然、安全、疗效确切的新型活性成分。

作为我国民间传统中药的灵芝(Ganoderma lucidum)，其多糖成分在抗病毒、抗肿瘤、免疫力提高、降血压、降血糖等方面都表现出显著的作用。国内外学者均报道过灵芝多糖在动物模型上表现出良好的降血糖作用，例如日本的Hiroshi Hikino从灵芝(Ganoderma lucidum)子实体热水提取物中得到三种降血糖活性的灵芝多糖A、B、C。在对71名糖尿病患者的临床试验中，灵芝糖蛋白Ganopoly也表现出良好并且安全的降血糖作用。可见，灵芝在糖尿病的治疗方面有着很好的前景。

现代药理学研究结果表明，血糖的降低可以通过升高胰岛素的含量，也可通过调节与糖代谢相关酶的活性，而促进葡萄糖的氧化利用，还可通过改善胰岛素抵抗或抑制葡萄糖吸收等而实现。

张玲芝发现灌服灵芝子实体多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的胰岛细胞具有一定的修复作用而使内源性胰岛素分泌增加，降低血糖。罗少洪在研究灵芝多糖调节血糖作用时发现，在灌胃剂量达100mg/kg以上时，可明显降低链尿菌素高血糖小鼠血糖水平，无剂量效应关系；在200mg/kg剂量时，可降低正常小鼠的血糖，有明显的刺激胰岛素分泌的作用，并可明显增强高血糖小鼠对葡萄糖的耐受力。陈伟强等也报道对STZ引起的糖尿病小鼠进行灌胃灵芝多糖，能使糖尿病大鼠血糖水平显著下降(p＜0.05)，血清胰岛素水平显著升高(p＜0.05)。灵芝子实体多糖B能增加正常小鼠和四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的血浆胰岛素水平，并能增强肝葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶和葡萄糖-6磷酸脱氢酶的活性，降低肝6-磷酸葡萄糖和糖原合成酶的活性，但不影响己糖激酶和糖原磷酸化酶的活性；其机制是能升高血浆胰岛素的浓度，加速葡萄糖代谢，提高周围组织对糖的利用，并通过强化参与肝脏糖代谢的各种关键酶的活性来提高肝脏对葡萄糖的利用。Seto发现灵芝水提物能够通过抑制肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK的表达降低2型糖尿病小鼠的血糖。

虽然目前已经发现灵芝及其活性成分具有显著的降血糖作用，但由于其化学结构复杂，绝大多数降血糖活性物质的成分、结构及其作用机理未能明确，直接阻碍了它们被开发成治疗糖尿病新药的进程。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有降血糖作用的新的灵芝多糖F31及其制备方法。

本发明的灵芝多糖F31是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤：

(a)取灵芝(Ganoderma lucidum karst)子实体，粉碎用热水抽提，然后再过滤，在滤液中加入乙醇沉淀，分离沉淀；

(b)沉淀上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱，先用Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)平衡，接着用含0.1M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，最后用含0.5M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，分别得到馏分F1、F2和F3；馏分F3上分子筛Sephacryl S300，用H₂O平衡，接着用H₂O洗脱，收集有效峰，减压浓缩，透析，干燥得灵芝多糖F31。

所述的步骤(a)的沉淀优选先用热水溶解，再用0.45μm直径的微孔滤膜过滤，滤液装入3000D孔径的透析袋透析，得粗多糖溶液，再调整粗多糖溶液中灵芝粗多糖的浓度，将此粗多糖溶液作为样品进行步骤(b)的上样层析分离。

该灵芝多糖F31分子量为1.90×10⁴D，多糖含量为94.8％，蛋白含量为4.2％，多糖主要由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，氨基酸组分主要是脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)，为β-吡喃糖环杂多糖，并且含有糖醛酸。根据上述参数，与现有技术中的灵芝多糖进行比较，没有发现相类似的，因此本发明的灵芝多糖F31是一个新的灵芝多糖。

