CN110305235A - 一种甘草均一多糖gup及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘草均一多糖GUP的制备方法和用途。所述均一多糖GUP是由甘草经石油醚和95％乙醇脱脂脱色后，水提醇沉，Sevag法除蛋白后经阴离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱纯化而得：GUP的总糖含量为98.39％，蛋白含量0.09％，葡萄糖醛酸含量1.66％，分子量为17416Da，其单糖组成为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖＝0.75:5.98:213.54:4.76:15.51，为α型吡喃糖，不具有空间三螺旋结构；本发明的甘草均一多糖GUP具有良好的降尿酸作用和抑制黄嘌呤氧化酶的作用，具有用于制备抗高尿酸血症药物的潜力。

Description

一种甘草均一多糖GUP及其制法和用途

技术领域

本发明涉及甘草均一多糖及其制法和在制备降尿酸药物中的应用。

背景技术

甘草，作为一种最常用的中药，有中草药之王的声誉，具有抗病毒、抗溃疡、抗糖尿病、抗炎、抗氧化、抗疟、抗真菌，抗菌等活性，一直被用于镇痛、缓解呼吸系统疾病、胃炎、炎症性疾病、皮肤病和肝病的治疗。现代研究表明，萜类、黄酮和多糖是甘草中的主要活性成分。

甘草多糖已被报道出具有多种生理活性，例如抗肿瘤作用，抗病毒作用，免疫调节，吞噬作用，抗补体作用等。因其广泛的生理活性以及应用前景，甘草多糖受到人们越来越多的关注。

高尿酸血症是由体内尿酸合成增加或/和肾脏尿酸排泄减少所导致的，进一步导致尿酸以尿酸钠结晶的形式沉积在关节处、薄壁组织和肾脏中，是痛风和慢性肾炎发病的关键因素，与肾功能不全、心脑血管疾病、高血压、高脂血症、糖尿病和代谢综合征等多种疾病相关。流行病学资料表明，近几十年来高尿酸血症患病率呈上升趋势，但其药物开发方面还存在着许多问题。目前使用的降尿酸药物主要包括黄嘌呤氧化酶抑制剂、促进尿酸排泄的药物以及尿酸氧化酶。别嘌醇、非布索坦是最常见XOD抑制药物。促进尿酸排泄的药物，能抑制尿液中尿酸的重吸收，包括丙磺舒、苯溴马隆和苯磺唑酮。聚乙二醇重组尿酸酶是一种合成尿酸酶，能将尿酸代谢为尿囊素从而减少尿酸水平。但是，这些药物存在很多副作用。例如，别嘌醇能产生胃肠道刺激、骨髓抑制、超敏综合征、肝炎和肾功能恶化等副作用。丙磺舒和苯磺唑酮在治疗高尿酸血症并发中度慢性肾功能不全时具有肾毒性。聚乙二醇重组尿酸酶只能在短期使用(3～6个月)，因为许多患者往往会产生聚乙二醇重组尿酸酶抗体，因此疗效降低。因此，应该致力于开发出提高疗效和减少传统疗法副作用的新治疗药物。

近年来，中药在高尿酸血症和痛风的预防及治疗中发挥越来越重要的作用，从仅局限于传统中药经验体系发展到基于先进的科学技术方法，对药用植物中的化学物质降尿酸的作用以及机制进行研究。从天然植物中寻找降尿酸的活性单体成为解决市售降尿酸药物有效性安全性的重要途径。目前未见甘草多糖降尿酸活性的相关研究报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种甘草多糖及其制备方法和用途。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种甘草均一多糖GUP，它是由甘草经石油醚和无水乙醇脱脂脱色后，水提醇沉，Sevag法除蛋白后经阴离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱纯化而得；所述均一多糖GUP总糖含量为98.39％，蛋白含量0.09％，葡萄糖醛酸含量1.66％，分子量为17416Da，其单糖组成为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖＝0.75:5.98:213.54:4.76:15.51，1→6or1→糖苷键所占比例为21.63％，1→3糖苷键所占比例为34.10％，1→2or1→4糖苷键所占比例为44.27％，为α型吡喃糖，不具有空间三螺旋结构。

一种上述的甘草均一多糖GUP的制备方法，包括如下步骤：(1)取甘草粉碎物，加其重量10～20倍的石油醚进行脱脂，加热至60～70℃，回流提取1～3次，每次1～3h，过滤，药渣备用；