取灵芝多糖F31进行体内降血糖试验，结果表明灵芝多糖F31连续腹腔注射7天，可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(^*P＜0.05)，其降血糖机理主要是通过减少肝脏葡萄糖的输出，从而降低血糖。

因此本发明的第二个目的是提供灵芝多糖F31在制备治疗糖尿病药物中的应用，尤其是在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，该药物以灵芝多糖F31作为活性成分。

所述的糖尿病为2型糖尿病。

本发明从灵芝子实体中分离出一种新的灵芝多糖F31，该灵芝多糖F31具有降血糖活性，可以用于制备治疗糖尿病的药物，尤其是治疗2型糖尿病的药物，为开发治疗糖尿病的新药打下基础，积极推动糖尿病天然药物活性成分的研究开发。

附图说明：

图1是沉淀上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱的色谱分析图；

图2是馏分F3上Sephacryl S300色谱柱的色谱分析图；

图3是多糖对照品的凝胶色谱校正曲线；

图4是灵芝多糖F31的HPLC分析图；

图5是灵芝多糖F31的红外光谱(IR)的扫描图；

图6是灵芝多糖F31的¹H-NMR谱图；

图7是灵芝多糖F31的¹³C-NMR谱图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、灵芝多糖F31的制备

取灵芝(Ganoderma lucidum karst)子实体250g，粉碎，用5000ml 80℃的热水抽提8h，过滤，滤液减压浓缩至1000ml，再加入4倍体积乙醇沉淀，5000rpm离心，得沉淀，将沉淀重新溶解于热水中，用0.45μm直径的微孔滤膜过滤，滤液装入3000D孔径的透析袋透析24h，得粗多糖溶液，再调整粗多糖溶液中灵芝粗多糖的浓度为10mg/ml。

取上述粗多糖溶液100ml过滤，滤液上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱(4.5×30cm)，用300ml的Tris-HCl(10mM，pH＝8.0)平衡，收集馏分浓缩得到馏分F1；接着用300ml的含0.1M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，收集馏分浓缩得到馏分F2；最后用300ml的含0.5M NaCl的Tris-HCL(10mM，pH＝8.0)洗脱，收集馏分浓缩得到馏分F3，洗脱过程中的检测图如图1所示，F1、F2和F3相对应OD490中的Fraction 1、2和3。

馏分F3上分子筛Sephacryl S300色谱柱，用H₂O平衡，接着用H₂O洗脱，第一个峰为有效峰，收集第一个洗脱峰F31(OD490中的F31峰)，减压浓缩，透析，冻干得灵芝多糖F31，洗脱过程中的检测图如图2所示。

二、灵芝多糖F31的纯度和分子量测定：

取灵芝多糖F31 10mg，溶于1ml超纯水中，然后进行HPLC分析：

色谱条件：TSK-GEL G3000SW_XL色谱柱(300mm×718mm)，柱温35℃；流动相：0.05M的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH6.7，加0.05％NaN₃)；体积流量：0.5mL/min；示差折光检测器，恒温35℃；进样量：20μL。

GPC校正曲线的建立：取Mr为738、5800、1.22×10⁴、2.37×10⁴、4.80×10⁴、1.00×10⁵、1.86×10⁵、3.80×10⁵、8.53×10⁵的多糖对照品10mg，用1ml含0.05M的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 6.7，加0.05％NaN₃)溶解，经0.45μm滤膜滤过，进行GPC分析。已知Mr多糖对照品的相应保留时间见表1。以多糖对照品的淋洗体积为横坐标，Mr为纵坐标做GPC的校正曲线，见图3。

灵芝多糖F31的纯度和分子量的测定：取10mg灵芝多糖F31，用1ml的0.05M的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH6.7，加0.05％NaN3)溶解，经0.45μm滤膜滤过，进行GPC分析。根据峰面积归一化求得该灵芝多糖F31的纯度≥98％(图4)，纯度较高，通过GPC色谱工作站自动计算得灵芝多糖F31的平均分子量为1.90×10⁴D。

表1：多糖对照品的保留时间

三、灵芝多糖F31的物理化学性质测定：

1、灵芝多糖F31的多糖含量及蛋白含量测定

灵芝多糖F31的多糖含量用硫酸-苯酚法测定，蛋白含量用Bradford测定。结果灵芝多糖F31的多糖含量为94.8％，蛋白含量为4.2％。

2、灵芝多糖F31的氨基酸组成分析

美国惠谱HP1050型高效液相色谱仪，由四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和HP1046A荧光检测器组成；日立GL20A全自动20000rpm高速冷冻离心机。

氨基酸对照品、衍生试剂OPA、FMOC，SIGMA公司生产；Na₂HPO₄为分析纯；甲醇、乙腈为HPLC级。

色谱条件：Hypersil ODS色谱柱柱，4.0×125mm，粒径5μm；流动相(A)：10mmol·L^-1Na₂HPO₄PH 7.2缓冲液(PB)；流动相(B)：PB+甲醇+乙腈(体积份量50+35+15)。线性梯度：在0～10min内，流动相B以线性从体积分数0％上升到40％。流量：1.0mL·min^-1。柱温40℃。检测波长：激发波长340nm，发射波长450nm。

样品处理：标准溶液：氨基酸对照品准确称量后用0.1mol·L^-1HCl溶液溶解并稀释配成含每种氨基酸250nM的系列混合标准溶液。

水解氨基酸：准确称取一定量的灵芝多糖F31置水解管中，加入6M HCl 10～15mL，滴加两滴新蒸馏的苯酚，将水解管置于冷冻剂中，冷冻3min～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空(接近0Pa)，然后冲入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口，将已封口的水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解23h后，去出冷却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到100mL容量瓶内，用去离子水定容。适当稀释，待检测。

经过图谱对比，灵芝多糖F31氨基酸组分主要氨基酸的主要成分是脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)，具体见表2。

表2：灵芝多糖F31的氨基酸组成

3、GC-MS分析灵芝多糖F31的单糖组成：

多糖的水解：取灵芝多糖F31，加入2M的H₂SO₄，加热回流6h，冷却，用饱和Ba(OH)₂溶液中和至中性，滤过，取清液。

多糖水解产物的乙酰化：取灵芝多糖F31水解溶液，彻底蒸干水分，加入70mg盐酸羟胺，5mL吡啶，于90℃水浴加热1h；取出稍冷，加入5mL醋酸酐，再于90℃水浴加热1h；冷却，加10mL水破坏醋酐，用氯仿萃取乙酰化产物，氯仿萃取液用水洗涤，无水硫酸钠脱水，上清液通氮气浓缩定容至1mL，进行GC-MS分析。

GC-MS条件：SE230弹性石英毛细管柱(15m×012mm×0133Lm)；柱温初温100℃，以10℃/min程序升温至280℃，保持10min；载气He，柱前压70kPa，分流比10∶1，溶剂延迟2min。EI离子源，电子能量70eV，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压2300V，GC2M S接口温度280℃，质量扫描范围m/z 29～500。

灵芝多糖F31水解并乙酰化后用GC-MS分析其单糖组成，将单糖对照品同时乙酰化进行对照。根据单糖对照品的总离子流色谱图，表明灵芝多糖F31主要是由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖组成的杂多糖。其单糖组成的相对质量分数见表3。

表3：灵芝多糖F31的单糖组成

4、灵芝多糖F31的红外光谱(IR)分析

分别取1mg左右的干燥灵芝多糖F31与100mg干燥KBr混合研细后，压片，在400～4000cm^-1区间进行红外扫描。对扫描图(图5)的吸收峰进行诠释，各峰的归属见表4。从红外光谱图分析，灵芝多糖F31主要由β糖苷键相连的吡喃环组成。

表4：灵芝多糖F31红外光谱吸收峰的归属诠释

5、灵芝多糖F31的核磁共振(NMR)：¹H-NMR和¹³C-NMR

¹H-NMR如图6所示，¹³C-NMR如图7所示。

从¹H-NMR中可以看出δ4.4的信号，提示灵芝多糖F31主要由吡喃糖环构成，这与红外光谱分析结构吻合。

在¹³C-NMR谱中，异头碳的化学位移一般在90～112之间。根据出现的信号峰来确定多糖的糖残基数。因此，灵芝多糖F31被判定有主要由5个糖基组成，GC-MS的结果显示由6个糖基组成，但核糖只占其中的0.52％，因此灵芝多糖F31主要是由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖组成。