(2)向步骤(1)所得药渣中加入甘草粉碎物重量10～20倍的95％乙醇进行脱色，加热至70～80℃，回流提取1～3次，每次1～3h，过滤，药渣备用；

(3)向步骤(2)所得药渣中加入甘草粉碎物重量10～20倍的单蒸水，加热至80～100℃，回流提取2～5次，每次2～4h，得到水提液；将水提液进行减压浓缩，浓缩液加4～5倍体积的95％乙醇进行沉淀，沉淀部分加水溶解，得到上清液，上清液按照4倍的体积量加入Sevag试剂(正丁醇:氯仿＝1:5v/v)，混合溶剂剧烈搅拌20～40min，高速离心机8000-10000r/min离心10～30min，水层和试剂层交界处会形成凝胶状物质，即为蛋白质，收集上层多糖溶液，重复除蛋白3～6次，将水层旋转蒸发，除去残留的Sevag试剂，并使用透析袋透析36-48h，浓缩，冷冻干燥，得到甘草多糖粗品；

(4)将上述甘草多糖粗品加水加热充分溶解，离心，上清液上样于二乙胺基乙基(DEAE)阴离子交换柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖洗脱液，减压浓缩后上样于凝胶层析柱，以蒸馏水洗脱，流速1mL/min，合并多糖洗脱液，冷冻干燥，即得所述的甘草均一多糖GUP。

甘草多糖GUP的结构鉴定如下：

对本发明获得的甘草多糖GUP采用高效凝胶过滤色谱法进行纯度及分子量测定：

实验仪器为安捷伦1260高效液相色谱系统，色谱条件为TSKgelG4000PW色谱柱(7.5×300mm)，流动相为20mmol/L乙酸铵，流速为0.6mL/min，进样量为20μL，检测器为蒸发光散射检测器：将甘草多糖GUP用适量水溶解，然后进样分析，分析结果呈单一对称峰，说明该组分为分子量均一的多糖，并且分子量大小为17416Da(可见图1所示)。

对本发明获得的甘草均一多糖GUP进行结构测定：

GUP经纯度鉴别，证明已是单一组分，可以进行结构分析。

采用苯酚硫酸法测定该多糖的总糖含量，考马斯亮蓝法测定蛋白的含量，硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量，元素分析测定C、H、N、S元素含量。测定结果显示GUP的总糖含量为98.39％；蛋白含量0.09％；葡萄糖醛酸含量为1.66％；GUP不含有S元素，且N元素的比例较小，这说明几乎不含有蛋白质。

柱前衍生化高效液相色谱法来测定GUP的单糖组成。其单糖组成为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖＝0.75:5.98:213.54:4.76:15.51(可见图2所示)。

高碘酸氧化来测定GUP的糖苷键类型，可知1→6or1→糖苷键所占比例为21.63％，1→3糖苷键所占比例为34.10％，1→2or1→4糖苷键所占比例为44.27％

红外和¹H NMR分析显示GUP为α型吡喃糖(可见图3、4所示)。

刚果红实验显示GUP不具有空间三螺旋结构(可见图5所示)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

药效学实验表明：在大鼠急性高尿酸血症模型中，高中低三个剂量的GUP均能显著降低血尿酸值。且GUP能呈剂量依赖性地抑制血清和肝脏中XOD活性，即可以通过抑制XOD活性，阻碍尿酸合成从而减少体内尿酸浓度。急性高尿血症大鼠的肾组织切片可观察到相比于模型组，GUP高剂量组大鼠肾脏病变较模型组减轻；肝组织切片可观察到相比于模型组，GUP高剂量组大鼠病变现象不明显，细胞形态也基本保持正常。因此，本发明所述的甘草均一多糖GUP有望作为降尿酸活性成分用于制备保健食品或药物制剂，使用安全，无副作用，且制备工艺简单，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为GUP凝胶过滤色谱图。

图2为GUP的单糖衍生化液相色谱图(1.甘露糖；2.鼠李糖；3.葡萄糖醛酸；4.内标；5.葡萄糖；6.甘露糖；7.阿拉伯糖；8.木糖；9.盐藻糖)。

图3为GUP的红外光谱图。

图4为GUP核磁共振¹H-NMR谱图。

图5为GUP的空间三螺旋结构分析。

图6为大鼠空白血清(A)和造模后大鼠血清色谱图(B)

图7为实验大鼠肾脏组织病理学检查(A.空白组；B.模型组；C.别嘌醇组；D.300mg/kg GUP；E.150mg/kg GUP；F.75mg/kg GUP)。

图8为实验大鼠肝脏组织病理学检查(A.空白组；B.模型组；C.别嘌醇组；D.300mg/kg GUP；E.150mg/kg GUP；F.75mg/kg GUP)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

实施例1

取甘草粉碎物，加其质量20倍的石油醚进行脱脂，加热至70℃，回流提取1次，3h，过滤，药渣备用；加入药渣质量20倍的95％乙醇进行脱色，加热至80℃，回流提取1次，3h，过滤，药渣备用；向所得药渣中加入10倍的单蒸水，加热至95℃，回流提取3次，每次2h，得到水提液。将水提液进行减压浓缩，浓缩至原体积的10％，浓缩液加4倍体积的95％乙醇进行沉淀，沉淀部分加水溶解，得到上清液。上清液按照4倍的体积量加入Sevag试剂(正丁醇:氯仿＝1:5v/v)，混合液剧烈搅拌20min，高速离心机10000r/min离心25min，水层和试剂层交界处会形成凝胶状物质，即为蛋白质，收集上层多糖溶液，重复除蛋白4次。将水层旋转蒸发，并使用透析袋透析40h，以除去残留的Sevag试剂，浓缩，冷冻干燥，得到甘草多糖粗品。

将上述甘草多糖粗品加水加热充分溶解，离心，上清液上样于二乙胺基乙基(DEAE)阴离子交换柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖洗脱液，减压浓缩后上样于凝胶层析柱，以蒸馏水洗脱，流速1mL/min，合并多糖洗脱液，冷冻干燥，即得所述的甘草均一多糖GUP。

一、进行纯度和分子量测定

采用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定各组分多糖的分子量。实验仪器为安捷伦1260高效液相色谱系统，色谱条件为TSKgelG4000PW色谱柱(7.5×300mm)，流动相为20mmol/L乙酸铵，流速为0.6mL/min，进样量为20μL，检测器为蒸发光散射检测器。以不同分子量的标准葡聚糖分子量的自然对数值为横坐标，保留时间为纵坐标，绘制葡聚糖分子量的标准曲线为y＝-1.2379x+28.588，R²＝0.9946。相同色谱条件下，根据样品的洗脱时间，按标曲计算分子量大小。

图1为所获得的甘草均一多糖GUP的凝胶过滤色谱图，可见为单一对称峰，表明其为均一多糖，且分子量大小为17416Da。

二、理化分析

采用苯酚硫酸法测定该多糖的总糖含量，考马斯亮蓝法测定蛋白的含量，硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量，元素分析测定C、H、N、S元素含量。

分析结果见表1所示。

表1所述GUP的理化分析结果

由表1可见：GUP不含有S元素，几乎不含蛋白，糖醛酸含量也较低。

三、单糖组成检测

采用安捷伦1260高效液相色谱系统，用柱前衍生高效液相色谱法来测定各组分多糖的单糖组成。将葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、盐藻糖配置为1mg/mL的标准溶液。精密称取GUP 10mg，溶于1mL水中。精密吸取500μL，置于含有500μL2mol/L三氟乙酸的具塞试管中，封口膜密封后，水浴锅中100℃水解反应6h，冷却至室温后，用NaOH溶液(0.3mol/L)调节水解液pH至7.0。分别取500μL单糖标准品溶液、GUP的水解液置于具塞试管中，每管分别加入30μL 10mg/mL的乳糖溶液(内标)。再依次加入0.5mol/L PMP-甲醇溶液500μL以及0.3mol/LNaOH溶液250μL，涡旋2min，使其充分混匀后，置于70℃水浴锅中，衍生化反应30min后，将具塞试管取出冷却至室温，加入250μL 0.3mol/L HCl溶液中和。取出1mL置于5mL试管中，氯仿萃取3次后，水层即为PMP衍生化产物，0.45μm滤膜过滤后，进样。

图2为所述的甘草均一多糖的HPLC图，分析可知：GUP单糖的组成及摩尔比为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖＝0.75:5.98:213.54:4.76:15.51。

四、红外分析

分别取适量干燥的甘草多糖GUP，加入干燥的溴化钾充分研磨，压片，傅里叶变换红外光谱仪在4000-400cm^-1范围内扫描。

图3为所述甘草均一多糖GUP的红外光谱图，GUP在1152cm^-1，1077cm^-1，1033cm^-1有明显的吸收峰，说明其为吡喃糖，同时GUP在844cm^-1有吸收峰，在890cm^-1处没有吸收峰，说明GUP为α构型。