¹³C-NMR可通过异头碳的共振区(δ90～110)峰的个数确定糖残基的数量和相对含量。通常，α-型糖苷异头碳的化学位移在δ95～101范围内，而多数β-型糖苷异头碳的化学位移位于δ101～105。因此，灵芝多糖F31被判定为β-型。

此外，由¹³C-NMR的特征信号可以确定某些糖残基或基团，如糖醛酸的羧基碳信号出现在低场区δ170～180；因此，灵芝多糖F31含有糖醛酸。

综上所述，本发明的灵芝多糖F31分子量为1.90×10⁴D，多糖含量为94.8％，蛋白含量为4.2％，多糖主要由葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，氨基酸组分主要氨基酸的主要成分是脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)，为β-吡喃糖环杂多糖，并且含有糖醛酸。根据上述参数，于现有技术中的灵芝多糖进行比较，没有发现相类似的，因此本发明的灵芝多糖F31是一个新的灵芝多糖。

四、药理实验

灵芝多糖F31对2型糖尿病小鼠的降血糖试验：

(1)实验性糖尿病动物模型：采用昆明种小鼠，6周龄，体重24～26克，雄性，标记，分笼饲养，适应性喂养后，禁食18-24h，用pH＝4.5的柠檬酸溶液配制链尿菌素，按65mg/kgBW腹腔注射链尿菌素，并饲以高脂高糖饲料，4W后，测定小鼠空腹血糖(空腹5h)，选用血糖值＞11.1mM的小鼠作为糖尿病(DM)小鼠。

(2)降低空腹血糖实验：设正常对照组(NC)，DM小鼠随机分为：①模型对照组(MC)②灵芝多糖F31组：50mg/kg BW，腹腔注射ip。分别按组对实验小鼠给药，各实验对照组均给于等体积的生理盐水，连续给药物7天，测定血糖。从表5可以看出，灵芝多糖F31连续腹腔注射7天，可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(^*P＜0.05)，因此本发明的灵芝多糖F31可以用于制备治疗糖尿病的药物，尤其是2型糖尿病。

表5：注射灵芝多糖F31对2型糖尿病小鼠的空腹血糖的作用

注：同糖尿病组相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

Claims

1.一种灵芝多糖F31的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）取灵芝（Ganoderma lucidum karst）子实体，粉碎用热水抽提，然后再过滤，在滤液中加入乙醇沉淀，分离沉淀；

（b）沉淀上DEAE Sepharose Fast Flow色谱柱，先用10mM,pH=8.0Tris-HCl平衡，接着用含0.1M NaCl的10mM,pH=8.0Tris-HCL洗脱，最后用含0.5M NaCl的10mM,pH=8.0Tris-HCL洗脱，分别得到馏分F1、F2和F3；馏分F3上分子筛Sephacryl S300，用H₂O平衡，接着用H₂O洗脱，收集有效峰，减压浓缩，透析，干燥得灵芝多糖F31。

2.根据权利要求1所述的灵芝多糖F31的制备方法，其特征在于，所述的步骤（a）的沉淀先用热水溶解，再用0.45μm直径的微孔滤膜过滤，滤液装入3000D孔径的透析袋透析，得粗多糖溶液，再调整粗多糖溶液中灵芝粗多糖的浓度，将此粗多糖溶液作为样品进行步骤（b）的上样层析分离。

3.根据权利要求1所述的灵芝多糖F31的制备方法制备得到的灵芝多糖F31。

4.权利要求3所述的灵芝多糖F31在制备治疗糖尿病药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病为2型糖尿病。

6.一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，该药物以权利要求3所述的灵芝多糖F31作为活性成分。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述的糖尿病为2型糖尿病。