五、¹H-NMR分析

准确称取GUP 30mg，加入500μL D2O中，超声使其充分溶解，在核磁共振仪上进行测定。仪器参数为：频率400MHZ，温度296.9K。

图4为所述甘草均一多糖GUP的¹H-NMR图，GUP中C-1质子的化学位移为5.31、5.30、5.27ppm，均大于4.95ppm，因此GUP的单糖异头碳的主要构型为α型，且GUP在5.4ppm未出现化学位移，说明其是吡喃糖。

六、刚果红实验

精密称取GUP 5mg，加入蒸馏水2mL并使其充分溶解，分别加入2mL 80μmol/L的刚果红试剂，涡旋使充分混匀。配置1mol/L的NaOH溶液，逐渐加入多糖刚果红混合溶液中，使混合液NaOH的浓度从0逐渐增加至0.5M，并在各个NaOH浓度下用紫外分光光度计进行全波长扫描，记录最大吸收波长。以蒸馏水为空白对照，NaOH浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标绘图。

图5为所述甘草均一多糖GUP的三螺旋结构分析图，随着NaOH浓度的升高，刚果红与GUP形成的络合物的最大吸收波长没有出现明显的红移现象，且随着NaOH浓度的升高，相对于刚果红本身最大吸收波长，络合物的最大吸收波长减小的缓慢，说明GUP不具有空间三螺旋结构，可能是一些较为伸展的链状或无规则线团。

七、甘草多糖的降尿酸作用

1)实验动物

健康雄性SD大鼠，标重(200±2)g，购买于江苏大学动物实验中心，室温(23±2)℃，相对湿度65％左右，合格证号：N0.201610827

2)体内尿酸色谱条件

岛津液相色谱系统：LC-20AD四元泵、DGU-20A脱气机、CTO-20AC柱温箱、SIL-20AC自动进样器、SPD-20A紫外检测器。色谱柱：C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm；Waters,USA)。流动相：甲醇-0.2％乙酸水溶液(6:94)。流速：1mL/min，检测波长：288nm，柱温：30℃，进样量：20μL

3)体内标曲的建立

精密称取10mg尿酸标准品于10mL容量瓶中，加入甲醇超声使其溶解，并用甲醇定容至10mL，配制成1mg/mL的储备液。用甲醇分别稀释成2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL的尿酸系列标准品溶液。大鼠眼眶取全血0.5mL于1.5mLEP管中，置37℃水浴20min后，3700rpm离心10min，上清即为大鼠空白血清，分别精密移取6份100μL空白血清置于1.5mL EP管，再分别加入100μL上述系列尿酸标准品溶液，使得大鼠空白血清样品中尿酸的浓度依次为1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。依次从各管中取出100μL上述配制好的血清样品，分别加入1.5mL EP管中，再加入色谱甲醇900μL，来沉淀血清样品中的蛋白等杂质，高速离心机10000rpm离心10min。取400μL上清并加入等体积的0.2％的乙酸水溶液，充分涡旋混匀，过0.45μm有机滤膜，按色谱条件进样，以血清中的尿酸浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积值(A)为纵坐标，绘制尿酸浓度标准曲线。

图6为大鼠空白血清(A)和造模后大鼠血清色谱图(B)，血清样品中尿酸的色谱峰保留时间在5.6min左右，与其它物质的色谱峰分离良好，没有杂质峰干扰。该方法的专属性符合分析测定的要求。尿酸标准曲线y＝35785x-11143，R2＝0.9998，在1μg/mL～20μg/mL的线性范围内，尿酸的浓度与峰面积的线性相关性良好。

4)急性高尿酸血症模型及给药

采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合建立急性高尿酸血症大鼠模型。30只标重雄性SD大鼠随机均分为6组，分别为空白组、模型组、阳性对照组(别嘌醇)、GUP(高、中、低)。除空白组外，其余5组灌胃浓度为100mg/mL的次黄嘌呤混悬液，给药剂量10mL/kg，并按照与次黄嘌呤相同的给药剂量腹腔注射浓度为25mg/mL氧嗪酸钾乳剂，进行造模。造模1h后，空白组灌胃相同体积的生理盐水，阳性药组按25mg/kg灌胃2.5mg/mL别嘌醇溶液，高剂量组分别按300mg/kg的剂量给药，中剂量组分别按150mg/kg的剂量给药，低剂量组分别按75mg/kg的剂量给药。

5)血样以及肝脏、肾脏样品的处理

给药3h后开始取血。大鼠眼眶取血0.5mL于1.5mL EP管中，置37℃水浴20min后，3700rpm离心10min。上清置于-20℃保存。处死大鼠后，取出大鼠的肝脏，一部分于液氮中保存，置于-80℃，备用；另一部分置于4％甲醛溶液中保存，备用。取出大鼠的肾脏，置于0.4％多聚甲醛溶液中保存，备用。

6)血清中尿酸值的测定

取100μL上述血清，再加入色谱甲醇900μL，充分涡旋混合均匀，高速离心机10000rpm离心10min。取400μL上清并加入等体积的0.2％的乙酸水溶液，过0.45μm有机滤膜，按照色谱条件进样，计算血清中尿酸值。

7)血清以及肝脏中黄嘌呤氧化酶(XOD)值的测定

取适量肝脏组织称重，加入9倍量的冰浴的80mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，混合均匀后，4000rpm，4℃离心20min，去除脂质层，上清10,000rpm，4℃离心10min，再取离心后的上清，按照试剂盒中的说明方法操作来测定大鼠肝脏中XOD值。取50μL血清，按照试剂盒的说明方法测定血清中XOD值。

表2为所述GUP对高尿酸大鼠相关指标的影响

Note:^a P＜0.01，与模型组相比。

^b P＜0.01，与别嘌醇组相比。

与空白组相比，模型组的尿酸水平显著提高，说明模型建立成功。与模型组相比，阳性对照组尿酸水平显著降低(P<0.01)；高中低三个剂量的GUP均能显著降低血尿酸值。GUP的降血尿酸能力没有阳性药别嘌醇强，别嘌醇组的大鼠的血尿酸水平甚至低于空白组。为了进一步探究GUP降尿酸的作用机制，我们研究了GUP对血清以及肝脏中XOD的影响。与模型组相比，GUP能显著抑制血清和肝脏中XOD活性(P＜0.01)，且与别嘌醇相比，GUP的肝脏XOD值具有统计学显著差异(P＜0.01)。别嘌醇是常见的嘌呤氧化酶(XOD)抑制药物，实验结果也显示，别嘌醇过度抑制肝脏XOD值，其值甚至低于空白组。

8)组织病理观察

将0.4％多聚甲醛固定好的肝组织和肾组织，常规石蜡包埋，苏木精-伊红(HE)染色，分别在光镜下观察。

实验大鼠肾组织病理学观察见图7所示：空白组大鼠肾组织肾细胞形态正常。模型组大鼠肾脏皮质中肾小球及周围肾小管，小管上皮细胞明显水肿坏死，呈气球样变，肾间质明显水肿。阳性对照药别嘌醇大鼠肾皮质、髓质结构清晰，肾小管空泡变性、肾间质水肿明显减少。GUP高剂量组大鼠肾脏病变较模型组减轻，肾小管空泡变性、肾间质水肿明显减少。

实验大鼠肝组织病理学观察见图8所示：空白组大鼠肝组织肝细胞形态正常。模型组大鼠正常肝细胞很少，大部分肝细胞出现水泡样变性，细胞核变成梭型，细胞形态不正常。阳性对照药别嘌醇组和GUP高剂量组大鼠细胞核基本保持正常，几乎观察不到水泡样变性，细胞形态也基本保持正常。

综合GUP对急性高尿酸血症大鼠的降尿酸效果和肝肾病理学观察可知，GUP有较好的治疗效果，且GUP降尿酸的主要机制可以归因于其对XOD的抑制作用，它们抑制尿酸合成过程中酶的活性，从而减少尿酸的形成。

实施例2

取甘草粉碎物，加其重量15倍的石油醚进行脱脂，加热至65℃，提取2次，每次2h，过滤，药渣备用；加入药渣重量15倍的95％乙醇进行脱色，加热至75℃，提取2次，每次2h，过滤，药渣备用；向所得药渣中加入15倍的单蒸水，加热至90℃，提取2次，每次2.5h，得到水提液。将水提液进行减压浓缩，浓缩至原体积的10％，浓缩液加4倍体积的95％乙醇进行沉淀，沉淀部分加水溶解，得到上清液。上清液按照4倍的体积量加入Sevag试剂(正丁醇:氯仿＝1:5v/v)，混合溶剂剧烈搅拌30min，高速离心机8000r/min离心15min，水层和试剂层交界处会形成凝胶状物质，即为蛋白质，收集上层多糖溶液，重复除蛋白3次。将水层旋转蒸发，除去残留的Sevag试剂，并使用透析袋透析40h，浓缩，冷冻干燥，得到甘草多糖粗品。

将上述甘草多糖粗品加水加热充分溶解，离心，上清液上样于二乙胺基乙基(DEAE)阴离子交换柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖洗脱液，减压浓缩后上样于凝胶层析柱，以蒸馏水洗脱，流速1mL/min，合并多糖洗脱液，冷冻干燥，即得所述的甘草均一多糖GUP。

关于本实施例所获得的均一多糖GUP结构分析内容及降尿酸作用内容均同实施例1中所述。

实施例3

取甘草粉碎物，加其重量10倍的石油醚进行脱脂，加热至75℃，提取3次，每次1.5h，过滤，药渣备用；加入药渣重量10倍的95％乙醇进行脱色，加热至85℃，提取3次，每次1.5h，过滤，药渣备用；向所得药渣中加入20倍的单蒸水，加热至90℃，提取3次，每次1.5h，得到水提液。将水提液进行减压浓缩，浓缩至原体积的10％，浓缩液加4倍体积的95％乙醇进行沉淀，沉淀部分加水溶解，得到上清液。上清液按照4倍的体积量加入Sevag试剂(正丁醇:氯仿＝1:5v/v)，混合溶剂剧烈搅拌40min，高速离心机8000r/min离心10min，水层和试剂层交界处会形成凝胶状物质，即为蛋白质，收集上层多糖溶液，重复除蛋白4次。将水层旋转蒸发，除去残留的Sevag试剂，并使用透析袋透析40h，浓缩，冷冻干燥，得到甘草多糖粗品。

将上述甘草多糖粗品加水加热充分溶解，离心，上清液上样于二乙胺基乙基(DEAE)阴离子交换柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖洗脱液，减压浓缩后上样于凝胶层析柱，以蒸馏水洗脱，流速1mL/min，合并多糖洗脱液，冷冻干燥，即得所述的甘草均一多糖GUP。

关于本实施例所获得的均一多糖GUP结构分析内容及降尿酸作用内容均同实施例1中所述。

综上所述，本发明所述的甘草均一多糖GUP具有显著的降尿酸作用，有望作为降尿酸活性成分用于降尿酸保健品、药物。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖权利要求保护范围中。

Claims (3)

1.一种甘草均一多糖GUP，其特征是：它是由甘草经石油醚和无水乙醇脱脂脱色后，水提醇沉，Sevag法除蛋白后经阴离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱纯化而得：所述均一多糖GUP总糖含量为98.39％，蛋白含量为0.09％以下，分子量为17416Da，其单糖组成为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖＝0.75:5.98:213.54:4.76:15.51，1→6or1→糖苷键所占比例为21.63％，1→3糖苷键所占比例为34.10％，1→2or1→4糖苷键所占比例为44.27％，为α型吡喃糖，不具有空间三螺旋结构。

2.一种权利要求1所述的甘草均一多糖GUP的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(1)取甘草粉碎物，加其重量10～20倍的石油醚进行脱脂，加热至60～70℃，回流提取1～3次，每次1～3h，过滤，药渣备用；

(2)向步骤(1)所得药渣中加入甘草粉碎物重量10～20倍的95％乙醇进行脱色，加热至70～80℃，回流提取1～3次，每次1～3h，过滤，药渣备用；

(3)向步骤(2)所得药渣中加入甘草粉碎物重量10～20倍的单蒸水，加热至80～100℃，回流提取2～5次，每次2～4h，得到水提液；将水提液进行减压浓缩，浓缩液加4～5倍体积的95％乙醇进行沉淀，沉淀部分加水溶解，得到上清液，上清液按照4倍的体积量加入Sevag试剂(正丁醇:氯仿＝1:5v/v)，混合溶剂剧烈搅拌20～40min，高速离心机8000-10000r/min离心10～30min，水层和试剂层交界处会形成凝胶状物质，即为蛋白质，收集上层多糖溶液，重复除蛋白3～6次，将水层旋转蒸发，除去残留的Sevag试剂，并使用透析袋透析36-48h，浓缩，冷冻干燥，得到甘草多糖粗品；

(4)将上述甘草多糖粗品加水加热充分溶解，离心，上清液上样于二乙胺基乙基(DEAE)阴离子交换柱，用蒸馏水洗脱，收集多糖洗脱液，减压浓缩后上样于凝胶层析柱，以蒸馏水洗脱，流速1mL/min，合并多糖洗脱液，冷冻干燥，即得所述的甘草均一多糖GUP。

3.权利要求1所述的甘草均一多糖GUP在制备降尿酸的保健食品或药物制剂中的应用。